CN1735431B - 作为免疫调节物的全细菌细胞 - Google Patents
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Abstract
一种免疫调节剂组合物和/或药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其中所使用的免疫调节剂组合物调节细胞免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及免疫调节剂,尤其是调节细胞免疫应答的疫苗及其应用。
背景技术
疫苗和其它免疫调节剂具有的主要作用是减少疾病的发病率和死亡率。目前大多数疫苗引发的初始免疫似乎是由体液免疫应答所介导的。对于需要细胞免疫应答的疾病来说,如肺结核和利什曼病,目前还没有一致有效的可用疫苗。
典型地,要向疫苗中加入佐剂。佐剂的作用是增强机体对疫苗特定抗原的免疫应答。通常使用的佐剂一般产生体液免疫应答,而不产生细胞介导的免疫应答。另外,例如,铝佐剂可能产生负作用,如无菌性脓肿,红斑,肿块,皮下结节,肉芽肿炎症和接触性超敏反应。
需要找到疫苗或其它免疫调节剂以改变细胞免疫应答并尤其要改变T辅助细胞应答,如T辅助细胞1(Th1)和T辅助细胞2(Th2)应答。
发明简述
从出生到死亡,免疫***通过接触环境被培养,其不断被刺激并被调控。当代的都市化以及预防传染病的公共卫生策略事实上减少了这种暴露,导致空前的疾病增长,如过敏和肿瘤疾病。通过使用无害、有益的环境细菌的灭活的悬液来恢复有益的环境影响可以恢复免疫***的正常平衡,从而在治疗疾病和/或促进健康的免疫***中起到治疗和/或预防作用。
因此,由于惊人的发现从而导致出现了本发明,即将选自放线菌属的红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌之任一的完整细菌细胞给药给受试者,则能够产生调节免疫***的作用,尤其是受试者的细胞免疫***。
在此所用的术语“细胞免疫***”包括细胞介导的免疫应答,该应答依赖于T淋巴细胞的存在。术语“T淋巴细胞”包括细胞毒性T淋巴细胞,辅助T细胞,抑制性T细胞和调节性T细胞。例如,可以用调节细胞介导的免疫应答来克服细胞介导的免疫失调,包括如免疫***失衡、免疫超敏反应。
在此所用的术语“调整”、“调节”、“调节”及其其它的派生词指的是下调、抑制、诱导、刺激、上调、改变或其它影响细胞免疫***的一个或多个成分。
发明详述
在一个方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物,其包含选自红球菌属(Rhodococcus),戈登氏菌属(Gordonia),诺卡氏菌属(Nocardia),迪茨氏菌属(Dietzia),冢村氏菌属(Tsukamurella)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)的完整细菌细胞。
在此所用的术语″免疫调节剂″指一种调节受试者细胞免疫***的物质。
在此所用的术语″完整细胞″指一种完整的或基本上完整的细菌.特别地,在此所用的术语″完整的″指一种细菌,其包含完整细胞,尤其是完整活细胞中存在的所有成分,和/或指一种细菌,其还没有被特别处理过以从其中去除一个或多个成分.在此所用的术语“基本上完整的”指,尽管在获得细菌时使用的分离和/或纯化过程可能导致诸如细胞的轻微改变和/或去除一个或多个细胞成分,但是这种改变和/或去除发生的程度并不显著.特别地,根据本发明所述的基本上完整的细胞还没有被特别处理过以从其中去除一个或多个成分.
尽管已有提示,即细菌细胞的单个成分能用于引发佐剂作用,但是在本发明之前,使用选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞来调节细胞免疫应答还没有被预见到。令人惊讶的,发现利用选自所述属的完整细菌细胞能够实现对细胞免疫***的调节。相较于通过给药细菌单一成分引发的应答,通过给药所述细菌的所述完整细胞而引起的细胞免疫应答的调节作用具有长期持续的优点。
优选地,根据本发明所述的组合物包含一种以上的完整细胞,更优选包含多种完整细胞。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,所用的免疫调节剂组合物调节细胞免疫应答。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物,其包含一种抗原和一种佐剂,其中所述佐剂包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
在另一方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞并任选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂,所用的免疫调节剂调节细胞免疫应答。
本发明还进一步提供了一种制备本发明药物组合物的方法,所述方法包括将一种或多种本发明化合物与药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合在一起。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物和/或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,以及至少一种抗原或抗原决定簇。
相适应地,所述抗原或抗原决定簇可以是选自以下一种或多种的抗原或抗原决定簇:BCG(卡介苗)疫苗,白喉类毒素疫苗,白喉/破伤风/百日咳(DTP或三联)疫苗,百日咳疫苗,破伤风类毒素疫苗,麻疹疫苗,腮腺炎疫苗,风疹疫苗,OPV(口服脊髓灰质炎疫苗),母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae),或其部分(如GB0025694.1所教导的)和疟原虫属抗原,例如疟疾寄生虫抗原。
相适应地,免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以包含两种或多种所述抗原或抗原决定簇。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物,其包含抗原或抗原决定簇和佐剂,其中所述抗原或抗原决定簇包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
当完整细菌细胞起着抗原或抗原决定簇功能的情况下,组合物可以适宜地进一步包含至少一种,优选至少两种,更优选至少三种抗原或抗原决定簇。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,所述药物治疗或预防感染(如细菌性的、病毒性的,例如由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常,或寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病)和/或伴随感染的免疫异常、应激(stress)(例如较大外伤的应激(major trauma stress)、社会心理应激(psychosocial stress)和长期的应激(chronic stress))、过敏(如包括过敏性哮喘的哮喘、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓(midge),比如库蠓(Culicoides)(其造成马的甜搔痒(Sweet Itch)))、马肺气肿病(heaves)、COPD和癌(例如黑素瘤或腺癌)、免疫***失衡(如儿童和老人的免疫***失衡)以及手术后应激和感染中的一种或多种。老人的免疫***失衡可称为免疫衰老(immunosenescence)。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防一种或多种病毒感染的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,所述病毒感染例如由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常。在一个方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物和/或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,和至少一种抗原或抗原决定簇,其中所述抗原或抗原决定簇是牛***瘤病毒的病毒抗原。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防一种或多种寄生虫感染的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,所述寄生虫感染例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防应激的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,所述应激例如,较大外伤的应激、社会心理应激和/或长期的应激。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防哮喘(包括过敏性哮喘)、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤)、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))中一种或多种疾病的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。优选地,包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞的免疫调节剂组合物或药物组合物用于制备治疗或预防包括过敏性哮喘的哮喘和虫(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))咬引起的过敏的药物。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防马肺气肿病和/或COPD(尤其是马的)中一种或多种疾病的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞.
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防黑素瘤和/或腺癌的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防老人的免疫***失衡的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。典型地,根据本发明该方面的免疫调节剂组合物或药物组合物可以是免疫增强剂。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备增强免疫***的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,所述免疫***的增强导致诸如生长增强或饲料利用效率增加。典型地,根据本发明该方面的免疫调节剂组合物或药物组合物可以是免疫增强剂。优势是,本发明的免疫调节剂组合物或药物组合物可用于替代抗生素,所述抗生素目前用于促进牲畜(livestock)生长。相适应地,本发明的免疫调节剂组合物可以单独使用或与其它治疗联用。在此所用的术语“牲畜”指任何畜牧的动物。优选地,牲畜是家禽、猪(包括小猪)、羊(包括羊羔)、母牛或公牛(包括小牛)中的一种或多种。更优选地,牲畜指猪,包括小猪。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防手术后应激或手术后感染的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防儿童的免疫***失衡的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备治疗或预防儿童期疫苗(如百日咳疫苗接种和目前的MMR疫苗接种)不良反应(adverse reaction)和/或其后遗症(consequences)的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。在此所用的术语“不良反应”指局部或全身性的不利应答,该应答由疫苗或疫苗的给药造成或激发,所述应答典型地发生在短时间内,但其能被推迟(例如6个月)。“不良反应”可包括儿童的死亡。“不良反应”可由分开事件的结果造成,对其的应答由疫苗或疫苗的给药负向激发。
本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物在制备调节细胞免疫应答的药物中的应用,所述免疫调节剂组合物或药物组合物包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
在另一方面,本发明进一步提供了用作药物的一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
在另一方面,本发明进一步提供了用于疫苗或用作疫苗的一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
相适宜地,疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗。
在另一方面,本发明进一步提供了用作免疫增强剂的一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
在另一方面,本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防如下病症中的一种或多种:感染(如细菌性的、病毒性的,例如由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常,或寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病)和/或伴随感染的免疫异常、应激(例如较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激)、过敏(如包括过敏性哮喘的哮喘、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))、马肺气肿病、COPD和癌(例如黑素瘤或腺癌,或病毒相关癌症,如***)、免疫***失衡(如儿童和老人的免疫***失衡)以及手术后应激和手术后感染。
在另一方面,本发明进一步提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病中的一种或多种。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防病毒感染,例如由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防应激,例如,较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激中的一种或多种。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防哮喘(包括过敏性哮喘)、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤)、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))中的一种或多种。优选地,免疫调节剂组合物或药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,用于治疗或预防哮喘,包括如过敏性哮喘和虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防马肺气肿病和/或COPD(尤其是马的)中的一种或多种.
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防癌(例如黑素瘤和/或腺癌,和/或病毒相关癌症,如***)。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防免疫***失衡,尤其是老人的免疫衰老。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防手术后应激和感染。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于增强免疫***,该免疫***的增强可导致诸如生长增强或饲料利用效率增加,如在牲畜中。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防儿童的免疫***失衡。
在另一方面,本发明提供了一种免疫调节剂组合物或一种药物组合物,其包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,其用于治疗或预防儿童期疫苗(如百日咳疫苗接种和当前MMR疫苗接种)的不良反应和/或其后遗症。
在另一方面,本发明提供了一种选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞在疫苗或药物中的应用,其中所述细菌的所述完整细胞调节细胞免疫应答。
在一个方面,根据本发明所述的完整细菌细胞可以下调Th2应答。
在另一方面,根据本发明所述的完整细菌细胞可以上调Th1应答。
相适宜地,根据本发明所述的完整细菌细胞可以下调Th2应答并上调Th1应答。
可选地,根据本发明所述的完整细菌细胞可以上调Th1应答而并不影响Th2应答。
可选地,根据本发明所述的完整细菌细胞可以下调Th2应答,而也下调Th1应答。
可选地,根据本发明所述的完整细菌细胞可以上调Th2应答,而也上调Th1应答。
仅作为示例,以下生物之任何一种或多种可以增强Th1应答而不改变Th2应答:赤红球菌(Rhodococcus rubber),紫红红球菌(Rhodococcusrhodocrous,Rhodococcus rhodococcus),海洋迪茨氏菌(Dietzia maris)和土生戈登氏菌(Gordonia terrae)。
仅作为示例,以下生物之任何一种或多种可以增强Th1应答,或不改变Th1应答,并且下调Th2应答:支气管戈登氏菌,Tsukamurella inchonensis,沟戈登氏菌(Gordonia amarae)和星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)。
仅作为示例,嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)可以既下调Th1又下调Th2应答,相称地,嗜粪红球菌可以强烈下调Th1和Th2应答。
在另一方面,本发明提供了一种治疗或预防患者病状的方法,包括向患者给药有效量的药物组合物和/或免疫调节剂组合物,其中所述组合物调节细胞免疫应答.
相适宜地,有效量的药物组合物和/或免疫调节剂组合物可以单剂量(single dose)给药。可选地,有效量的药物组合物和/或免疫调节剂组合物可以多(重复)剂量给药,例如二或多剂,三或多剂,四或多剂,五或多剂,十或多剂,二十或多剂的重复剂量。
在本发明的另一方面,提供了一种包括免疫的保护个体的方法,包括给药根据本发明所述的药物组合物和/或免疫调节剂组合物。
优选地,保护个体,如免疫个体,使之抗御以下一种或多种病状:感染(如细菌性的、病毒性的,例如由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常,或寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病)和/或伴随感染的免疫异常、应激(例如较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激)、过敏(如包括过敏性哮喘的哮喘、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))、马肺气肿病、COPD和癌(例如黑素瘤或腺癌,或病毒相关癌症,如***)、免疫***失衡(如儿童和老人的免疫***失衡)以及手术后应激和手术后感染。
优选地,免疫个体使之抗疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病中的一种或多种。
优选地,免疫个体使之抗病毒感染,例如抗由***瘤病毒造成的感染,包括抗马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常。
优选地,保护个体使之抗应激,例如,较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激中的一种或多种。
优选地,保护(包括免疫)个体使之抗哮喘(包括过敏性哮喘)、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))中的一种或多种。更优选地,免疫个体使之抗哮喘(如包括过敏性哮喘)、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))
优选地,保护(包括免疫)个体使之抗COPD和/或马肺气肿病中的一种或多种,尤其其中所述个体是马。
优选地,保护(包括免疫)个体使之抗手术后应激和感染。
优选地,保护个体使之抗癌症的发生和/或发展,例如黑素瘤和/或腺癌和/或病毒相关癌症,如***。
优选地,保护(包括免疫)个体使之抗老人的免疫***失衡。特别地,根据本发明所述的组合物可用于调节个体的免疫***。
优选地,保护(包括免疫)个体使之抗儿童的免疫***失衡。特别地,根据本发明所述的组合物可用于调节患者的免疫***,尤其是儿童的免疫***。
优选地,保护(包括免疫)个体使之抗儿童期疫苗的不良反应和/或其后遗症。特别地,在进行儿童期疫苗给药之前和/或期间和/或之后,来调节个体的免疫***,尤其是儿童的免疫***。
在此所用的术语“保护”指的是相较于没有用本发明的组合物治疗或给药过的患者,该患者不易受疾病/失调影响,和/或相较于没有用本发明的组合物治疗或给药过的患者,该患者更能够抗御或克服疾病/失调。
在另一方面,本发明提供了向患者给药有效量的根据本发明所述的药物组合物和/或免疫调节剂组合物,其中所述组合物和抗原或抗原决定簇联合给药。
根据本发明,当所述组合物和抗原或抗原决定簇联合给药时,抗原或抗原决定簇可以相适应地选自以下一种或多种的抗原或抗原决定簇:BCG(卡介苗)疫苗,白喉类毒素疫苗,白喉/破伤风/百日咳(DTP或三联)疫苗,百日咳疫苗,破伤风类毒素疫苗,麻疹疫苗,腮腺炎疫苗,风疹疫苗,OPV(口服脊髓灰质炎疫苗),母牛分枝杆菌,或其部分(如GB0025694.1所教导的)和疟原虫属抗原,例如疟疾寄生虫抗原。相适应地,两种或多种、或三种或多种所述抗原或抗原决定簇可以和根据本发明所述的药物组合物或免疫调节剂组合物联合给药。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防感染(如细菌性的、病毒性的,例如由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常,或寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病)和/或伴随感染的免疫异常、应激(例如较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激)、过敏(如包括过敏性哮喘的哮喘、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))、马肺气肿病、COPD和癌(例如黑素瘤或腺癌,或病毒相关癌症,如***)、免疫***失衡(如儿童和老人的免疫***失衡)以及手术后应激和手术后感染中的一种或多种。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病中的一种或多种。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防病毒感染,例如抗由***瘤病毒造成的感染,包括抗马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防应激,例如,较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防哮喘(包括过敏性哮喘)、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))中的一种或多种。更优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防哮喘(如包括过敏性哮喘)、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防COPD和/或马肺气肿病中的一种或多种。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防癌症(例如黑素瘤和/或腺癌和/或病毒相关癌症,如***)。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防老人的免疫***失衡。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防手术后应激和感染。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防儿童的免疫***失衡。
优选地,根据本发明所述的药物用于治疗或预防儿童期疫苗的不良反应和/或其后果。
在本发明的另一方面,根据本发明所述的药物组合物或免疫调节剂包含选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属中一种以上的细菌.适宜地,组合物可以包含两种或多种,或三种或多种细菌,该细菌选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属中任一细菌.
优选地,本发明所用的细菌选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属,包括这些属中任意属的任意菌种,如支气管戈登氏菌(Gordonia bronchialis),沟戈登氏菌(G.amarae),痰戈登氏菌(G.sputti),土生戈登氏菌(G.terrae),星状诺卡氏菌(Nocardiaasteroides),海洋迪茨氏菌,微代谢冢村氏菌(Tsukamurella paurometabola),赤红球菌(Rhodococcus ruber),椿象红球菌(Rhodococcas rhodnii),嗜粪红球菌(R.copropholis),白色类诺卡氏菌(Nocardioides albus)和Tsukamurellainchonensis。适宜地,每个特定属中所选用的菌种为能够在培养基上生长的菌种,该培养基为低(优选无)抗原的培养基。仅作为示例,合适的无抗原培养基为Sauton氏培养基(Sauton’s medium)。
更优选地,本发明所用的细菌选自红球菌属,包括赤红球菌(以前称Nocardia rubra),紫红红球菌(Rhodococcus rhodocrous),椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii),嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus),混浊红球菌(Rhodococcus opacus),红串红球菌(Rhodococcus erythopolis)。
更优选地,本发明所用的细菌是赤红球菌。
仅作为示例,支气管戈登氏菌,赤红球菌,紫红红球菌,椿象红球菌,海洋迪茨氏菌和土生戈登氏菌中的一种或多种可以有效地治疗和/或预防寄生虫感染。
仅作为示例,生物Tsukamurella inchonensis,沟戈登氏菌和星状诺卡氏菌中的一种或多种可以特别有效地治疗和/或预防过敏,如虫(例如,蠓)咬引起的过敏,和/或治疗和/或预防癌症,包括皮肤肿瘤,如马类肉瘤(Equinesarcoid)。
仅作为示例,嗜粪红球菌可以特别有效地调节感染,尤其是寄生虫感染,和/或增强牲畜的生长。
优选地,本发明所述的细菌在使用前灭活。优选地,本发明所述的细菌通过热处理灭活,例如,在高压灭菌锅中于121℃热处理15分钟。其它合适的灭活细菌的处理方式包括紫外线或电离辐射或用化学品处理,如苯酚,酒精或***。
优选地,本发明所述的细菌经纯化和/或分离。
优选地,本发明所述的细菌悬浮于水或缓冲的盐水中,合适的是pH 8的硼酸盐缓冲液。
在此所用的术语“患者(个体,受试者)”指动物。优选地,患者是哺乳动物,包括如牲畜或人。在本发明的一些方面,患者适宜为人。
在此所用的术语“免疫调节剂”包括疫苗。
治疗用途
本发明的免疫调节剂可用于治疗。特别地,这种化合物可用于调整体内T淋巴细胞的应答和/或涉及体内免疫应答的其它细胞。
免疫调节剂/药物组合物能够调节,特别是能阻断T细胞增殖和/或分化和/或活性,该免疫调节剂/药物组合物可用于抗任何失调,该失调易于通过调整获得性免疫应答(adaptive immune response),如细胞免疫应答,来防止或治疗。
适宜地,根据本发明所述的组合物用于调整细胞免疫应答从而治疗或预防如下病症中的一种或多种:感染(如细菌性感染,如二甲氧苯青霉素(methycillin)抗性的金黄色葡萄球菌的感染,结核病,包括多种药物抗性的结核病和麻疯病;慢性病毒感染,例如肝炎,HIV和由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常;潜伏的病毒感染,例如带状疱疹(带状疱疹病毒所致)或唇疱疹(cold cores)(单纯疱疹病毒所致);或寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病);过敏(如过敏性皮炎或过敏性哮喘);应激(例如较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激);和癌(例如,组合物可以在成人期有规律地给药以克服烟草的影响)。
更多的病症由WO-A-98/09985列出。为了便于参考,现在提供该列表的部分内容:超敏反应相关的炎症,过敏反应,哮喘,口疮溃疡(aphthusulceration)相关的炎症,溃疡性结肠炎,肝纤维化,肝硬化或其它肝病,皮炎,特别是特应性皮炎(如湿疹),牙周疾病或其它牙齿疾病,用以治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病,如白血病,其它癌症。
传染病
能调节,特别是能刺激(如,诱导或增强)T细胞增殖和/或分化的组合物,或能防止诱发T细胞无反应性或能逆转T细胞无反应性的组合物,一般可应用于增强或诱导T细胞免疫应答。事实上所有获得性免疫应答需要T细胞的活化和其分化成产生细胞因子的细胞。因此,这些组合物一般可应用于预防和/或治疗传染病(infectious diseases),如病毒性的或细菌性的。适宜地,这些组合物可用于预防和治疗寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病。适宜地,这些组合物可用于预防和治疗病毒感染,例如由***瘤病毒造成的感染,包括马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常。
在本发明的一个方面,感染优选为锥虫病。
在本发明的另一方面,感染优选为由***瘤病毒造成的感染,尤其是牛***瘤病毒1和2。在本发明的另一方面,感染优选为马类肉瘤、生殖器疣和***前的子宫颈发育异常中的一种或多种。
马类肉瘤
本发明的组合物也可应用于预防和治疗马类肉瘤
马类肉瘤是马最常见的皮肤肿瘤,其与牛***瘤病毒1和2的感染相关(Chambers等J.Gen.Virol.2003:84:1055-1062)。尽管外科手术、非特异性免疫治疗和细胞毒性药物都有一些效果,但目前该病症还没有有效的治疗方法。
本发明的组合物优选在与损伤或肿瘤相同的***流经区域给药。
过敏
本发明的组合物也可应用于预防和治疗过敏(如包括过敏性哮喘的哮喘、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒))。
甜搔痒(Sweet Itch)是马最常见的皮肤病之一,尤其在野马和/或小马中。英国约3%的马在一定程度上受此影响。多数马在1岁至4岁之间显示出症状,而且该病症一般在夏天恶化。某些品种尤其易患该病。夏尔重挽马(shires)、Hackneys、威尔士(Welsh)和冰岛的小马(Ice landic ponies)被认为是易感的品种.甜搔痒由对小库蠓叮咬的超敏反应而造成的.在英国,这种飞蝇在4月至10月存在,而在5月至9月达到数量的峰值.这种飞蝇叮咬马的特定位点,一般在尾头周围和鬣毛下面.在英国存在有20种库蠓,一些供养在马的腹部下面.
仅作为示例,本发明的组合物也可通过用本发明的组合物向患者给药而应用于预防和/或治疗过敏性休克,所述患者具有遭受过敏性休克的易感体质(如患者已知具有过敏症,如对花生过敏),从而减少患者过敏性休克的易感倾向,过敏性休克发生在他们(偶然)接触能导致不良反应的抗原,如花生。
马肺气肿病/COPD
本发明的组合物也可应用于预防和治疗马肺气肿病和/或COPD(慢性阻塞性肺病)。
马肺气肿病是一种肺病,与人的哮喘和COPD相似。临床症状由已经一定程度纤维化损伤的肺部中的过敏反应引发,该过敏反应针对干草尘埃中的颗粒。这在冬季不活跃的老马(大于6岁)中最为常见。干草包含微生物,如细菌和真菌以及饲料谷物、植物、粪便、皮削和花粉的小颗粒。这些小颗粒在干草尘埃中成烟雾状散开并在患马肺气肿病的马吸入时引发过敏反应和纤维化。据信涉及马肺气肿病的病因的主要微生物是烟曲霉(Aspergillusfumigatus),普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)和直枝干草菌(Faenia rectivirgula)。减少哮喘的支气管痉挛和COPD的纤维化也都包含在本专利的范围之内。
应激
应激常作为现代生活、高压力的行为生活方式的征兆而出现,其结果被广泛认为会导致主要的病理状态,如胃溃疡、高血压、心脏疾病和中风。其它生活中的主要应激事件,如离婚、丧亡和搬家也被视作心脏疾病的高风险因素。
这些并不是误解,农业界非常知道由于牲畜面对较大应激(majorstress)(如过于拥挤、分娩、运输)而带来的经济损失,这会导致增加对感染的易感性和潜在病理倾向。医生和科学家的研究正逐步增加公开的成果数量,这些成果显示诸如分娩等的可定义的应激能导致内分泌(激素)活性的显著改变,其最终能影响身体的免疫功能。在较大外伤的应激(包括外科手术应激)中,这能被显著地论证,其中细胞介导的免疫应答被戏剧性地关闭了(dramatically paralysed)(参见Faist(1996))。
Elenkov IJ(1999)报道近来的证据显示糖皮质激素和儿茶酚胺,应激***的末端产物,和组胺,活化的肥大细胞的产物,可能选择性地抑制细胞免疫和促进体液免疫应答。其由各种应激激素和组胺对Th1/Th2模式和1型/2型细胞因子的产生的不同影响介导。因此,***地来看,应激可诱导Th2转变,而局部地、在某些情况下,它可通过外周促肾上腺皮质激素-释放因子-肥大细胞-组胺轴的神经活化来诱导产生炎症前活性(pro-inflammatoryactivities)。Paik(2000)和Kay(2001)在各自独立的学术应激的研究中,调查了在非考试和考试期间学生的免疫学状况。他们报道IL-2和γ-干扰素的产量显著地减少,而IL-6增加了。这表明身体的免疫***通过下调Th-I细胞因子并选择性地上调Th2细胞因子来对应激事件做出了应答。
利用约束应激(restraint stress)的小鼠模型,Iwakabe(1998)报道了免疫应答朝向Th2占优势的免疫(Th2 dominant immunity)的免疫应答滞后。
也有报道在非较大的、长期的应激状况下,如在澳大利亚国家南极研究考察站越冬的员工中的社会心理应激,(Mehta(2000)),该应激激素可诱导转向Th2免疫失衡.他们还报道潜伏病毒的重新活动(reactivation)也相应增加了.
从痴呆病人的护理人员(Bauer(2000))和Euromir 95 mission的宇航员(Norbiato(1998))的长期的应激中也报道了相似的应激激素和免疫变化。宇航员增加了对感染的易感性尤其值得关注。
身体本来就能从应激中恢复,并且剧烈的应激显然也是,就像感染的风险会随着病人从主要损伤中恢复过来而降低。
可是长期的应激似乎会持续Th2为主的免疫的失衡。这是很严重的结果,因为被引述的作者们都提到通过以上机制带来的应激可能影响感染、炎症、过敏和肿瘤疾病的发生和/或进程。
Lawrence(2000)进一步支持了该结果。
本发明所述的免疫调节剂,优选为口服免疫调节剂,其刺激Th1应答并下调Th2,该免疫调节剂可以恢复免疫***的健康平衡并因此减少与长期的应激相关的严重疾病的风险。
优选地,本发明所述的组合物用于治疗和/或预防应激,特别是较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激。
优选地,本发明所述的组合物用于治疗和/或预防动物的应激,适宜治疗和/或预防人和/或牲畜的。
免疫***失衡
免疫***失衡,如上调、下调或不合适地调节细胞免疫应答,可以在患者生命中的任何时间出现。适宜地,该组合物可用于调节免疫***失衡。也就是说,本发明所述的组合物用于治疗和/或预防免疫***失衡。
(a)儿童中
适宜地,免疫调节剂组合物或药物组合物可用于在儿童中调节免疫***失衡,包括在婴儿、幼儿和青少年中。免疫***失衡,如上调、下调或不合适地调节细胞免疫应答,可以在免疫接种后的儿童中出现,如在儿童期免疫接种后。该免疫***失衡可以造成的病症如产生过敏,如过敏性皮炎和过敏性哮喘。
为了防止儿童感染,重复注射从而使其抗白喉,破伤风,百日咳,脊髓灰质炎,麻疹,腮腺炎和风疹。所有这些注射都被认为是必要的,健康管理部门承担着应激要保证儿童在适当时间进行免疫接种。可是,大多数在生命早期进行的免疫接种包含了明矾佐剂,该佐剂有着重要的免疫学效果。明矾是Th2模式应答的强有力的刺激物并且随之产生的免疫失调造成儿童变得易受诸如过敏的发生和可能的癌症的影响。
可能重新教导免疫***对自身和周围世界进行正确的识别、调节并应答。
适宜地,免疫调节剂组合物或药物组合物也可用于治疗或预防对儿童期疫苗,如百日免疫接种和当前的MMR免疫接种的不良反应和/或其后果。
(b)老人的免疫***失衡
免疫***失衡,如上调、下调或不合适地调节细胞免疫应答,特别是下调,例如免疫功能的退化,可以在老人中出现,一般为超过60岁的。在老人中细胞免疫应答的下调一般称为免疫衰老。典型地,免疫功能的退化可导致增加对诸如感染疾病和肿瘤的易患性 在人群比例中老年人的数量正急剧增加,老年医学正变成临床实践的一个重要方面.所以并不令人惊讶的是,研究集中于免疫衰老的机制和免疫***健康与长寿之间的联系上.Goronzy(2001)检测了老人中流感疫苗的不同功效.在该研究中,仅有17%的受试者在免疫接种1个月后显示出滴度上升至所有3个血凝素(成功免疫),而46%没有显示出一点可证明的应答.这说明对流感疫苗的应答是一个免疫衰老有用的生物学标志.许多研究人员研究了老人的各个不同方面的免疫功能.例如,Lio(2000)研究了细胞因子的应答,Solana(2000)研究了NK和NKt细胞,而且Ginaldi(1999)暗示Th1到Th2细胞因子产物的转变和炎症前细胞因子的增加产生可以解释许多方面的年龄相关的病理事件,如动脉硬化症和骨质疏松症.因此需要对免疫***的非病理刺激,该刺激使得细胞因子应答从炎症前Th2变到Th1.优选地,该免疫调节剂减少了急性感染的死亡率,阻止其发生并减少了年龄相关的自身免疫病的死亡率并可能减少肿瘤疾病的比率,所有这些疾病都与免疫衰老有关.
典型地,本发明该方面所述的的免疫调节剂组合物或药物组合物可以是免疫增强剂。
在该领域已经调查了肠道共生的益生菌或乳品细菌的潜在作用。例如,奶制品每剂量补充了5×109或5×1010个乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)或乳杆菌(Lactobacillus),已报道每日喝此奶制品3周可增加外周血NK,CD4和CD25细胞的数量,并一般能增强老人全身的细胞免疫(Gill,(2001))。
目前许多包含大量乳杆菌(Lactobacilli)和其它肠道共生菌群的制品正被积极地提升为“生活方式增强剂”。Sanders(2001)有关嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的益生效果(probioticeffect)的综述提示其效果需要作用机理的进一步确认和澄清,其中嗜酸乳杆菌自1950年用为药物。其中有益效果有在腹泻后替代肠道菌群和在抗生素治疗后抗念珠菌病,而同时免疫刺激似乎是不可靠且是短期的。可是,该工作清楚地确认了口服免疫调节剂的有效的作用,尤其是灭活的免疫调节剂,以避免保持活菌产品的困难。
口服疫苗已长期确认具有成功的机制以诱导抗口/粪便病原体的局部保护性免疫,如抗脊髓灰质炎的。可是,口服疫苗也显示出引起由细胞和体液介导的***保护性免疫应答。Sharpe(2002)利用包含了麻疹病毒抗原的口服腺病毒构建体来诱导***抗体和脾淋巴细胞对麻疹抗原的应答。Manube(2002)开发了一种模型,能显示出口服减毒田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)比传统皮下给药的BCG带来了针对气雾结核杆菌攻击更高水平的保护。
Kim(2001)显示用日本雪松花粉饲养能产生对特定过敏的口服耐受性,该过敏由接下来注射油中的花粉来诱导。这与减少特定免疫球蛋白水平和显著减少白介素-4的产生,即下调TH2应答相关。
所以,***免疫应答由给药(如口服)合适的免疫调节剂来刺激和调整。
适宜地,在本发明的一个方面,可以见到本发明所述的完整细菌细胞可以包含在食品制剂中和/或可以作为一种“治疗剂”来补充,优选口服。
增强免疫***
本发明的组合物可用于制备药物,该药物增强动物,优选哺乳动物,更优选牲畜的免疫***,这可导致诸如生长增强(促进)和/或饲料利用效率增加和/或普遍增加受试着的康乐感(即受试者的总体健康得到改善).可通过以下参数的一个或多个来确定受试着的整体健康,如:重量数据(重量增加是正向决定因素),机敏性(完全机敏是正向决定因素),运动(积极的运动是正向决定因素,迟钝的运动相反)和疾病(疾病数量的减少是正向决定因素).典型地,本发明该方面所述的免疫调节剂组合物或药物组合物可以是免疫增强剂.
方便地,本发明的免疫调节剂组合物或药物组合物可用于替代目前常用于促进牲畜生长的抗生素。
在此所用的术语“牲畜”指任何畜牧的动物。优选地,牲畜是家禽包括鸡、猪(包括小猪)、羊(包括羊羔)、母牛或公牛(包括小牛)中的一种或多种。更优选地,牲畜指猪,包括小猪。
本发明也预期本发明各属的菌可以和已知的益生细菌联合给药,用于调节细胞免疫应答。
目前商品化的抗生素通常用作饮食强化饲料添加剂(或生长促进剂)并纳入到动物饲料中去。可是,预期欧盟会引入全面的禁令,禁止畜牧业中抗生素的非临床使用。因此,市场需要有效的替代品。
本发明的优点是可以(任选与其它好的畜牧业实践产品一起)用作饮食强化饲料添加剂(或生长促进剂)的替代品。
当用作增强免疫***时,可以将本发明的免疫调节剂组合物或药物组合物作为食品添加剂使用。
癌
适宜地,本发明所述的组合物用于调节细胞免疫应答从而治疗和/或预防癌。特别地,已见到本发明所述的组合物可用于保护受试者对抗癌症的发生和/或发展。特别地,调节了细胞免疫应答的受试者较不易于发生癌症。
特别地,在癌生长期间观察到了未经调节的Th2增加。
癌是影响许多人的疾病,65%的病例发生在那些超过65岁的人中。自19世纪中叶以来英国的平均期望寿命几乎翻倍,癌症的风险人群增加了。其它死亡原因(如心脏病)的死亡率近年来减少了,而癌症的死亡率仍保持相对稳定。结果是3个人中的1个在其生命中诊断有癌症并且4个人中的1个会死于癌症。
癌的实例包括膀胱癌,脑肿瘤,乳腺癌,***,结肠和直肠癌,腺癌,子宫内膜癌,食管癌,肾癌,白血病,肝癌,肺癌,黑素瘤,骨髓瘤,非hodgkin氏淋巴瘤,卵巢癌,胰腺癌,***癌,肉瘤,软组织和胃癌。
另外,长期吸烟和较小范围内的被动吸烟与直接与烟接触的部位的癌相关,所述部位有咽,气管,肺,食管和胃。而且,吸烟也可以增加远距离的部位的肿瘤,如肾,膀胱,胰腺,肝和髓样白血病。本发明中,已见到本发明所述的组合物可以向吸烟者给药以减少吸烟者发生与吸烟有关的癌的风险。
适宜地,癌可以是腺癌或黑素瘤。
适宜地,癌可以是病毒相关的癌,如***。不受理论所限,在一些情况下发现由***瘤病毒造成的感染,如子宫颈发育异常(dysplasia of theurerine cervix)先于***.因此,在此***被认为是“病毒相关的癌”.可是,在此所用的术语“病毒相关的癌”指任何由病毒感染造成或与病毒感染相关的癌.
手术后恢复、应激和感染
在任何较大手术后,许多状况可能出现:
与外科手术相关的应激包括以下的一种或多种:手术前恐惧、由于手术过程而造成的对组织的应激、通常伴随在恢复期的疼痛、忧虑重大的手术发现。
这些种类的应激与T-细胞功能向Th2的偏离有关。手术前用药和麻醉的免疫抑制效应可在其手术后持续多天或多周。
另外手术时的暴露切口的直接感染和恢复室中伤口的感染以及离开医院前的病室也是一个问题。
这些因素的组合使患者暴露于一系列潜在的细菌感染,其中:-
自从患者送进医院治疗,就暴露在医院相关的恶性感染中,如那些二甲氧苯青霉素(methicillin)抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染。由于切开的肠部组织暴露于肠内容物,肠手术使患者暴露于革兰氏阴性细菌的感染中。下肢手术也易于感染普通的肠道菌群。
伤口的小感染减慢了康复并增加了发展出更严重感染的机会。
为了克服这些影响,对Th1的免疫调节和对Th2的下调,即本发明应用的结果,会造成以下一种或多种结果:对手术后细菌感染增加非特异性抗性;帮助伤口痊愈和/或减少应激。
T辅助细胞
在此所用的术语“Th1”指1型T辅助细胞(Th1)。在此所用的该术语也可指通过该细胞类型介导的应答。该应答可包括分泌白细胞介素-2(IL-2),分泌γ-干扰素(IFN-γ),活化巨噬细胞,活化细胞毒性T-细胞,或任何其它Th1-相关事件中的一种或多种。因此术语“Th1”可以包括Th1细胞以及这些细胞产生的免疫应答。
在此所用的术语‘Th2’指2型T-辅助细胞(Th2)。在此所用的该术语也可指通过该细胞类型介导的应答。该应答可包括分泌白细胞介素-4(IL-4),分泌剪切变体白细胞介素IL-4δ2,分泌白细胞介素-5(IL-5),增加淋巴细胞上的细胞决定簇(cell determinant)30(CD30)的水平,增加血中免疫球蛋白-E(IgE)或血中嗜酸性粒细胞的水平,或任何其它Th2相关事件中的一种或多种。因此术语“Th2”可以包括Th2细胞以及这些细胞产生的免疫应答。
已知各种病症可造成失调节(unregulated)或不适当调节的细胞免疫应答或失调节或不适当调节的细胞免疫应答可导致各种病症,特别是在Th1和/或Th2活化和/或增殖方面,如果失调节或不适当的调节,则发现其导致一种或多种患者的有害效应。
特别地,发现该失调节或不适当调节的细胞免疫应答在免疫接种后出现,如在儿童接种后,认为导致诸如过敏症发作的病症,即过敏性皮炎和过敏性哮喘。比如,Lewis D Curr Opin Immunol 2002;14:644报道由IL-4,IL-5和IL-13分泌介导的Th2免疫应答在特应性病症(atopic disorder)的发病机制中起关键的作用,该特应性病症包括过敏原诱导的哮喘,鼻结膜炎和过敏性反应.尽管由传统特定的免疫治疗能某种程度地下调该应答,但是该方法仅仅部分有效并具有实质性的有害效应的风险.免疫治疗性预防和特应性病症的治疗的许多策略已经基于小鼠过敏模型而设计,包括由调节性T细胞活性诱导的Th2应答的下调,Th2到Th1的免疫偏离,Th1对Th2免疫应答的交叉调节,无反应性和免疫抑制性细胞因子.Choi & Koh Ann AllergyAsthma Immunol 2002;88:584-91检测了患有哮喘(一种Th2相关过敏疾病)的成人患者的BCG疫苗接种是否在临床上有效。显示出疫苗接种在中等至严重哮喘的成人中增强了肺功能并减少了药物的使用。这样的改善伴随着抑制Th2型免疫应答,暗示了BCG疫苗接种可以是抗哮喘的有效治疗形式。Von Hertzen J Allergy Clin Immunol 2002;109:923-8概述了这种可能性,即与持续过量皮质醇分泌相关的长期的母体的应激可能影响免疫***发育-尤其是Th1/Th2细胞分化,其可进一步在有遗传倾向的个体中增加哮喘和特应性疾病(atopy)的易感性。
另外,在疾病进展期观察到了未调节或不适当调节的细胞免疫应答。特别在癌生长期间观察到了Th2的失调节的增加。例如,Maraveyas等.AnnOncol 1999;10:817-24在癌症(如恶性黑素瘤晚期阶段IV(AJCC))患者中研究了SRL 172疫苗的有效性。检测了这些患者外周血淋巴细胞(PBLCs)中的细胞间细胞因子(IL-2和INF-γ)的诱导,该诱导与临床结果相关。证实了在显著多的恶性黑素瘤晚期阶段IV(AJCC)的患者中,SRL 172能有效诱导细胞间IL-2应答。Stanford等.International Journal of Pharmaceutical Medicine1999;13:191-195报道有越来越多的证据表明有效的抗肿瘤免疫应答可能由1型细胞因子介导的。近来的调查显示加热灭活的母牛分枝杆菌是可靠的Th1佐剂,而且初期临床试验显示出了在黑素瘤和***癌和肺癌中的有益效果。当前更广泛的受控研究正在进行以证实这些发现。
在感染(尤其是慢性感染)期间也观察到了未调节或不适当调节的细胞免疫应答,例如在进行性肺结核,麻风结节性麻疯病,内脏利什曼病和HIV感染期间以及在过敏期间。例如,Clerici & Shearer GM Immunol Today 1993;14:107-11提出Th1到Th2的转变在HIV感染的病因中是一个关键的步骤。Clerici & Shearer Immunol Lett 1996;51:69-73显示HIV特异性细胞介导的免疫是抗HIV感染和抗HIV感染发展到AIDS的主要相关保护因素。AbbotNC等European Journal of Vascular and Endovascular Surgefy 2002 24:202-8评估了将通过给药加热灭活的母牛分枝杆菌来增加慢性麻疯患者外周血流作为免疫疗法。在全面治疗的慢性麻风病患者中显示出18个月前使用的免疫治疗能显著增加血流和温度敏感性。
因此,本发明的目的是促进和建立细胞免疫应答的调节,包括调节或调节Th1和/或Th2,用该方式克服未调节或不适当调节的细胞免疫应答负效应。
适宜地,本发明所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物的应用调节Th1或Th2应答,如导致组织损伤的Th1或Th2应答。
适宜地,本发明所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物的应用可以减少Th1应答并减少Th2应答。例如,该免疫调节剂和/或药物组合物可用于治疗糖尿病。
适宜地,本发明所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物的应用可以增加Th1应答而不影响Th2应答。例如,该免疫调节剂和/或药物组合物可用作免疫增强剂。
适宜地,本发明所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物的应用可以增加Th1应答并减少Th2应答。例如,该免疫调节剂和/或药物组合物可用于治疗哮喘。
适宜地,本领域普通技术人员能够测试本发明每个属中的具体菌种以确定特定的Th1/Th2应答。
未调节或不适当调节的细胞免疫应答在疾病的确立中起作用,因为一些疾病造成偏移的Th1和/或Th2应答。伴随这些非典型Th1和Th2反应的是一系列异常炎症反应,其参与导致组织病理学的机理。
仅作为示例,本发明所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以克服现代生活相应的与环境影响(例如,抗原)接触减少的缺点,可以克服对以下情况的治疗的影响:感染(如,寄生虫感染,例如,疟疾、锥虫病、利什曼病和弓形体病)和/或伴随感染的免疫异常、应激(例如较大外伤的应激、社会心理应激和长期的应激)、过敏(如包括过敏性哮喘的哮喘、枯草热、过敏性皮炎(湿疹)、过敏性休克、植物接触或摄食引起的过敏、螫伤(如荨麻和昆虫螫伤、以及虫咬引起的过敏(如蠓,比如库蠓(其造成马的甜搔痒)、马肺气肿病、COPD和癌(例如黑素瘤或腺癌)、免疫***失衡(如儿童的免疫***失衡,如儿童期疫苗的不希望的效应,以及老人的免疫***失衡)以及手术后应激和手术后感染。
疫苗
疫苗的制备对本领域普通技术人员来说是公知的,其中该疫苗包含一种或多种物质作为活性成分。典型地,这样的疫苗制成可注射的,如溶液或悬浮液;也可以制成适合在注射前制成溶液或悬浮液的固体形式。制品也可以是乳化的,或将活性成分以脂质体形式存在于胶囊中。活性成分通常与赋形剂混合在一起,其中赋形剂是药学上可接受的并与活性成分相容。合适的赋形剂如,水,盐水,葡萄糖,甘油,乙醇,或其类似物及其组合。可选地,疫苗可制成如,口服摄取的和/或能吸入的。
另外,如果需要,疫苗可以包括少量辅助物质,如湿润剂或乳化剂和pH缓冲剂。
给药
典型地,医生会确定疫苗、免疫调节剂组合物和药物组合物的实际剂量,其中,它们会最适合于单个患者并随年龄、体重和特定患者的反应而变化。以下剂量是对平均情况的示例。当然,可有个别情形高于或低于所述剂量范围。
优选地,实际使用的剂量对患者造成最小的毒性。
本发明的组合物可以直接注射给药。
组合物可以配成非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤的给药形式。
适宜地,本发明所述的组合物给药的剂量为103-1011个生物体,优选为104-1010个生物体,更优选为106-10-5×109个生物体,并更优选为106-109个生物体。典型地,本发明所述的组合物应用于人和动物时以108-109个细菌的剂量给药。
如果本发明的组合物作为免疫增强剂进行给药,则应用于人和动物时可以以有规律的间隔给药,每剂(per dose)为103-1011个生物体,优选每剂为104-1010个生物体,更优选每剂为106-10-5×109个生物体,并更优选每剂为106-109个生物体,并更优选每剂为108-109个细菌。
正如本领域普通技术人员能迅速理解的那样,给药剂量将取决于药剂所施用的生物体对象。
术语“给药”通过递送机制的递送过程,递送机制包括注射、脂质介导的转染、脂质体、免疫脂质体(immunoliposome)、脂质转染物(lipofectin),阳离子表面两性分子(cationic facial amphiphile)(CFAs)及其组合(combinations),或病毒递送.该递送机制的途径包括但不限于粘膜、鼻、口、非肠道、胃肠道、局部、或舌下途径.
术语“给药”包括但不限于通过粘膜途径的递送,例如,鼻腔喷雾剂或吸入气雾剂或可吸收的溶液;非肠道途径,包括通过可注射的形式递送,例如,静脉,肌肉,皮内或皮下途径。
术语“联合给药(co-administered)”指本发明的佐剂、抗原和/或抗原决定簇中的每一个的给药位置和时间能使得免疫***得到必要的调节。因此抗原和佐剂可以同时和在相同位置给药,则可以比在不同时间和不同位置给药佐剂和抗原和/或抗原决定簇更有优势。抗原和/或抗原决定簇和佐剂可以在同一个递送载体中被递送,并且抗原和/或抗原决定簇和佐剂可以偶联在一起和/或不偶联和/或在基因水平上偶联或不偶联。仅作为示例,本发明所述的免疫调节剂组合物可以在一种或多种抗原或进一步的抗原给药之前、同时或之后进行给药。
抗原,抗原决定簇,肽或其同源物(homologue)或模拟物可以以单剂或多剂的形式向患者分开或联合进行给药。
本发明的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以通过许多不同途径进行给药,如注射(其包括非肠道,皮下,皮内和肌肉注射)鼻内,粘膜,口腔,***内,尿道或眼部给药。
优选地,在本发明中通过注射给药。更优选地,注射为皮内注射。
优选地,本发明中通过口服可接受的组合物来进行给药。
对于疫苗接种来说,组合物能以0.1至0.2ml水溶液的形式来提供,优选生理盐水缓冲液,并进行非肠道注射给药,例如通过皮内接种。本发明所述的疫苗优选进行皮内注射。在注射部位可能会发现轻微的肿胀和发红,有时也会有搔痒。给药的模式、给药的剂量和次数可通过本领域普通技术人员已知的方式进行优化。
抗原
在此所用的“抗原”指一种实体,当其导入具有免疫能力的宿主时会调节能与该实体结合的特定抗体或多个抗体的产生,和/或调节相应的Th应答,如Th2和/或Th1应答。抗原可以是纯的物质,混合物或可溶或颗粒材料(包括细胞或细胞碎片或细胞的超声波降解物)。在该意义上,该术语包括任何合适的抗原决定簇,交叉反应性抗原,同种异体抗原,异种抗原,耐受原,过敏原,半抗原和免疫原或其部分,以及它们的任意组配物(combination),而且这些术语在全文中可以替换使用。
在此所用的术语“抗原决定簇或表位”指抗原上这样的位置,其可由抗体或T-细胞受体识别,或能够引起T-辅助细胞的应答。优选地,其为衍生自蛋白质抗原的短肽或为蛋白质抗原的一部分。可该术语也包括糖肽和糖类表位。该术语也包括修饰的氨基酸序列或糖类,其刺激能识别完整生物体的应答。
如果抗原决定簇为能够造成感染性疾病的感染因子的抗原决定簇,则更好。
“预防性的”或“预防疾病的”疫苗是一种疫苗,向自然个体(naiveindividual)给药该疫苗可预防病症的发生,如通过刺激保护性免疫。
“治疗性”疫苗是一种疫苗,向已经存在病症的个体给药该疫苗,可减少或最小化该病症或消除该病症的免疫病理结果。
佐剂
在此所用的术语‘佐剂’指一种实体,其能增加或参与免疫应答的影响。佐剂是任何能辅助、增强、下调、调节或多样化针对抗原的免疫应答的物质或混合物。
本发明所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物可以包括一种或多种佐剂,该佐剂增强免疫调节剂组合物和/或药物组合物的有效性。添加的有效的佐剂的实例包括但不限于:氢氧化铝,磷酸铝,硫酸钾铝(明矾(alum)),硫酸铍,硅土(silica),高岭土(kaolin),碳,油包水乳剂,水包油乳剂,胞壁酰二肽,细菌内毒素,脂质X,短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)(疮疱丙酸杆菌(Propionobacterium acnes)),百日咳杆菌(Bordetella pertussis),母牛分枝杆菌,多聚核糖核苷酸,藻酸钠,羊毛脂,溶血卵磷脂,维生素A,诸如白细胞介素2和白细胞介素-12的白细胞介素,皂角苷,脂质体,左旋四咪唑,DEAE-葡聚糖,封闭的共聚物或其它合成佐剂。这些佐剂可从多种商业来源获得,例如,Merck佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)或福氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)。仅有氢氧化铝被批准在人身上应用。一些其它佐剂,如母牛分枝杆菌(M.vaccae),被批准进行临床试验。
适宜地,佐剂可以是选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞。
现有技术中已知DNA疫苗是有效的疫苗递送***,其中DNA疫苗基本上是吸附在金颗粒上的DNA序列并且可通过氦***将其射入皮肤中。不像传统的疫苗,这些DNA疫苗不需要传统的佐剂成分。根据本发明的另一个方面,在此定义的免疫调节剂组合物适合与这些DNA疫苗联合使用以增强或参与进免疫应答的影响。
药物组合物
本发明也提供了一种药物组合物,其包含治疗有效量的选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的完整细菌细胞,并任选药学上可接受的载体,稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
药物组合物可以包含两种成分-第一成分包含一种抗原并且第二成分包含其佐剂。第一和第二成分可以先后、同时或一起递送,甚至可以通过不同给药途径进行。
适宜地,抗原甚至可以是在作为病程一部分的宿主组织中产生的。因此,抗原可以源自细菌、宿主或寄生虫侵入,或可以是从组织中释放的物质,如应激蛋白质(stress protein)或肿瘤抗原。
药物组合物可以是在人或兽医学中针对人或动物使用的,典型地将包含药学上可接受的稀释剂,载体或赋形剂中的任何一种或多种。可接受的治疗所用的载体或稀释剂在制药领域是公知的,例如在Remington′sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中所述的。药物载体,赋形剂或稀释剂的选择可以根据给定的给药途径和标准药学实践来选择。药物组合物可以包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂布剂、溶剂以用作(或额外加入)载体,赋形剂或稀释剂。
可以在药物组合物中加入防腐剂,稳定剂,染料以及调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠,山梨酸和p-羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。
根据不同的递送***可以有不同的组合物/配方要求.仅通过示例,本发明的药物组合物可以配成利用小泵(mini-pump)或通过粘膜途径的给药的制剂形式来递送.例如,鼻腔喷雾剂或吸入气雾剂或可摄入的溶液,或非肠道途径,其中组合物配成通过可注射的形式递送,例如,静脉,肌肉,皮内或皮下途径.可选地,设计配方使之通过两种途径递送.
优选地,本发明中的制剂是可注射的形式。更优选地所述制剂是皮内注射的形式。
优选地,本发明中的是可口服的组合物。
粘膜递送制剂使之通过胃肠粘膜,其能够在通过胃肠道时保持稳定;例如,其抗水解蛋白酶降解,在酸性pH值情况下稳定并抗胆汁的清涤剂效应(detergent effect)。
如果合适,药物组合物能以以下方式给药:吸入,以栓剂或***栓剂的形式,以洗剂,溶液,乳油,油膏或粉剂(dusting power)的形式局部给药,通过使用皮肤贴,以包含诸如淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式口服,或单独或与赋形剂一起混合装入胶囊或胶丸中,或以包含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式,或它们可以进行非肠道注射,如静脉,肌肉,皮内或皮下注射。对于非肠道给药,组合物最好以无菌水溶液的形式来使用,该水溶液可包含其它物质,如足够的盐或单糖以使溶液与血液的渗透压相同。对于口腔或舌下给药,组合物可以以片剂或锭剂的形式给药,它们以常规方式进行配伍。
药物组合物
本发明的试剂可以和一种或多种其它药物活性物质一起给药。例如,本发明包括同时或顺序治疗方法,该疗法使用本发明所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物,和一种或多种类固醇,镇痛剂,抗病毒剂,诸如IL-2的白细胞介素,或其它药物活性物质。
将能理解这些疗法包括顺序、同时或一起给药所述物质。
免疫增强剂
在此所用的术语“免疫增强剂”指一种或多种分离的或培养的细菌,该细菌在向患者给药时能有益该患者的健康。优选地,通过调节患者的细胞免疫应答来获得该益处。
按照本发明,可以使用免疫增强剂,例如,以治疗或预防患者中的免疫***失衡,优选儿童或老人患者,或加强患者的免疫***,例如哺乳动物的,尤其是牲畜或人的。
可以通过吃专门设计的食物或动物饲料(例如补充了本发明细菌的猪类动物饲料)来给药免疫增强剂。
也可以通过其它途径来给药免疫增强剂,如直接注射。
优选地,灭活细菌以避免保存活菌产品的困难。
鉴定调整细胞免疫应答的细菌
在另一方面,本发明涉及一种鉴定一种或多种完整细菌细胞的方法,所述细菌选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属,所述细菌调整(如调节)细胞免疫应答,该方法包括以下步骤:(a)用免疫刺激剂接触第一测试动物;(b)用混合了细菌的免疫刺激剂接触第二测试动物;(c)测量测试动物中每一个的细胞免疫应答;并(d)比较测试动物中每一个的细胞免疫应答,其中,混合了细菌的免疫刺激剂相对于单独使用免疫刺激剂得到较低的细胞免疫应答,这就可以作为细菌调节了细胞免疫应答的指标。
在另一方面,本发明涉及一种确定细菌菌种Th1/Th2应答的方法,所述细菌选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属,该方法包括使用结核菌素皮肤测试。在小鼠中,结核菌素皮肤测试优选在足垫上进行。在Th1为主的反应中,阳性足垫免疫应答在24小时时达到最大值并在48小时时下降。可是,当Th2反应性增加之后,48小时阳性足垫免疫应答增加并甚至可超过在24小时时的足垫免疫应答。
利用该结核菌素皮肤测试能很好记录BCG疫苗接种的效果。因此,能用该测试评估导入本发明所述的免疫调节剂组合物能否调节BCG细胞免疫应答。
在此所用的术语″测试动物″指任何能针对免疫刺激剂产生细胞免疫应答的动物。优选地,测试动物是哺乳动物。更优选地,测试动物是大鼠、仓鼠、兔、豚鼠或小鼠。更优选地,测试动物是小鼠。
优选地,细菌调节T辅助细胞应答。适宜地,细菌可以通过减少Th1和Th2应答来调节T辅助细胞应答。适宜地,细菌可以通过增加Th1应答并减少Th2应答来调节T辅助细胞应答。适宜地,细菌可以通过增加Th1应答而不影响Th2应答来调节T辅助细胞应答。
优选地,免疫刺激剂会具有已知的Th1和Th2应答。例如,使用免疫刺激剂BCG,则反应通常在24h处达到最大值,其可作为Th1应答的指标;在48h处的反应通常较小并包括Th2的作用。已知BCG主要刺激Th1应答。
通过使用这种免疫刺激剂可能确定测试细菌的Th1/Th2应答,并因此可能鉴定一种或多种细菌,该细菌具有期望的Th1/Th2应答以治疗和/或预防特定的疾病和/或失调。
优选地,利用结核菌素皮肤测试测定细胞免疫应答。在以后测试时,用免疫刺激剂(如BCG)进行的免疫接种能诱导针对结核菌素(Tubercle bacilli的可溶性制品)皮肤测试的应答。以不同间隔测定局部反应,例如在注射结核菌素后的24小时,48小时和72小时。简而言之,免疫刺激剂(如BCG)用于诱导针对结核菌素的阳性免疫应答。在测试动物中,结核菌素皮肤测试优选在足垫上进行。在Th1为主的反应中,阳性足垫免疫应答通常在24小时处达到最大值并在48小时处减小。可是当Th2反应性增加之后,48小时处的阳性足垫免疫应答增加并甚至超过24小时处的足垫免疫应答。因此,试验能用于评估导入本发明所述的免疫调节剂组合物能否调节细胞免疫应答。
优选地,免疫刺激剂为BCG。
附图说明
图1的图表显示了断奶后超过12周的重量增加平均值/雌性幼仔测试样品和对照样品的结果。
图2的图表显示了断奶后超过12周的重量增加平均值/雄性幼仔测试样品和对照样品的结果。
图3的图表证实了支气管戈登氏菌(Gordonia bronchialis)增强了早期TH1效应。
图4的图表证实了Tsukamurella inchonensis增强了早期TH1应答并抑制晚期TH2应答。
图5的图表证实了嗜粪红球菌抑制TH1和TH2应答。
图6的图表证实了相对于未免疫接种的对照,1个月后产生了针对BCG的结核菌素(tuberculin)应答。
图7的图表证实了由三种细菌造成的BCG免疫调节效应。在24和48小时时测定结核菌素应答。代表性的菌种为(Na)星状诺卡氏菌;(Gb)支气管戈登氏菌;和(Tp)Tsukamurella inchonensis。
图8的图表证实了由两种细菌造成的BCG/BCG+免疫调节作用.在24,48和72小时时测定结核菌素应答.代表性的菌种为(Rrh)紫红红球菌和(Dm)海洋迪茨氏菌.
图9的图表证实了由选自红球菌属(Rhodococcus)的菌种造成的BCG免疫调节效应。在24,48和72小时时测定结核菌素应答。(Rrh)紫红红球菌;(Rru)赤红球菌;(Rrhod)椿象红球菌;(Rcop)嗜粪红球菌;(Ropa)混浊红球菌;(Reryth)红串红球菌。
图10的图表显示了赤红球菌的最佳剂量,其中相对于单独使用BCG,其利用了从108至104的对数稀释的赤红球菌调理(modified)的BCG。
图11的图表显示了猪的生长增加,其中将嗜粪红球菌(Ro)作为测试试剂向该猪给药。
图12显示给药T.inchonensis的马的甜搔痒症(sweet-itch)的发展(development)。
图13显示了摄于2003年6月的照片,其显示了给药T.inchonensis的马的类肉瘤损伤(sarcoid lesion)。
图14显示了摄于2003年6月的照片,其显示了给药T.inchonensis的马的类肉瘤损伤。
图15显示了摄于2002年8月的照片,其显示了在给药T.inchonensis前的类肉瘤损伤。
图16显示了摄于2003年6月的照片,其显示了给药T.inchonensis的马的类肉瘤损伤。
图17显示了摄于2002年8月的照片,其显示了在给药T.inchonensis前的类肉瘤损伤。
图18显示了摄于2003年8月的照片,其显示了在给药T.inchonensis之后的类肉瘤损伤。损伤大大地减轻了(约为其最大尺寸的四分之一[没有照片])。
图19显示了摄于2003年8月的照片,其显示了在给药T.inchonensis之后的类肉瘤损伤。损伤大大地减轻了(约为其最大尺寸的四分之一[没有照片])。
图20显示了摄于2003年8月的照片,其显示了在给药T.inchonensis之后的类肉瘤损伤。
图21显示了与马甜搔痒症相关的应激反应的图示。
现在本发明将进一步通过实施例进行描述,旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明,但其意决不是用来限制本发明的范围。
实施例
方法
结核菌素皮肤测试
结核菌素皮肤测试是合适的模型测试,用以评估免疫调节剂组合物(如包含本发明所述的完整的灭活细菌细胞的细菌组合物/悬浮液)对细胞免疫应答的影响。
BCG疫苗接种包括诱导出针对结核菌素的阳性免疫应答。小鼠中,结核菌素皮肤测试优选在足垫上进行。在Th1为主的反应中,阳性足垫免疫应答在24小时时达到最大值并在48小时时减弱。可是,当Th2反应性增加之后,48小时的阳性足垫免疫应答增加并甚至超过在24小时处的足垫免疫应答。
利用该结核菌素皮肤测试能很好记录BCG疫苗接种的效果。因此,能用该测试评估导入本发明所述的免疫调节剂组合物能否调节BCG细胞免疫应答。
细菌悬液的制备
选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属的细菌菌种可以在无抗原的培养基中生长,如Sauton’s培养基,其在发酵罐中培养2-28天。可选地,感兴趣的细菌菌种在固体斜面上培养。本领域普通技术人员会很快得到可选的方法。
可以收集产生的菌体并直接使用或经洗涤后用缓冲液制成悬浮液再使用。制成的细菌细胞悬浮液每剂包含100,000到10,000,000,000个细菌。将细菌细胞重悬浮于水中或盐水中。优选地,盐水是pH8.0的硼酸盐缓冲液。细菌优选是失活(灭活)的,适宜通过在高压灭菌锅中121℃加热15分钟来灭活。由此产生的细菌悬浮液包含完整的细胞。
实施例1:用赤红球菌(R.r.)调节细胞免疫应答
组1:青年远系繁殖的雌性小鼠不经免疫接种,将其用作对照组。
组2:青年远系繁殖的雌性小鼠在第0天用BCG(105个细菌)(Evans)向其后颈进行免疫接种。
组3:青年远系繁殖的雌性小鼠在第0天用BCG(105个细菌)向其后颈进行免疫接种,其中向BCG中加入加热灭活的母牛分枝杆菌(M.v.)(107个细菌)。
组1-3中的所有小鼠进行足垫测试,在第10和30天测试结核菌素免疫应答。然后在第40天每只小鼠注射加热灭活的母牛分枝杆菌(10个细菌)。在第50天重复进行足垫上的结核菌素测试。
组4:青年远系繁殖的雌性小鼠不经免疫接种,将其用作另一对照组。
组5:青年远系繁殖的雌性小鼠在第0天用BCG(105个细菌)(Evans)向其后颈进行免疫接种。
组6:青年远系繁殖的雌性小鼠在第0天用BCG(105个细菌)向其后颈进行免疫接种,其中BCG中加入加热灭活的母牛分枝杆菌(10个细菌)。
组7:青年远系繁殖的雌性小鼠在第0天用BCG(105个细菌)向其后颈进行免疫接种,其中BCG中加入加热灭活的赤红球菌(107个细菌)。
组8:青年远系繁殖的雌性小鼠在第0天用BCG(105个细菌)向其后颈进行免疫接种,其中BCG中加入加热灭活的赤红球菌(106个细菌)。
组4-7中的所有小鼠进行足垫测试,在第30天测试结核菌素免疫应答。然后在第40天,拆分每个组从而使每个组中的一半小鼠不接受进一步的治疗,而每个组中的另一半小鼠接受注射赤红球菌(107个细菌)。在第50天重复进行足垫上的结核菌素测试。
实施例1的结果如表1所示。
表1:用赤红球菌(R.r.)调节细胞免疫应答
天 24小时时的结 48小时时的结 24小时和48小
核菌素应答 核菌素应答 时之间的差异
组1-对照
10 6.9±4.5 5.3±3.7 1.6
30 5.9±4.7 5.2±4.5 0.7
50M.v. 13.1±5.6 14.0±5.2 +0.9
p<0.01 p<0.001
组2-BCG
10 16.8±11.1 16.8±5.5 0
30 31.1±17.8 16.9±9.1 14.2<0.05
50M.v. 33.9±12.3 19.2±11.3 14.7<0.02
组3-BCG+M.v.
10 14.6±8.3 9.9±2.7 4.7
30 23.8±16.1 21.7±11.5 2.1n.s
50M.v. 27.4±10.3 15.1±5.8 12.3<0.005
组4-对照
30 2.8±3.7 2.5±2.3 0.3n.s.
50 6.4±9.4 3.6±7.5 2.8n.s.
50R.r. 4.2±5.4 1.0±1.7 3.2n.s.
组5-BCG
30 28.8±15.4 19.1±10.9 9.7(<0.1)
50 33.8±21.6 12.0±7.9 21.8(<0.1)
50R.r. 40.0±22.4 12.2±9.2 27.8<0.05
组6-BCG+M.v.
30 19.4±20.5 17.7±11.8 1.7n.s.
50 56.8±53.8 29.4±31.1 27.4n.s.
50R.r. 50.0±38.4 9.0±10.4 41.0<0.05
组7-BCG+R.r.
30 20.6±10.9 17.8±10.3 2.8n.s.
50 24.8±22.5 14.6±13.2 10.2n.s.
50R.r. 28.0±13.2 11.0±4.7 17.0<0.05
组8-BCG+R.r./10组
30 19.5±13.9 20.9±14.9 +1.4
50 37.2±25.2 20.2±5.3 17.0n.s.
R.r.
50 26.8±14.8 12.8±8.0 14.0(<0.1)
M.v.=母牛分枝杆菌
在对照组1中,母牛分枝杆菌的处理诱发了针对结核菌素的免疫应答的统计学意义上的显著增加,在24小时(p<0.01)和48小时(p<0.001)后都增加了。可是在对照组4中,用赤红球菌的处理没有在24小时和48小时后诱发出针对结核菌素的免疫应答的显著改变。在两个时间点上,M.v.的结果都显著大于R.r.的结果(p<0.02)。
在BCG组(组2和组5)中,在接受赤红球菌处理的小鼠中,其在24小时和48小时之间对结核菌素的应答的下降(平均下降28.2±15.7)较之接受母牛分枝杆菌处理的小鼠的(平均下降14.9±9.6)幅度更大(p=0.06)。
在BCG+母牛分枝杆菌组(组3和组6)中,在接受赤红球菌处理的小鼠组中,其在24小时和48小时之间对结核菌素的应答的下降(平均下降41.0±41.0)较之接受母牛分枝杆菌处理的小鼠的(平均下降12.7±7.0)幅度更大(p<0.05)。
这些数据提示了在用赤红球菌处理后出现了Th2应答的下调,而这种下调在用母牛分枝杆菌处理后没有出现。
在BCG+R.r.组(组7和8)中,向BCG添加107个(组7)或106个(组8)R.r.的效果是非常相似的,并且用R.r.第二次注射后,应答会在24和48小时之间出现实质性的减弱(15.5±10.0).
实施例2:用星状诺卡氏菌(N.a.)、支气管戈登氏菌(G.b.)或Tsukamurella inchonensis(T.p.)调节细胞免疫应答
该实验设计用以比较用结核菌素进行的足垫测试的效果,该测试在免疫接种6个小鼠的各组后的第28天进行,该测试单独使用BCG或添加有10个M.v.,R.r.,星状诺卡氏菌(N.a.),支气管戈登氏菌(G.b.)或Tsukamurella inchonensis(T.p.)。为了找出针对这些添加的生物体中的每一种的免疫应答都有什么效果,在用结核菌素测试后的第28天,用皮肤测试试剂在其它足垫上测试动物组,该试剂由包括在其疫苗接种中的生物体制备而来(牛痘苗(Vaccin),Rubin,Asterin,Bronchialin和Inchonensin)。
结果由表2详述。
表2:细胞免疫应答的调节
24小时时的结 48小时时的结 24小时和48小
核菌素应答 核菌素应答 时之间的差异
天 1)对照组
28 3.8±4.8 3.7±3.6 0.1
2)BCG组
28 38.0±20.2 28.2±17.0 9.8
细核菌素
56 65.0±31.2 45.8±23.6 19.2
3)BCG+M.v.组
28 20.3±10.0 14.2±5.7 6.1
牛痘苗
56 18.7±12.1 8.0±6.5 10.7
4)BCG+R.r.组
28 31.3±16.0 24.2±10.3 7.1
Rubin
56 19.5±7.1 12.3±10.4 7.2
5)BCG+N.a.组
28 24.2±20.8 20.2±17.6 4.0
Asterin
56 7.3±8.3 5.3±5.0 2.0
6)BCG+G.b.组
28 15.8±14.4 15.7±13.2 0.1
Bronchialin
56 11.3±3.4 6.2±4.3 5.1
7)BCG+T.p.组
28 19.5±7.4 15.8±5.7 3.7
渐***素
(Paurometabolin)
56 9.8±5.0 2.3±2.7 7.5
所有细菌悬浮液相对于单独使用BCG后的结果,都降低了28天的结核菌素应答(p=0.05;p=0.2),该应答是在24和48小时时测定。
除了结核菌素和牛痘苗之外,这是这些所用的皮肤测试试剂的第一次测试.在24小时时对新试剂的应答的差异可能是因为除了蛋白质估计之外它们还没有被均衡(equilibrated).然而,所有都显示了在第50天在24和48小时之间的应答都下降了,提示存在免疫调节剂活性.
实施例3:用赤红球菌处理来调节细胞免疫应答
该实验设计出来用以研究白喉/破伤风/百日咳(DTP)疫苗和/或麻疹/腮腺炎/风疹(MMR)疫苗对接下来的BCG疫苗接种的影响,以及,如何通过提前7天或28天给予热灭活的完整赤红球菌细胞,或和第一剂DTP一起使用来调节所述影响。
表4详述了实验设计。6个由断奶的远系繁殖的雌性小鼠组成的组接受了如表4所详述的处理。在BCG疫苗接种后的28天,对所有小鼠进行结核菌素测试。
结果如表3所示。
表3:
24小时时的结 48小时时的结 24小时和48小
核菌素应答 核菌素应答 时之间的差异
表4中的组5
仅用BCG: 35.0±24.7 22.0±14.8 13.0
表4中的组3
DTP/MMR
然后用BCG: 42.7±28.5 24.2±13.2 18.5
表4中的组4
DTP/MMR
然后用BCG: 42.0±21.1 23.7±8.0 18.3
表4中的组6
在用BCG前
的49天用R.r.:50.3±47.0 31.8±32.0 18.5
表4中的组1
在用DTP/MMR前的7天用R.r.,
然后用BCG:
32.0±18.4 24.3±15.4 7.7
表4中的组2
在用DTP/MMR前的28天用R.r.,
然后用BCG:
44.7±25.8 20.0±11.0 24.7
表4中的组7
R.r.DTP/MMR
然后用BCG: 40.3±26.0 27.3±16.5 13.0
该实验显示的趋势:
在BCG前给药DTP/MMR的效果(表4中的组3&4):在BCG疫苗接种前给药DTP和MMR导致24小时应答的增加和24和48小时应答更好的分开了。
在BCG前给药R.r.的效果(表4中的组6):在BCG疫苗接种前49天用R.r.能增加24和48小时时的结核菌素应答,并增加两者之间的差异。
在BCG前给药DTP/MMR之前给药R.r.的效果(表4中的组1&2):在DTP/MMR接种前28天用R.r.能增加24和48小时结核菌素应答之间的g分开程度,其中在DTP/MMR接种前7天用R.r.能抑制接下来对BCG的效应。
在BCG前用第一剂DTP/MMR和R.r.一起给药的效果(表4中的组7):第一剂注射用的DTP/MMR和R.r.一起使用似乎没有使得DTP/MMR对接下来的BCG疫苗接种造成影响上的差异。
初步发现提示了在BCG疫苗接种之前用DTP并接着用MMR来进行免疫会对28天后的结核菌素反应产生影响。研究也提示了在BCG疫苗接种之前用R.r进行疫苗接种会对28天后的结核菌素反应产生影响。在DTP/MMR相关的免疫中,先于BCG疫苗接种而使用R.r.的时间选择可能是重要的。
实施例4:向成年豚鼠皮内注射而引起的局部皮肤反应
剃去3个动物的左侧胁腹的毛,向其进行皮内注射,即在头部后侧注射0.1ml包含108个母牛分枝杆菌的注射剂并向动物尾部末端5cm处注射0.1ml包含109个母牛分枝杆菌的注射剂。
剃去另外3个动物的右侧胁腹的毛,向其进行皮内注射,即在头部后侧注射0.1ml包含108个紫红红球菌(R.rhodochrous)的注射剂并向动物尾部末端5cm处注射0.1ml包含109个紫红红球菌的注射剂。
以mm表示的硬块参数
在3只豚鼠中,109个赤红球菌(R.ruber)(人和动物使用的典型剂量)的皮内注射(典型用于兽医和医学实践中的注射途径)的局部反应与另外3只豚鼠中相同剂量母牛分枝杆菌的反应相似。注射后48小时,对赤红球菌的反应比对母牛分枝杆菌的更小(p<0.05)。因此,赤红球菌比母牛分枝杆菌在药学上更可接受。108的剂量都没有出现局部反应。
实施例5:皮下注射后带来的毒性
在接受3次注射赤红球菌的17只大鼠中没有观察到皮下注射剂量的毒性证据,其中所述鼠的年龄为1天、14天和28天(在expt.6中,这些实验的最后一个为用克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)攻击后的7天)。
在48小时对赤红球菌的应答比相同剂量母牛分枝杆菌的更小(p<0.05)。7天或14天的都没有差异。许多小鼠接受了本发明各种细菌菌种的注射,没有任何毒性证据。
实施例6:对大鼠中锥虫病的调节
准备动物
i)通过皮下注射,向一天大的雄性″1″号鼠的后颈部注射0.1ml体积的107个赤红球菌或嗜粪红球菌。
ii)在14天之后,该雄性“1”号鼠第二次进行皮下注射,在其左侧注射0.1ml 107个赤红球菌。
iii)动物在第21天用活的克氏锥虫刺激,该刺激通过皮下途径并用106个克氏锥虫的Tulahuèn菌株的锥虫成虫进行.通过在CBi小鼠中连续传代来保持传染性的血锥虫成虫.
iv)通过感染后(pi)第7和14天直接显微观察5μl肝素化的尾部静脉血,在标准化的条件下评估克氏锥虫血流形态。数据以寄生虫数/50个视野来表示。
v)7天后,在右侧皮下注射给药额外的0.1ml 107个赤红球菌。
对照动物仅接受克氏锥虫攻击。
为了进行比较,另一组动物未经攻击。
结果如表5所示。
表5:寄生虫血症(数据以寄生虫数/50个视野来表示)
第1个实验
第7天 第14天
组 n 平均数±SD 中位数 平均数±SD 中位数(R)
(等级(rank))
对照 7 2.57±1.8 2(1-5 1.14±1.07 1(0-3)
Rr 10 0.30±0.67 0(0-2) 0±0 0(0-0)
P<0.005 P<0.005
Student′s检验
第2个实验
第7天 第14天
组 n 平均数±SD 中位数(等级) 平均数±SD 中位数(R)
对照 7 2.14±1.07 2(1-4) 1±1.15 1(0-3)
Rr 7 1.1±0.69 0(1-2) 1.5±0.97 2(0-3)
P=0.05
Student′s检验
来自两个实验的汇总数据
第7天 第14天
组 n 平均数±SD 中位数(等级(rank))
对照1 1 42.35±144 2(1-5) 1.07±1.07 1(0-3)
对照2 6 3.83±4.36 3.50±2.89
Rr 17 0.65±0.78 0(1-2) 0.69±1.01 0(0-3)
Rc 6 1.67±0.81 0.75±1.5
P=0.001
Student′s检验
Rc=嗜粪红球菌
这些数据证实了在血液中循环的寄生虫显著的减少了,而在此时对照动物却发现了最多的数量。这提示了赤红球菌(R.rubber)和嗜粪红球菌(R.coprophilus)都能增强Th1应答(7天对于通过Th2途径产生抗体来说太早了)。
实施例7:研究嗜粪红球菌NCIMB 11211,支气管戈登氏菌NC10667和Tsukamurella inchonensis NC13040的毒性效应,尤其是新生小鼠的生长率和接下来的BCG疫苗接种
可选的毒性测试是在其中进行皮下注射,在出生时注射支气管戈登氏菌,嗜粪红球菌或Tsukamurella inchonensis,并在第21天在不同的位置上再次注射。这些动物和用盐水注射的对照在3个月中定期称体重。
方法
使用9个怀孕后期的Balb C小鼠。
制备灭活的细菌悬浮液:从10天Sauton防沫肉汤培养基中制备悬浮液,离心并在硼酸盐缓冲液中重悬成10mg/ml,高压灭菌并储存于4℃。用硼酸盐溶液1/2稀释10mg/ml,1010个细菌/ml的菌液,得到5×109的浓度,然后用硼酸缓冲液1/10稀释成终浓度为20μL中有107个菌体的悬液,使之付诸应用。
第1天
在出生日逐一分离新生小鼠并向幼仔的后颈注射含107个灭活菌的悬液,并还回鼠母亲。
向对照幼仔的后颈注射20μL升M15硼酸盐缓冲液。
幼仔1=2个雌性的+3雄性的(嗜粪红球菌NCIMB 11211)
幼仔2=2个雌性的+3雄性的(嗜粪红球菌NCIMB 11211)
幼仔3=5个雌性的+3雄性的(支气管戈登氏菌NC10667)
幼仔4=3个雌性的+4雄性的(支气管戈登氏菌NC10667)
幼仔5=1个雌性的+1雄性的(硼酸盐缓冲液)
幼仔6=3个雌性的+1雄性的(硼酸盐缓冲液)
幼仔7=5个雌性的+3雄性的(Tsukamurella inchonensis NC13040)
幼仔8=5个雌性的+4雄性的(Tsukamurella inchonensis NC13040)
幼仔9=4个雌性的+5雄性的(硼酸盐缓冲液)
第21天
小鼠断奶了,按性别将幼仔分成2组:雄性和雌性
称体重并重新免疫接种。通过用不能拭除的笔标记尾部来标记个体。
每周称体重并重新标记尾部,如此持续3个月。
图1显示了断奶后12周的重量增加平均值/雌性幼仔测试样品和对照样品的结果。
图2显示了断奶后12周的重量增加平均值/雄性幼仔测试样品和对照样品的结果。
在所有组中都有相同的重量增加,而仅有2/57的动物3个月后死亡。这两个都是雄性的,恰好是在断奶后与其它雄性放在一起之后死亡。因此能够得出结论,即3种测试菌种没有影响动物的重量增加和成长发育。
实施例8:通过结核菌素皮肤测试应答来测量的BCG免疫的效果
设计免疫调节剂测试模型是基于以下原理:在4周以后测试,用BCG进行的疫苗接种诱导出针对结核菌素(Tuberculin)(Tubercle bacilli的可溶性制品)测试皮肤的应答。注射结核菌素后的24小时,48小时和72小时测量局部反应。在小鼠中,反应通常在第24小时达到最大值,其可以作为针对结核菌素抗原的Th1应答的指标。48小时的反应通常较小并诱导出Th2的作用。72小时的反应通常稍小于48小时的,并且其为Th2应答。该BCG处理后的结核菌素反应能通过预先激发(prior priming)来调节,因而反应的Th1和Th2成分会反映出所使用的激发试剂(priming reagent)的性质。
方法
根据实施例8激发的小鼠在其3个月大时,向其测试组的一半和对照组的小鼠后颈注射100μl 106个BCG。
在第4个月,用1mg/mlT1475试剂进行结核菌素测试。将100μl放入1.9ml中稀释成终浓度为50μgms/ml。储存于4℃。向后足垫给药的剂量为25μg,以50μ升的形式给药。在24,48和72小时利用测微计测量结核菌素应答的肿胀。
结果
图3显示了支气管戈登氏菌增强了24小时的TH1效应。
图4显示了Tsukamurella inchonensis增强了24小时的TH1应答并抑制72小时的TH2应答。
图5显示了嗜粪红球菌都抑制TH1和TH2应答。
结论
每个测试的菌种在BCG攻击后,诱导出对结核菌素测试的不同效果:
紫红红球菌(Rhodococus rhodocrous)诱导出增强的Th1应答,而并不改变Th2应答。也有显示椿象红球菌,海洋迪茨氏菌和土生戈登氏菌也具有该功能。赤红球菌也具有该功能。
Tsukamurella inchonensis增强或不改变Th1应答并下调Th2应答。也有显示支气管戈登氏菌,沟戈登氏菌和星状诺卡氏菌也具有该功能。
嗜粪红球菌大大地下调了Th1和Th2应答。
这些结果也清楚地显示用本发明的代表菌种进行的2次给药免疫的影响在第二次免疫后持续至少9周。
实施例9:免疫调节剂测试模型
设计免疫调节剂测试模型是基于以下原理:在4周以后测试,用BCG进行的疫苗接种诱导出针对结核菌素(Tuberculin)(Tubercle bacilli的可溶性制品)皮肤测试的应答.注射结核菌素后的24小时,48小时和72小时测量局部反应.反应通常在第24小时达到最大值,其可以作为针对结核菌素抗原的Th1应答的指标.48小时的反应通常较小并诱导出Th2的作用.72小时的反应通常稍小于48小时的,并且为Th2应答.该BCG处理后的结核菌素反应能通过预先激发来调节,因而反应的Th1和Th2成分会反映出所使用的激发试剂的性质.
向年幼3周大的小鼠后颈注射已知的免疫刺激剂(BCG),并通过向小鼠足垫皮下注射结核菌素的1个月后测量结核菌素应答。然后在24,48和72小时测量由此产生的肿胀,即″结核菌素应答″。24小时的肿胀被认为是早期或Th1介导的应答,而48和72小时的肿胀被认为是晚期或Th2介导的应答。健康小鼠中BCG刺激以Th1为主的应答。
方法
(a)BCG皮内疫苗接种,剂量10的药瓶(10 dose vial)(Evans Medical)。
通过补足1ml无菌水来重新构建疫苗,其用注射器和针用5分钟溶解。浓度应当是1×107/ml。
用注射器和针转移所有的疫苗并转送到塑料小瓶中。
1/10稀释,即将0.15ml加入到1.35ml M15硼酸盐缓冲液中,达到100μl,105。
向后颈给药,剂量为100μl中含105个菌体。
(b)结核菌素
T1475 1mg/ml。
将100μl放入1.9ml中稀释,达到终浓度为50μgms/ml。
储存于4℃。
以50μl中2.5μg的剂量向后足垫皮内给药。
在24,48和72小时用测微计测定结核菌素应答。
图6显示了相对于未免疫接种的对照,1个月后针对BCG的结核菌素应答。
(c)制备测试悬浮液
培养物在Sauton肉汤中生长,离心收集并重悬成浓度为10mg/ml M15硼酸盐缓冲液并储存于4℃。
10mgs/ml=100μl中有109个菌体。
1/10稀释=100μl中有108个菌体。
向1.2mlM15硼酸盐缓冲液中加入150μl 108个菌体并加入150ìl BCG。
现在剂量是100μl中有105个BCG+107个测试生物体,将其注射进后颈。
结果
图7的图表证实了由三种细菌造成的BCG免疫调节效应。在24和48小时时测定结核菌素应答。代表性的菌种为(Na)星状诺卡氏菌;(Gb)支气管戈登氏菌;和(Tp)Tsukamurella inchonensis。
图8的图表证实了由两种细菌造成的BCG/BCG+免疫调节作用。在24,48和72小时时测定结核菌素应答。代表性的菌种为(Rrh)紫红红球菌和(Dm)海洋迪茨氏菌。
图9的图表证实了由选自红球菌属的菌种造成的BCG免疫调节效应。在24,48和72小时时测定结核菌素应答。(Rrh)紫红红球菌;(Rru)赤红球菌;(Rrhod)椿象红球菌;(Rcop)嗜粪红球菌;(Ropa)混浊红球菌;(Reryth)红串红球菌。
图10的图表显示了赤红球菌的最佳剂量,其中相对于单独使用BCG,其利用了从108至104的对数稀释的赤红球菌调理(modified)的BCG。
结论
筛选试验证实了通过将BCG和测试悬液混合在一起并与单独用BCG的作比较,在28天后,用作对BCG应答的指标的结核菌素试验已被调节或改变了。在这简单的模型中,免疫调节显示为在24和48小时都减弱了应答的强度。这能用更长期的实验进一步研究,其中在用BCG攻击前的几周用测试悬液激发,并接着进行结核菌素测试。
实施例10:促进猪的生长
这基于以下理论,即Th1增强所激发的免疫***,无论受或不受Th2调节,会导致较小的由亚临床感染引起的生长限制。因此在经常有轻微感染的状况下,它们影响的减少会导致动物增加更多体重。可通过减少循环的TNF(肿瘤坏死因子)水平来达到该目的,即在存在Th2细胞因子的情况下它可起“恶病因子(cachectic factor)”的作用,减少食欲并增加代谢率。
在10只新生小猪上进行该研究。这些动物与其它该周出生的动物放在一起。
在出生的那天:所有小猪在其后颈左侧接受0.1ml皮内注射剂。然后将它们称重并放回母猪旁。对照组(5只小猪)接受硼酸盐缓冲液(pH 8)(即安慰剂)的注射。测试组(5只小猪)接受了含500微克嗜粪红球菌的0.1ml硼酸盐缓冲液(pH 8)。
在第7天:所有小猪在其后颈右侧接受0.1ml皮内注射剂。然后将它们称重并放回母猪旁。对照组接受硼酸盐缓冲液(pH 8)(即安慰剂)的注射。测试组接受了含500微克嗜粪红球菌的0.1ml硼酸盐缓冲液(pH 8)。
在第14天:所有小猪在其后颈右侧接受0.1ml皮内注射剂。然后将它们称重并放回母猪旁。对照组接受硼酸盐缓冲液(pH 8)(即安慰剂)的注射。测试组接受了含2mg嗜粪红球菌的0.2ml硼酸盐缓冲液(pH 8)。
效果如下所示:
图11的图表显示其证实了猪的生长增加,其中将嗜粪红球菌(Ro)作为测试试剂向该猪给药。
初步研究表明相对于给药相似的缓冲注射液的安慰剂对照组,接受了嗜粪红球菌的小猪显著地增加了体重。其优点是猪会比通常情况早2至3周达到合格的屠宰体重(在90-100kg之间)。
并不希望受理论所限,推测接受了测试试剂的动物所增加的体重可能是因为如下原因的一种或多种:更好的食物转化,感染的减轻和应激的减轻。
实施例11:调节马的与甜搔痒相关的应激
甜搔痒是通常困扰马和小马的皮肤病况,其造成由库蠓(Culicoidesmidges)叮咬引起的过敏性应答。这通常发生在毛发长的区域,如鬃毛和尾部。患有搔痒会导致毛发减少和皮肤增厚以及炎症。这种状况可使马兴奋和沮丧,可造成其体重下降。这是每年都有的状况,通常在晚春和夏季影响折磨马和小马。
已知4只小马和马每年都发生甜搔痒(sweet-itch),在分隔的2周2次对该4只小马和马组成的组皮内注射1mg T.inchonensis,4只接受缓冲液注射的动物作为对照,而接受1mg母牛分枝杆菌注射的2只动物作为阳性对照。由于在甜搔痒季节进行该实验,因此动物盖了毯子、头巾或面罩从而保护它们免遭蠓咬,这些保护罩在第二次注射后的3周被揭去。外罩揭去后,预计对照组在1-2周内发生甜搔痒,与此同时进行第一次全面的有效性评估。这时可进行第三次试剂的注射。
结果如下所示:
1 3 15 16 12 17 2 5 6 7 马
P P P P V V T T T T 试剂
B B B B B B B B B B 毯子
H H H H H H H 头巾
M 面罩
5 4 5 5 5 5 4 4 3 5 尾部异响 1-5不变
0 2 53 1 5 0 1 0 5 11 头部摆动 15分钟
0 7 4 10 0 11 1 19 3 2 踢腹部
0 3 0 6 0 0 0 0 0 0 跺脚
0 4 8 7 0 3 0 1 1 1 摩擦(rubbing)
0 3 0 2 0 3 0 1 1 2 咬
0 0 2 3 0 0 0 0 2 1 无意走动(mildless walking)
0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 滚动
1 2 4 6 1 5 1 5 2 6 观察者印象1-10高
6 25 77 41 11 28 7 30 17 28 总分
P 37 V 19 T 21 平均值/组
结果显示母牛分枝杆菌和T.inchonensis减少了由甜搔痒造成的应激症状(p<0.01)。
实施例12:预防马的甜搔痒
一只7岁大的马已知每年在蠓的季节发生了相当严重的甜搔痒,在1月和2月分别向该马前胸部皮内注射T.inchonensis,注射间隔两周。直至5月的最后几天,其时已进入库蠓季节,令人惊奇地是该马没有出现甜搔痒的迹象,如毛发脱落或皮肤炎症。在5月底,甜搔痒确实在该动物上出现了,将T.inchonensis第三次向该动物注射。在给药24-48小时内,甜搔痒症状(特别是皮肤炎症和/或毛发脱落)完全消失了。然后该动物直至8月初都没发生甜搔痒。再一次(第4次)注射给药T.inchonensis,甜搔痒症状又一次在给药后24-48小时内消失了。
该数据如图21的图表所示。
结果显示在甜搔痒季节前给药T.inchonensis两次,然后特别以此为基础在甜搔痒季节再一次给药,并在甜搔痒症状发生时给药,这样可有效预防和/或治疗甜搔痒。
实施例13:癌症模型
该研究可评估注射本发明的106和107个支气管戈登氏菌,嗜粪红球菌和Tsukamurella inchonensis对于预防和治疗肺腺癌细胞系攻击的小鼠的有效性。小鼠组接受皮下注射测试菌种或盐水安慰剂,该注射在用肿瘤细胞对其一侧攻击前5周和2周向其后颈部进行。在肿瘤攻击后1周向其后颈部第三次注射测试生物体和盐水安慰剂。由熟悉该***的技术人员确定注射的肿瘤细胞的数量。在攻击后的7、14和21天在攻击部位最终测试肿瘤的存在和大小。
初步研究提示至少一种测试细菌会延迟肿瘤的发生并减缓肿瘤的进展。
实施例14:显示了完整细菌细胞的悬浮液能比细胞提取物更有效地调节免疫,以BCG攻击/结核菌素皮肤测试***制备并测试比较制剂。
100mgTsukamurella inchonensis悬浮于预先称重的离心管中的缓冲盐溶液(pH8.0)中,以达到浓度为10mg湿重生物体/ml。这全部的10ml用超声发生器处理,使多数生物体(70-80%)破碎。
在试管中以15000rpm离心超声降解体1个小时,并小心分离上清液并将其从0.2μm孔径的过滤膜滤过,从而形成测试提取物。再次称重试管和沉淀以确定没有破碎的完整生物体和细胞碎片等的比例。其为64mg。然后估计提取物的量等于0.01mg T.inchonensis,其同0.01mg(约107个)完整细菌进行比较。
在断奶时和7天之后,10只动物组成的组接受注射,向其后颈部注射提取物或完整细菌细胞悬液(等于0.01mg/剂)或缓冲液安慰剂。两周之后,动物用BCG攻击。28天后进行结核菌素测试,在24,48和72小时进行读数。(该数据将到九月提供。)
结果:
在不给药、给药硼酸盐缓冲液、T.inchonensis完整细胞或可溶性抗原(过滤的超声降解体)之后,小鼠的结核菌素应答接着BCG疫苗接种后进行。
对于没有激发的动物,BCG后的结核菌素应答:-
编号 24小时 48小时 72小时
6 9±4.2 7.7±3.39 3.67±3.5
对于仅仅给药硼酸盐缓冲液的动物,BCG后的结核菌素应答:-
6 9±5.7 6.3±7.1 3.17±2.93
给药硼酸盐缓冲液对于BCG后的结核菌素测试没有影响。
对于给药完整热灭活T.inchonensis的动物,BCG后的结核菌素应答:
6 7.3±1.03 6.17±3.87 1.5±2.07
给药完整T.inchonensis降低结核菌素应答,特别在72小时(Th2应答)时。
对于给药T.inchonensis可溶性制剂(过滤的超声降解体)的动物,BCG后的结核菌素应答:
6 6.8±6.8 11.0±8.0 4.6±6.8
给药T.inchonensis的过滤的超声降解体增加48小时和72小时的应答(Th2应答)。这可能因为增加了炎症抗体的产生,这些抗体针对参与BCG和T.inchonensis间的共同抗原。结果显示T超声降解体导致了应答,该应答不同于给药完整灭活生物体后的应答。
初步研究提示细菌完整细胞能比细胞提取物更有效地调节免疫。
实施例15:猪的应激
要评估细菌完整细胞的对猪(小猪)的影响,其中所述细菌选自红球菌属,戈登氏菌属,诺卡氏菌属,迪茨氏菌属,冢村氏菌属和类诺卡氏菌属中的一种或多种,则要在猪中测试这些属中一种或多种属的一种或多种菌种。
测定唾液皮质醇是一种在实验室、农场、野生捕获和自由生活的动物中进行非侵入性的定量急性应激的方法。以下我们详细描述从猪或羊中收集唾液的方法以及使用商业上可得的皮质醇酶联免疫吸附试验(ELISA),设计该试验用以测量人唾液中的皮质醇。该ELISA试剂盒已成功应用于测定猪和羊中的唾液皮质醇。
方法
收集唾液样品。
1.猪有强的昼夜节律的(每日的)皮质醇(cortisol)节律,该节律指它们自然地在早晨比在这一天的晚些时候具有更高的应激激素水平。对于猪,发现最高的皮质醇水平在0700h并到正午下降。因为该原因,关键的是唾液样品一直要在一天的相同时间采集。
2.进食和饮水能影响唾液中激素的浓度。为了得到最真实的结果,在猪没有喂食或饮水时采集唾液样品。最好在它们喂食或饮水前采集样品。
3.对于小猪来说,让猪咀嚼标准的棉絮芽(cotton wool buds)(有色的棉絮芽更容易在干草中被发现),与此同时你持另一端。一只猪用约4个棉芽(都是末端)可收集足够的唾液。对较大的猪来说,用大的棉絮芽从面颊内部收集唾液。约2个大棉芽可收集足够的唾液。每个猪最少需要0.2ml唾液。
4.收集后立即将棉芽切成适合装入ependorf微离心管的尺寸。用棉花钎将棉芽装入ependorf管顶部。高速离心约2分钟或直至唾液落到ependorf管的底部。轻轻弹芽的顶部以从中空部分得到剩余的唾液。
5.通过在每个ependorf管中离心超过一个棉芽,但每次仅一个,每个ependorf管最少应收集0.1ml(唾液上的第一个标记)唾液。每只猪收集2个ependorf管。
6.用识别号和日期清楚标记ependorf管。
7.尽快将唾液样品储存于冰箱中的可重复密封的密封袋中,优选储存于-20℃。
皮质醇试验。
1.草拟平皿的编排。
2.从冰箱拿出唾液样品并解冻。
3.将温箱开到25℃。
4.使用前把ELISA试剂置于室温。
5.根据厂商说明书稀释洗液。
6.将100μl皮质醇标准品和唾液样品一式两份分配进合适的孔中。
7.将200μl酶偶联物分配进每个孔中。
8.震荡平皿10秒。
9.于25℃(温箱中)温浴1小时。
10.所有孔洗3次,去除沉入槽底的内容物,用多通道移液管将400μl洗液分配进每个孔中,再次去除内容物并进一步重复2次。
11.轻打倒转的紧贴有吸水纸的平皿,用以去除多余的洗液。试验的洗涤阶段非常重要,必须适当地洗涤平皿。
12.将200μl底物溶液分配进每个孔中。
13.于25℃(温箱中)温浴30分钟。
14.不清空孔而将100μl终止溶液分配进每个孔中。
15.加入终止溶液10分钟内在450nm处对平皿读数。
唾液皮质醇ELISA试剂盒。
人唾液的96孔试剂盒,可获得自:
Immunodiagnostic SystemsLtd,
10 Didcot Way,
Boldon Business Park,
Boldon,
Tyne and Wear,
NE359PD.
在第3周、65天和4-5个月的上市年龄时从每个动物获取一个或多个唾液的棉试子(swabs)。对唾液进行应激相关的激素分析,特别是皮质醇分析。
预期一种或多种测试细菌会通过神经-内分泌免疫机制来减轻应激。
实施例16:治疗马类肉瘤
马类肉瘤(Equine sarcoid),最常见的马皮肤肿瘤,与牛***瘤病毒1和2的感染相关。
一只6岁大的***的牲畜(3/4纯种;1/4比利时热血种)已经在以前的一年或几年中发生了类肉瘤损伤。2002年春天,在腹股沟/大腿内侧区域的高处发现了几个小疣样增生体。
2002年8月,肿瘤接近护套(sheath),在照片拍摄时该损伤为约3cm直径的葡萄串状增生体,其已开始溃烂。该串的部分有肉茎,但不适合结扎。另一组未溃烂、疣状增生体发生在右前腿的顶部,覆盖的区域约有3.5×2.5cm。开始用Camrosa药膏(草药治疗)进行每日两次的治疗。
2002年8月拍摄的照片如图15和17所示。
2002年秋,小类肉瘤仍没有改变,但前腿顶部的串组继续增大,覆盖的区域约为4.3×3cm,并且溃烂生长到护套附近,大小增大了3倍。
2003年1月,进行Tsukamurella inchonensis第一次注射,而在此之前继续一天2次使用Camrosa药膏。在接下来的几个月中很明显观察到所有增生体大小逐渐减小。
起初,于分隔的2周在距胸部损伤(如右前腿的顶部的损伤)约8-10cm处和相同的***流经区域处2次皮内注射1mg Tsukamurella inchonensis。第二次注射后的4周,胸部损伤逐渐平整并消退。大的***部的损伤(如在护套附近的损伤)更明显出现肉茎并似乎开始坏死。
第二次注射后的一个月,进行T.inchonensis的第3次注射,这次注射在***流经区域的胸部左前部,在该处没有类肉瘤损伤。一个月后没有观察到类肉瘤的进一步消退。
第3次注射后的一个月,进行第4次注射,这次又注射在右胸损伤的几厘米内。在胸部损伤几乎完全消退后的1个月,***部的损伤继续发生坏死并且其它腹股沟损伤稍微小一点了。
2003年5月,除了作为蚊蝇驱避剂每日一次在溃烂的增生体上应用外,其它部位完全停止了Camrosa药膏的应用。
2003年6月拍摄的照片如图13,14和16所示。
到了2003年8月,除了一个小增生体,所有的都在前腿顶部消失了。护套附近的增生体仍旧溃烂,但现在仅有其最大尺寸的约1/4大小,并且当增生体清除时,小片组织剥落了。
2003年8月拍摄的照片如图18,19和20所示.注意到了在T.inchonensis给药后,图17所示的类肉瘤到2003年8月完全痊愈了.
在1月中旬到8月中旬之间的时间里,一共有给药7剂T.inchonensis。
结论:T.inchonensis制品能有效减轻类肉瘤损伤。总体上说,类肉瘤减小了约75%。当向与损伤相同的***流经区域给药时,该制品尤其有效。
在一种状况下这种治疗尤其重要,其中该状况有证据表明为病毒仅限于损伤部位并几乎没有证据表明其出现在循环中(Nasir等Res.Vet.Sci.1997,63:289-290)。
这些结果显示除其它因素之外,T.inchonensis能用于治疗与***瘤病毒存在相关的常见皮肤肿瘤。例如,显示本发明可用于治疗生殖器疣(genitalwarts)和/或***前的子宫颈发育异常,两者都是由***瘤病毒感染造成的。
以上说明书中所提及的所用公开文献均纳入本文作参考。对本领域普通技术人员来说,不脱离本发明范围和精神的本发明所述方法和***的各种修改和变化是显而易见的。尽管本发明描述了相关的具体优选的实施方案,但是应当能理解所要求的发明并不仅限于这些特定的具体实施方案。事实上,对于生物化学和生物技术或相关领域普通技术人员来说,所述的实施发明的模式的各种显而易见的修改都应纳入以下权力要求的范围之内。
表4:实验设计。6只断奶的远系杂交的雌性小鼠组成的组接受如下治疗:
第0天 | 第7天 | 第14天 | 第21天 | 第28天 | 第35天 | 第42天 | 第49天 | 第56天 | 第77天 | 第84天 | 第105天 | |
组1 | R/r | DTP | DTP | DTP | MMR | BCG | TT | |||||
组2 | R/r | DTP | DTP | DTP | MMR | BCG | TT | |||||
组3 | DTP | DTP | DTP | MMR | BCG | TT | ||||||
组4 | DTP | DTP | DTP | MMR | BCG | TT | ||||||
组5 | BCG | TT | ||||||||||
组6 | R/r | BCG | TT | |||||||||
组7 | R/r/DTP | DTP | DTP | MMR | BCG | TT |
说明
R/r 赤红球菌
DTP 白喉/破伤风/百日咳
MMR 麻疹/腮腺炎/风疹
BCG BCG疫苗
TT 结核菌素测试
参考文献
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Claims (20)
1.一种免疫调节剂组合物,其包含选自红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)和冢村氏菌属(Tsukamurella)的104-1010个灭活的完整细菌细胞,其中所述免疫调节剂组合物在使用时调节细胞免疫应答。
2.根据权利要求1所述的免疫调节剂组合物,其中所述组合物进一步包含抗原或抗原决定簇。
3.根据权利要求2的免疫调节剂组合物,其中所述组合物包含两种或多种抗原或抗原决定簇。
4.根据权利要求2所述的免疫调节剂组合物,其中所述抗原或抗原决定簇是选自以下一种或多种的抗原或抗原决定簇:卡介苗(BCG)疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)、母牛分枝杆菌、或其部分。
5.根据权利要求4所述的免疫调节剂组合物,其中所述组合物包含两种或多种抗原或抗原决定簇。
6.权利要求1所述的免疫调节剂组合物,其中所述组合物包含抗原和佐剂,其中所述佐剂包含选自红球菌属、戈登氏菌属、迪茨氏菌属和冢村氏菌属的完整细菌细胞。
7.根据权利要求6所述的免疫调节剂组合物,其中所述抗原是抗原决定簇。
8.根据权利要求7所述的免疫调节剂组合物,其中所述组合物包含两种或多种抗原决定簇。
9.根据权利要求7所述的免疫调节剂组合物,其中所述抗原决定簇是选自以下一种或多种的抗原决定簇:卡介苗(BCG)疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)、母牛分枝杆菌、或其部分。
10.根据权利要求9所述的免疫调节剂组合物,其中所述组合物包含两种或多种抗原决定簇。
11.一种药物组合物,其包含选自红球菌属、戈登氏菌属、迪茨氏菌属和冢村氏菌属的104-1010个灭活的完整细菌细胞,以及任选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂,其中所述药物组合物在使用时调节细胞免疫应答。
12.根据权利要求11所述的药物组合物,其中所述组合物进一步包含抗原或抗原决定簇。
13.根据权利要求12所述的药物组合物,其中所述组合物包含两种或多种抗原或抗原决定簇。
14.根据权利要求12所述的药物组合物,其中所述抗原或抗原决定簇是选自以下一种或多种的抗原或抗原决定簇:卡介苗(BCG)疫苗、白喉类毒素疫苗、白喉/破伤风/百日咳疫苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)、母牛分枝杆菌、或其部分。
15.根据权利要求14所述的药物组合物,其中所述组合物包含两种或多种抗原或抗原决定簇。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物,其中所述细菌选自红球菌属细菌。
17.根据权利要求16所述的免疫调节剂组合物和/或药物组合物,其中所述细菌是以下的一种或多种:赤红球菌(Rhodococcus ruber)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodococcus)、椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)、嗜粪红球菌(Rhodococcus coprophilus)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)和红串红球菌(Rhodococcus erythopolis)。
18.根据权利要求1至17中任一所述的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备调节细胞免疫应答的药物中的用途。
19.根据权利要求1至17中任一所述的免疫调节剂组合物或药物组合物在制备疫苗中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途,其中所述疫苗是预防性疫苗或治疗性疫苗。
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