CN104498565A

CN104498565A - 一种利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法

Info

Publication number: CN104498565A
Application number: CN201410458385.6A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 赵磊; 周建飞; 刘春巧; 陈毅明; 张俊
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2014-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用野油菜黄单胞菌发酵液离心或微滤膜过滤后的菌体和上清酶液，分别采取游离细胞法催化合成α-熊果苷和无细胞发酵黄原胶的方法。本发明包括野油菜黄单胞菌斜面种子的制备和一级液体发酵，以蔗糖和对苯二酚为底物利用游离细胞法催化合成α-熊果苷，无细胞发酵生产黄原胶。该方法合成α-熊果苷的转化率达到75~90%，对苯二酚耐受度提高到50~67mmol/L；无细胞法产黄原胶产量达到10.0~20.0g/L，粘度4500~5380mPa·s。该方法具有酶活性高、条件易控、易于产物分离等优点。

Description

一种利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243发酵液离心或微滤膜过滤后的菌体和上清酶液，分别采取游离细胞法催化合成α-熊果苷和无细胞发酵黄原胶的方法。

背景技术

熊果苷(Arbutin)是杜鹃花科熊果属的熊果叶子细胞里的一种成分，具有良好的皮肤美白效果，化妆品行业中用途很广。研究表明α-熊果苷的化学性质比β型更加稳定，美白效果更好，且对人体细胞的副作用更小。现在α-熊果苷的合成方法也多是通过微生物发酵添加底物来进行。

黄原胶(Xanthan gum)是一种高分子胞外多糖，大多是由野油菜黄单胞菌(Xanthomnas campestris)发酵产生。黄原胶具有特殊的三级螺旋分子结构，使其具有良好的水溶性、假塑性，常被用来做乳化剂、增稠剂等，已广泛用于食品、石油、地质、医药、农药、轻工业、印染、陶瓷等工业领域，有着很大的市场潜力。

前人对于黄单胞菌催化生产α-熊果苷和生产黄原胶两个方向分别有一定的研究。许喜林等利用离心方法得到除细胞发酵液，加入培养基后得到的黄原胶产量较一般方法略高，证明这种方法的可行性。王秀捧等探究了游离细胞法产α-熊果苷的条件，其转化率约为80%，但是对苯二酚耐受度较低，只有30mmol/L。游离细胞法和无细胞发酵都有着各自的优点：游离细胞有着酶活性高的特点，反应条件容易控制，也利于熊果苷分离纯化，但由于缺少黄原胶的保护，对对苯二酚的耐受度偏低。无细胞发酵的好处是对于氧气的需求量较小，在分离纯化中也更容易得到产品，降低物料消耗。但由于排出胞外的酶量小，酶促反应要求高，使得到的黄原胶在产量和粘度这两个重要指标上都低于细胞发酵的水平。但利用同一菌种联产两种产物的研究至今未见报道。

本发明采用同一菌种，利用创新的联产方式，在两种产品的生产中分别采用游离细胞和无细胞发酵的方法，以期达到最大的产出比和最小的能源消耗。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶这两种产物的方法，分别采用游离细胞催化合成α-熊果苷、无细胞发酵黄原胶，具有酶活性高、反应条件容易控制、产物易于分离纯化的优点。本发明利用同一菌种，经过高速离心或微滤膜过滤处理后分别用于联产两种产物，可以达到节约物料、降低成本的目的，带来较好的经济效益和社会效益，具有创新性，为工业生产奠定了基础。

本发明的整体技术构思是：

利用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243联产α-熊果苷和黄原胶的方法，该方法由下列工艺步骤组成：

(1) 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243斜面种子的制备和一级液体发酵；

(2) 将步骤（1）发酵液高速离心或微滤膜过滤获得菌体和上清酶液；

(3) 游离细胞法合成α-熊果苷；

(4) 无细胞发酵生产黄原胶。

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：

步骤（1）中培养基成分为：

蔗糖15~30g/L、牛肉蛋白胨1~10g/L、MgS0₄·7H₂0 1~10g/L、酵母粉 1~10g/L、K₂HP0₄·3H₂0 1~10g/L、NaCl 1~10g/L、琼脂5~20g/L。（斜面培养基加，液体培养基不加）

斜面菌种的制备工艺为：将黄单胞菌接入装有固体培养基的试管中，制成斜面菌种，在20~35℃条件下培养12~48小时。

一级液体发酵的制备工艺为：将斜面生长的黄单胞菌用灭菌后的生理盐水溶解后，接种到50ml液体培养基中，接种量为1%~10%，在20~35℃、100~200r/min的摇床中培养，采用好氧培养的方式培养12~48小时。

步骤（2）中高速离心：

将步骤（1）发酵液在5000~20000r/min条件下高速离心10~30min，或者采用0.20μm~0.45μm微滤膜过滤收集菌体和上清酶液。

步骤（3）中游离细胞法合成α-熊果苷具体工艺为：

收集离心后的菌体，在磷酸缓冲溶液中添加明胶和抗坏血酸，添加量分别为1~10%和0.1~2.0g/L，洗涤菌体形成均匀的菌液，加入蔗糖和对苯二酚作为反应底物，在温度20~35℃条件下反应12~48小时。

步骤（4）中无细胞发酵生产黄原胶具体工艺为：

离心上清酶液加入到等体积产胶培养基，温度为15-35℃，培养15-45小时。

产胶培养基成分为：蔗糖10~30g/L，酵母膏0.08g/L，CaCO₃ 1~5g/L，MgS0₄ 1.2g/L，KH₂P0₄ 0.5g/L，KCl 5~30g/L、柠檬酸0.01g/L，pH6.0~8.0。

本发明所用的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所（100080），保藏号为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243，保藏时间为2004年11月8日。

本发明所取得的技术进步在于：

利用本发明联产α-熊果苷和黄原胶的方法具有以下优点：

(1) 本发明采用的游离细胞催化生产α-熊果苷的方法，具有酶活性高的特点，反应条件容易控制，产物纯度高、熊果苷易于分离纯化。

(2) 本发明有效降低了游离细胞缓冲液中对苯二酚对菌体的毒害作用，添加的水溶性高分子和抗氧化剂大幅提高了合成反应转化率。

(3) 本发明采用的无细胞发酵黄原胶的方法，对于氧气的需求量较小，解决了由于黄原胶的高粘度导致的产物难以分离的问题，降低物料消耗。

(4) 本发明利用创新的联产方式，使用同一菌种，在两种产品的生产中分别采用游离细胞和无细胞发酵的方法，以期达到最大的产出比和最小的能源消耗。

实施例：以下结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

（1）野油菜黄单胞菌斜面种子的制备和一级液体发酵：

蔗糖25g/L、牛肉蛋白胨6.0g/L、MgS0₄·7H₂0 1.0g/L、酵母粉 2.5g/L、K₂HP0₄·3H₂0 2.0g/L、NaCl 2.0g/L、琼脂15g/L。（斜面培养基加，液体培养基不加）

斜面菌种的制备工艺为：将黄单胞菌接入装有固体培养基的试管中，制成斜面菌种，在25℃条件下培养24小时。

一级液体发酵的制备工艺为：将斜面生长的黄单胞菌用灭菌后的生理盐水溶解后，接种到50ml液体培养基中，接种量为2%，在28℃、150r/min的摇床中培养，采用好氧培养的方式培养12小时。

（2）将步骤（1）发酵液高速离心获得菌体和上清酶液：

将步骤（1）发酵液在15000r/min条件下高速离心30min，收集菌体和上清酶液。

（3）游离细胞法合成α-熊果苷：

收集离心后的菌体，在磷酸缓冲溶液中添加明胶和抗坏血酸，添加量分别为2%和0.1g/L，洗涤菌体形成均匀的菌液，加入蔗糖和对苯二酚作为反应底物，在温度22℃条件下反应48小时。在此反应条件下，α-熊果苷转化率为75.43%，对苯二酚耐受度为37mmol/L。

（4）无细胞发酵生产黄原胶：

离心上清酶液加入到等体积产胶培养基，温度为15-35℃，培养15-45小时。黄原胶产量达到12.4g/L，粘度4520 mPa·s。

产胶培养基成分为：蔗糖10g/L，酵母膏0.08g/L，CaCO₃ 1.0g/L，MgS0₄ 1.2g/L，KH₂P0₄ 0.5g/L，KCl 10g/L、柠檬酸0.01g/L，pH7.5。

实施例2

（1）野油菜黄单胞菌斜面种子的制备和一级液体发酵：

一级液体发酵的制备工艺为：将斜面生长的黄单胞菌用灭菌后的生理盐水溶解后，接种到50ml液体培养基中，接种量为2%，在28℃、150r/min的摇床中培养，采用好氧培养的方式培养10小时。

（2）将步骤（1）发酵液微滤膜过滤获得菌体和上清酶液：

将步骤（1）发酵液使用0.20μm微滤膜过滤，收集菌体和上清酶液。

（3）游离细胞法合成α-熊果苷：

收集过滤后的菌体，在磷酸缓冲溶液中添加明胶和抗坏血酸，添加量分别为6%和0.4g/L，洗涤菌体形成均匀的菌液，加入蔗糖和对苯二酚作为反应底物，在温度22℃条件下反应48小时。在此反应条件下，α-熊果苷转化率为90%，对苯二酚耐受度为40mmol/L。

（4）无细胞发酵生产黄原胶：

离心上清酶液加入到等体积产胶培养基，温度为32℃，培养36小时。黄原胶产量达到13.6g/L，粘度5120 mPa·s。

产胶培养基成分为：蔗糖10g/L，酵母膏0.08g/L，CaCO₃ 3.0g/L，MgS0₄ 1.2g/L，KH₂P0₄ 0.5g/L，KCl 5g/L、柠檬酸0.01g/L，pH7.5。

实施例3

（1）野油菜黄单胞菌斜面种子的制备和一级液体发酵：

一级液体发酵的制备工艺为：将斜面生长的黄单胞菌用灭菌后的生理盐水溶解后，接种到50ml液体培养基中，接种量为2%，在28℃、150r/min的摇床中培养，采用好氧培养的方式培养14小时。

（2）将步骤（1）发酵液微滤膜过滤获得菌体和上清酶液：

将步骤（1）发酵液使用0.45μm微滤膜过滤，收集菌体和上清酶液。

（3）游离细胞法合成α-熊果苷：

收集过滤后的菌体，在磷酸缓冲溶液中添加明胶和抗坏血酸，添加量分别为8%和1.0g/L，洗涤菌体形成均匀的菌液，加入蔗糖和对苯二酚作为反应底物，在温度24℃条件下反应48小时。在此反应条件下，α-熊果苷转化率为80%，对苯二酚耐受度为67mmol/L。

（4）无细胞发酵生产黄原胶：

离心上清酶液加入到等体积产胶培养基，温度为32℃，培养36小时。黄原胶产量达到20g/L，粘度5380 mPa·s。

产胶培养基成分为：蔗糖10g/L，酵母膏0.08g/L，CaCO₃ 5.0g/L，MgS0₄ 1.2g/L，KH₂P0₄ 0.5g/L，KCl 15g/L、柠檬酸0.01g/L，pH7.5。

Claims

1.一种利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法，其特征为：利用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243液体发酵液高速离心或微滤膜过滤后的菌体和上清酶液，分别使用游离细胞法合成α-熊果苷和无细胞发酵生产黄原胶，达到使用同一菌种联产两种产物的目的；游离细胞法合成α-熊果苷的转化率达到75~90%，对苯二酚耐受度提高到50~67mmol/L；无细胞法产黄原胶产量达到10.0~20.0g/L，粘度4500~5380mPa·s。

2.如权利要求1所述利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法，其特征在于：其制备流程为：野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243斜面种子的制备和一级液体发酵；将步骤（1）发酵液高速离心或微滤膜过滤获得菌体和上清酶液；

游离细胞法合成α-熊果苷；无细胞发酵生产黄原胶。

3.如权利要求2所述利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法，其特征在于：所述（1）步骤中的培养基成分为蔗糖15~30g/L、牛肉蛋白胨1~10g/L、MgS0₄·7H₂0 1~10g/L、酵母粉 1~10g/L、K₂HP0₄·3H₂0 1~10g/L、NaCl 1~10g/L、琼脂5~20g/L。

4.根据权利要求2所述利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法，其特征在于：所述（3）步骤中的游离细胞法合成α-熊果苷具体为：用磷酸缓冲溶液洗涤收集的菌体形成均匀的菌液，加入蔗糖和对苯二酚作为反应底物，催化合成α-熊果苷；反应条件为15~30℃、摇床转速100~200r/min，反应时间12~60小时。

5.根据权利要求2所述利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法，其特征在于：所述（3）步骤中的磷酸缓冲液需要添加明胶、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚丙烯酰胺和抗坏血酸、维生素E，添加量分别为1~10%和0.1~2.0g/L。

6.根据权利要求2所述利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法，其特征在于：所述（4）步骤中的无细胞发酵生产黄原胶具体为：离心上清酶液加入到等体积产胶培养基，温度为15-35℃，培养15-45小时。

7.根据权利要求2所述利用黄单胞菌联产α-熊果苷和黄原胶的方法，其特征在于：所述（4）步骤中的产胶培养基成分为：蔗糖10~30g/L，酵母膏0.08g/L，CaCO₃ 1~5g/L，MgS0₄ 1.2g/L，KH₂P0₄ 0.5g/L，KCl 5~30g/L、柠檬酸0.01g/L，pH6.0~8.0。

8.野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris ）CGMCC NO.1243。