CN104515823A

CN104515823A - 一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素a的方法

Info

Publication number: CN104515823A
Application number: CN201410781469.3A
Authority: CN
Inventors: 林佶; 许燕; 赵世文; 徐丹先
Original assignee: YUNNAN PROVINCIAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: YUNNAN PROVINCIAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: CN104515823B

Abstract

本发明公开了一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。属于食品安全生物毒素检测技术领域。主要步骤包括食品中酵米面黄杆菌毒素A的提取、浓缩。运用串联质谱，使用ESI源，在负离子模式下，确定了酵米面黄杆菌毒素A的分子离子峰(M-1离子)为485.4，三个有代表性特征子离子，分别为441.4、397.3、321.5。将浓缩好的样品用UPLC经Waters C18 2.1mm×100mm，1.8μm分离，在MRM模式下进行定性定量分析。本发明解决了TLC和HPLC检测方法的不足，简化了提取步骤、提高了检测灵敏度和准确度，重复性好，易于推广应用。

Description

一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法

技术领域

本发明涉及一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。属于食品安全生物毒素检测技术领域。

背景技术

酵米面黄杆菌是从引起食物中毒的酵米面中分离出来的一种细菌。目前认为该菌是引起食物中毒细菌中死亡率较高的一种。流行病学调查，我国近年在广西、云南、湖北、广东、四川、河北、江苏等省发生多起酵米面食物中毒事件。山东、河南、河北等省因进食变质银耳也发生同类中毒。中毒多发生在农村，特别是山区、半山区，城镇偶见。引起中毒的主要食品是酵米面(玉米加水浸泡10～30天,用水洗,磨浆过滤,沉淀晾干成粉,加工后做成的食品)和变质的银耳。中毒发病急、病情严重、发展迅速，病死率高达30～90％，至今尚无特效的治疗方法。

目前检测酵米面黄杆菌毒素A(米酵菌酸)的国家标准检测方法仅有GB/T 5009.189-2003银耳中米酵菌酸的测定中规定的薄层色谱法和高效液相色谱法，但该方法，仅能检测银耳中的黄杆菌毒素A(米酵菌酸)，且样品提取复杂，耗时长，检测灵敏度低，无法准确定性等问题。

发明内容

本发明提供了一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法包括步骤如下：

(1)样品提取步骤；

(2)酵米面黄杆菌毒素A的分子离子峰、特征子离子峰及MAM参数的确定；

(3)样品定性定量检测。

所述样品提取具体步骤如下：

(1)不含油样品：

准确称取2.000g食物，加10ml纯水匀浆，用6mol/L HCL调至pH2～3，8000r/min离心10min，取上清液，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40℃旋转蒸发至干，用甲醇定容至1ml，待测；

(2)含油样品：

准确称取2.000g食物，加10ml 40g/L碳酸氢钠匀浆，8000r/min离心10min，取上清液，加石油醚10ml提取，弃去石油醚，用6mol/LHCL调至pH2～3，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40℃旋转蒸发至干，用甲醇定容至1ml，待测；

所述确定酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰、特征子离子峰及

MAM参数具体的步骤如下：

(1)把酵米面黄杆菌毒素A的标准品，配置成1mg/kg的浓度，通过蠕动泵注入串联质谱仪，找到酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰(母离子，M-1离子)为485.4、

(2)通过调节串联质谱仪的碰撞气能量(CE)和去簇电压(DP)撞击酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰(母离子，M-1离子)485.4，找到三个有代表性特征子离子，分别为441.4、397.3、321.5。

(3)通过串联质谱仪把碰撞气能量(CE)和去簇电压(DP)调节到最佳状态。选择测定酵米面黄杆菌毒素A的离子对、碰撞电压和去簇电压详见表1。

表1酵米面黄杆菌毒素MRM监测参数

所述样品检测具体步骤如下：

(1)对步骤2处理后的样品使用超高效液相色谱和在ESI负离子模式下用串联四极杆质谱进行定性定量分析；

①色谱条件为：Waters BEH HILIC 1.7μm 2.1×100mm色谱柱及同种填料不同柱形的色谱柱；进样量5～20μl；柱温为30℃；流动相A为水，其中含有0.1％甲酸：B为甲醇，流动相比率A:B＝30％:70％，等梯度洗脱3min，流速300μl/min；

②质谱条件为：离子化方式：电喷雾离子源负离子模式；检测方式：MRM；碰撞气：Midium；气帘气：25psi；雾化气：45psi；加热气：55psi；喷雾电压：-4500V；去溶剂温度：400℃；扫描时间:20ms。

(2)样品的定性测定：对酵米面黄杆菌毒素A标准品及对步骤2处理后的样品溶液按照上述UPLC/MS/MS测定条件分别进行测定，如果进行样品测定时，检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并3个二级特征子离子均出现，且与标准样品的3个特征离子相一致，则可判断样品中存在酵米面黄杆菌毒素A。

(3)样品的定量测定：本方法中UPLC/MS/MS采用外标校准曲线法定量测定为减少基质对定量的测定的影响，采用不含酵米面黄杆菌毒素的样品洗脱液来配制标准系列溶液，绘制标准曲线，计算样品中酵米面黄杆菌毒素A的含量。为了保证定量结果的准确性，所测样品中酵米面黄杆菌毒素的响应值均应在标准曲线的线性范围内。

本发明的积极效果如下：

1、该发明与国家仅有的GB/T 5009.189-2003银耳中米酵菌酸的测定标准方法比较，简化了提取步骤，增加了含油样品提取步骤。

2、该发明通过UPLC/MS/MS找到酵米面黄杆菌毒素A的三个有代表性的子离子441.4、397.3、321.5，并使用这三个子离子进行定性检测，能有效降低干扰，大大提高定性检测的准确性。

3、该发明对酵米面食物样品中酵米面黄杆菌毒素A的方法检出限0.25μg/kg，两个水平的加标回收率在76.8％～101.6％，相对标准偏差均为8.5％。该方法测定酵米面食物样品中的酵米面黄杆菌毒素快速、准确、可靠，灵敏度高。

附图说明

图1是酵米面黄杆菌毒素A子离子质谱图；

图中可以看出，本发明的方法能很好的显示酵米面黄杆菌毒素A的3个有代表性的子离子，分别为441.4、397.3、321.5。

图2是酵米面黄杆菌毒素A样品提取离子(XIC)图；

图中可以看出，本发明的方法能很好的分离酵米面黄杆菌毒素A，且出峰稳定、快速。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径得到。

实施例1

1仪器

1290超高效液相色谱仪(Agilent)\AB3200Q TRAP(ABSCIEX)；Nanopure纯水机(Barnstead公司)；FLUCA匀浆机；SIGMA大容量高速离心机；Buchi旋转蒸发仪，1.0ml微量注射器(agilent)。

2试剂

6mol/L盐酸，40g/L碳酸氢钠、石油醚(沸程30℃～60℃)、正己烷(HPLC)、甲醇(HPLC)、甲酸(HPLC)、标准品:酵米面黄杆菌毒素

A 1mg/ml Sigma公司。

3色谱条件：Waters BEH HILIC 1.7μm 2.1×100mm色谱柱；进样量20μl；柱温为30℃；流动相A为水(0.1％甲酸)：B为甲醇，流动相比率A:B＝30％:70％等梯度洗脱3min，流速300μl/min。

4质谱条件离子化方式：电喷雾离子源(ESI)负离子模式；检测方式：多离子反应监测(MRM)；碰撞气(CAD)：Midium；气帘气(CUR)：25psi；雾化气(GS1)：45psi；加热气(GS2)：55psi；喷雾电压(IS)：-4500V；去溶剂温度(TEM)：400℃；扫描时间:20ms,酵米面黄杆菌毒素A(米酵菌酸)保留时间、离子对碰撞电压和去簇电压见表2。

表2酵米面黄杆菌毒素AMRM监测参数

5标准储备液的配制取1mg/ml酵米面黄杆菌毒素A标准品0.1ml用甲醇定容至10ml，相当于10mg/L，避光，4℃可保存3个月。

6标准使用液的配制取0.1ml标准储备液，用甲醇定容至10ml，相当于100μg/L，使用时用流动相稀释成：0、1、5、10、50、100μg/L的标准系列进行测定并绘制标准曲线。

7样品的前处理

7.1不含油样品

准确称取2.000g食物，加10ml纯水匀浆，用6mol/L HCL调至pH2～3，8000r/min离心10min。取上清液，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40℃旋转蒸发至干，用甲醇定容至1ml，待测。

7.2含油样品

准确称取2.000g食物，加10ml 40g/L碳酸氢钠匀浆，8000r/min离心10min。取上清液，加石油醚10ml提取，弃去石油醚。用6mol/LHCL调至pH2～3，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40℃旋转蒸发至干，用甲醇定容至1ml，待测。

8线性范围与检出限

酵米面黄杆菌毒素A的线性方程线性范围和线性相关系数见表3以信噪比为3倍噪声估算检出限(LOD)，样品中酵米面黄杆菌毒素A的检出限为0.25μg/kg。

表3酵米面黄杆菌毒素的线性方程、相关系数和检出限

9方法的回收率与精密度

取3份样品，一份吊浆面，一份已煮熟吊浆粑，一份已生吊浆粑分别进行低、高浓度2种不同浓度加标试验，回收率在76.8％～101.6％，6次平行测定变异系数(CV％)在4.4～5.8,结果见表4，相对标准偏差为8.5％。

表4方法的回收率和精密度(n＝6)

10定性测定

样品溶液和标准品按照UPLC/MS/MS设定的条件分别进行测定，进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的3个二级特征离子均出现，且与标准样品的3个特征离子相一致，则可判断样品中存在酵米面黄杆菌毒素A。

11定量测定

本方法中UPLC/MS/MS采用外标校准曲线法定量测定为减少基质对定量的测定的影响，采用不含酵米面黄杆菌毒素A的样品洗脱液来配制标准系列溶液，绘制标准曲线，并且保证所测样品中酵米面黄杆菌毒素A的响应值均在仪器的线性范围内。检测该中毒事件中采集的3个食物样品，在吊浆面中检出酵米面黄杆菌毒素A1.73mg/kg、已煮熟的吊浆粑中检出酵米面黄杆菌毒素A 3.08mg/kg、生吊浆粑中检出酵米面黄杆菌毒素A 9.67mg/kg。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法，其特征在于方法包括步骤如下：

(1)样品提取步骤；

(3)样品定性定量检测。

2.如权利要求1所述的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法，其特征在于：所述样品提取具体步骤如下：

(1)不含油样品：

(2)含油样品：

准确称取2.000g食物，加10ml 40g/L碳酸氢钠匀浆，8000r/min离心10min，取上清液，加石油醚10ml提取，弃去石油醚，用6mol/LHCL调至pH2～3，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40℃旋转蒸发至干，用甲醇定容至1ml，待测。

3.如权利要求1所述的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法，其特征在于：所述确定酵米面黄杆菌毒素A分子的离子峰、特征子离子峰及MAM参数具体的步骤如下：

(1)把酵米面黄杆菌毒素A的标准品，配置成1mg/kg的浓度，通过蠕动泵注入串联质谱仪，找到酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰(母离子，M-1离子)为485.4；

(2)通过调节串联质谱仪的碰撞气能量CE和去簇电压DP撞击酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰(母离子，M-1离子)485.4，找到三个有代表性特征子离子，分别为441.4、397.3、321.5；

(3)通过串联质谱仪把碰撞气能量CE和去簇电压DP调节到最佳状态，选择测定酵米面黄杆菌毒素A的离子对、碰撞电压和去簇电压详见下表；

4.如权利要求1所述的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法，其特征在于：所述样品检测具体步骤如下：

②质谱条件为：离子化方式：电喷雾离子源负离子模式；检测方式：MRM；碰撞气：Midium；气帘气：25psi；雾化气：45psi；加热气：55psi；喷雾电压：-4500V；去溶剂温度：400℃；扫描时间:20ms；

(2)对步骤2处理后的样品进行定性测定：标准品及样品溶液按照上述UPLC/MS/MS测定条件分别进行测定，如果进行样品测定时，检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的3个二级特征离子均出现，且与标准样品的3个特征离子相一致，则可判断样品中存在酵米面黄杆菌毒素A；

(3)对步骤2处理后的样品进行定量测定：本方法中UPLC/MS/MS采用外标校准曲线法定量测定，为减少基质对定量的测定的影响，采用不含酵米面黄杆菌毒素A的样品洗脱液来配制标准系列溶液，绘制标准曲线，并且保证所测样品中酵米面黄杆菌毒素A的响应值均在仪器的线性范围内。