CN104422750B - 一种烟叶中磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的检测方法 - Google Patents

一种烟叶中磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别的方法。利用新鲜烟叶中磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值对代谢组学研究中的新鲜烟叶质量进行判别，该法操作简单快速、结果准确可靠，可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。

Description

一种烟叶中磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，是一种基于新鲜烟叶中的脂类物质含量对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别的方法。
背景技术
植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究植物体系的一种技术。通过对植物体内小分子化合物代谢的轮廓分析可直接获得植物的生理生态变化。在植物代谢组学研究中，样品的质量决定着分析数据的真实可靠性；而样品的保存条件决定样品质量的好坏。对于不能在取样后立刻进行代谢组学分析的植物样品，通常建议超低温保存；即在-80℃以下的极低温度环境下保存生物样品。在超低温环境下植物样品的代谢过程会大大减缓，以此来保持样品的稳定性。
烟草作为模式生物和重要的经济作物，近几年来针对烟草的代谢组学研究越来越多。但由于烟草样品保存不当而导致的质量发生变化而导致代谢物含量失真的情况时有发生。急需一种简单、快速的分析方法对植物代谢组学研究中的烟草样品质量进行判别。
脂类是烟草中一类重要物质，具有重要的生物学功能。它是烟草代谢过程中所需燃料的贮存形式，可作为能源；类脂（主要是磷脂）是构成生物膜的主要成分，膜的不可通透性、对各种物质的扩散与运输功能等，均与其有关；脂类作为细胞的表面物质，与细胞识别、组织免疫等有密切关系。近年来有关植物中脂类化合物的提取、检测等方法的报道也是层出不穷，但未曾有人提出将新鲜烟叶中的脂类物质含量或含量比值用于代谢组学新鲜烟叶样品质量的判别。
发明内容
本发明目的在于提供了一种对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别的方法。利用新鲜烟叶中磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别，该法操作简单快速、结果准确可靠。
为了实现本发明目的，本发明技术方案为：
一种基于代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量的判别方法，通过检测新鲜烟叶中磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别。
将得到磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的比值作为区分代谢组学正常样品、变质样品及部分变质样品的标准，其中待测品种中磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的比值在1.8及以上的为正常样品，可用于代谢组学分析，磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的比值在0.1以下的为变质样品，磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的比值在0.1-1.8之间的为部分变质样品。
其具体方法为：
1）称取一定量的新鲜烟叶样本，加入含内标的甲醇，涡旋0.5-1.5分钟；再加入甲基叔丁基醚，涡旋0.5-1.5分钟；最后加入水，涡旋0.5-1.5分钟；静置后离心，将上清液稀释2-4倍，移至进样瓶中用于HPLC-MS分析。
2）HPLC具体参数：色谱柱：WatersT3；柱温：55℃；进样量4μL；柱流速：0.26mL/min；流动相A：6/4乙腈/水（含10mM乙酸铵）；流动相B：9/1异丙醇/乙腈（含10mM乙酸铵）；洗脱梯度0-0.01min：0-30%B，0.01-1.5min：30%-54%B，1.5-4.0min：54-55%B，4.0-14.0min：55-80%B，14-17.0min：80-85%B，17-17.5min：85-100%B，17.5-22.5min：100%-30%B，22.5-27.5min：30%B；MS具体参数：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350℃，干燥气流速为9mL/min，雾化气压45psig；离子源温度350℃，毛细管电压为4000V，溶剂化离子去簇电压230V，锥孔电压65V，质心（Centroid）模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z400～1000。
所述内标及其含量为：磷脂酰乙醇胺0.02-0.04g/L及甘油三酯0.002-0.004g/L；
所述烟草鲜叶、含内标的甲醇溶液、甲基叔丁基醚和水按质量/体积比加入量为=10～30:0.1～0.3：0.5～0.7：0.1～0.15。
本发明研究人员经过大量新鲜烟叶样品的分析研究，发现新鲜烟叶如果保存不当，其脂类物质的含量会发生较大变化，磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值也会明显降低，此类样品将不能用于代谢组学分析。因此可以以磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值作为一个标准对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别。
本发明研究人员利用新鲜烟叶样品中磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值和样品质量的相关性，对代谢组学新鲜烟叶样品进行质量判别。本发明的优点：操作简单快速，结果准确可靠；样品用量少；适用于不同生育期的新鲜烟叶。本方法可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。
具体实施方式
下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
本发明将磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值作为区分代谢组学正常样品、变质样品及部分变质样品的标准。即待测品种中磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在1.8及以上的为正常样品，可用于代谢组学分析，磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在0.1以下的为变质样品，磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在0.1-1.8之间的为部分变质样品。
磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）是植物中广泛存在的两种脂类物质，本实验采用高效液相色谱质谱联用法（HPLC-MS）对新鲜烟叶样品中的磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）进行相对定量分析。分析步骤如下：
1）称取一定量的新鲜烟叶样本（10mg-30mg），加入含内标磷脂酰乙醇胺（15:0/15:0）（0.02-0.04g/L,avanti）及甘油三酯（15:0/15:0/15:0）（0.002-0.004g/L,avanti）的纯甲醇(100-300μL，Merk)，涡旋0.5-1.5分钟；再加入甲基叔丁基醚(500-700μL,sigma)，涡旋0.5-1.5分钟；最后加入水(100-150μL)，涡旋0.5-1.5分钟；静置后离心，将上清液稀释2-4倍，移至进样瓶中用于HPLC-MS分析。
2）HPLC（Agilent1200）具体参数：色谱柱：WatersT3（1.8μm，2.1×100mm）；柱温：55℃；进样量4μL；柱流速：0.26mL/min；流动相A：6/4乙腈/水（含10mM乙酸铵,sigma）；流动相B：9/1异丙醇/乙腈（含10mM乙酸铵,sigma）；洗脱梯度0-0.01min：0-30%B，0.01-1.5min：30%-54%B，1.5-4.0min：54-55%B，4.0-14.0min：55-80%B，14-17.0min：80-85%B，17-17.5min：85-100%B，17.5-22.5min：100%-30%B，22.5-27.5min：30%B。MS（AgilentQTOF6510）具体参数：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350℃，干燥气流速为9mL/min，雾化气压45psig；离子源温度350℃，毛细管电压为4000V，溶剂化离子去簇电压230V，锥孔电压65V，质心（Centroid）模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z400～1000。
在上述条件下可定性新鲜烟叶中的120种脂类物质，采用内标校正法对脂类物质进行相对定量。
磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)是一种物质，括号中表示的是脂肪酸链的链长；磷脂酰乙醇胺（15:0/15:0）是内标，用来校正分析过程中的误差。两者属于同一个类别，但是脂肪酸链长不同。
实施例1
本批待测样本包括福建、贵州、湖南等7个省份、7个品种、15个产地，5个不同生育期的36个点共206份烟草鲜叶样本（每个点有5-7个生物学重复）。其中中部叶成熟时期的福建龙岩云烟87，贵州黔南的毕纳1号、湖南张家界的K326等烟草鲜叶样本及云南大理现蕾期中烟100及下部叶成熟期红大，贵州遵义盛花期红大样本因液氮不足等原因已完全褐化，河南许昌的样本部分褐化，其他样本保存完好。
样品分析步骤如下所述：
1）称取20mg的新鲜烟叶样本，加入含磷脂酰乙醇胺（15:0/15:0）（0.03g/L，avanti）及甘油三酯（15:0/15:0/15:0）（0.003g/L,avanti）的纯甲醇200μL，涡旋0.5-1.5分钟；再加入600μL甲基叔丁基醚（sigma），涡旋0.5-1.5分钟；最后加入120μL水，涡旋0.5-1.5分钟；静置后离心（15000rpm,10分钟），将上清液稀释2-4倍（稀释剂：异丙醇/乙腈/水:65/30/5），移至进样瓶中用于HPLC-MS分析。
2）HPLC（Agilent1200）具体参数：色谱柱WatersT3（1.8μm，2.1×100mm）；柱温：55℃；进样量4μL；柱流速：0.26mL/min；流动相A：6/4乙腈/水（含10mM乙酸铵，sigma）；流动相B：9/1异丙醇/乙腈（含10mM乙酸铵，sigma）；洗脱梯度0-0.01min：0-30%B，0.01-1.5min：30%-54%B，1.5-4.0min：54-55%B，4.0-14.0min：55-80%B，14-17.0min：80-85%B，17-17.5min：85-100%B，17.5-22.5min：100%-30%B，22.5-27.5min：30%B。MS（AgilentQTOF6510）具体参数：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350℃，干燥气流速为9mL/min，雾化气压45psig；离子源温度350℃，毛细管电压为4000V，溶剂化离子去簇电压230V，锥孔电压65V，质心（Centroid）模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z400～1000。
该分析条件下获得了上述206份新鲜烟叶中120种脂类物质的相对含量（即每种脂质的质谱响应与内标响应的比值），发现磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值变化显著，见表1。
表1实施例1中所用实验样品信息及磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值
经过以上实验，发明人发现采用HPLC-MS方法测定成熟期新鲜烟叶样品中的脂类物质含量，褐化样品中发现褐化样品的大部分脂类物质含量显著降低，磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值显著降低。本发明将磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值作为区分代谢组学正常样品、变质样品及部分变质样品的标准。即待测品种中磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在1.8及以上的为正常样品，可用于代谢组学分析，磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在0.1以下的为变质样品，磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在0.1-1.8之间的为部分变质样品。
实施例2
随机挑选来自中国3个省份，8个种植地，5个不同生育期，5个品种20个点共55份烟草鲜叶样本（每个点有5-6个生物学重复），对其中的脂类物质进行测定。样品分析步骤如下所述：
1）称取20mg的新鲜烟叶样本，加入含磷脂酰乙醇胺（15:0/15:0）（0.03g/L，avanti）及甘油三酯（15:0/15:0/15:0）（0.003g/L，avanti）的纯甲醇200μL，涡旋0.5-1.5分钟；再加入甲基叔丁基醚600μL（sigma），涡旋0.5-1.5分钟；最后加入水120μL，涡旋0.5-1.5分钟；静置后在15000rpm下离心10分钟，将上清液稀释2-4倍（稀释剂：异丙醇/乙腈/水:65/30/5），移至进样瓶中用于HPLC-MS分析。
2）HPLC（Agilent1200）具体参数：色谱柱：WatersT3（（1.8μm，2.1×100mm）；柱温：55℃；进样量4μL；柱流速：0.26mL/min；流动相A：6/4乙腈/水（含10mM乙酸铵，sigma）；流动相B：9/1异丙醇/乙腈（含10mM乙酸铵，sigma）；洗脱梯度0-0.01min：0-30%B，0.01-1.5min：30%-54%B，1.5-4.0min：54-55%B，4.0-14.0min：55-80%B，14-17.0min：80-85%B，17-17.5min：85-100%B，17.5-22.5min：100%-30%B，22.5-27.5min：30%B。MS（AgilentQTOF6510）具体参数：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350℃，干燥气流速为9mL/min，雾化气压45psig；离子源温度350℃，毛细管电压为4000V，溶剂化离子去簇电压230V，锥孔电压65V，质心（Centroid）模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z400～1000。
该分析条件下获得了上述55份烟草鲜叶中120种脂类物质的相对含量。按照附例1所述标准对所测样本进行质量判别。待测品种中磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在1.8以上的均为正常样本。磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在0.1以下的为褐化变质样本，其中包括贵州毕节云烟97的中部叶成熟期样本，云南大理K326的盛花期样本。磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值在0.1与1.8之间的为部分变质样本，包括河南许昌中烟100的中部叶成熟期样本。此结果与样本保存过程中的液氮不足行为完全吻合。表2列出了本实施例中实验样本的信息及磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值。
表2实施例2中所用实验样品信息及磷脂酰乙醇胺(18:3/18:3)与甘油三酯（16:0/16:0/16:0）含量的比值
此结果说明本发明提出的代谢组学新鲜烟叶样品质量判别方法在不同生长期的不同烟叶样品中能得到同样的区分效果，也表明本发明方法的可行性和可靠性。
尽管对本发明已作了详细的说明并印证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。

Claims (2)

1.一种烟叶中磷脂酰乙醇胺与甘油三酯含量的检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
1)称取一定量的新鲜烟叶样本，加入含内标的甲醇，涡旋0.5-1.5分钟；再加入甲基叔丁基醚，涡旋0.5-1.5分钟；最后加入水，涡旋0.5-1.5分钟；静置后离心，将上清液稀释2-4倍，移至进样瓶中用于HPLC-MS分析；
2)HPLC具体参数：色谱柱：WatersT3；柱温：55℃；进样量4μL；柱流速：0.26mL/min；流动相A：6/4乙腈/水，流动相B：9/1异丙醇/乙腈，流动相A与B中均含10mM乙酸铵；洗脱梯度0-0.01min：0-30％B，0.01-1.5min：30％-54％B，1.5-4.0min：54-55％B，4.0-14.0min：55-80％B，14-17.0min：80-85％B，17-17.5min：85-100％B，17.5-22.5min：100％-30％B，22.5-27.5min：30％B；MS具体参数：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350℃，干燥气流速为9mL/min，雾化气压45psig；离子源温度350℃，毛细管电压为4000V，溶剂化离子去簇电压230V，锥孔电压65V，质心(Centroid)模式采集质谱数据；质量扫描范围m/z400～1000；
3)通过检测烟叶中磷脂酰乙醇胺与甘油三酯的含量，计算其比值，对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：其具体方法为：内标及其含量为：磷脂酰乙醇胺0.02-0.04g/L及甘油三酯0.002-0.004g/L；
所述烟草鲜叶、含内标的甲醇溶液、甲基叔丁基醚和水按质量/体积比加入量为10～30mg:0.1～0.3mL:0.5～0.7mL:0.1～0.15mL。
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