CN104529993B - 一种含不饱和羰基的药物小分子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，包括(1)将D‑核糖溶于丙酮，搅拌下滴加浓硫酸，经中和、提纯得化合物1a；(2)将1a溶于THF溶液，滴加乙烯基溴化镁，反应得到化合物2a；(3)向2a的CH2Cl2溶液中滴加高碘酸钠，反应制得化合物3a；(4)向3a的甲醇溶液中加入盐酸羟胺和碳酸氢钠，反应得到化合物3b；(5)向3b与硅胶的甲醇的悬浮液里滴加氯亚明三水合物，反应得到化合物3c；(6)将化合物3c溶于二氯甲烷中，加入吡啶并滴加Tf2O，反应得到化合物4a；(7)4a溶于无水二氯甲烷，回流，加入Et3N反应得到化合物4b；(8)将4b溶于THF中，加入SmI2，反应得到
Description
技术领域
本发明属于药物制备领域，涉及一种含不饱和羰基的药物小分子的制备方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高、现代社会生活节奏的加快、生活方式的改变、环境的污染等诸多因素，癌症已经成为危害人类健康的主要杀手。近年来，肿瘤的诊断、治疗等研究尽管已经取得了很大的进展，但总体上来看，常见恶性肿瘤的发病率及死亡率仍居高不下。肿瘤的靶向诊断和治疗已经成为肿瘤的诊疗领域的最重要的研究方向之一，目前常用的是靶向分子主要是利用肿瘤细胞表面特异分子的配基或者抗体作为肿瘤靶向分子，通过基因工程或化学修饰手段将配基或抗体与其他功能分子进行偶联，从而发挥其肿瘤靶向的诊断或者治疗功能。
其中，化学修饰手段中化学诱导因子是常用的方法。某些病态细胞或者组织在其表面或者在细胞内部过表达某些特异性的水解酶，被用来作为外部诱导因子选择性的释放小分子。蛋白酶能够快速切断肽键，但因为其对底物序列的选择性导致难以针对小分子和多肽之间的连接键；分子内吞入细胞后经历pH变化(从中性到内涵体中的约pH 5.5)也常常被用来做外部诱导因子，然而这一过程导致键的断裂通常比较缓慢。
现有技术中比如阿霉素DOX上的酮和多肽上的肼形成的腙键可以在弱酸性条件下释放，但这一个过程需要几十小时。从血液中到细胞内，谷胱甘肽的浓度上升上千倍(从10μM升高到10mM左右)，因此二硫键能够在血液中保持稳定，但在细胞内被高浓度的谷胱甘肽所切断。虽然这一巯基交换反应被广泛应用于细胞内的药物释放，但这一巯基交换过程同样比较缓慢(其反应半衰期通常长达十几小时)，而且在小分子药物上引入巯基往往会改变药物的功能。实验证明二硫键被谷胱甘肽断裂在体内是个非常低效的过程。我们在前期工作中发现了一个新型的键断裂反应。
发明内容
本发明克服现有技术中药物释放缓慢的不足，提供一种含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，该药物小分子与荧光标记的多肽分子通过酯键偶联后得到短肽-小分子复合物。我们发现谷胱甘肽能与短肽-小分子复合物中的不饱和羰基起加成反应，导致酯键断裂，使得药物释放，且酯键断裂的速率跟谷胱甘肽的浓度呈线性关系，当多肽-小分子复合物进入细胞后，小分子可以迅速释放出来，这一反应对谷胱甘肽浓度的高度敏感性非常适合用于细胞内的选择性释放。
一种利用酯键断裂释放药物的方法，将含有不饱和羰基的药物小分子与肿瘤靶向多肽通过酯键偶联得到多肽-小分子复合物，然后利用细胞内谷胱甘肽与多肽-小分子复合物通过加成反应，导致酯键发生断裂，达到释放药物的目的。
进一步地，所述的肿瘤靶向多肽为结肠癌肿瘤靶向多肽(TPSPFSH)、RGD多肽，所述的药物小分子为
作为优选，所述的多肽具有荧光标记。
进一步地，所述的药物小分子的制备方法包括如下步骤：
(1)将D-核糖溶于丙酮，在室温条件下向其中滴加浓硫酸并搅拌，反应完成后，混合物用碱中和，过滤并减压蒸发浓缩，得到无色糖浆化合物(1a)，作为优选，其中所述的D-核糖与浓硫酸质量体积比为10：0.3g/ml；
(2)将步骤(1)制得的化合物1a溶于无水THF溶液，-78℃条件下向其中滴加乙烯基溴化镁的THF溶液，同时搅拌，将反应混合物在0℃下搅拌3小时，得到化合物(2a)，作为优选，其中所述的化合物1a与乙烯基溴化镁的摩尔比为1:4～5；
(3)将化合物2a溶于CH2Cl2溶液中，0℃下滴加高碘酸钠水溶液，将反应混合物在室温下搅拌40分钟，制得化合物(3a)，作为优选，所述化合物2a与碘酸钠的摩尔比为1:1.5；
(4)向化合物3a的甲醇溶液中，加入盐酸羟胺和碳酸氢钠，室温搅拌至反应结束，得到化合物(3b)，作为优选，步骤(4)所述的化合物3a、盐酸羟胺和碳酸氢钠三者的摩尔比为0.56:3:4；
(5)向化合物3b与硅胶的甲醇的悬浮液里，滴加chloramine-T三水合物的甲醇溶液并搅拌，室温搅拌至反应结束，得到化合物(3c)，作为优选，所述的chloramine-T三水合物与化合物3b的摩尔比为1.5:1；
(6)氮气保护下，将化合物3c溶于干燥二氯甲烷中，0℃下加入吡啶并逐滴加入Tf2O，混合物室温搅拌，得到化合物(4a)，作为优选，所述的化合物3c、吡啶、Tf2O三者之间的摩尔比为5:13:11；
(7)将化合物4a在氮气保护下溶于无水二氯甲烷，然后加热回流，缓慢加入Et3N，搅拌反应，得到化合物(4b)，作为优选，所述的Et3N添加量与化合物4a的摩尔比为1.2-1.5；
(8)氮气保护下，将化合物4b溶于无水THF中，加入SmI2，室温搅拌得到作为优选，所述的化合物SmI2浓度为0.1M，SmI2与化合物4b摩尔比为3：1。
作为优选，步骤(2)所述的乙烯基溴化镁的THF溶液中乙烯基溴化镁的浓度为1M；步骤(3)所述的高碘酸钠水溶液浓度为0.65M；步骤(5)所述的硅胶的粒径为230-400目。
进一步地，所述的多肽-小分子复合物的合成方法为：将溶于无水二氯甲烷中，氮气保护，0℃下加入马来酸酐的二氯甲烷溶液，缓慢加入三乙胺，室温搅拌，制备得到将溶于DMF中，0℃下加入HBTU，DIPEA搅拌，加入肿瘤靶向多肽(Peptide3)的DMF溶液，混合物室温搅拌，得到多肽-小分子复合物。
作为优选，所述的马来酸酐和三乙胺三者之间摩尔比为1:10：1,；所述的HBTU、DIPEA、肿瘤靶向多肽(Peptide3)四者之间的摩尔比为1:1.5:3:1。
本发明的有益效果是，申请人发现并利用谷胱甘肽能与短肽-小分子复合物中的不饱和羰基起加成反应，导致酯键断裂，使得药物释放，且酯键断裂的速率跟谷胱甘肽的浓度呈线性关系，当多肽-小分子复合物进入细胞后，小分子可以迅速释放出来，这一反应对谷胱甘肽浓度的高度敏感性，由于血液中GSH浓度较小，细胞内GSH浓度相对高出很多，非常适合用于细胞内的选择性释放，本申请提供了一种能够有效与短肽结合的含不饱和羰基小分子，产量高。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是药物小分子和含有该药物小分子的多肽-小分子复合物的合成途径；
图2是GSH诱导多肽-小分子复合物酯键断裂释放药物小分子的反应过程；其中GSH指谷胱甘肽；GS指脱去巯基H原子的谷胱甘肽分子；
图3是GSH诱导多肽-小分子复合物酯键断裂释放药物小分子的HPLC色谱图；
图4是多肽-小分子复合物与谷胱甘肽反应后酯键断裂的动力学参数测量。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
实施例1
如图1所示，药物小分子的制备：(1)将D-ribose(80g，532.9mmol)溶于丙酮1000ml，室温下滴加H2SO4(2.4ml)并搅拌，室温搅拌2.5小时，混合物用固体NaHCO3中和，过滤并减压蒸发浓缩，得到无色糖浆(1a)，产率74％。
(2)将化合物1a(20.36g，107.1mmol)溶于无水THF(800ml)，-78℃条件下滴加乙烯基溴化镁(480.0ml，480.0mmol，1.0M THF溶液)，将反应混合物在0℃下搅拌3小时，得到化合物(2a)，产物(2a+2b)中化合物2a(主产物)含量为74％。
(3)将化合物2a(19.25g，88.2mmol)用于CH2Cl2(330ml)溶液中，0℃下滴加高碘酸钠(204.0ml，132.4mmol，0.65M水溶液)溶液，将反应混合物在室温下搅拌40分钟，制得化合物(3a)。
(4)向化合物3a(0.28mmol)的甲醇(10ml)溶液中，加入盐酸羟胺(1.5mmol)和碳酸氢钠(2mmol)，室温搅拌至反应结束，得到化合物(3b)。
(5)化合物3b(0.55mmol)与硅胶(230–400目)的甲醇(10mL)的悬浮液里，滴加chloramine-T三水合物(1.5eq)甲醇溶液(5mL)并搅拌，室温搅拌至反应结束，得到化合物(3c)，步骤(2)至步骤(5)四个步骤总产率46％。
(6)氮气保护下，将化合物3c(20mmol)溶于干燥二氯甲烷中，0℃下加入吡啶(52mmol)，同时逐滴加入Tf2O(44mmol)，在室温下搅拌混合物，得到化合物(4a)。
(7)将化合物4a在氮气保护下溶于无水二氯甲烷，并加热回流，缓慢加入Et3N(1.2-1.5eq)，搅拌反应，得到化合物(4b)。
(8)氮气保护下，将化合物4b(1eq)溶于无水THF中，向其中加入3eqSmI2(0.1M)，室温下搅拌反应得到(1)，以上步骤(6)～步骤(8)三个步骤总产率为39％。
所述的多肽-小分子复合物的合成方法为：将上述制得的(1eq)溶于无水二氯甲烷中，氮气保护条件下，0℃下加入马来酸酐(10eq)的二氯甲烷溶液，缓慢加入三乙胺(1eq)，室温搅拌，制备得到(1b)；将(1b)溶于DMF中，0℃下加入HBTU(1.5eq)，DIPEA(3eq)搅拌，加入结肠癌肿瘤靶向多肽(TPSPFSH)(1eq)的DMF溶液，混合物室温搅拌，得到多肽-小分子复合物，产率30％。
通过以上方法合成了一个含不饱和羰基的药物小分子1(1H NMR:δ＝1.38(s,3H),1.39(s,3H),2.66(s,1H),4.35(d,J＝1.2Hz,2H),4.51(d,J＝5.2Hz,1H),5.22(m,1H),7.43ppm(d,J＝2.0Hz,1H)；13C NMR:δ＝26.11,27.51,57.22,77.10,77.77,115.66,146.08,153.21,202.56ppm)，并且把1与荧光标记的多肽分子3通过酯键偶联后得到多肽-小分子复合物2，其合成途径显示在图1中。分子2在水溶液和有机溶剂如DMF，DMSO中都具有良好的溶解性。我们发现谷胱甘肽能与2起加成反应，导致酯键发生断裂(图2)而得到一个含羧基的多肽分子10和谷胱甘肽连接的环外不饱和羰基分子11。荧光多肽分子2、3和10用质谱分析根据其分子量得到证实(2分子量为1695.7；3分子量为1428.6；10分子量为1528.7)。在谷胱甘肽过量的情况下，11能够进一步与GSH反应，或者与细胞内的蛋白质发生反应。
利用多肽-小分子复合物2和多肽产物10在反相HPLC中可以实现基线分离的这一特性，我们可以用固定2的浓度，而加入不同浓度的谷胱甘肽，在pH7.4的磷酸缓冲液中。用高效液相色谱法研究由2反应生成10的不同时间点的转化率，图3是不同的几种物质2、3、10的HPLC液相色谱图，从而得到此反应的动力学参数。固定2的浓度，谷胱甘肽浓度远大于2的浓度的时候(图4A中我们选择0.3，0.5，1和3mM的GSH浓度)，在反应过程中谷胱甘肽的浓度可以认为是固定常数，因此此二级反应可以当做假一级反应，k’＝k2[GSH]。在某一谷胱甘肽浓度下，Ln([2])跟时间t呈线性关系，其斜率为-k’。我们可以看到如图4B所示，当2的浓度一定的条件下，酯键断裂的速率(也即10的生成)跟谷胱甘肽的浓度呈线性关系。二级反应常数k2达24±5M-1·min-1(图4B)。在血液中GSH的浓度在20μM，而细胞内为2-10mM，也即有约500倍的差别，因此在细胞内外这一键断裂反应的速率差达到500倍。在含3mM GSH的PBS中，我们观察到10分钟内90％的酯键发生断裂；相比较而言，在含20μM GSH的PBS中，两个小时后仅有15％的酯键发生断裂。因为注射入体内的小分子通常只需要几分钟就可以随血液循环到达患处，我们的模拟实验表明在传输过程中产生的药物释放可以忽略不计，而当多肽-小分子复合物进入细胞后，小分子可以迅速释放出来。更加特别的是，这个酯键的断裂产生了一个碳碳双键和羧基；在我们的实验中含羧基的多肽被完整地释放出来，而且这一反应对谷胱甘肽浓度的高度敏感性非常适合用于细胞内的选择性释放。
因而，我们利用谷胱甘肽和多肽-小分子2的加成反应，导致酯键的断裂，用以药物释放。
Claims (9)
1.一种含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于，所述的药物小分子为其制备方法包括如下步骤：
(1)将D-核糖溶于丙酮，在室温条件下向其中滴加浓硫酸并搅拌，反应完成后，混合物用碱中和，过滤并减压蒸发浓缩，得到无色糖浆化合物1a
(2)将步骤(1)制得的化合物1a溶于无水THF溶液，-78℃条件下向其中滴加乙烯基溴化镁的THF溶液，同时搅拌，将反应混合物在0℃下搅拌3小时，得到化合物2a
(3)将化合物2a溶于CH2Cl2溶液中，0℃下滴加高碘酸钠水溶液，将反应混合物在室温下搅拌40分钟，制得化合物3a
(4)向化合物3a的甲醇溶液中，加入盐酸羟胺和碳酸氢钠，室温搅拌至反应结束，得到化合物3b
(5)向化合物3b与硅胶的甲醇的悬浮液里，滴加氯胺T三水合物的甲醇溶液并搅拌，室温搅拌至反应结束，得到化合物3c
(6)氮气保护下，将化合物3c溶于干燥二氯甲烷中，0℃下加入吡啶并逐滴加入Tf2O，混合物室温搅拌，得到化合物4a
(7)将化合物4a在氮气保护下溶于无水二氯甲烷，然后加热回流，缓慢加入Et3N，搅拌反应，得到化合物4b
(8)氮气保护下，将化合物4b溶于无水THF中，加入SmI2，室温搅拌得到
2.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的碱为固体碳酸氢钠；所述的D-核糖与浓硫酸质量体积比为10：0.3g/ml。
3.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的乙烯基溴化镁的THF溶液中乙烯基溴化镁的浓度为1M；其中所述的化合物1a与乙烯基溴化镁的摩尔比为1:4～5。
4.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的高碘酸钠水溶液浓度为0.65M，所述化合物2a与高碘酸钠的摩尔比为1:1.5。
5.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的化合物3a、盐酸羟胺和碳酸氢钠三者的摩尔比为0.56:3:4。
6.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的硅胶的粒径为230-400目，所述的氯胺T三水合物与化合物3b的摩尔比为1.5:1。
7.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于：步骤(6)所述的化合物3c、吡啶、Tf2O三者之间的摩尔比为5:13:11。
8.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于：步骤(7)所述的Et3N添加量与化合物4a的摩尔比为1.2-1.5。
9.根据权利要求1所述的含不饱和羰基的药物小分子的制备方法，其特征在于：步骤(8)所述的化合物SmI2浓度为0.1M，SmI2与化合物4b摩尔比为3：1。
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