CN104502255B - 三维成像流式细胞仪装置 - Google Patents

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Abstract

三维成像流式细胞仪装置，涉及生物学和医学的光学仪器领域，解决现有成像流式细胞仪装置对细胞进行扫描时，存在液流速度较慢，影响流式测试的效率。另外，其样品流需要与显微物镜直接接触，样品流很容易对显微物镜带来污染，影响其寿命等问题。通过两个垂直方向的成像流式***对运动的细胞进行两个方向同步的细胞成像，提取细胞内部结构的相对位置分布，进而得到细胞的三维结构图像。侧向散射和荧光激发的激光光源在45°方向照射，测速‑对焦单元和成像单元的两套装置共用侧向散射和荧光激发激光光源。三维的细胞成像保持细胞内部结构的原有位置信息，对形态学的描述真实性更好，可以使得成像流式细胞仪获得更多、更有意义的生物医学信息。

Description

三维成像流式细胞仪装置
技术领域
本发明涉及生物学和医学的光学仪器领域，具体涉及一种三维成像流式细胞仪装置。
背景技术
流式细胞术是一种用以对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒(如微球，细菌，小型模式生物等)逐个进行快速定量分析和分选的技术。在生物学与医学领域，当需要对大量的细胞进行扫描时，流式细胞仪完全牺牲空间分辨率，可以获得高的检测速度，数十千个细胞每秒。成像流式细胞仪不仅能够获得大量细胞的群体分析数据，而且还能够实时看到细胞图像，每一步的分析结果都可以通过图像进行确认。当需要获得细胞形态及内部结构信息时，相对于传统的流式细胞仪，成像流式细胞仪有着更大的优势。
目前，成像流式细胞仪已经在国际上获得了极大的重视，以美国Merck Millipore旗下的Amnis公司为代表已经做出了性能不错的成像流式细胞仪，型号有Image StreamMark II和Flow Sight等，能实时捕获每个流动细胞最多可以达到12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒，并具有更强荧光灵敏度。
成像流式细胞仪对快速流动的细胞进行显微成像，通常情况下获得的细胞二维图像是把细胞内所有的结构投影到一个平面，失去了细胞内部结构的原有位置信息，对形态学的描述缺乏真实性，因此，成像流式细胞仪的三维成像具有重大的研究意义。中国专利CN201310202769.7报道了一种流式荧光显微成像装置及方法，它是光片显微镜在流式细胞仪中的一种应用。该装置为满足光片方向对细胞断层扫描，其液流速度较慢，影响流式测试的效率。另外，其样品流需要与显微物镜直接接触，样品流很容易对显微物镜带来污染，影响其寿命。
发明内容
本发明为解决现有成像流式细胞仪装置对细胞进行扫描时，存在液流速度较慢，影响流式测试的效率。另外，其样品流需要与显微物镜直接接触，样品流很容易对显微物镜带来污染，影响其寿命等问题，提供一种三维成像流式细胞仪。
三维成像流式细胞仪装置，所述装置包括样品进样单元、第一光源、第二光源和第三光源，通过两套成像流式***同步对运动的待测样品进行两个方向的成像，获得最终的三维图像；所述两套成像流式***结构相同，每套成像流式***包括测速-对焦单元和成像单元；
一个方向的成像流式***的成像过程为：样品进样单元保持待测样品匀速单个、并排的通过成像检测区域，第二光源侧向照明待测样品，侧向散射光经过第一成像单元中的第一显微物镜进入第一测速-对焦单元，获得待测样品的运动速度和离焦量，实现对第一TDI CCD和显微物镜的反馈控制；同时，第二光源作为暗场或荧光激发光源，第三光源作为明场光源，待测样品的散射光和荧光信号经过第一显微物镜、第一测速-对焦单元中的第一二向色镜进入第一成像单元，获得待测样品的明场、暗场和荧光图像；
另一个方向的成像流式***的成像过程为：第二光源侧向照明待测样品，侧向散射光经过第二成像单元中的第二显微物镜进入第二测速-对焦单元，获得待测样品的运动速度和离焦量，实现对第二TDI CCD和第二显微物镜的反馈控制；同时，第二光源作为暗场或荧光激发光源，第一光源作为明场光源，待测样品的散射光和荧光信号经过第二显微物镜、第二测速-对焦单元中的第二二向色镜进入第二成像单元，获得待测样品的明场、暗场和荧光图像；对待测样品在两个方向上同步获得的明场、暗场和荧光图像进行处理，获得三维图像。
本发明的有益效果：本发明采用通过两个相互垂直方向的成像流式***对运动的细胞进行两个方向同步的细胞成像，提取细胞内部结构的相对位置分布，进而得到细胞的三维结构图像。侧向散射和荧光激发的激光光源在45°方向照射，测速-对焦单元和成像单元的两套装置共用侧向散射和荧光激发激光光源。三维的细胞成像保持细胞内部结构的原有位置信息，对形态学的描述真实性更好，可以使得成像流式细胞仪获得更多、更有意义的生物医学信息。
附图说明
图1为本发明所述的三维成像流式细胞仪装置的光学原理示意图；
图2为采用本发明所述的三维成像流式细胞仪装置获得细胞相互垂直两个方向的平面图。
具体实施方式
具体实施方式一、结合图1和图2说明本实施方式，三维成像流式细胞仪装置，通过两套成像流式***同步对运动的待测样品进行两个方向的成像，获得最终的三维图像；该装置包括样品进样单元100、光源200、两套测速-对焦单元和两套成像单元；所述两套成像流式***结构及工作原理完全相同，每套成像流式***包括测速-对焦单元和成像单元；
样品进样单元100保证病毒、细胞、微球或小型模式生物等待测样品高速地单个、并排地通过成像检测区域。
光源200包括第一光源201、第二光源202和第三光源203，所述第二光源202发出侧向散射和荧光激发光源，中心波长488nm，功率150mw。第一光源201和第三光源203是两个明场光源。明场光源为LED，功率2W，中心波长830nm。同时第二光源202可以作为两套测速-对焦单元部分的照明光源。
所述两套测速-对焦单元包括完全相同的两部分，分别作为两套成像单元的辅助单元。本实施方式以其中的一套测速-对焦单元和一套成像单元(第一测速-对焦单元300a和第一成像单元400a)为例对该具体实施例的详细介绍。
第一测速-对焦单元300a包括第一二向色镜301a、第一分光镜302a、第一聚焦镜组303a和第二聚焦镜组306a、第一光栅304a和第二光栅307a、第一光电探测器305a和第二光电探测器308a。第一二向色镜301a为长波通二向色镜，中心波长488nm。第一分光镜302a的中心波长为488nm。第一光栅304a为正光栅，其位置在中间像面之后。第二光栅307a为负光栅，其位置在中间像面之前。第一光电探测器305a和第二光电探测器308a为两个中心波长488nm的高灵敏度光电倍增管。
第一成像单元400a包括第一显微物镜401a、第一多光谱分光镜组402a、第一成像物镜403a、第一TDI CCD(Time Delay Integration CCD)404a。所述第一显微物镜401a作为细胞高分辨率成像光学***，焦距6mm，竖直孔径0.5，视场100X200μm。所述第一多光谱分光镜组402a由6片长波通二向色镜组成，分光波段分别为420-480nm，480-560nm，560-600nm，600-640nm，640-745nm，745-800nm。
本实施方式的工作过程：样品进样单元100保持待测样品以一定稳定的速度单个、并排地通过成像检测区域。第二光源202发出488nm的激光束侧向照明待测样品，激光光源在45°方向照射。侧向散射光经过第一显微物镜401a、第一二向色镜301a和第一分光镜302a、第一聚焦镜组303a和第二聚焦镜组306a以及第一光栅304a和第二光栅307a，由第一光电探测器305a和第二光电探测器308a得到第一成像单元400a***所需的细胞运动速度和离焦量信息。另外，由第二光源202作为暗场、荧光激发光源，第三光源203作为明场光源，细胞的散射和荧光信号经过第一显微物镜401a、第一多光谱分光镜组402a和第一成像物镜403a，第一TDI CCD 404a得到细胞的明、暗场和荧光图像。
与此同时，在第一套成像单元垂直方向放置的第二测速-对焦单元300b和第二成像单元400b同步地获得该方向的细胞图像，其中第二光源202依然作为暗场、荧光激发光源，第一光源201作为该部分的明场光源。最终通过两个方向得同步曝光，得到细胞两个方向投影图像，最终得到细胞的三维图像。
所述垂直方向的成像流式***由第二测速-对焦单元300b和第二成像单元400b同步地获得该方向的细胞图像，所述第二成像单元400b还包括第二多光谱分光镜组402b、第二成像物镜403b和第二TDI CCD 404b；第二测速-对焦单元300b还包括第二分光镜302b、第三聚焦镜组303b、第三光栅304b、第三光电探测器305b、第四聚焦镜组306b、第四光栅307b和第四光电探测器308b；
所述垂直方向的成像流式***的成像过程为：所述第二光源202发出的侧向散射光经过第二显微物镜401b、第二二向色镜301b和第二分光镜302b分为两束散射光，一束散射光经第三聚焦镜组303b、第三光栅304b后由第三光电探测器305b接收；另一束散射光经第四聚焦镜组306b和第四光栅307b后由光第四电探测器308b接收，根据第三光电探测器305b和第四光电探测器308b接收散射光的强度和频率，获得待测样品的运动速度和离焦量，实现对TDI相机和显微物镜的反馈控制；同时，第二光源202作为暗场或荧光激发光源，第一光源201作为明场光源，待测样品的散射光和荧光信号经过第二显微物镜401b、第二多光谱分光镜组402b和第二成像物镜403b，第二TDI CCD404b得到待测样品的明场、暗场和荧光图像。
结合图2说明本实施方式，图2给出了采用本实施方式所述的装置获得细胞相互垂直两个方向的平面图1和2，可以看到细胞内部细胞器a和b在两个方向上分布情况，通过算法可以重建出细胞器a和b的空间分布。例如，左图给出细胞器a在一个方向的投影图得到XZ方向的二维坐标，右图给出另一个方向的投影图得到YZ方向的二维坐标，最终很容易可以获得该细胞器a的三维空间坐标。同样的得到细胞器b三维空间坐标，通过二者之间的空间相对位置可以确定该细胞器在细胞内部结构的空间分布。
本发明所述的三维的细胞成像保持细胞内部结构的原有位置信息，对形态学的描述真实性更好，可以使得成像流式细胞仪获得更多、更有意义的生物医学信息。

Claims (6)

1.三维成像流式细胞仪装置，所述装置包括样品进样单元(100)、第一光源(201)、第二光源(202)和第三光源(203)，其特征是，通过两套成像流式***同步对运动的待测样品进行两个方向的成像，获得最终的三维图像；
所述两套成像流式***结构相同，每套成像流式***包括测速-对焦单元和成像单元；
一个方向的成像流式***的成像过程为：样品进样单元(100)保持待测样品匀速单个、并排的通过成像检测区域，第二光源(202)侧向照明待测样品，侧向散射光经过第一成像单元(400a)中的第一显微物镜(401a)进入第一测速-对焦单元(300a)，获得待测样品的运动速度和离焦量，实现对第一TDI CCD(404a)和第一显微物镜(401a)的反馈控制；同时，第二光源(202)作为暗场或荧光激发光源，第三光源(203)作为明场光源，待测样品的散射光和荧光信号经过第一显微物镜(401a)、第一测速-对焦单元(300a)中的第一二向色镜(301a)进入第一成像单元(400a)，获得待测样品的明场、暗场和荧光图像；
另一个方向的成像流式***的成像过程为：第二光源(202)侧向照明待测样品，侧向散射光经过第二成像单元(400b)中的第二显微物镜(401b)进入第二测速-对焦单元(300b)，获得待测样品的运动速度和离焦量，实现对第二TDI CCD(404b)和第二显微物镜(401b)的反馈控制；同时，第二光源(202)作为暗场或荧光激发光源，第一光源(201)作为明场光源，待测样品的散射光和荧光信号经过第二显微物镜(401b)、第二测速-对焦单元中的第二二向色镜(301b)进入第二成像单元(400b)，获得待测样品的明场、暗场和荧光图像；
对待测样品在两个方向上同步获得的明场、暗场和荧光图像进行处理，获得三维图像。
2.根据权利要求1所述的三维成像流式细胞仪装置，其特征在于，所述第一成像单元(400a)还包括第一多光谱分光镜组(402a)、第一成像物镜(403a)和第一TDI CCD(404a)；第一测速-对焦单元(300a)还包括第一分光镜(302a)、第一聚焦镜组(303a)、第一光栅(304a)、第一光电探测器(305a)、第二聚焦镜组(306a)、第二光栅(307a)和第二光电探测器(308a)；
所述侧向散射光经过第一显微物镜(401a)、第一二向色镜(301a)和第一分光镜(302a)分为两束散射光，一束散射光经第一聚焦镜组(303a)、第一光栅(304a)后由第一光电探测器(305a)接收；另一束散射光经第二聚焦镜组(306a)和第二光栅(307a)后由光第二电探测器(308a)接收，根据第一光电探测器(305a)和第二光电探测器(308a)接收散射光的强度和频率，获得待测样品的运动速度和离焦量，实现对第一TDI CCD(404a)和显微物镜的反馈控制；同时，第二光源(202)作为暗场或荧光激发光源，第三光源(203)作为明场光源，待测样品的散射光和荧光信号经过第一显微物镜(401a)、第一多光谱分光镜组(402a)和第一成像物镜(403a)，第一TDI CCD(404a)得到待测样品的明场、暗场和荧光图像。
3.根据权利要求1所述的三维成像流式细胞仪装置，其特征在于，所述第二成像单元(400b)还包括第二多光谱分光镜组(402b)、第二成像物镜(403b)和第二TDI CCD(404b)；第二测速-对焦单元(300b)还包括第二分光镜(302b)、第三聚焦镜组(303b)、第三光栅(304b)、第三光电探测器(305b)、第四聚焦镜组(306b)、第四光栅(307b)和第四光电探测器(308b)；
所述侧向散射光经过第二显微物镜(401b)、第二二向色镜(301b)和第二分光镜(302b)分为两束散射光，一束散射光经第三聚焦镜组(303b)、第三光栅(304b)后由第三光电探测器(305b)接收；另一束散射光经第四聚焦镜组(306b)和第四光栅(307b)后由光第四电探测器(308b)接收，根据第三光电探测器(305b)和第四光电探测器(308b)接收散射光的强度和频率，获得待测样品的运动速度和离焦量，实现对第二TDI CCD(404b)和显微物镜的反馈控制；同时，第二光源(202)作为暗场或荧光激发光源，第一光源(201)作为明场光源，待测样品的散射光和荧光信号经过第二显微物镜(401b)、第二多光谱分光镜组(402b)和第二成像物镜(403b)，第二TDI CCD(404b)得到待测样品的明场、暗场和荧光图像。
4.根据权利要求1、2或3所述的三维成像流式细胞仪装置，其特征在于，所述第二光源(202)在45°方向照射待测样品，所述第二光源(202)为激光器发出488nm的侧向散射光或作为荧光激发的激光光源。
5.根据权利要求4所述的三维成像流式细胞仪装置，其特征在于，激光器光源采用二向色镜合束，采用多个波长的激光光源进行多色照明激发。
6.根据权利要求1所述的三维成像流式细胞仪装置，其特征在于，所述第一光源(201)和第三光源(203)为LED，光源的中心波长为830nm。
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