CN104458677A

CN104458677A - 一种筛选间变性淋巴瘤激酶抑制剂高通量筛选方法

Info

Publication number: CN104458677A
Application number: CN201310421283.2A
Authority: CN
Inventors: 严明; 张陆勇; 胡洁; 高鹏
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明发现了一种筛选间变性淋巴瘤激酶抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)间变性淋巴瘤激酶抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP开始反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药IC₅₀；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NX^P自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。

Description

一种筛选间变性淋巴瘤激酶抑制剂高通量筛选方法

技术领域

本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了间变性淋巴瘤激酶(ALK)激酶抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对ALK激酶抑制活性的高通量检测。

背景技术

ALK是一个受体型蛋白酪氨酸磷酸激酶，它能够接受细胞外的信号，调控着细胞的生长、分化、存活和转化。在结构上，ALK包括一个细胞外的配体结合区，一个跨膜区和细胞内的结构域。ALK的cDNA全长6226bp，编码了一个177kDa的蛋白质，经过编译后修饰的ALK蛋白质分子量接近200～220kDa。ALK是一个单链跨膜蛋白质，含有1620个氨基酸残基。ALK的细胞膜外部分包含1030个氨基酸残基，形成了几个重要的结构。跨膜区包括28个氨基酸残基，紧接着是一个由66个氨基酸残基组成的关节膜片段。最初，人们是在间变性大细胞淋巴瘤中以一种激活的融合癌基因的形式发现了ALK，随后连续的研究在多种癌症中发现了ALK的融合形式，其中包括***性组织异常增生、炎性肌纤维细胞瘤、非小细胞肺癌等。ALK在多种癌症中的突变和异常的活性，已经使它成为一个治疗ALK阳性癌症的药物靶点。因此，研究ALK激酶抑制剂具有重大意义。

时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素如铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。

目前，已有多种ALK激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选ALK激酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的ALK激酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。

本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外ALK激酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制ALK激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：

本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种ALK激酶抑制剂高通量筛选模型。

步骤一：ALK激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。

步骤二：阳性药验证模型可靠性。

步骤三：高通量筛选模型验证。

附图说明：

图1：ALK激酶浓度梯度优化实验结果。(n=3，)

图2：ALK激酶温孵时间优化实验结果。(n=3，)

图3：ALK激酶底物浓度优化实验结果。(n=3，)

图4：ALK激酶ATP浓度优化实验结果。(n=3，)

图5：阳性药十字孢碱对ALK激酶的抑制曲线图。(n=3，)

图6：ALK激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。

图7：高通量筛选Z′值分布。

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式：

1.ALK激酶抑制剂筛选方法建立

(1)实验材料

ALK激酶检测试剂盒(Cisbio，法国)、ALK激酶(Invitrogen，美国)、ATP(生兴，中国)、十字孢碱(碧云天，中国)、384低体积白板(Coming，美国)、枪头(Axygen，美国)。

(2)实验步骤

1)进行ALK激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。

2)待测化合物精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10^-3mol/L。

3)在反应容器中每孔加入ALK激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP2μl。室温反应1小时。

4)每孔加入Estradiol-XL6655μl，Anti-Estradiol-cryptate5μl，室温孵育1小时。

5)利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块分别检测665nm和610nm处的荧光强度。

6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC₅₀值，见图5。

7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z’值确定高通量筛选模型的可靠性，见图6，7。

2.数据处理

(1)根据公式计算各孔665nm和610nm处荧光强度的比值(Ratio665/610)；

(2)根据公式计算各孔的相对抑制率

(3)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC₅₀。

实验结果

ALK激酶筛选模型优化结果：最佳反应所需的ALK激酶为0.1ng/μl(见图1)，最佳温孵时间为30min(见图2)，最佳底物浓度为0.1μM(见图3)，最佳ATP浓度为2.3μM(见图4)。阳性药半数抑制率IC₅₀为42nM(见图5)，并通过信噪比和Z’值(见图6，7)验证表明采用本方法建立的ALK激酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行ALK激酶抑制剂的高通量筛选。

Claims

1.一种间变性淋巴瘤激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤：

(1)激酶抑制剂筛选模型的建立与优化；

(2)阳性药验证模型可靠性；

(3)高通量筛选模型验证。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为间变性淋巴瘤激酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行间变性淋巴瘤激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤(1)可得到最佳反应所需的间变性淋巴瘤激酶浓度为0.1ng/μl，最佳温孵时间为30min，最佳底物浓度为0.1μM，最佳ATP浓度为2.3μM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)选用步骤(1)所到的合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km；将激酶和底物按1：2体积混合，每孔加入4ul，再按浓度梯度每孔加入4ul阳性药，最后每孔加入2ul ATP开始反应，按优化时间室温孵育；配制SA-XL665和TK-Ab，将SA-XL665和TK Ab按体积比1：1混合，每孔加入10ul终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率IC₅₀为42nM。

6.权利要求1-5中所述任一方法在筛选间变性淋巴瘤激酶抑制剂的应用。