CN105695537B - 一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法 - Google Patents

一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法，其制备方法为：浒苔干燥后超微粉碎，经乙醇回流提取工艺，浓缩、干燥粉碎后得到脱脂的浒苔粉末，经脱蛋白、去除多糖及色素后，再将岩藻糖基转移酶加入含有浒苔寡糖的反应体系中，进行岩藻糖基化反应，制备得到所述的岩藻糖基化浒苔寡糖。经证实糖基化浒苔寡糖对α‑葡萄糖苷酶具有强抑制活性，显著提高肠道益生菌数量，可用于制备防治糖尿病改善肠道菌群等代谢性疾病的药品或保健品。

Description

一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法。
背景技术
随着人民生活的提高，高血糖人群的日益扩大，由高血糖引起的糖尿病，血液循环***疾病对人类健康危害越来越大。近年来的研究数据显示，肠道菌群与2型糖尿病密切相关。双歧杆菌是人体肠道菌群中的优势菌属，是人类健康的重要标志之一。双歧杆菌数量的减少可导致整个肠道菌群失调和肠道微生态失衡，从而导致众多代谢性疾病的发生。双歧杆菌可以有效改善糖耐量和葡萄糖诱发的胰岛素分泌功能，降低高脂饮食诱导的糖尿病小鼠内毒素血症和血浆脂肪组织的促炎症因子水平，从而改善糖尿病代谢紊乱的状态。寡糖的岩藻糖基化是通过岩藻糖基转移酶将岩藻糖基转移到寡糖上完成的。岩藻糖基化寡糖在真核生物的多种生理和病理过程中发挥重要作用。浒苔隶属绿藻门石莼目石莼科浒苔属植物，具有取材方便、价格低廉的优点，是开发海洋药物的极好资源。目前，功能性浒苔寡糖研究相关报道极少，尚未见糖基化浒苔寡糖降血糖和促进肠道益生菌增殖功能研究的相关报道或专利。本发明制备的糖基化浒苔寡糖对á-葡萄糖苷酶具有强抑制活性，能显著促进肠道益生菌增殖，在制备治疗和预防糖尿病肠道疾病药物及保健品上的应用具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种降血糖及调节肠道菌群的糖基化浒苔寡糖制备方法。制备工艺路线简单有效，增强了功能性寡糖的活性，是一种绿色高效制备糖基化功能性寡糖的有效方法，极大提升了绿藻浒苔资源的经济附加值。制备的糖基化浒苔寡糖对á-葡萄糖苷酶具有强抑制活性，能显著促进肠道益生菌增殖，并且具有改善肠道菌群的功效，对肠道益生菌双歧杆菌增殖有明显促进作用。本发明糖基化浒苔寡糖可应用于降糖益生菌制剂药物或保健品的制备，所要解决的技术问题是提供一种疗效好且利用度高的防治糖尿病改善肠道菌群的糖基化寡糖。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）取干燥、超微粉碎、过80-100目筛的浒苔粉末，按重量体积比（g/mL）1:20-30加入质量浓度为60%-80%的乙醇溶液，60-90℃下200-400W超声提取1-1.5小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的3-8%，真空冷冻干燥后粉碎，过50-80目筛；
（2）向步骤（1）所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为（g/mL）1:10-20，进行搅拌复溶，用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种或几种除蛋白3-5次；
（3）将步骤（2）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1:30-50去除色素，于摇床中60-80 r/min振荡1-2h，4000-6000rpm离心15-20 min，收集上清液；
（4）将步骤（3）得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的3-8%，然后按体积比1:3-4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4-10℃条件下静置24 h，6000-8000rpm离心15-20min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔功能性寡糖的固体，粉末后过50-80目筛；
（5）将步骤（4）中浒苔寡糖粗品粉末加蒸馏水溶解，粉末质量与水体积比（g/mL）为1:20-50，溶液用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37-40℃及转速为60-80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10-1/5；浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未糖基化浒苔寡糖精制品；
（6）步骤（5）得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比（mg/mL）1:1-2溶解于蒸馏水中，将商品化岩藻糖基转移酶加入到反应体系中进行生物反应，岩藻糖基转移酶用量与反应体系按质量与体积比（mg/mL）1:3-5，反应体系中浒苔寡糖与二磷酸鸟苷-岩藻糖浓度比（mM）1:1.0-1.5，MgCl2终浓度为15-20 mM，pH6.5-8.0，置于35-40℃温度，80-100 r/min摇床条件下反应24 -36 h。
（7）将步骤（6）反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，8000-10000 r/min离心15-20min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到糖基化浒苔活性寡糖粗品。
（8）将步骤（7）所得粗品溶解后过Bio-Gel P-2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3,5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分，浓缩后真空冷冻干燥得到糖基化浒苔活性寡糖。
本发明的优点在于：本发明利用岩藻糖基转移酶生物反应制备出具有防治2型糖尿病改善肠道菌群的糖基化浒苔寡糖，尚未见到岩藻糖基化浒苔寡糖促进肠道益生菌增殖的报道。本发明简单易操作，提高了功能性寡糖的原有活性，减少了岩藻糖基化寡糖制备的生产成本。同时，本发明能有效合理的综合利用浒苔资源，提高其商品价值与经济附加值。
附图说明
图1 浒苔寡糖对á-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。
图2 糖基化寡糖对婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis增殖影响。
具体实施方式
实施例1
（1）取干燥、超微粉碎、过80目筛的浒苔粉末，按重量体积比（g/mL）1:20加入质量浓度为60%的乙醇溶液，60℃下200W超声提取1小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的3%，真空冷冻干燥后粉碎，过50目筛；
（2）向步骤（1）所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为（g/mL）1:10，进行搅拌复溶，用三氟三氯乙烷法除蛋白3次；
（3）将步骤（2）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1:30去除色素，速度为60 r/min振荡1 h，4000rpm离心15 min，收集上清液；
（4）将步骤（3）得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的3%，然后按体积比1:3加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4℃条件下静置24 h，6000rpm离心15min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔功能性寡糖的固体，粉末后过50目筛；
（5）将步骤（4）中浒苔寡糖粗品粉末加蒸馏水溶解，粉末质量与水体积比（g/mL）为1:20，溶液用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37℃及转速为60 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10；浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未糖基化浒苔寡糖精制品；
（6）步骤（5）得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比（mg/mL）1:1溶解于蒸馏水中，将商品化岩藻糖基转移酶加入到反应体系中进行生物反应，岩藻糖基转移酶用量与反应体系按质量与体积比（mg/mL）1:3，反应体系中浒苔寡糖与二磷酸鸟苷-岩藻糖浓度比（mM）1:1.0，MgCl2终浓度为15 mM，pH6.5，置于35℃温度，80 r/min摇床条件下反应24 h。
（7）将步骤（6）反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，10000r/min离心20min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到糖基化浒苔活性寡糖粗品。
（8）将步骤（7）所得粗品溶解后过Bio-Gel P-2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3,5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分，浓缩后真空冷冻干燥得到糖基化浒苔活性寡糖。
实施例2
（1）取干燥、超微粉碎、过100目筛的浒苔粉末，按重量体积比（g/mL）1: 30加入质量浓度为80%的乙醇溶液，90℃下400W超声提取1.5小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行3次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的8%，真空冷冻干燥后粉碎，过80目筛；
（2）向步骤（1）所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为（g/mL）1:20，进行搅拌复溶，用Sevag法除蛋白5次；
（3）将步骤（2）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1: 50去除色素，于摇床中80 r/min振荡2 h，5000rpm离心17 min，收集上清液；
（4）将步骤（3）得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的8%，然后按体积比1: 4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入10℃条件下静置24 h， 8000rpm离心20min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔功能性寡糖的固体，粉末后过100目筛；
（5）将步骤（4）中浒苔寡糖粗品粉末加蒸馏水溶解，粉末质量与水体积比（g/mL）为1: 50，溶液用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在40℃及转速为80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5；浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未糖基化浒苔寡糖精制品；
（6）步骤（5）得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比（mg/mL）1: 2溶解于蒸馏水中，将商品化岩藻糖基转移酶加入到反应体系中进行生物反应，岩藻糖基转移酶用量与反应体系按质量与体积比（mg/mL）1: 5，反应体系中浒苔寡糖与二磷酸鸟苷-岩藻糖浓度比（mM）1: 1.5，MgCl2终浓度为20 mM，pH8.0，置于40℃温度，100 r/min摇床条件下反应36 h。
（7）将步骤（6）反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，10000r/min离心20min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到糖基化浒苔活性寡糖粗品。
（8）将步骤（7）所得粗品溶解后过Bio-Gel P-2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3,5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分，浓缩后真空冷冻干燥得到糖基化浒苔活性寡糖。
实施例3
（1）取干燥、超微粉碎、过90目筛的浒苔粉末，按重量体积比（g/mL）1:26加入质量浓度为75%的乙醇溶液，75℃下300W超声提取1.3小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行3次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的5%，真空冷冻干燥后粉碎，过70目筛；
（2）向步骤（1）所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为（g/mL）1:16，进行搅拌复溶，用三氯乙酸法除蛋白4次；
（3）将步骤（2）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比（g/mL）1:40去除色素，于摇床中70 r/min振荡1.5 h，6000rpm离心20 min，收集上清液。
（4）将步骤（3）得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的6%，然后按体积比1:3加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入5℃条件下静置24 h，7000rpm离心17min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔功能性寡糖的固体，粉末后过70目筛；
（5）将步骤（4）中浒苔寡糖粗品粉末加蒸馏水溶解，粉末质量与水体积比（g/mL）为1:40，溶液用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在38℃及转速为70 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10；浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未糖基化浒苔寡糖精制品；
（6）步骤（5）得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比（mg/mL）1:1.5溶解于蒸馏水中，将商品化岩藻糖基转移酶加入到反应体系中进行生物反应，岩藻糖基转移酶用量与反应体系按质量与体积比（mg/mL）1:4，反应体系中浒苔寡糖与二磷酸鸟苷-岩藻糖浓度比（mM）1:1.2，MgCl2终浓度为18 mM，pH7，置于37℃温度，90 r/min摇床条件下反应30h。
（7）将步骤（6）反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，9000 r/min离心18min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到糖基化浒苔活性寡糖粗品。
（8）将步骤（7）所得粗品溶解后过Bio-Gel P-2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3,5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分，浓缩后真空冷冻干燥得到糖基化浒苔活性寡糖。
本发明制备的浒苔活性寡糖对á-葡萄糖苷酶具有强抑制活性，其IC50值为1.36mg/mL，且呈现剂量依赖性（图1）。
将婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis接种至商品化BBL培养基中（BBL培养基配方：蛋白胨15g/L，酵母膏粉2g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉0.5g/L，氯化钠5g/L，半胱氨酸0.5g/L，吐温-80 1mL/L，肝粉0.3g/L，琼脂15g/L，pH 6.8±0.2），同时糖基化寡糖替换葡萄糖作为受试样品组，置于厌氧培养箱37℃培养84 h，每隔12h测定培养液OD600值以监测双歧杆菌增殖情况。由图2可见，糖基化寡糖能显著提高肠道益生菌双歧杆菌数量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种糖基化浒苔活性寡糖在制备防治糖尿病改善肠道菌群代谢性疾病的药品或保健品中的应用，其特征在于：所述糖基化浒苔活性寡糖制备方法包括如下：
（1）取干燥、超微粉碎、过80-100目筛的浒苔粉末，按重量g与体积mL之比1:20-30加入质量浓度为60%-80%的乙醇溶液，60-90℃下200-400W超声提取1-1.5小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，合并提取液，将获得的滤液混合后进行减压浓缩至原体积的3-8%，真空冷冻干燥后粉碎，过50-80目筛；
（2）向步骤（1）所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量g与蒸馏水mL体积比为1:10-20，进行搅拌复溶，用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种或几种除蛋白3-5次；
（3）将步骤（2）所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比1:30-50去除色素，于摇床中60-80r/min振荡1-2h，4000-6000rpm离心15-20 min，收集上清液；
（4）将步骤（3）得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的3-8%，然后按体积比1:3-4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4-10℃条件下静置24 h，6000-8000rpm离心15-20min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔功能性寡糖的固体，粉末后过50-80目筛；
（5）将步骤（4）中浒苔寡糖粗品粉末加蒸馏水溶解，粉末质量g与水mL体积比为1:20-50，溶液用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37-40℃及转速为60-80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10-1/5；浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未糖基化浒苔寡糖精制品；
（6）步骤（5）得到的浒苔寡糖精制品按质量mg与体积mL之比1:1-2溶解于蒸馏水中，将岩藻糖基转移酶加入到反应体系中进行生物反应，岩藻糖基转移酶用量与反应体系按质量mg与体积mL比1:3-5，反应体系中浒苔寡糖与二磷酸鸟苷-岩藻糖浓度比1:1.0-1.5、MgCl2终浓度为15-20 mM、pH6.5-8.0，置于35-40℃温度，80-100 r/min摇床条件下反应24-36 h；
（7）将步骤（6）反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，8000-10000r/min离心15-20min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到糖基化浒苔活性寡糖粗品；
（8）将步骤（7）所得粗品溶解后过Bio-Gel P-2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3,5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分，浓缩后真空冷冻干燥得到糖基化浒苔活性寡糖。
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