CN104450641B - 一种环氧化物水解酶及其编码基因和应用 - Google Patents

一种环氧化物水解酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种环氧化物水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明涉及一种环氧化物水解酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还涉及一种环氧化物水解酶的应用，所述环氧化物水解酶以外消旋的芳香环氧化物为底物制备手性的芳香环氧化物。本发明提供的环氧化物水解酶可以整细胞的湿菌体或冻干菌体的形式，也可以粗酶液或纯酶的形式，以外消旋的芳香环氧化物为底物，制备得到对映纯的手性的芳香环氧化物(ee>99％)。

Description

一种环氧化物水解酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及酶催化领域，更具体地涉及一种环氧化物水解酶及其编码基因和应用。
背景技术
环氧化物水解酶(EC 3.3.2.3)是一组功能相似的酶系，能够立体选择性催化环氧化合物生成光学纯的环氧化物和相应邻位二醇。作为一种水解酶它具有一般水解酶的特点如：反应不需要辅酶的协助；具有广泛的来源；在非水溶剂中仍具有催化活力；以及这些反应常常显示出化学、区域和立体对映选择性，能够对同类型广泛的底物进行作用。
环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，在哺乳动物、昆虫、微生物和植物中均有发现。由于微生物种类的多样性、生长速度快、易于培养和产量高等优点，从微生物中筛选获得环氧化物水解酶是目前主要的途径。近年，已从多种微生物中发现了环氧化物水解酶，如Rhodococcus equi，Rhodococcus ruber，Mycoplana rubra，Bacillus megaterium,Diplodia gossipina，Streptomyces striana,Rhodotorula glutinis,Bacillussubtilis,Sphingomonasechinoides，Rhodotorula araucariae，Rhodosporidiumtoruloides，Agrobacterium radiobacter，Mycobacter tuberculosis，Aspergillusniger，Caulobacter crescentus，Trichosporon loubierii，Sphingomonas sp，Novosphingobium aromaticivorans，Saccharomyces cerevisiae等。其中部分环氧化物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母、耶氏酵母等)中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于不对称拆分外消旋环氧化物，其中来自Aspergillusniger的环氧化物水解酶已经上市。
由于环氧化物能够被多种亲核试剂开环，所以环氧化物是应用广泛的合成中间体。在对手性纯药物的持续扩大的需求下，酶法制备手性化合物是温和无污染低能耗的绿色途径。在对映纯芳香环氧化物的制备方法中，环氧化物水解酶以低价格外消旋环氧化物为底物，不需要昂贵的辅酶参与，反应条件简单温和，并且底物产物分离工艺简便，是首选的制备途径。
目前，手性的苯基缩水甘油醚及其衍生物可用于合成β-受体阻滞剂、保护神经的化合物和BACE抑制剂。随着手性药物的不断出现，光学纯的苯基缩水甘油醚及其衍生物将有更加广泛的用途。但是，目前仍没有一种环氧化物水解酶能够高效地以外消旋苯基缩水甘油醚为底物制备R构型的苯基缩水甘油醚的方法。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的无法通过高选择性的环氧化物水解酶以外消旋苯基缩水甘油醚为底物制备光学纯的R构型苯基缩水甘油醚的问题，本发明旨在提供一种环氧化物水解酶及其编码基因和应用。
本发明提供一种环氧化物水解酶，该环氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供一种环氧化物水解酶的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明提供一种环氧化物水解酶的应用，所述环氧化物水解酶以外消旋的芳香环氧化物为底物制备手性的芳香环氧化物。
所述芳香环氧化物为苯基缩水甘油醚、间甲基苯基缩水甘油醚、间硝基苯基缩水甘油醚或对甲基苯基缩水甘油醚。
所述底物溶解于二甲基亚砜中，所述环氧化物水解酶溶解于pH为7～8的缓冲液或纯水中，两者混合形成反应体系。具体地，溶解于二甲基亚砜中的外消旋的芳香环氧化物底物，于pH 7～8缓冲液或纯水的反应体系中进行转化反应，在25～35℃、100～250r/min条件下转化反应0.05～2h得到含手性的芳香环氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得手性芳香环氧化物。其中，优选地，所述底物的初始浓度为400mM，所述冻干菌体的质量用量以菌体干重计为10mg/ml底物。
所述环氧化物水解酶的制备方法包括：S1，将来源于DSM20162 Tsukamurellapaurometabola的SEQ ID NO：1所示的环氧化物水解酶的基因构建载体，将载体转化大肠杆菌；S2，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离获得含环氧化物水解酶的菌体细胞。
所述步骤S1包括：以GenBank登录号为YP_003645475的序列设计引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；以从DSM20162 Tsukamurella paurometabola提取的基因组为模板克隆获得全长1038bp的基因片段；经过BamHI和HindIII两个内切酶酶切后，与对应的经过酶切的pET-28a线性化质粒连接，将连接产物转化至克隆宿主E.coli DH5α，获得的单克隆过夜培养提取质粒，转化至E.coli BL21。
所述步骤S2包括：获得的重组基因工程菌以IPTG为诱导剂进行诱导培养，得到含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21的湿菌体。具体地，将含有胞内表达重组质粒pET28a-EH的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以1％的接种量(v/v)接种到新鲜的含有50ug/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃诱导培养20h后，将培养液在4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即为含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH湿菌体。
所述环氧化物水解酶的制备方法还包括：S3，冷冻干燥所述湿菌体得到冻干菌体。
所述环氧化物水解酶的制备方法还包括：S4，破碎所述湿菌体或所述冻干菌体后得到粗酶液。
所述环氧化物水解酶的制备方法还包括：S5，提纯所述粗酶液得到纯酶。
本发明所涉及的来源于DSM20162 Tsukamurella paurometabola的环氧化物水解酶的基因，经过遗传操作转化至大肠杆菌后可获得一种新型的环氧化物水解酶，该环氧化物水解酶可以整细胞的湿菌体或冻干菌体的形式，也可以粗酶液或纯酶的形式，以外消旋的芳香环氧化物为底物，制备得到对映纯的手性的芳香环氧化物(ee>99％)。
附图说明
图1是本发明的重组表达载体pET-28a(+)的物理图谱；
图2是电泳图谱，其中，泳道2示出了本发明的纯化后环氧化物水解酶的SDS-PAGE电泳条带。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
发明人克隆并表达了几十个预测有环氧水解酶基因的序列，其或者选择性不够高、或者活性低、或者存在耐受性等问题，通过筛选，最终确定以来源于DSM20162Tsukamurella paurometabola的环氧化物水解酶基因为基础进行实验。
实施例1：含有环氧水解酶基因的克隆
从德国DSMZ购买编号为DSM20162的标准菌株冻干管。
1LTsukamurella paurometabola培养基如下：Trypticase Soy Broth(BBL11768,Oxoid CM129 or Merck 5459)30.0g；蒸馏水1000ml；PH7.3。121℃灭菌15min。28℃恒温摇床200rpm培养1至3天，离心收集菌体，按照捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取Tsukamurella paurometabola基因组，以如下两条引物扩增：
F：5’-CGCGGATCCATGACGATCACCCCGCACACCGTG-3’(SEQ ID NO：3)；
R：5’-CCCAAGCTTTCAGCCCGCGGGGTGGTTCTCC-3’(SEQ ID NO：4)；
得到该环氧水解酶的基因全长。
东洋纺KOD酶PCR反应体系为：H2O 32.5ul、缓冲液5ul、2mm dNTP5ul、MgCl22.5ul、模板2ul、20mM F/R引物1ul、KOD酶1ul。琼脂糖凝胶电泳确认条带大小正确后，使用天根公司胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的基因。随后，使用Fermentas公司内切酶BamHI和HindIII切割基因末端获得有悬挂末端的核酸序列。同时使用相同的内切酶切割获得相对应的具有悬挂末端的pET28a线性化载体。纯化后将两者在连接酶存在的体系中连接成环，如图1所示。将连接液转化入克隆宿主DH5α挑取转化子测序，确认重组质粒是否成功。提取测序正确的转化子的质粒，将其转入表达宿主BL21中。
实施例2：含有环氧水解酶整细胞的获得
获得的转化子接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以1％的接种量(v/v)接种到新鲜的含有50ug/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃诱导培养20h后，将培养液在4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即为含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH湿菌体。将湿菌体冷冻干燥4h后即得到冻干菌体。1000mlLB培养基配方为：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母膏5g。将湿菌体破碎后离心弃沉淀，取上清使用镍柱纯化，在20mM咪唑下洗脱杂蛋白，200mM咪唑下洗脱目的蛋白可以得到单一条带的环氧水解酶纯酶，如图2所示，再次可确认重组质粒构建成功。纯酶酶活为30U/mg。
实施例3：该环氧水解酶在制备R-苯基缩水甘油醚中的应用
以实施例2得到的冻干菌体作为催化剂。将50mg冻干菌体溶于45mL，100mMTrish-Hcl中，200rpm 5min充分混匀后加入5ml 4M DMSO溶解的外消旋苯基缩水甘油醚，200rpm30℃，1h后终止反应。使用15ml正己烷萃取三次得到ee>99％R-苯基缩水甘油醚，之后15ml乙酸乙酯萃取三次得到ee>83％S-苯氧基乙二醇。
检测手段为：大赛璐OD-H手性色谱柱，Agilent 1100型液相色谱。流动相为正己烷：异丙醇＝90:10，流速1.5ml。
R-间甲基苯基缩水甘油醚、R-间硝基苯基缩水甘油醚、R-对甲基苯基缩水甘油醚制备方式与此类似，在此不再赘述。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (6)

1.一种环氧化物水解酶的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQID NO：2所示，所述环氧化物水解酶以外消旋的芳香环氧化物为底物制备手性的芳香环氧化物，所述芳香环氧化物为苯基缩水甘油醚、间甲基苯基缩水甘油醚、间硝基苯基缩水甘油醚或对甲基苯基缩水甘油醚，所述底物溶解于二甲基亚砜中，所述环氧化物水解酶溶解于pH为7～8的缓冲液或纯水中，两者混合形成反应体系；在25～35℃的条件下转化，获得R构型的手性芳香环氧化物；所述环氧化物水解酶的制备方法包括：S1，将来源于DSM20162Tsukamurella paurometabola的SEQ ID NO：1所示的环氧化物水解酶的基因构建载体，将载体转化大肠杆菌；S2，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离获得含环氧化物水解酶的菌体细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤S1包括：以GenBank登录号为YP_003645475的序列设计引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；以从DSM20162 Tsukamurella paurometabola提取的基因组为模板克隆获得全长1038bp的基因片段；经过BamHI和HindIII两个内切酶酶切后，与对应的经过酶切的pET-28a线性化质粒连接，将连接产物转化至克隆宿主E.coli DH5α，获得的单克隆过夜培养提取质粒，转化至E.coli BL21。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤S2包括：获得的重组基因工程菌以IPTG为诱导剂进行诱导培养，得到含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21的湿菌体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的制备方法还包括：S3，冷冻干燥所述湿菌体得到冻干菌体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的制备方法还包括：S4，破碎所述湿菌体或所述冻干菌体后得到粗酶液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的制备方法还包括：S5，提纯所述粗酶液得到纯酶。
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