CN104450824A - 一种以绿豆为原料制备甘露三糖和甘露四糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种以绿豆为原料制备甘露三糖(manninotriose)和甘露四糖(manninotetraose)的方法。包括如下步骤：选取绿豆种子，用粉碎机粉碎，过筛，按一定料液比加入乙醇水溶液提取，将提取液离心，收集上清液，重复上述步骤两次，并合并上清液。以绿豆水溶性糖为底物，加入转化酶进行酶解反应，上中压层析柱，用一系列线性浓度梯度的乙醇水溶液洗脱。对洗脱液进行HPLC分析，合并收集相应组分，得到甘露三糖和甘露四糖粗品。将得到的粗品分别经Biogel P-2凝胶过滤层析柱，得到甘露三糖和甘露四糖纯品。本方法为一种快速制备甘露三糖和甘露四糖的方法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种以转化酶进行酶解反应，利用中压柱层析、Biogel P-2凝胶过滤层析柱，以绿豆为原料制备甘露三糖和甘露四糖的方法。
背景技术
功能性低聚糖是益生元的一种，通常由2-10个单糖分子以糖苷键连接而成的低度聚合糖，它的分子量在200-2000之间。益生元的定义为“通过选择性的增殖一种或少数种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响从而改善寄主健康的不可被消化的食品成分”。因人体肠道内不具备相应的分解消化的酶***，所以低聚糖本身不能被机体消化吸收，而是直接进入到大肠被大肠菌群利用，具有低热量、抗龋齿、防治糖尿病、提高免疫力、改善肠道菌落结构等生理作用。主要的功能性低聚糖包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖等。
棉子糖家族低聚糖(RFOs)是α-低聚半乳糖的重要组成之一，其结构是在蔗糖的葡萄糖残基一侧以α-(1→6)糖苷键连接一个或多个半乳糖分子构成的低聚糖，如三糖的棉籽糖、四糖的水苏糖、五糖的毛蕊花糖、六糖的筋骨草糖等。甘露三糖(Galα(1→6)Galα(1→6)Glc)和甘露四糖(Galα(1→6)Galα(1→6)Galα(1→6)Glc)结构与RFOs的水苏糖和毛蕊花糖结构相似，分别是在葡萄糖一侧以α-(1→6)糖苷键分别连接两个和三个半乳糖分子。目前关于甘露三糖和甘露四糖的研究较少，也很少在天然产物中发现此类低聚糖。然而研究表明在许多天然植物中含有棉子糖家族低聚糖，尤其是在豆类植物中棉子糖家族低聚糖的含量很高。同时已经发现绿豆中水苏糖和毛蕊花糖的含量高于其他豆类植物，因此如果能以绿豆为原料酶解棉子糖家族低聚糖上的果糖获得甘露聚糖，获得快速大量制备甘露三糖和甘露四糖的方法，将具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是以绿豆为原料，通过转化酶进行快速酶解反应，利用中压柱层析，BiogelP-2凝胶过滤层析柱，制备得到甘露三糖和甘露四糖纯品。包括如下工艺步骤：
(1)选取籽粒饱满、无虫害、无缺失的绿豆种子，用粉碎机粉碎，过筛，得到绿豆粉用于磨粉提取。
(2)称取适量步骤(1)中豆粉于容器中，按一定料液加入乙醇水溶液，恒温条件下振荡提取。将提取液离心，收集上清液，下层豆粉重复上述步骤两次，收集上清液，并将上清液合并。
(3)冻干步骤(2)所得提取物加适量水复溶，加入一定量的转化酶，55℃下恒温进行酶解反应。
(4)对步骤(3)中反应前和反应后的水溶性糖组成分别进行HPLC分析，收集反应后的组分过活性炭-硅藻土中压层析柱进行分离。
(5)步骤(4)所得甘露三糖和甘露四糖粗品过Biogel P-2凝胶过滤层析柱，收集只含有单一组分的部分，真空浓缩，冷冻干燥，分别得到甘露三糖和甘露四糖纯品。
(6)步骤(5)所得甘露三糖和甘露四糖的结构鉴定方法为：分离纯化得到的甘露三糖和甘露四糖样品进行ESI-TOF-MS，1H-NMR和13C-NMR和分析。
附图说明
图1为绿豆水溶性糖的HPLC图
图2为酶解反应后溶液的HPLC图
图3为甘露三糖的MS图谱
图4为甘露三糖的1H-NMR图谱
图5为甘露三糖的13C-NMR图谱
图6为甘露四糖的MS图谱
图7为甘露四糖的1H-NMR图谱
图8为甘露四糖的13C-NMR图谱
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
实施例1：
选取籽粒饱满的绿豆，用粉碎机粉碎，过60目筛。称取适量绿豆粉，按料液比1∶10加入80％的乙醇水溶液，于70℃恒温振荡器中振荡提取1h，然后5000转离心10min，收集上清液，下层豆粉按以上条件再次提取，离心收集上清液。将两次的上清液合并、浓缩和冻干，得到绿豆水溶性糖粗提物。称取一定量绿豆粗提物溶解于适量的去离子水中，配制成浓度为50mg/ml的糖溶液。以3U/mg绿豆水溶性糖称取一定量的转化酶，用pH4.5的醋酸缓冲液溶解。迅速将配制好的转化酶溶液加入绿豆水溶性糖溶液中，置于55℃水浴中恒温反应1h后沸水浴10min灭酶活。将反应后的混合溶液经滤膜过滤，滤液上活性炭-硅藻土(1∶1)中压层析柱。层析柱用一系列线性梯度的乙醇溶液(0％～50％)进行洗脱，收集洗脱液，利用HPLC法分析洗脱液的糖组成，合并合适的组分，并经真空浓缩与冷冻干燥，分别制备得到甘露三糖和甘露四糖粗品。将甘露三糖和甘露四糖粗品分别配制为100mg/2ml溶液，分别上 Biogel P-2凝胶过滤层析柱。层析柱用超纯水进行洗脱，利用HPLC法分析洗脱液的糖含量与组成。选取只含单一组分的收集液进行真空浓缩和冷冻干燥，分别制备得到甘露三糖和甘露四糖纯品。
实施例2：
选取籽粒饱满的绿豆，用粉碎机粉碎，过60目筛。称取适量绿豆粉，按料液比1∶10加入50％的乙醇水溶液，于50℃恒温振荡器中振荡提取1h，然后5000转离心10min，收集上清液，下层豆粉按以上条件再次提取，离心收集上清液。将两次的上清液合并、浓缩和冻干，得到绿豆水溶性糖粗提物。称取一定量绿豆粗提物溶解于适量的去离子水中，配制成浓度为100mg/ml的溶液。以3U/mg绿豆水溶性糖称取一定量的转化酶，用pH4.5的醋酸缓冲液溶解。迅速将配制好的转化酶溶液加入绿豆水溶性糖溶液中，置于50℃水浴中恒温反应1h后沸水浴10min灭酶活。将反应后的混合溶液经滤膜过滤，滤液上活性炭-硅藻土(1∶1)中压层析柱。层析柱用一系列线性梯度的乙醇溶液(0％～40％)进行洗脱，收集洗脱液，利用HPLC法分析洗脱液的糖组成，合并合适的组分，并经真空浓缩与冷冻干燥，分别制备得到甘露三糖和甘露四糖粗品。将甘露三糖和甘露四糖粗品分别配制为100mg/2ml溶液，分别上BiogelP-2凝胶过滤层析柱。层析柱用超纯水进行洗脱，利用HPLC法分析洗脱液的糖含量与组成。选取只含单一组分的收集液进行真空浓缩和冷冻干燥，分别制备得到甘露三糖和甘露四糖纯品。
实施例3：
选取籽粒饱满的绿豆，用粉碎机粉碎，过60目筛。称取适量绿豆粉，按料液比1∶12加入50％的乙醇水溶液，于70℃恒温振荡器中振荡提取1h，然后4000转离心15min，收集上清液，下层豆粉按以上条件再次提取，离心收集上清液。将两次的上清液合并、浓缩和冻干，得到绿豆水溶性糖粗提物。称取一定量绿豆粗提物溶解于适量的去离子水中，配制成浓度为200mg/ml的溶液。以3U/mg绿豆水溶性糖称取一定量的转化酶，用pH5.5的醋酸缓冲液溶解。迅速将配制好的转化酶溶液加入绿豆水溶性糖溶液中，置于50℃水浴中恒温反应1h后沸水浴10min灭酶活。将反应后的混合溶液经滤膜过滤，滤液上活性炭-硅藻土(1∶1)中压层析柱。层析柱用一系列线性梯度的乙醇溶液(0％～50％)进行洗脱，收集洗脱液，利用HPLC法分析洗脱液的糖组成，合并合适的组分，并经真空浓缩与冷冻干燥，分别制备得到甘露三糖和甘露四糖粗品。将甘露三糖和甘露四糖粗品分别配制为150mg/2ml溶液，分别上Biogel P-2凝胶过滤层析柱。层析柱用超纯水进行洗脱，利用HPLC法分析洗脱液的糖含量与组成。选取只含单一组分的收集液进行真空浓缩和冷冻干燥，分别制备得到甘露三糖和甘露 四糖纯品。
综上所述仅为本发明的较佳施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所做的等效变化与修饰都应为本发明的技术范畴。
Claims (3)
1.一种以绿豆为原料制备甘露三糖和甘露四糖的方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)选取籽粒饱满、无虫害、无缺失的绿豆种子，用粉碎机粉碎，过筛，得到绿豆粉用于水溶性糖的提取。
(2)称取适量步骤(1)中豆粉于容器中，按一定料液加入乙醇水溶液，恒温条件下振荡提取。将提取液离心，收集上清液，下层豆粉重复上述步骤两次，收集上清液，并将上清液合并。
(3)冻干步骤(2)所得提取物加适量水复溶，加入一定量的转化酶，55℃下恒温进行酶解反应。
(4)对步骤(3)中反应前和反应后的水溶性糖组成分别进行HPLC分析，收集反应后的组分过活性炭-硅藻土中压层析柱进行分离。
(5)步骤(4)所得甘露三糖和甘露四糖粗品过Biogel P-2凝胶过滤层析柱，收集只含有单一组分的部分，真空浓缩，冷冻干燥，分别得到甘露三糖和甘露四糖纯品。
2.根据权利要求1所述的制备甘露三糖和甘露四糖的方法，其特征在于步骤(2)中乙醇水溶液浓度为80％，绿豆水溶性糖提取的料液比为1∶10，在70℃下水浴浸提1h。
3.根据权利要求1所述的制备甘露三糖和甘露四糖的方法，其特征在于步骤(3)中转化酶以pH4.5的醋酸缓冲液配制，浓度为3U/mg绿豆水溶性糖。于55℃水浴反应1h。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN108164571A (zh) * | 2018-02-23 | 2018-06-15 | 上海悦目化妆品有限公司 | 一种绿豆α-低聚半乳糖提取物及其提取方法和护肤应用 |
| CN114957351A (zh) * | 2022-07-11 | 2022-08-30 | 成都长力元生物科技有限公司 | 一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法 |
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Non-Patent Citations (5)
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| 朱玉亮 等: "1,6连接的葡萄四糖、半乳四糖及甘露四糖的合成", 《厦门大学学报（自然科学版）》 * |
| 李道义 等: "低聚甘露糖的酶法制备、分离与结晶", 《食品科学》 * |
| 武卫红 等: "甘露三糖的制备及其工艺优化", 《中药材》 * |
| 武卫红: "地黄寡糖的制备工艺及其药理活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 * |
| 苏娣: "绿豆中毛蕊花糖的分离纯化、肠道益生和免疫活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108164571A (zh) * | 2018-02-23 | 2018-06-15 | 上海悦目化妆品有限公司 | 一种绿豆α-低聚半乳糖提取物及其提取方法和护肤应用 |
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