CN102533665B

CN102533665B - 分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN102533665B
Application number: CN 201210004165
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 周雪平; 董静云
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102533665A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。以纯化的RRSV重组外壳蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠，获得1株稳定传代并分泌抗RRSV的单克隆抗体的杂交瘤细胞4H5，其保藏号为CGMCCNo.5536。Westernblot检测结果表明细胞株4H5分泌的单抗与RRSV衣壳蛋白有特异性反应。4H5单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。利用4H5单抗建立的检测褐飞虱和水稻中RRSV的dot-ELISA检测方法，当单头褐飞虱稀释到800μL时，病叶1:320倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。建立的dot-ELISA方法能准确、特异、灵敏地检测田间褐飞虱及水稻样品中的RRSV病毒。抗RRSV单抗的制备及其检测方法的建立为该水稻病毒病的诊断、预测预报及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是上个世纪70年代末发现的一种新病毒，在东南亚、东亚和南亚一些国家局部发生，对水稻生产造成一定影响。目前主要发生在我国的广西、福建、湖南、江西、贵州、云南等地。病株表现浓绿矮缩，叶片扭曲呈锯齿状缺刻，在叶背和叶鞘生有细长脉肿。分蘖期前发病不能抽穗，后期发病，抽穗不完全、谷粒不充实等症状。发病田块一般减产10％～20%，严重的减产可达80％～100%，是影响水稻产量比较严重的病毒病害之一。RRSV为呼肠孤病毒科水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员，引起水稻齿叶矮缩病。RRSV基因组包括10条双链RNA片段(S1-S10)，其形态结构和基因组双链RNA的电泳图谱与该科另外两个属—植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)和斐济病毒属(Fifivirus)的病毒有较大的区别。RRSV具有双层衣壳，呈二十面体结构，完整病毒粒体的直径约为65nm，核心颗粒约50nm。电镜下可观察到直径50～66nm或是40nm的病毒粒子分布在感病水稻叶片韧皮细胞的病毒质体(viro-plasm)中；带毒虫体内的器官或组织里也可观察到直径40～45nm或50～75nm两类球形结晶状粒子，聚集或是分散地排列在细胞质的病毒质体中。水稻锯齿叶矮缩病主要是由褐飞虱传播的RRSV病毒引起，病株液汁、种子和土壤均不传毒。病毒粒子球状，底部有较宽的突起。其自然寄主有水稻、蟋蟀草、水蜈蚣和稗草，人工侵染的植物有大麦、小麦、燕麦、玉米、甘蔗、稗等10多种。RRSV的介体昆虫为褐飞虱(Nilaparvatalugens)，是一种迁飞性昆虫，其传播为持久性方式，但不经卵传播。褐飞虱的若虫蜕皮但不失毒，病毒在虫体中的分布以唾液腺中含量最高。介体最小获毒时间是3小时（h），平均9天(d)。最短的传毒期是1h，接种后10-36d显示症状，传毒率大约为40％。幼虫可能比成虫的传毒效率更高，雌虫和雄虫，长翅型和短翅型传毒效率相同。介体蜕皮时仍传毒，介体传毒通常具有间歇性传毒期，可保持1-4周或终生传毒。褐飞虱的四个型具有相似的传毒特性。为了掌握褐飞虱自然种群带毒及水稻发病状况，强化我国水稻齿叶矮缩病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测褐飞虱体内及水稻中RRSV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法、核酸电泳等可对小样本进行检测。本发明以原核表达的RRSV衣壳蛋白（CP）为抗原通过杂交瘤技术制备了1株抗RRSV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测RRSV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间RRSV的检测，从而为我国水稻齿叶矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5536，它能分泌抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体。

抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与水稻齿叶矮缩病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其免疫学检测试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株分泌的抗水稻齿叶矮缩病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测水稻齿叶矮缩病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测水稻齿叶矮缩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间水稻作物及褐飞虱中的水稻齿叶矮缩病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测水稻RRSV的灵敏度分析。感病水稻叶片分别从1:10，倍比稀释直到1:5120，CK-为健康水稻，1、2为同一样品的重复；

图2是dot-ELISA方法检测水稻田间样品中RRSV的结果，CK+为带毒为感染了水稻齿叶矮缩病毒的水稻，CK-为健康水稻；

图3是dot-ELISA方法检测褐飞虱体内RRSV的灵敏度分析；

图4是dot-ELISA方法检测田间褐飞虱体内RRSV的结果，1、2、3、4、5、6、7、8分别代表8个田间褐飞虱样品。

具体实施方式

分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2011年11月 28日，保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5536，它能分泌抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体。

本发明提供的杂交瘤细胞株大量分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单抗，且其特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测RRSV的高通量的免疫学方法及其免疫学检测试剂盒，可成功应用于田间RRSV的检测，从而为我国水稻齿叶矮缩病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

根据GeneBank中报道的水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）的衣壳蛋白基因（CP基因）序列（登陆号：EU523360）设计特异性引物，RRSV-CP-F： GGATCC CGAATCATCACTGAACAAGTATTTGG和RRSV-CP-R： AAGCTT TCATACACCGGAACCGCTGG，下划线分别为BamHI和HindIII酶切位点。PCR扩增得到全长约为1500bp的CP基因，目的基因经回收后***到pMD-18T载体（RRSV-CP-pMD18T）上并通过PCR和酶切筛选获得pMD-18T-CP重组子，序列测定表明克隆到的CP基因与RRSV CP基因序列完全相同。重组质粒pMD-18T-CP中的CP基因经BamHI和HindIII双酶切后连接至原核表达载体PMAL-C2X上，获得重组表达载体pMAL-C2X-CP，经PCR、酶切和测序分析表明CP基因按正确的读码框***原核表达载体，且碱基未发生突变。重组质粒pMAL-C2X-CP分别导入大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落于LB培养液中培养，经0.5mmol/L IPTG诱导蛋白表达之后发现带有MBP标签的RRSV-CP-pMAL-c2x能正确表达大小为80KDa左右的重组蛋白，并利用MBP柱子纯化，麦芽糖缓冲液洗脱，得到了浓度较高的纯化蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原及检测抗原。

2.免疫动物

用表达的重组蛋白RRSV-CP免疫四周龄体重18-20g BALB/C 雌性小鼠，1mg/ml纯化的RRSV 的融合蛋白0.5ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔的细胞板中，37℃，5 % CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-50%时，以RRSV-CP检测抗原为包被抗原，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获123个阳性孔。选择5个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗RRSV的特异性单抗的杂交瘤细胞株4H5。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并能稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测

用感染芜菁花叶病毒（TuMV）、番茄花叶病毒（ToMV）、烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯X病毒（PVX）和马铃薯Y病毒(PVY)、水稻矮缩病毒（RDV）、水稻条纹病毒（RSV）、南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）、水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）、水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）的病叶汁包被ELISA反应板，以相应的健康叶提取液作阴性对照，以水稻齿叶矮缩病毒为阳性对照，用间接ELISA法测定单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃ 2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭30-60min;加入单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，4H5单抗对RRSV有特异性反应，而与TuMV、TMV、ToMV、CMV、PVY、PVX、RDV、RSV、SRBSDV、RBSDV其他病毒均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃条件下，流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，实验结果表明：4H5单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价在10^－7。

二、免疫学检测方法及其试剂盒

1.用单抗建立间接抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液或按150 ul碳酸盐缓冲液每头褐飞虱加入后捣烂的上清100ul/孔加入ELISA板，RRSV病叶或携带RRSV的褐飞虱为阳性对照，相应健康叶或非带毒褐飞虱为阴性对照，37℃ 2h，或4℃包被过夜；

（2）PBST洗涤后，用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入5000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）或辣根过

氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37

℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物或TMB 底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，或用

2mol/L 氢氧化钠或硫酸终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405或

450值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

ACP-ELISA方法检测灵敏度检测

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：10至5120作倍比稀释或单头褐飞虱进行倍比稀释50uL/头至12800uL/头，分别以相应稀释度的健康叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：10～320倍稀释的病叶汁液及单头褐飞虱稀释到3200uL/头时均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：320，对褐飞虱的检测灵敏度达到1600 uL/头，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2. 检测RRSV的TAS-ELISA检测方法

2.1. TAS-ELISA 方法的操作流程：

1)抗RRSV的兔抗血清（表达的纯化重组RRSV CP蛋白免疫兔子获得）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，包被过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔，于37℃封闭30-60min ；

3)加入检测样品100ul/孔。以RRSV病叶或携带RRSV的褐飞虱为阳性对照，以相应的健康样品或非带RRSV的褐飞虱作阴性对照，37℃1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃ 1-2h；

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP或HRP标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃ 1-2h；

6)PBST洗涤后加PNPP底物或TMB底物于室温显色5-30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色或蓝色的孔为阳性，2mol/L 氢氧化钠或硫酸终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm或450nm的OD值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

2.2.TAS-ELISA 检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA 方阵试验进行，即首先横向分别加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕102400倍比稀释的RRSV兔抗血清；第二步加入RRSV 病叶汁（1:10）或褐飞虱匀浆液（150ul/只）；第三步纵向分别加用封闭液从1﹕5至1﹕2048000倍比稀释单抗腹水；第四步加入AP标或HRP记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书1﹕10000倍稀释，；第五步PNPP或TMB底物显色（按TAS-ELISA方法流程进行操作）。结果为褐飞虱的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕5000、1﹕8000。

2.3.TAS-ELISA 方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将RRSV病叶汁或褐飞虱匀浆液用 PBS倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA 检测病叶和褐飞虱的灵敏度分别达到1:1250倍稀释（w/v, g /mL）和1600 uL/头，说明本方法具有很好的灵敏度。

3. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

3.1 dot-ELISA检测水稻中RRSV方法的建立及其田间样品检测

将水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到NC膜上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30~60 min; PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测水稻病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明4H5单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测RRSV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当水稻叶片稀释到1:320倍（w/v, g/mL）时，以4H5单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:320倍稀释（图1）。

用建立的dot-ELISA方法对2010、2011年采自福建福州、贵州荔波、浙江金华、云南施甸县等水稻田间疑似发病水稻样品进行检测，结果发现，50个水稻检测样品中有21个样品产生紫色的阳性斑点（图2），阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到RRSV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染RRSV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于水稻样品中水稻齿叶矮缩病毒的检测。

3.2 dot-ELISA检测褐飞虱体内RRSV方法的建立及其田间样品检测

单头褐飞虱放入1.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入100 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂褐飞虱后、5000 rpm 离心3 min，取3μL上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测水稻中RRSV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，显色底物是HRP的显色底物，即TMB显色底物。同时设非带毒和带毒的褐飞虱作为阴性和阳性对照。

用方阵试验确定检测褐飞虱的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明4H5单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:4000和1:5000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测褐飞虱体内RRSV的dot-ELISA方法，检测结果表明携带RRSV的褐飞虱呈现蓝色斑点，而无毒的褐飞虱没有任何显色反应，即建立的dot-ELISA方法能特异性地检测褐飞虱体内的RRSV。灵敏度分析表明，当单头褐飞虱加800 μL PBS时，以4H5单抗建立的dot-ELISA检测仍呈现蓝色的阳性斑点，即其检测褐飞虱的灵敏度达到1：800稀释（头/μL）（图3）。

用建立的dot-ELISA方法对2010、2011年采自福建福州、贵州荔波、云南施甸县等水稻发病田间的褐飞虱、人工饲喂获毒的和无毒的褐飞虱进行检测。结果发现， 110头褐飞虱检测样品中有61头产生蓝色的阳性斑点，而无毒的褐飞虱没有产生任何蓝色斑点（图4）。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到RRSV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染RRSV。说明该dot- ELISA方法能准确、可靠地用于褐飞虱样品中水稻齿叶矮缩病毒的检测。

3.3水稻齿叶矮缩病毒dot-ELISA检测试剂盒（检测水稻和褐飞虱样品）

1）试剂盒主要成分：

RRSV 单克隆抗体 1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗1管 0.1 ml

HRP标记的羊抗鼠IgG二抗1管 0.1 ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2 ml和1ml

TMB底物 1瓶 10 ml

阳性对照1 （含RRSV水稻叶片汁液） 1管 2 ml

阳性对照2 （带毒RRSV褐飞虱匀浆液） 1管 2ml

阴性对照1（健康水稻叶片汁液） 1管 2 ml

阴性对照2（非带毒褐飞虱匀浆液） 1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）检测水稻样品的操作步骤：

a.将水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c.取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10～20 min;

d.NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e.NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

f.用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

g.PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h.待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）检测白背飞虱样品的操作步骤：

a.单头褐飞虱放入1.5 mL的eppendorf的离心管中，并加入50～100 μL PBS (0.01mol/L，pH7.4)，用牙签捣烂褐飞虱后、5000 rpm 离心3 min，取3 μL上清点到NC膜上，同时设置带毒和非带毒的褐飞虱分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10～20 min;

b. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

c. NC膜放入1:4000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

d. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:5000倍稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

e. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 膜放入TMB底物液中反应，肉眼观察结果；

f.待阳性对照显色明显(蓝色)，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

4）保存及有效期

于2～8℃避光保存，有效期12个月。

5）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄·12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1. 一种分泌抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5536，其特征在于能分泌抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体。

2. 一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗水稻齿叶矮缩病毒的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与水稻齿叶矮缩病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

3. 一种如权利要求2所述的抗水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用，其特征在于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法及其免疫学检测试剂盒。