CN110057798A - 一种流式样品多波长荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种流式样品多波长荧光检测方法，包括，使激光经过二向色镜进入物镜镜头后聚焦照射到样品池上；样品池中的荧光样品流经激光焦斑时发射多波长荧光，多波长荧光由聚焦物镜镜头收集后，依次穿过二向色镜、长通滤光片、光栅，在光学成像仪上形成一个零级光斑和若干个一级条纹；根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，测量计算荧光样品的各发射光谱和浓度。本发明的方法，仅需一个光学检测器即可实现流式样品的多波长荧光检测，避免了以往使用多个光学检测器造成的仪器体积过大和灵敏度不够高的问题。

Description

一种流式样品多波长荧光检测方法
技术领域
本发明涉及生物化学分析与传感技术领域，具体涉及一种流式样品多波长荧光检测方法。
背景技术
荧光物质在受到光激发时，基态电子跃迁至激发态，当电子跃迁回基态时发光的现象称为荧光。荧光分析是一种非常重要而常用的生化分析和生物传感方法。在众多的仪器中广泛使用，比如分光光度计、荧光光谱仪、荧光显微镜、共聚焦显微镜、全内反射显微镜、双光子荧光光谱仪以及如流式细胞仪等。这些仪器大多只能对单一的荧光物质进行分析。对于发射多种波长的流式荧光样品的同时检测，通常利用多个不同波段的滤光片将多波长荧光分光，将不同波长的荧光引入不同的检测通道，每个检测通道需要一个检测器。这导致多波长荧光检测需要多个检测器，一方面增加了仪器成本，另一方面减弱了荧光信号、降低了检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度、低成本的流式样品多波长荧光检测方法。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：
一种流式样品多波长荧光检测方法，包括以下步骤：
S1：使激光经过二向色镜进入物镜镜头后聚焦照射到样品池上；
S2：样品池中的荧光样品流经激光焦斑时发射多波长荧光，多波长荧光由聚焦物镜镜头收集后，依次穿过二向色镜、长通滤光片、光栅，在光学成像仪上形成一个零级光斑和若干个一级条纹；
S3：根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，测量计算荧光样品的各发射光谱和浓度。
进一步的，所述的样品为流动样品，所述样品池为样品流动池，样品流动池为毛细管或微通道，样品流动方向与激光照射方向垂直。
进一步的，所述样品流动池的横截面形状为圆形、方形、或梯形，所述样品流动池的材质为玻璃、石英或高聚物。
进一步的，所述样品流动池的横截面长度、宽度或直径在1微米～3毫米之间。
进一步的，多波长荧光样品是单一样品标记多波长荧光探针或混合样品分别标记不同波长的荧光探针。
进一步的，所述二向色镜和长通滤光片之间还具有反射镜和狭缝
进一步的，所述光栅为透射光栅或反射光栅，光栅常数为30～1000线/毫米。
进一步的，所述激光激发是单束激光激发或多束激光同时激发。
进一步的，所述光学成像仪为电感耦合器件或互补金属氧化物半导体传感器。
进一步的，所述步骤S3具体包括：根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，通过分别测量零级光斑与各一级条纹的距离以及各一级条纹的强度分布测定荧光样品的多个发射光谱；通过测定对应一级条纹的强度测定荧光物质浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的方法，以激光为激发光源，将流式多波长荧光样品在激光焦斑内激发，受激发射的多波长被光栅分光为零级光斑和多个一级条纹，在光学成像仪上成像记录；以一级条纹位置判定荧光波长以及种类，以一级条纹光谱强度与荧光物质浓度关系做曲线，然后对未知样品中的荧光物质进行定量；仅需一个光学检测器即可实现流式样品的多波长荧光检测，避免了以往使用多个光学检测器造成的仪器体积过大和灵敏度不够高的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1的检测方法光路示意图；
图2为本发明实施例2中的量子点(QD)625成像结果；
图3为本发明实施例2中的不同浓度的QD 625与对应一级条纹的强度相关曲线，其中，内插图为直线相关部分；
图4为本发明实施例3中的QD 525，QD 585和QD 655混合样品的成像结果；
图1中，1为样品流动池，2为物镜，3为激光器，4为二向色镜，5为反射镜，6为狭缝，7为长通滤光片，8为透射光栅，9为光学成像仪。
具体实施方式：
实施例1
一种流式样品多波长荧光检测方法，包括以下步骤：
(1)按照图1搭建光路；
(2)用聚二甲基硅氧烷与盖玻片制作出微通道(100微米×60微米)作为样品流动池1；
(3)将微通道置于物镜2上方，使用注射泵推动发射波长不同的三种量子点混合溶液以一定速度流过微通道；
(4)以波长488nm，光束直径约为100微米m的氩离子激光器3经物镜2聚焦后垂直照射微通道；样品流动池1中的荧光样品流经激光焦斑时发射多波长荧光，多波长荧光由聚焦物镜2镜头收集后，依次穿过二向色镜4、反射镜5、狭缝6、长通滤光片7、光栅8后，在光学成像仪9(CCD)上形成一个零级光斑和若干个一级条纹；
(5)以CCD记录样品的零级和一级光谱图像；以一级光谱位置定性量子点发射波长即量子点种类，以一级光谱高斯峰最强处荧光强度为浓度依据。
实施例2对QD625溶液浓度的检测
a.取8μM QD625用10mM pH 8.3硼酸缓冲溶液分别稀释至0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，4，8nM。
b.将微通道置于100倍物镜上，将上述浓度的QD625通过注射泵以一定速度推入通道中。
c.使用光源为488nm的激光的共聚焦显微镜成像，CCD拍摄通过光栅成像的零级光斑和一级光谱(图2)。
d.定量实验：重复实验步骤b～c，得到不同浓度QD625的一级光谱图像，使用图像处理软件获得不同浓度QD625一级条纹的强度。以QD625浓度为横坐标，一级条纹强度为纵坐标作图，得到相关线性曲线，线性范围为0.01～1nM，相关线性系数R2＝0.997(图3)。
实施例3对多波长荧光样品的检测
a.取一定量8μM QD525，QD585，QD655混合，用10mM pH8.3硼酸缓冲溶稀释，混合液中QD525，QD585，QD655最终浓度分别为2nM，1nM，0.5nM。
b.将微流控通道置于100倍物镜上，使得激光正好垂直于通道，三种量子点混合物通过注射泵以一定速度推入通道中。
c.使用光源为488nm的激光的共聚焦显微镜成像，CCD拍摄通过光栅成像的一个零级光斑和三个一级光谱(图4)。根据一级光谱的位置及强度分布，三种荧光物质均能够准确辨识，从左至右分别为QD525，QD585，QD655。
需要说明的是，以上只是为了进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims (10)

1.一种流式样品多波长荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：使激光经过二向色镜进入物镜镜头后聚焦照射到样品池上；
S2：样品池中的荧光样品流经激光焦斑时发射多波长荧光，多波长荧光由聚焦物镜镜头收集后，依次穿过二向色镜、长通滤光片、光栅，在光学成像仪上形成一个零级光斑和若干个一级条纹；
S3：根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，测量计算荧光样品的各发射光谱和浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品为流动样品，所述样品池为样品流动池，样品流动池为毛细管或微通道，样品流动方向与激光照射方向垂直。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品流动池的横截面形状为圆形、方形、或梯形，所述样品流动池的材质为玻璃、石英或高聚物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样品流动池的横截面长度、宽度或直径在1微米～3毫米之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，多波长荧光样品是单一样品标记多波长荧光探针或混合样品分别标记不同波长的荧光探针。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二向色镜和长通滤光片之间还具有反射镜和狭缝。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光栅为透射光栅或反射光栅，光栅常数为30～1000线/毫米。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激光激发是单束激光激发或多束激光同时激发。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光学成像仪为电感耦合器件或互补金属氧化物半导体传感器。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，通过分别测量零级光斑与各一级条纹的距离以及各一级条纹的强度分布测定荧光样品的多个发射光谱；通过测定对应一级条纹的强度测定荧光物质浓度。
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