CN105567646B - 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents
分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105567646B CN105567646B CN201610096086.1A CN201610096086A CN105567646B CN 105567646 B CN105567646 B CN 105567646B CN 201610096086 A CN201610096086 A CN 201610096086A CN 105567646 B CN105567646 B CN 105567646B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- strain
- mosaic virus
- corn
- scmv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 53
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 47
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 241000723806 Sugarcane mosaic virus Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 9
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 45
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 11
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 claims description 7
- 241000702634 Rice black streaked dwarf virus Species 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 4
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 abstract description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 abstract 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 14
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 11
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 9
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 7
- 241000756822 Southern rice black-streaked dwarf virus Species 0.000 description 7
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800000653 Helper component proteinase Proteins 0.000 description 2
- 241001582888 Lobus Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101800001775 Nuclear inclusion protein A Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000035824 paresthesia Diseases 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 241000772998 Arthraxon Species 0.000 description 1
- 241000209763 Avena sativa Species 0.000 description 1
- 241000544765 Bromus arvensis Species 0.000 description 1
- 241000209202 Bromus secalinus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001273256 Chloris virgata Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 244000058871 Echinochloa crus-galli Species 0.000 description 1
- 244000025670 Eleusine indica Species 0.000 description 1
- 235000014716 Eleusine indica Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101800000089 Movement protein P3N-PIPO Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000007199 Panicum miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000003461 Setaria viridis Species 0.000 description 1
- 235000002248 Setaria viridis Nutrition 0.000 description 1
- 235000010086 Setaria viridis var. viridis Nutrition 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 240000002439 Sorghum halepense Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 244000022185 broomcorn panic Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NFJCQBGAUBIGKV-UHFFFAOYSA-N nitro dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[N+]([O-])=O NFJCQBGAUBIGKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- -1 pH 9.5) and it mixes Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 231100000732 tissue residue Toxicity 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。以纯化的甘蔗花叶病毒(SCMV)粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗SCMV云南株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株22A6，其保藏号为CGMCC No.12007。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水的间接ELISA效价达10‑7，抗体类型及亚类为IgG1，kappa轻链。该单抗与36kDa的SCMV外壳蛋白有特异性免疫反应。利用22A6单抗为核心建立检测玉米中SCMV的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法，这两种方法检测检测病叶的灵敏度分别达到1:163840和1:5120倍稀释(w/v,g/mL)。该杂交瘤细胞株22A6及其单抗的获得和血清学检测方法的建立为该病毒病的诊断和检测、抗病育种及科学防控提供物质和技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗甘蔗花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
背景技术
甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起玉米矮花叶病和甘蔗花叶病的病原。玉米矮花叶病于1963年首先在美国俄亥俄州大发生，随后美国多达37个州均相继报道了该病毒病。1968年玉米矮花叶病在我国河南新乡和安阳爆发，给当地造成了巨大的损失，仅辉县的粮食损失就达当年全县粮食总产量的33.53％，随后我国的其他地区也相继发现了该病，如黑龙江、辽宁、北京、上海、浙江、广西和台湾等省(市区)，其中以华北和西北危害较为严重。而甘蔗花叶病是一种严重危害甘蔗生长的世界性甘蔗病毒病害，最早于1892年在印度尼西亚的爪哇发现，随后在阿根廷、波多黎各、美国、古巴、中国等国家严重流行，现已在全世界蔗区普遍发生，成为危害甘蔗生产最严重的病毒性病害之一，严重影响甘蔗的产量和品质。
SCMV是马铃薯Y病毒属的重要成员之一，病毒粒子呈线状，无包膜，长750nm，宽13nm，其基因组由一长约9.6kb的单链正义RNA组成。RNA基因组只有单一的大开放阅读框(ORF)，编码一个约350kDa的多聚蛋白前体，在病毒编码的三种蛋白水解酶(Pl、HC-Pro和NIa-Pro)的作用下被水解成至少10个成熟的功能蛋白，从N端到C端依次为PI、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP。近年又发现了第11个可能存在的蛋白PIPO。病毒粒子的致死温度为55-60℃，稀释限点为103-105倍，室温下可体外存活1-2天。SCMV可以经病株汁液摩擦、蚜虫、真菌等传播，也可经病株种子和玉米花粉传播。SCMV寄主范围仅限于禾本科植物，但所涉及的范围较广。Rosenkranz等对SCMV的寄主范围做了***研究，共测定了39属293种禾本科植物对SCMV的侵染性，结果发现SCMV能侵染200种以上的禾本科植物。我国的史春霖等对北京地区的SCMV作了寄主范围测定，在供试的21种禾本科植物中，发现能被SCMV侵染的有画眉草、野雀麦、虎尾草、蟋蟀草、小米、黍、稗、马唐、青狗尾草、高粱、大油芒、矛叶荩草、玉米等13种，不能侵染大麦、小麦、黑麦、金丝雀麦草、约翰逊草、燕麦、草原看麦娘、水稻。玉米在整个生育期均可感染甘蔗花叶病毒，幼苗期发病时先在心叶基部出现点条状褪绿斑点，随后沿叶脉扩展至全叶，最终形成全株叶片花叶症状，随着病情的发展，叶片将形成明显的黄绿相间条纹症状，最终全叶失绿；拔节期发病时，先在心叶基部出现褪绿斑点，随后扩展至全叶成为典型的花叶症状；植株发育后期感病株叶片提早变黄，能抽穗结籽，但籽粒少；重病株则多数表现早枯，几乎颗粒不收。甘蔗感病后，叶片呈现大小不一、黄绿相间的嵌纹或条斑，种苗萌芽率下降，分蘖减少，生长缓慢，节间变短，品质变劣，蔗糖结晶率下降。
本发明主要针对甘蔗花叶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用展开工作。当前甘蔗花叶病毒的预警和监测体系尚未建立，甚至很多主要流行区并未进行病毒的预测预警和防控工作。另外，目前仅用田间症状观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法来检测该病毒，但这些检测方法效率低，并不适合大批量样品检测和田间应用。而血清学方法操作简单、特异性好，且可规模化检测应用，但该方法必须依赖于特异和灵敏的病毒抗体。因此，本发明专利利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗SCMV单抗的杂交瘤细胞22A6，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国甘蔗花叶病毒的早期预测预警、准确检测、抗病育种、科学指导防控提供物质和技术支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗甘蔗花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12007，它能分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗。
一种所述的杂交瘤细胞株22A6所分泌的抗甘蔗花叶病毒云南株系的单抗，抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与36kDa甘蔗花叶病毒的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测感染SCMV病叶的灵敏度达到1:163840倍稀释(w/v,g/mL)。
抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗与甘蔗花叶病毒云南株系和北京株系均有特异性免疫反应，而与玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、马铃薯Y病毒和健康玉米均不发生免疫反应。
抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株22A6分泌抗甘蔗花叶病毒特异性单抗，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测甘蔗花叶病毒；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测甘蔗花叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物中的甘蔗花叶病毒的检测。
附图说明
图1是dot-ELISA方法检测SCMV云南株系和北京株系的灵敏度分析；
图2是dot-ELISA方法检测SCMV的特异性分析；
1：感染SCMV云南株系的玉米叶片；2：感染SCMV北京株系的玉米叶片；3：感染玉米褪绿斑驳病毒的玉米叶片；4：感染南方水稻黑条矮缩病毒的玉米叶片；5：感染水稻黑条矮缩病毒的玉米叶片；6：感染马铃薯Y病毒的烟草叶片；7：健康玉米叶片；8：健康甘蔗叶片；上下两个点为同一样品的重复。
图3是dot-ELISA方法检测田间样品中SCMV的代表性结果；
图4是RT-PCR方法检测田间样品中SCMV的代表性结果。23跑道为感染SCMV的玉米病叶，作阳性对照，跑道24为健康玉米叶片，作阴性对照
生物保藏
杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.12007，分类命名：分泌抗甘蔗花叶病毒(SCMV)单抗杂交瘤细胞。
具体实施方式
分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12007，它能分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗。
一种所述的杂交瘤细胞株22A6所分泌的抗甘蔗花叶病毒云南株系的单抗，抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与36kDa甘蔗花叶病毒的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测感染SCMV病叶的灵敏度达到1:163,840倍稀释(w/v,g/mL)。
抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗与甘蔗花叶病毒云南株系和北京株系均有特异性免疫反应，而与玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、马铃薯Y病毒和健康玉米均不发生免疫反应。
抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
本发明提供的杂交瘤细胞株22A6能大量分泌抗甘蔗花叶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好，以该单抗为核心建立的检测SCMV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间SCMV的检测，从而为我国甘蔗花叶病毒的早期预测预警、正确检测、抗病育种、科学指导防控提供物质和技术支持。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫原及检测抗原的制备
用下面的操作步骤提纯病毒粒子：
1)将大研钵和组织搅拌器预冷；
2)称取感染SCMV云南株系玉米病叶500g，每100g病叶中加入pH 7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)200mL(含0.01M Na-EDTA和0.1％巯基乙醇)，在匀浆仪中匀浆2min后用双层棉纱布过滤，滤液6,000rpm离心20min去植物组织残渣；
3)所得上清液边搅拌边加至终浓度为2.5％Triton X-100、4％PEG(分子量6,000)和0.1M NaCl，4℃搅拌4h以上；
4)4℃1,1000rpm离心15min；
5)沉淀用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2和0.5M脲)充分悬浮，悬浮液6,000rpm离心15min后吸出上清置于新离心管中，沉淀再悬浮、离心重复3次；
6)合并离心上清液，33,000rpm超速离心100min，所得沉淀用0.5M PB悬浮后8,000rpm离心15min，收集上清，沉淀再悬浮、离心重复3次；
7)合并上清液后加到底部已有25％蔗糖垫的离心管中，33,000rpm超速离心100min；
8)所得沉淀用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2)悬浮，悬浮液即为病毒提纯液；
9)用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的线性甘蔗花叶病毒粒子。
2.免疫动物
用SCMV提纯病毒免疫八周龄BALB/c雌性小鼠。即SCMV提纯病毒粒子50μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后背腹部皮下多点注射0.2mL/只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2mL/只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射免疫，3天后取脾细胞进行细胞融合。
3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按9:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1,500rpm离心5min去除培养基，在37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1500)并融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1,500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，并置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养。
4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10-30％时，以感染SCMV病毒的玉米叶片为包被抗原，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获156个阳性孔。选择3个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法细胞克隆，获得1株能分泌抗SCMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株22A6。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
5.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入8×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，注射针头采取腹水，8,000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M pH 4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边搅拌边加辛酸(30uL/mL腹水)，4℃澄清1h，12,000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3,000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24h后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。
6.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定
用Sigma公司的用于鉴定单抗类型的DAS-ELISA试剂盒鉴定单抗的类型及亚类，结果显示22A6单抗类型为IgG1、kappa轻链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果表明22A6单抗腹水效价达到10-7。
7.单抗的特异性检测
用感染玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒和马铃薯Y病毒的病叶粗提液包被ELISA板，以相应的健叶粗提液作阴性对照，感染甘蔗花叶病毒的病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法分析单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为：上述病毒感染的病叶按1:30(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆后100uL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100uL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤三次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100uL/孔，37℃1-2h；PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色30-60min后用2M氢氧化钠终止反应，用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，22A6单抗对SCMV云南株系和北京株系均有特异性免疫反应，而与玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、马铃薯Y病毒和健康植物组织均无任何免疫反应。
二、检测SCMV免疫学方法及其试剂盒的建立
1.检测SCMV的ACP-ELISA方法
1.1ACP-ELISA方法的操作步骤：
1)病叶超重后用液氮研磨成粉末，按1:30(w/v,g/mL)比例加入0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)匀浆，5,000rpm离心3min，离心上清100uL/孔包被ELISA板，以SCMV病叶为阳性对照，健叶为阴性对照，37℃2h，或4℃过夜；
2)PBST洗涤3次后用3％脱脂奶粉封闭30min；
3)加入适当稀释后的单抗腹水，100uL/孔，37℃1h；
4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100uL/孔，37℃1h；
5)用PBST洗涤4次后加入PNPP硝基磷酸盐底物100uL/孔，室温30min；
6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用2M氢氧化钠终止反应后用酶联免疫检测仪测OD405，以P/N>2.1作为阳性判断标准。
1.2ACP-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定
用常规方阵试验确定ACP-ELISA方法中SCMV单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明22A6单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5,000和1:8,000倍稀释，以抗体的最适工作浓度建立检测SCMV的ACP-ELISA方法。病叶粗提液从1:20至655,360倍比稀释(w/v,g/mL)，并分别以相应稀释度的健叶粗提液作阴性对照，分析上述建立的ACP-ELISA方法的灵敏度。结果表明ACP-ELISA方法对1:163,840倍稀释(w/v,g/mL)的病叶粗提液仍呈阳性反应，即对病叶的检测灵敏度可达到1:163,840倍稀释(w/v,g/mL)，表明建立的ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性。该方法检测SCMV云南株系和北京株系病叶均呈强阳性反应，而检测玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、马铃薯Y病毒和健康植物均呈阴性反应，且阴阳性OD值对比差异极显著，说明该方法和单抗的特异性均很好。
2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用
2.1dot-ELISA的操作步骤
将玉米叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:30(w/v,g/mL)的比例加入0.01M PBS(pH 7.4)后匀浆；匀浆液5,000rpm离心3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素(NC)膜上，同时设置健康和感染SCMV玉米叶片组织粗提液分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含3％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl2，pH 9.5)混匀，膜放入底物液中显色，肉眼观察结果；待阳性对照显色明显而阴性没有任何显色时在自来水中漂洗终止反应，拍照记录结果。
2.2dot-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定
用常规方阵试验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明22A6单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5,000和1:8,000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测植物中SCMV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当感染SCMV病叶粗提液稀释到1:5,120倍(w/v,g/mL)时，以22A6单抗为核心建立的dot-ELISA方法检测仍呈紫色的阳性斑点，说明该方法检测病叶的灵敏度达到1:5120倍稀释(w/v,g/mL)(图1)。特异性分析表明，该方法检测SCMV云南株系和北京株系病叶均呈强阳性反应，而检测玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、马铃薯Y病毒和健康植物均呈阴性反应(图2)。
2.3dot-ELISA方法的田间检测应用
用建立的dot-ELISA方法对2015年采自云南、海南、浙江、江西田间疑似发病玉米和甘蔗样品进行检测，结果发现，56个检测样品中有27个样品产生紫色的阳性斑点(图3)，样品同时用RT-PCR检测，结果表明，所有dot-ELISA检测阳性的样品中均扩增到特异性PCR产物，而所有dot-ELISA检测阴性的样品中均未扩增到基因片段(图4)。PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染SCMV，说明该建立的dot-ELISA方法能准确、可靠地用于玉米样品中甘蔗花叶病毒的检测。
3.甘蔗花叶病毒dot-ELISA检测试剂盒
1)试剂盒主要成分：
以上试剂均保存于4℃下
硝酸纤维素(NC)膜 10张
2)检测植物样品的操作步骤：
a.将植物样品叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:30(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH 7.4)后匀浆；
b.匀浆液5,000rpm离心3min；
c.取2.5μL上清点到NC上，同时设置健康和感病玉米叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；
d.NC膜浸入到含3％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；
e.NC膜放入1:4,000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；
f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:5,000倍稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；
g.PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl2、pH 9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；
h.待阳性对照显色呈现明显的紫色而阴性没有任何显色时用自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。
3)保存及有效期
于2-8℃避光保存，有效期12个月。
4)缓冲液配方：
磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH 7.4)：
加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1,000mL
ELISA洗涤液(0.01M PBST)：
1,000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20
ELISA封闭液：
0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v)。
Claims (4)
1.一种分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗的杂交瘤细胞株22A6，其特征在于能分泌抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗，杂交瘤细胞株22A6于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12007。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株22A6所分泌的抗甘蔗花叶病毒云南株系的单抗，其特征在于该单抗腹水的间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与36kDa甘蔗花叶病毒的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA方法分析发现该单抗检测感染SCMV病叶的灵敏度达到1:163840倍稀释。
3.如权利要求2所述的抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗，其特征在于所述单抗与甘蔗花叶病毒云南株系和北京株系均有特异性免疫反应，而与玉米褪绿斑驳病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、马铃薯Y病毒和健康玉米均不发生免疫反应。
4.一种如权利要求2所述的抗甘蔗花叶病毒云南株系单抗在该病毒检测上的应用，其特征在于以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610096086.1A CN105567646B (zh) | 2016-02-22 | 2016-02-22 | 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610096086.1A CN105567646B (zh) | 2016-02-22 | 2016-02-22 | 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105567646A CN105567646A (zh) | 2016-05-11 |
| CN105567646B true CN105567646B (zh) | 2019-01-01 |
Family
ID=55878277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610096086.1A Active CN105567646B (zh) | 2016-02-22 | 2016-02-22 | 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105567646B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108776229A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-11-09 | 扬州大学 | 一种甘蔗线条花叶病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法 |
| CN110904053B (zh) * | 2019-12-04 | 2020-10-20 | 浙江大学 | 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004093906A1 (en) * | 2003-03-26 | 2004-11-04 | Wyeth | Immunogenic composition and methods |
| CN104450624A (zh) * | 2014-11-10 | 2015-03-25 | 浙江大学 | 分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
-
2016
- 2016-02-22 CN CN201610096086.1A patent/CN105567646B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004093906A1 (en) * | 2003-03-26 | 2004-11-04 | Wyeth | Immunogenic composition and methods |
| CN104450624A (zh) * | 2014-11-10 | 2015-03-25 | 浙江大学 | 分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 玉米矮花叶病病原鉴定_检测及外壳蛋白基因变异研究;蒋军喜;《中国优秀博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20021215(第02期);摘要，第二部分第二章第56页第1段至第64页最后1段，表2-1，表4.2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105567646A (zh) | 2016-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109897829B (zh) | 分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105543176B (zh) | 分泌抗马铃薯y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104450623B (zh) | 分泌抗番茄斑萎病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105567646B (zh) | 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104404000B (zh) | 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105671001B (zh) | 分泌抗南方菜豆花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN102559603B (zh) | 分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513810B (zh) | 分泌抗黄瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105543177B (zh) | 分泌抗柑橘黄化脉明病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN108165533B (zh) | 分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105624121B (zh) | 分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN103911351B (zh) | 分泌抗香蕉束顶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105624120B (zh) | 分泌抗马铃薯s病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN102533664A (zh) | 分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513811B (zh) | 分泌抗西瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN110904053B (zh) | 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN110257341B (zh) | 分泌抗马铃薯m病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN108486065B (zh) | 分泌抗水稻瘤矮病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN106636008B (zh) | 分泌抗大麦黄矮病毒pav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104450624A (zh) | 分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN102559602B (zh) | 分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN106636009B (zh) | 分泌抗小麦矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513812B (zh) | 分泌抗鸢尾黄斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513809B (zh) | 分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104845937B (zh) | 分泌抗小麦黄花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |