CN104513812B

CN104513812B - 分泌抗鸢尾黄斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN104513812B
Application number: CN201410629108.7A
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 于翠; 周雪平; 李娜
Original assignee: TECHNICAL CENTRAL FOR ANIMALS PLANTS AND FOOD INSPECTION AND QUARANTINE SHANGHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU; Zhejiang University ZJU
Current assignee: TECHNICAL CENTRAL FOR ANIMALS PLANTS AND FOOD INSPECTION AND QUARANTINE SHANGHAI ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2034-11-10
Also published as: CN104513812A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗鸢尾黄斑病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用差速离心的方法提纯的鸢尾黄斑病毒病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗鸢尾黄斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株12C10，其保藏号为CGMCC No.9336。该杂交瘤细胞分泌的单抗腹水ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链，且该单抗能非常特异和灵敏地检测鸢尾黄斑病毒。12C10分泌的单抗仅与鸢尾黄斑病毒有特异性反应，而不与番茄斑萎病毒、芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒等反应。该杂交瘤细胞株及其分泌的单抗为该病毒病的诊断、检验检疫及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗鸢尾黄斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗鸢尾黄斑病毒（IYSV）单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

鸢尾黄斑病毒（Iris yellow spot virus, IYSV）是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒。自20世纪80年代以来随着植物病毒研究手段的提高和分子生物学技术的迅速发展，Tospovirus 属内多种新病毒被鉴定和命名。IYSV最早于1992年在荷兰的鸢尾上被发现据文献报道，IYSV的寄主范围较窄，但能侵染单子叶植物。鸢尾受到侵染时，最初出现褪绿斑，随病情发展为黄色坏死斑。依据栽培品种的不同，受侵染植物可达50%～95%。此外IYSV还可自然侵染洋葱、韭菜等蔬菜作物。同其它Tospovirus 病毒一样，IYSV也通过蓟马传播，病情严重的地区，通常蓟马也比较多。目前该病毒在荷兰、意大利、德国、美国、日本都有报道，但国内还没有发生危害的报道。

鉴于Tospovirus 属病毒复杂的血清学关系和我国对鸢尾、洋葱等进口量的不断增加，有必要对该病毒进行相应的检测技术研究，建立相应的技术储备。

针对鸢尾黄斑病毒（IYSV）单克隆抗体的制备展开工作。当前监测体系尚不完善，甚至主要流行区也未开展相关预测预报的工作。目前用来检测这种病毒的方法主要采用RT-PCR检测、电镜观察等方法。这几种方法都具有其局限性，而且不适合大批量的田间样品检测。而血清学的方法适于田间样品批量检测，但必须依赖于特异性的病毒单抗。目前国内外未研制出针对这种病毒的特异性的单克隆抗体。

以鸢尾黄斑病毒（IYSV）提纯病毒粒子为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗IYSV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞12C10，以其分泌的单抗为核心建立了检测IYSV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并成功应用于鸢尾黄斑病毒的检测，从而为我国鸢尾黄斑病毒的检验检疫，科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗鸢尾黄斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗鸢尾黄斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株12C10，它能分泌抗鸢尾黄斑病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株12C10于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9336；

抗鸢尾黄斑病毒的单克隆抗体的腹水ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与鸢尾黄斑病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能检测出传毒介体蓟马体内的鸢尾黄斑病毒；

抗鸢尾黄斑病毒的单克隆抗体仅能与鸢尾黄斑病毒有特异性反应，而不与番茄斑萎病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反应；

抗鸢尾黄斑病毒单克隆抗体在该病毒检测、检验检疫上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株分泌抗鸢尾黄斑病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测鸢尾黄斑病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测鸢尾黄斑病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于植物和其传毒介体蓟马中鸢尾黄斑病毒的检测，也可以用于该病毒的检验检疫。

附图说明

图1 是dot-ELISA方法检测鸢尾黄斑病毒的灵敏度分析；

图2 是dot-ELISA方法检测烟草中鸢尾黄斑病毒病的结果。

具体实施方式

分泌抗鸢尾黄斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株12C10，它能分泌抗鸢尾黄斑病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株12C10于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.9336，分类命名为：分泌抗鸢尾黄斑病毒(IYSV)单抗杂交瘤细胞；

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗鸢尾黄斑病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测IYSV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并可应用于IYSV的检测及其检验检疫。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

1)将大研钵和组织搅拌器预冷；

2)称取500g病叶，每100g病叶中加入 pH 7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(即 PB缓冲液）200ml（含0.01M Na-EDTA和0.1%巯基乙醇），匀浆2分钟后用双层尼龙纱布过滤，滤液离心（6000r/min, 20min）去植物组织残渣；

3)所得上清液边搅拌边滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG（分子量为6000）和0.1mol/L NaCl, 4℃搅拌4h以上；

4)离心（11000r/min, 15min）得沉淀；

5)沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂和0.5M脲)充分洗涤，离心（6000r/min, 15min）后吸出上清置于离心管，沉淀再洗涤，离心反复3次；

6)合并上清液，超速离心（33000r/min，100min）所得沉淀悬浮后离心（8000r/min,15min）；

7)合并上清液再超速离心（33000r/min，100min），离心管底部加有20%-30%蔗糖垫；

8)所得沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂）悬浮，悬浮液即为病毒提纯液；

2.免疫动物

用提纯的鸢尾黄斑病毒（IYSV）的病毒粒子免疫四周龄体重18-20g BALB/c 雌性小鼠。即鸢尾黄斑病毒（IYSV）的病毒粒子100µL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO₂的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-50%时，以感染IYSV病毒的烟草叶片和提纯病毒为检测抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获72个阳性孔。选择10个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗IYSV的特异性单抗的杂交瘤细胞株12C10。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测

用感染番茄斑萎病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反应的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以鸢尾黄斑病毒（IYSV）为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃ 2小时使其吸附于ELISA板孔；PBST洗涤三次后用3％的脱脂奶粉或1％ BSA或3％牛血清封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100ul/孔，37℃1-2 小时；PBST洗涤三次后加入稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时；PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，12C10单抗对IYSV有特异性反应，而与番茄斑萎病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系及健康植物均无免疫反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06 M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果为12C10单抗亚类为IgG1、kappa链。用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，检测结果表明上述单抗腹水效价在10^－7。

二、病毒免疫学检测方法及其检测试剂盒

1. dot-ELISA方法的建立及其田间检测应用

1.1 dot-ELISA检测鸢尾中IYSV方法的建立及其田间样品检测

将鸢尾叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/LPBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病鸢尾叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3-4次，每次3 min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜4-5次，每次3 min;66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测鸢尾病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明12C10单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测IYSV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当鸢尾叶片稀释到1:20480倍（w/v, g/mL）时，以12C10单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:20480倍稀释（图1）。

用建立的dot-ELISA方法对上海出入境检验检疫局截获的可疑感染IYSV样品进行检测，结果发现，22个样品中有14个样品产生紫色的阳性斑点（图2）。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到IYSV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染IYSV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于鸢尾样品中IYSV的检测和检疫。

1.2 dot-ELISA检测蓟马体内IYSV方法的建立

单头蓟马放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入10 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂蓟马后、5000 rpm 离心3 min，取3 μL上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测鸢尾中IYSV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，显色底物是HRP的显色底物，即如TMB沉淀型显色底物等。同时设非带毒和带毒的蓟马作为阴性和阳性对照。

用方阵试验确定检测蓟马的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明12C10单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:6000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测蓟马体内IYSV的dot-ELISA方法，检测结果表明携带IYSV的蚜虫呈现蓝色斑点，而无毒的蓟马没有任何显色反应，即建立的dot-ELISA方法能特异性地检测蓟马体内的IYSV。

2.以单抗为核心建立的抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测IYSV病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液或按100 ul碳酸盐缓冲液每头蓟马加入后捣烂的上清100ul/孔加入ELISA板，IYSV病叶或携带IYSV蓟马为阳性对照，相应健叶或非带毒蓟马为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入5000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物或TMB 底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，或用2mol/L 氢氧化钠或硫酸终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405或450值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

ACP-ELISA方法检测灵敏度检测

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：10至5120作倍比稀释或单头蓟马进行倍比稀释20uL/头至3200uL/头，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：10～40960倍稀释的病叶汁液及单头蓟马稀释到160uL/头均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：40960，对蓟马的检测灵敏度达到160 uL/头，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

3. 检测IYSV的TAS-ELISA检测方法

3.1. TAS-ELISA 方法的操作流程：

1)抗IYSV的兔抗血清1:3000倍稀释后（合成的免疫原免疫兔子获得）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min；

3)加入检测样品100ul/孔。以IYSV病叶或携带IYSV的蓟马为阳性对照，以相应的健康样品或非带IYSV的蓟马作阴性对照，37℃ 1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃ 1-2h

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP或HRP标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃ 1-2h

6)PBST洗涤后加PNPP底物或TMB底物于室温显色5-30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，2mol/L 氢氧化钠或硫酸终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm或450nm的OD值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

3.2TAS-ELISA 检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA 方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕102400倍比稀释的兔抗IYSV血清；加入IYSV 病叶汁或蓟马匀浆液；纵向分别加用封闭液从1﹕5至1﹕2048000倍比稀释单抗腹水；AP或HRP标记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1﹕10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为IYSV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕5000、1﹕8000。

3.3.TAS-ELISA 方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将IYSV病叶汁或蓟马匀浆液用PBS倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA 检测病叶和蓟马的灵敏度分别达到1:81920倍稀释（w/v, g /mL）和160 uL/头，说明本方法具有很好的灵敏度。

4. 鸢尾黄斑病毒dot-ELISA检测试剂盒

1）试剂盒主要成分：

IYSV单克隆抗体1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

HRP标记的羊抗鼠IgG二抗1管 0.1ml

TMB底物1瓶 10ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2ml和1ml

阳性对照1 （含IYSV鸢尾叶汁）1管 2 ml

阳性对照2 （带毒IYSV蓟马）1管 2 ml

阴性对照1（健康鸢尾叶汁） 1管 2 ml

阴性对照2（健康蓟马匀浆液）1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）检测鸢尾样品的操作步骤：

a.将鸢尾叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01mol/L PBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3μl上清点到NC上，同时设置健康和感病鸢尾叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:3000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

f. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

g. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）检测蓟马样品的操作步骤：

a.单头蓟马放入0.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入20 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂虫子后、5000 rpm 离心3 min，取3 μL上清点到NC膜上，同时设置带毒和非带毒的蓟马分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

b. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

c. NC膜放入1:3000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

d. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:3000倍稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

e. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 膜放入TMB底物液中反应，肉眼观察结果；

f. 待阳性对照显色明显(蓝色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

4）保存及有效期

于2～8℃避光保存，有效期12个月。

5）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄•12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1.一种分泌抗鸢尾黄斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株12C10，其特征在于能分泌抗鸢尾黄斑病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株12C10于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9336。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株12C10分泌的抗鸢尾黄斑病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与鸢尾黄斑病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，能检测出传毒介体蓟马体内的鸢尾黄斑病毒。

3.一种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株12C10分泌的抗鸢尾黄斑病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体能与鸢尾黄斑病毒有特异性反应，而不与番茄斑萎病毒、花生环斑病毒、西瓜银色斑驳病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反应。

4.一种如权利要求2所述的抗鸢尾黄斑病毒的单克隆抗体在该病毒检测、检验检疫上的应用，其特征在于以该单克隆抗体为核心建立各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。