CN110218235A - 一种化合物及其制备方法和作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种化合物及其制备方法和作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用。所述化合物结构式如式(Ⅰ)所示：本发明提供的化合物具有荧光特性，对LXRβ有较好的特异性结合。将该化合物作为荧光偏振探针，通过竞争的方法，可以实现对LXRβ配体的筛选及配体亲和力水平的评价；基于本发明建立的筛选方法，本发明筛选获得了20个可以结合LXRβ的小分子量化合物，为后续的LXRβ靶向的药物设计提供了基础。

Description

一种化合物及其制备方法和作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛 选中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，更具体地，涉及一种化合物及其制备方法和作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用。
技术背景
肝X受体(LXR)属于核受体超家族，可以通过调控相关基因的转录，调节胆固醇和脂肪代谢、糖代谢以及抗炎等相关的生理过程。因此LXR也成为了核受体中重要的药物靶标。
LXR主要由DNA结合结构域、配体结合结构域组成，另外在其N端和C端分别有激活功能结构域1(AF1)和激活功能结构域2(AF2)。LXR最初被认为是孤儿受体，但是后来研究认为氧化甾醇类的化合物，例如24(S)-羟基胆固醇为其内源性的配体。LXR与一些核受体一样，能够与RXR形成异源二聚体发挥作用。LXR/RXR异源二聚体结合在DNA上相应靶基因的启动子区域，与LXR反应元件(LXRE)相结合。当LXR激动剂与LXR配体结合域结合后，可以招募共激活因子，从而促进下游靶基因的转录。
经过二十多年的研究，已有众多LXR激动剂被开发出来。典型的比如T091317，GW3965等。但是这些化合物均存在着升高甘油三酯的副作用。LXR由两个亚型组成，LXRα(NR1H3)和LXRβ(NR1H2)。二者在序列上有77％的同源度，但在体内的分布不同。LXRα主要在肝脏、小肠、肾、脾和脂肪组织等部位集中表达，而LXRβ在体内广泛分布。后来的研究证明这些副作用可能是由于LXRα引起的，所以后续的药物开发多集中在LXRβ选择性激动剂的开发上。另外，随着对LXR关注的增多，人们对于LXR的生理功能以及适应症有了更深入的了解。从最初针对动脉粥样硬化进行开发，到现在适应症的范围已经扩展到了糖尿病、阿尔兹海默症、特应性皮炎以及一些癌症。
LXR-623是由Wyeth开发的第一个进入临床试验的LXR激动剂，但是由于中枢神经***的副作用以失败告终。Bristol-Myers Squibb公司开发的BMS-852927也由于升高甘油三酯等副作用导致临床试验失败。其他的药物研发快速推进，目前有两个药物在进行临床试验。用于治疗实体瘤和淋巴癌的RGX-104已进入临床I期，用于治疗特异性皮炎的ALX-101已进入临床II期。但是，寻找结构更加多样，疗效更显著的LXR激动剂仍然是学术界和工业界所关注的。
为了寻找新型的LXR激动剂，研究者们建立了一些筛选方法。例如在细胞水平上进行的报告基因实验。但是细胞水平的筛选实验存在着影响因素多，筛选周期长等缺点，难以实现化合物的快速大量筛选。在蛋白水平上的筛选方法包括荧光共振能量转移、均相时间分辨荧光、AlphaScreen等方法。但是这些方法都是基于LXR在结合配体之后能够招募共激活因子，从而检测LXR招募共激活因子能力的原理。而在蛋白水平上直接检测配体与LXR结合的方法主要为闪烁近邻法，通过待测配体竞争同位素标记的阳性化合物实现检测。虽然这种方法蛋白耗量少，但是同位素标记的化合物难以获得，难以实现筛选的目的。所以其他蛋白水平的筛选方法仍需建立。
荧光偏振是一种能够检测分子间相互作用的方法。通过荧光基团标记配体，进行竞争实验，即可实现待测化合物与受体结合能力的检测。其基本原理是，小分子在溶液中的转动速度比大分子快，因此不结合大分子的荧光化合物产生的偏振值较低；而当荧光化合物与大分子结合之后，转动变慢，从而产生较高的偏振值。因此，荧光偏振是一种可以在微孔板上实现检测，试剂用量少，可以实现高通量筛选的一种检测方法。
对于其他核受体来说，基于荧光偏振竞争的方法，已经开发出相应的检测方法甚至商品化试剂盒。但是暂未见利用荧光偏振方法测试化合物与LXR结合能力的详细报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足，提供一种化合物。本发明提供的化合物具有荧光特性，对LXRβ有较好的特异性结合。将该化合物作为荧光偏振探针，通过竞争的方法，可以实现对LXRβ配体的筛选及配体亲和力水平的评价；基于本发明建立的筛选方法，本发明筛选获得了20个可以结合LXRβ的小分子量化合物，为后续的LXRβ靶向的药物设计提供了基础。
本发明的另一目的在于提供上述化合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述化合物作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种LXRβ配体筛选的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种化合物，结构式如式(Ⅰ)所示：
本发明提供的化合物具有荧光特性，对LXRβ有较好的特异性结合。将该化合物作为荧光偏振探针，通过竞争的方法，可以实现对LXRβ配体的筛选及配体亲和力水平的评价；基于本发明建立的筛选方法，本发明筛选获得了20个可以结合LXRβ的小分子量化合物，为后续的LXRβ靶向的药物设计提供了基础。
上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：猪去氧胆酸和叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯进行酰胺反应后得中间体1a；
S2：将中间体1a进行脱保护，与异硫氰酸荧光素FITC于50～60℃下进行亲核加成反应即得所述化合物。
S1中的酰胺反应可按照常规的酰胺反应条件进行。
优选地，S1中酰胺反应选用的有机溶剂为DMF、DHF或乙腈中的一种或几种。
优选地，S1中酰胺反应选用的缩合剂为PyBoc、HOAT、HOBT、HBTU或BOP中的一种或几种。
优选地，S1中酰胺反应选用的碱为N，N-二异丙基乙胺或者三乙胺中的一种或几种。
优选地，S1中所述猪去氧胆酸和叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯的摩尔比为1:1～1:2
S2中的脱保护反应可按照常规的脱保护反应条件进行。
优选地，S2中脱保护反应选用的有机溶剂为1，4-二氧六环、DMF或THF中的一种或几种。
优选地，S2中脱保护反应选用的酸为HCl、醋酸或者三氟乙酸中的一种。
S2中的亲核加成反应可按照常规的反应条件进行。
优选地，S2中亲核加成反应选用的有机溶剂为1，4-二氧六环、DMF或THF中的一种或几种。
优选地，S2中亲核加成反应选用的碱为DIPEA或者三乙胺中的一种或几种。
优选地，S2中所述中间体1a和异硫氰酸荧光素的摩尔比为1:1～1:2。
上述化合物作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明还请求保护一种LXRβ配体筛选的方法，包括如下步骤：
S3：将权利要求1所述化合物、包含LXRβ配体结合域的蛋白和待测化合物混合得混合物；
S4：利用荧光偏振技术测定混合物的偏振值，根据偏振值确认待测化合物是否为LXRβ的配体。
一般情况下偏振值降低大于检测窗的25％即可判定其为LXRβ的配体。
优选地，S3中所述LXRβ配体结合域的蛋白序列为：
MGHHHHHHGEGVQLTAAQELMIQQLVAAQLQCNKRSFSDQPKVTPWPLGADPASGSASQQRFAHFTELAIISVQEIVDFAKQVPGFLQLGREDQIALLKASTIEIMLLETARRYNHETECITFLKDFTYSKDDFHRAGLQVEFINPIFEFSRAMRRLGLDDAEYALLIAINIFSADRPNVQEPGRVEALQQPYVEALLSYTRIKRPQDQLRFPRMLMKLVSLRTLSSVHSEQVFALRLQDKKLPPLLSEIWDVHEGSGSGSHKILHRLLQDSSS。
优选地，对应的DNA序列为：
ATGGGCGAGGGTGTCCAGCTAACAGCGGCTCAAGAACTAATGATCCAGCAGTTGGTGGCGGCCCAACTGCAGTGCAACAAACGCTCCTTCTCCGACCAGCCCAAAGTCACGCCCTGGCCCCTGGGCGCAGACCCCGCGTCCGGCTCTGCCAGCCAGCAACGCTTTGCCCACTTCACGGAGCTGGCCATCATCTCAGTCCAGGAGATCGTGGACTTCGCTAAGCAAGTGCCTGGTTTCCTGCAGCTGGGCCGGGAGGACCAGATCGCCCTCCTGAAGGCATCCACTATCGAGATCATGCTGCTAGAGACAGCCAGGCGCTACAACCACGAGACAGAGTGTATCACCTTCTTGAAGGACTTCACCTACAGCAAGGACGACTTCCACCGTGCAGGCCTGCAGGTGGAGTTCATCAACCCCATCTTCGAGTTCTCGCGGGCCATGCGGCGGCTGGGCCTGGACGACGCTGAGTACGCCCTGCTCATCGCCATCAACATCTTCTCGGCCGACCGGCCCAACGTGCAGGAGCCGGGCCGCGTGGAGGCGTTGCAGCAGCCCTACGTGGAGGCGCTGCTGTCCTACACGCGCATCAAGAGGCCGCAGGACCAGCTGCGCTTCCCGCGCATGCTCATGAAGCTGGTGAGCCTGCGCACGCTGAGCTCTGTGCACTCGGAGCAGGTCTTCGCCTTGCGGCTCCAGGACAAGAAGCTGCCGCCTCTGCTGTCGGAGATCTGGGACGTCCACGAGGGCAGCGGCAGCGGCAGCCATAAAATTCTCCATAGATTATTACAGGATTCTTCTTCTTAA。
本发明同时提供了20个可以结合LXRβ的小分子化合物，结构如下：
其中我们提供了叔丁基7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸酯(F3)的共晶结合模式。我们认为该片段上的叔丁氧羰基结构可以作为LXRβ的优势片段，通过与435位组氨酸形成氢键，起到激活LXRβ的作用。我们的共晶结构也证实了这样的激动模式。另外，叔丁氧羰基上的叔丁基部分被口袋中的疏水性氨基酸Leu449,Phe268,Leu345,Leu442和Val439包围，二氢异喹啉的苯环部分与Phe329形成π-π堆积，使得该片段可以稳定地结合在口袋中。
所述化合物片段叔丁基7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸酯与LXRβ的结合模式如图12所示。
优选地，S4中所述LXRβ的配体为F1～F20及含有F1～F20任意一种或几种片段的活性分子中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的化合物具有荧光特性，对LXRβ有较好的特异性结合。将该化合物作为荧光偏振探针，通过竞争的方法，可以实现对LXRβ配体的筛选及配体亲和力水平的评价；基于本发明建立的筛选方法，本发明筛选获得了20个可以结合LXRβ的小分子量化合物，为后续的靶向LXRβ的药物设计提供了基础。
附图说明
图1为实施例1提供的荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸的结构；
图2为实施例1提供的荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸的合成路线；
图3为实施例1提供的荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸与LXRβ的饱和曲线；
图4为实施例1提供的荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸的总荧光强度随LXRβ浓度的变化；
图5为单独的FITC的荧光偏振值随LXRβ浓度的变化；
图6为实施例1提供的荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸与LXRβ-A275I突变体的饱和曲线；
图7为LXR阳性化合物荧光偏振竞争测试结果；A图为所用阳性化合物的结构，B图为竞争曲线；
图8为荧光偏振测试的二甲基亚砜(DMSO)耐受实验；
图9为Z’因子的测定；
图10为荧光偏振竞争方法对1074个片段进行片段筛选的结果；
图11为荧光偏振竞争方法测试的片段叔丁基7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸酯(F3)的竞争曲线；
图12为X射线晶体学阐明的片段叔丁基7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸酯(球棍模型)与LXRβ(卡通模型)的结合模式(PDB编号：6JIO)。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
本发明选用如下两个方法对荧光偏振探针进行荧光偏振(Fluorescencepolarization)的分析。
(1)饱和分析实验(Saturation assay)：采用不同浓度的受体与一定浓度荧光偏振探针混合后孵育一定的时间，然后测量体系的荧光偏振值。本发明中饱和实验的实施方案如下：用测试缓冲液稀释LXRβ，与10nmol/L荧光偏振探针混合孵育后，测定荧光偏振值，作出饱和曲线进行分析。
(2)竞争分析实验(Competition assay)：用于测定配体与受体的亲和力。即采用固定浓度的LXRβ和荧光偏振探针，与不同浓度的待测化合物混合后测定体系的荧光偏振值。化合物竞争荧光偏振探针，使得荧光偏振值随化合物浓度增加而降低。本发明中竞争实验的实施方案如下：用测试缓冲液稀释LXRβ的阳性化合物，与10nmol/L荧光偏振探针和400nmol/L LXRβ蛋白混合孵育后测定体系的荧光偏振值，作出竞争曲线进行分析。
实施例1 FITC-猪去氧胆酸的合成
如图1和2所示，以猪去氧胆酸为原料，经过两步反应，即可得到产物。具体步骤如下。
(1)将猪去氧胆酸(786mg,2mmol)溶于DMF溶液中，加入1040mg(2mmol)PyBop、432mg(2mmol)叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯和0.33mL(2mmol)DIPEA。将反应的混合液在室温搅拌过夜。然后将混合液溶解于100mL DCM中，有机相用水冲洗(50mL×6)，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，得到粗化合物。硅胶柱层析色谱纯化得中间体1a，为白色固体。1HNMOL/LR(500MHz,Chloroform-d)δ4.01(dt,J＝11.95,4.75Hz,1H),3.57(tt,J＝10.76,4.71Hz,1H),3.45(d,J＝10.86Hz,1H),3.18(q,J＝6.76Hz,3H),3.07(q,J＝6.97Hz,2H),2.21(ddd,J＝15.02,10.48,4.99Hz,1H),2.11–1.99(m,1H),1.97–1.90(m,1H),1.91–1.78(m,1H),1.74(dt,J＝13.71,3.31Hz,2H),1.69–1.60(m,1H),1.60(s,0H),1.41(d,J＝5.10Hz,12H),1.07(ttd,J＝24.75,13.88,13.27,7.17Hz,5H),0.88(d,J＝6.41Hz,4H),0.86(s,2H),0.60(d,J＝5.94Hz,3H).13C NMOL/LR(125MHz,Chloroform-d)δ173.00,155.18,78.11,70.48,66.94,55.16,54.95,47.38,41.81,39.18,38.97,38.83,38.17,34.91,34.58,34.51,33.84,33.80,32.60,30.88,29.09,28.94,28.38,28.17,27.43,27.18,25.19,25.05,23.21,22.52,19.74,17.35,11.02.LC-MS(ESI):m/z＝491.3[M+H-Boc]+。
(2)将59mg(0.1mmol)中间体溶于3mL 2,4-二氧六环，加入0.2mL HCl(4M,2,4-二氧六环稀释)，室温搅拌一小时，减压浓缩得到粗品。将粗品溶于2mL无水DMF中，然后加入40mg(0.11mmol)异硫氰酸荧光素和0.1mL(0.63mmol)DIPEA，80℃下搅拌过夜。冷却反应液，用反向C-18柱进行纯化得到橙黄色终产物。1H NMOL/LR(400MHz,Chloroform-d andMethanol-d4)δ7.98(s,1H),7.78–7.66(m,1H),7.06(d,J＝8.26Hz,1H),6.84(d,J＝8.94Hz,2H),6.60(d,J＝2.26Hz,2H),6.50(dd,J＝8.93,2.32Hz,2H),3.92(dt,J＝12.20,4.73Hz,1H),3.53(tt,J＝7.07,3.40Hz,2H),3.44(dq,J＝10.69,5.03,4.47Hz,1H),3.24(p,J＝1.63Hz,2H),3.09(t,J＝6.94Hz,2H),2.20–2.08(m,1H),2.05–1.95(m,1H),1.95–1.86(m,1H),1.78(dd,J＝10.18,5.34Hz,1H),1.69(d,J＝13.97Hz,1H),1.61–1.49(m,2H),1.49–1.40(m,1H),1.39–1.26(m,5H),1.21(d,J＝4.14Hz,1H),1.19(s,4H),1.14(d,J＝6.48Hz,2H),0.85(d,J＝6.39Hz,3H),0.82(s,3H).13C NMOL/LR(100MHz,chloroform-d andmethanol-d4)δ180.82,175.33,168.63,155.08,140.53,130.16,130.11,129.62,127.60,127.52,126.82,126.79,121.00,119.39,116.20,112.36,102.70,85.28,77.76,71.07,67.43,56.17,56.00,54.12,49.04,42.73,39.95,39.86,39.03,35.70,35.48,34.80,34.24,33.13,32.01,29.74,29.02,28.65,28.56,27.97,26.29,24.03,23.15,20.63,18.33,17.87,11.61.HRMS(ESI)for C51H65N3O8S[M+H]+,calcd 880.4565,found880.4549。
实施例2人源肝X受体β配体结合域原核表达质粒的构建
将人源肝X受体β(UniProt编号P55055)的配体结合域(氨基酸序列215-461)的DNA编码序列***到pET28a(+)载体，并在该DNA编码序列的N端***六个组氨酸标签，在C端用GSGSGS短序列连接上一段共激活因子SRC2上的一段与核受体结合的序列(氨基酸序列687HKILHRLLQDSSS699)。另外，为了降低蛋白的表面熵和避免蛋白的聚集，促进蛋白的表达，序列中的259QSRDAR264段通过突变替换为259ASGSAS264。由此构建成表达His6-LXRβ-SRC2蛋白的原核表达质粒。***的DNA序列经过测序验证。
表达出的蛋白序列如下：
MGHHHHHHGEGVQLTAAQELMIQQLVAAQLQCNKRSFSDQPKVTPWPLGADPASGSASQQRFAHFTELAIISVQEIVDFAKQVPGFLQLGREDQIALLKASTIEIMLLETARRYNHETECITFLKDFTYSKDDFHRAGLQVEFINPIFEFSRAMRRLGLDDAEYALLIAINIFSADRPNVQEPGRVEALQQPYVEALLSYTRIKRPQDQLRFPRMLMKLVSLRTLSSVHSEQVFALRLQDKKLPPLLSEIWDVHEGSGSGSHKILHRLLQDSSS。
对应的DNA序列为：
ATGGGCGAGGGTGTCCAGCTAACAGCGGCTCAAGAACTAATGATCCAGCAGTTGGTGGCGGCCCAACTGCAGTGCAACAAACGCTCCTTCTCCGACCAGCCCAAAGTCACGCCCTGGCCCCTGGGCGCAGACCCCGCGTCCGGCTCTGCCAGCCAGCAACGCTTTGCCCACTTCACGGAGCTGGCCATCATCTCAGTCCAGGAGATCGTGGACTTCGCTAAGCAAGTGCCTGGTTTCCTGCAGCTGGGCCGGGAGGACCAGATCGCCCTCCTGAAGGCATCCACTATCGAGATCATGCTGCTAGAGACAGCCAGGCGCTACAACCACGAGACAGAGTGTATCACCTTCTTGAAGGACTTCACCTACAGCAAGGACGACTTCCACCGTGCAGGCCTGCAGGTGGAGTTCATCAACCCCATCTTCGAGTTCTCGCGGGCCATGCGGCGGCTGGGCCTGGACGACGCTGAGTACGCCCTGCTCATCGCCATCAACATCTTCTCGGCCGACCGGCCCAACGTGCAGGAGCCGGGCCGCGTGGAGGCGTTGCAGCAGCCCTACGTGGAGGCGCTGCTGTCCTACACGCGCATCAAGAGGCCGCAGGACCAGCTGCGCTTCCCGCGCATGCTCATGAAGCTGGTGAGCCTGCGCACGCTGAGCTCTGTGCACTCGGAGCAGGTCTTCGCCTTGCGGCTCCAGGACAAGAAGCTGCCGCCTCTGCTGTCGGAGATCTGGGACGTCCACGAGGGCAGCGGCAGCGGCAGCCATAAAATTCTCCATAGATTATTACAGGATTCTTCTTCTTAA。
实施例3人源肝X受体β配体结合域的原核表达
将上述的pET28a-LXRβ转入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。用LB培养基对细菌进行培养，37℃下摇床220rpm震荡培养至OD600到达0.6左右后将培养温度降至18℃，加入0.25mmol/L诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，继续培养，18～20小时后，离心法收集菌体。
实施例4人源肝X受体β配体结合域的纯化
将上述收集的菌体用裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.5，400mmol/L NaCl，5％甘油，20mmol/L咪唑，2mmol/Lβ-巯基乙醇)重悬后在冰浴中超声破碎菌体，离心去除细胞碎片等杂质。将离心后的上清液上样至预先平衡好的Ni-NTA亲和层析柱上，然后用20个柱体积的裂解缓冲液清洗杂蛋白，再用含梯度浓度咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白。将各洗脱组分用SDS-PAGE进行检测，浓缩含有目的蛋白的组分，置换为分子筛缓冲液(20mmol/LTris pH8.5，200mmol/L NaCl，5％甘油，5mmol/Lβ-巯基乙醇)。使用HiLoad 16/60Superdex200制备级分子筛对蛋白进行进一步的纯化，收集主峰，浓缩后置于-80℃保存。
实施例5荧光偏振探针的饱和实验
荧光偏振测量采用Victor X5酶标仪(Perkin-Elmer)。使用384孔，黑色圆底，NBS表面，聚苯乙烯材料的微孔板(Corning)进行实验。
饱和实验使用10nmol/L荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸，与0～20μmol/L浓度梯度的LXRβ蛋白混合，稀释用的缓冲液均为50mmol/L Tris，pH 8.0，400mmol/L NaCl，5mmol/Lβ-巯基乙醇。将混合液室温中孵育30分钟，然后用酶标仪进行读数。采用的激发波长和发射波长分别为485nm和535nm。使用Graphpad Prism 6.0软件进行作图，用如下公式拟合曲线，即可计算得出荧光偏振探针与受体的解离常数Kd。
式中，FPread是酶标仪读数的偏振值；FP0为单独的荧光分子、不含受体时的偏振值；FPmax是被LXRβ饱和后的偏振值；[R]是LXRβ蛋白的浓度；[L*]是荧光偏振探针的浓度；Q是荧光偏振探针被受体饱和后的总荧光强度与单独荧光分子的荧光强度的比值。
荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸与LXRβ的饱和曲线如图3所示。其解离常数为92.1±3.8nmol/L。RXRα和RXRβ作为阴性对照，与荧光偏振探针无明显的非特异性结合。
荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸的总荧光强度随LXRβ浓度的变化如图4所示。总荧光强度随LXRβ浓度的变化不大，可取Q值为1。
FITC的荧光偏振值随LXRβ浓度的变化如图5所示。偏振值随LXRβ浓度变化不大，说明FITC在测试条件下与LXRβ无明显的非特异性结合。
荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸与LXRβ-A275I突变体的饱和曲线如图6所示，A275的位置在LXRβ配体结合口袋中间。将A275突变为I，能够使得荧光偏振探针进入口袋受阻。结合曲线的右移证明了这一点。进一步证明了荧光偏振探针与LXRβ的特异性结合。
实施例6荧光偏振探针的竞争实验
本实施例采用的实验材料与仪器同实施例5。
实验使用10nmol/L荧光偏振探针FITC-猪去氧胆酸，与400nmol/L LXRβ蛋白，相应浓度梯度的待测试化合物混合，稀释用的缓冲液均为50mmol/L Tris，pH 8.0，400mmol/LNaCl，5mmol/Lβ-巯基乙醇。将混合液室温中孵育30分钟，然后用酶标仪进行读数。采用的激发波长和发射波长分别为485nm和535nm。使用Graphpad Prism 6.0软件进行作图，用如下公式拟合曲线，即可计算得出待测化合物与LXRβ结合的Ki。
其中，
a＝Kd+Ki+[L*]+[L]-[R]
b＝Kd([L]-[R])+Ki([L*]-[R])+KdKi
c＝-KdKi[R]
[L]为待测化合物的浓度；Kd是前面饱和实验中得出的荧光偏振探针分子与LXRβ结合的解离常数；Ki为待测化合物的解离常数；其他参数同实施例5。
常见LXR阳性化合物的测试结果如表1，竞争曲线如图7。
表1荧光偏振所测得的Ki与报道值(同位素竞争法)的比较
实施例7二甲基亚砜(DMSO)耐受实验
在不同DMSO浓度下，测定400nmol/L LXRβ与10nmol/L荧光偏振探针结合的偏振值。结果如图8所示。高至5％的DMSO对偏振值的测试影响不大。
实施例8 Z’因子的测定
在一块384孔板上，50μL含有400nmol/L LXRβ和10nmol/L的荧光偏振探针的混合液加入终浓度为10μmol/L GW3965作为阳性对照，不含GW3965的作为阴性对照。阳性对照的孔和阴性对照的孔均为192个，测定偏振值，按如下公式进行计算。
式中μ+和μ-分别代表阳性和阴性对照的平均偏振值，SD+和SD-分别是阳性对照和阴性对照的标准偏差。测试结果如图9所示。实验所得的阳性对照的荧光偏振值为166±6mP，阴性对照荧光偏振值为311±8mP，计算所得Z’因子为0.71，证明本实验的测试方法可靠，可用于化合物的筛选。
实施例9基于荧光偏振技术的片段筛选
片段筛选在384孔板中进行，采用的实验材料与仪器同实施例5。筛选采用的片段库应该首先剔除在检测波长下有吸收的化合物，避免假阳性结果。筛选采用50μL体系，包含10nmol/L荧光偏振探针分子，400nmol/L LXRβ蛋白和1mmol/L的各片段。相比阳性化合物(10μmol/L GW3965)，可以使荧光偏振值降低≥25％(4倍阳性化合物的标准偏差)检测窗的片段可被认为是可以与LXRβ结合的片段。图10和表2为对1074个片段进行片段筛选的结果。其中20个与LXRβ有结合的片段F1-F20如下：
表2 20个筛选所得片段的Ki值
a.Ki值由本发明提供的荧光偏正竞争方法所测得。
b.EC50指的是共激活因子招募实验所测得的结果。
c.指的是共激活因子招募实验中与GW3965相比能达到的最大效价。
其中筛选得到的片段叔丁基7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸酯(F3)的的竞争曲线如图11所示。
实施例10共激活因子招募实验
共激活因子招募实验采用荧光偏振的方法进行。混合1μmol/LXRβ-LBD，0.1μmol/L荧光标记的共激活因子多肽片段D22(Thermo Fisher)和待测化合物。激发波长和发射波长分别为485nm和535nm。用酶标仪读取荧光偏振值。
实施例11人源肝X受体β配体结合域的结晶
终浓度为2mmol/L的片段与终浓度为10mg/mL肝X受体β配体结合域混合，4℃孵育过夜后离心去除沉淀。采用坐滴气相扩散法生长人源肝X受体β配体结合域的晶体，结晶条件为100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，22％PEG3350。
衍射数据采集在上海同步辐射光源(SSRF)BL19U1工作站进行。衍射数据采用XDS软件进行数据处理。利用Phaser程序，以人源肝X受体β配体结合域结构(PDB编号：5HJP)为模板，通过分子置换解析衍射相位。利用Coot程序，根据电子密度图，手动进行实空间修正和完善蛋白质结构模型；并利用Refmac5程序，在倒易空间对结构模型进行自动修正。实空间与倒易空间交替进行结构修正，直至结构模型达到较高质量。结构修正末期，在Coot程序中添加片段叔丁基7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸酯，并进一步通过refmac5进行修正。结合模式如图12所示。
以上所述是本发明的特定示例实施方式，对于本领域的技术人员，在不脱离本发明的原理下，还可以做出若干的改进与修辞。事实上，本发明的范围由所附的权利要求及其等效限定。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种化合物及其制备方法和作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 蛋白质序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Met Gly His His His His His His Gly Glu Gly Val Gln Leu Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Glu Leu Met Ile Gln Gln Leu Val Ala Ala Gln Leu Gln Cys
20 25 30
Asn Lys Arg Ser Phe Ser Asp Gln Pro Lys Val Thr Pro Trp Pro Leu
35 40 45
Gly Ala Asp Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gln Gln Arg Phe Ala His
50 55 60
Phe Thr Glu Leu Ala Ile Ile Ser Val Gln Glu Ile Val Asp Phe Ala
65 70 75 80
Lys Gln Val Pro Gly Phe Leu Gln Leu Gly Arg Glu Asp Gln Ile Ala
85 90 95
Leu Leu Lys Ala Ser Thr Ile Glu Ile Met Leu Leu Glu Thr Ala Arg
100 105 110
Arg Tyr Asn His Glu Thr Glu Cys Ile Thr Phe Leu Lys Asp Phe Thr
115 120 125
Tyr Ser Lys Asp Asp Phe His Arg Ala Gly Leu Gln Val Glu Phe Ile
130 135 140
Asn Pro Ile Phe Glu Phe Ser Arg Ala Met Arg Arg Leu Gly Leu Asp
145 150 155 160
Asp Ala Glu Tyr Ala Leu Leu Ile Ala Ile Asn Ile Phe Ser Ala Asp
165 170 175
Arg Pro Asn Val Gln Glu Pro Gly Arg Val Glu Ala Leu Gln Gln Pro
180 185 190
Tyr Val Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Arg Ile Lys Arg Pro Gln Asp
195 200 205
Gln Leu Arg Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Leu Val Ser Leu Arg Thr
210 215 220
Leu Ser Ser Val His Ser Glu Gln Val Phe Ala Leu Arg Leu Gln Asp
225 230 235 240
Lys Lys Leu Pro Pro Leu Leu Ser Glu Ile Trp Asp Val His Glu Gly
245 250 255
Ser Gly Ser Gly Ser His Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Asp Ser
260 265 270
Ser Ser
<210> 3
<211> 804
<212> DNA
<213> DNA序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
atgggcgagg gtgtccagct aacagcggct caagaactaa tgatccagca gttggtggcg 60
gcccaactgc agtgcaacaa acgctccttc tccgaccagc ccaaagtcac gccctggccc 120
ctgggcgcag accccgcgtc cggctctgcc agccagcaac gctttgccca cttcacggag 180
ctggccatca tctcagtcca ggagatcgtg gacttcgcta agcaagtgcc tggtttcctg 240
cagctgggcc gggaggacca gatcgccctc ctgaaggcat ccactatcga gatcatgctg 300
ctagagacag ccaggcgcta caaccacgag acagagtgta tcaccttctt gaaggacttc 360
acctacagca aggacgactt ccaccgtgca ggcctgcagg tggagttcat caaccccatc 420
ttcgagttct cgcgggccat gcggcggctg ggcctggacg acgctgagta cgccctgctc 480
atcgccatca acatcttctc ggccgaccgg cccaacgtgc aggagccggg ccgcgtggag 540
gcgttgcagc agccctacgt ggaggcgctg ctgtcctaca cgcgcatcaa gaggccgcag 600
gaccagctgc gcttcccgcg catgctcatg aagctggtga gcctgcgcac gctgagctct 660
gtgcactcgg agcaggtctt cgccttgcgg ctccaggaca agaagctgcc gcctctgctg 720
tcggagatct gggacgtcca cgagggcagc ggcagcggca gccataaaat tctccataga 780
ttattacagg attcttcttc ttaa 804

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于，结构式如式(Ⅰ)所示：
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：猪去氧胆酸和叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯进行酰胺反应后得中间体1a；
S2：将中间体1a进行脱保护，与异硫氰酸荧光素FITC于50～60℃下进行亲核加成反应即得所述化合物。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S1中酰胺反应选用的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺DMF、四氢呋喃THF或乙腈中的一种或几种；S1中酰胺反应选用的缩合剂为PyBoc、HOAT、HOBT、HBTU或BOP中的一种或几种；S1中酰胺反应选用的碱为N，N-二异丙基乙胺DIPEA或三乙胺中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S1中所述猪去氧胆酸和叔丁基(6-氨基己基)氨基甲酸酯的摩尔比为1:1～1:2。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S2中脱保护反应选用的酸为HCl、醋酸或三氟乙酸中的一种或几种；S2中脱保护反应的有机溶剂为1，4-二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺DMF或四氢呋喃THF中的一种或几种；S2中亲核加成反应选用的有机溶剂为1，4-二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺DMF或四氢呋喃THF中的一种或几种，S2中亲核加成反应选用的碱为DIPEA或三乙胺中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，S2中所述中间体1a和异硫氰酸荧光素的摩尔比为1:1～1:2。
7.权利要求1所述化合物作为荧光偏振探针在LXRβ配体筛选中的应用。
8.一种LXRβ配体筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S3：将权利要求1所述化合物、包含LXRβ配体结合域的蛋白和待测化合物混合得混合物；
S4：利用荧光偏振技术测定混合物的偏振值，根据偏振值确认待测化合物是否为LXRβ的配体。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，S3中所述LXRβ配体结合域的蛋白序列为：MGHHHHHHGEGVQLTAAQELMIQQLVAAQLQCNKRSFSDQPKVTPWPLGADPASGSASQQRFAHFTELAIISVQEIVDFAKQVPGFLQLGREDQIALLKASTIEIMLLETARRYNHETECITFLKDFTYSKDDFHRAGLQVEFINPIFEFSRAMRRLGLDDAEYALLIAINIFSADRPNVQEPGRVEALQQPYVEALLSYTRIKRPQDQLRFPRMLMKLVSLRTLSSVHSEQVFALRLQDKKLPPLLSEIWDVHEGSGSGSHKILHRLLQDSSS。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，S4中所述LXRβ的配体为F1～F20及含有F1～F20任意一种或几种片段的活性分子中的一种或几种。
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