CN103820417B - 一种酯水解酶、编码基因、载体、工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种来自于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的酯水解酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。所述酯水解酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因如SEQ ID NO.1所示。本发明重组的酯水解酶是可用于立体选择性催化手性化合物的合成，具有较高的催化活力和立体选择性。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种具有S-异构体立体选择性的酯水解酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。
（二）背景技术
酯水解酶包括有脂肪酶和酯酶，它是一类在手性合成中有着重要用途的生物催化剂。这些酶能识别很宽的底物，目前＞40%的生物不对物合成反应可有酯水解酶催化完成，这些反应具有条件温和、反映的区域选择性和立体选择性高等特点。在酶动力学拆分外消旋酯、胺和转化前手性醇等方面等到广泛的应用。另外，它们还可用于选择性酯化、转酯化和聚合反应中。
由于对手性药物和中间体需求的增长，利用生物法或酶法合成手性化合物日益得到人们的重视和工业化应用。生物法合成手性化合物的关键问题在于寻找具有高度立体选择性催化功能的生物催化剂。由于酯水解酶具有广泛的用途，筛选新的酯水解酶正成为酶工程的研究热点。虽然酯水解酶在微生物界分布很广，但它们的立体选择性催化功能不一样。在同一生物体内往往存在多种酯水解酶，由于它们之间立体选择性存在差异性，利用为生物细胞或它们的粗酶制品进行酶法合成手性化合物时往往会降低产物的光学纯度（Geun-Joong Kim,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic17，2002:29-38）。解决这一问题可以通过工程的调控手段来减少副反应的发生，也可以通过分离纯化得到单一的酶制剂来进行催化反应，但这些过程往往较复杂和高的成本，再生产中不易被采用。如果通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需要的酶的基因，就能够很方便达到以上的目的。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种筛选获得的具有S-异构体立体选择性的酯水解酶，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。
本发明采用的技术方案是：
一种具有S-异构体立体选择性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明人通过筛选大量的微生物，发现巨大芽孢杆菌能产生一种有高度立体选择性的酯水解酶，本发明酯水解酶来自巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）WZ009，该菌株保藏编号为CCTCC NO：M2010171，已在CN102168036A中披露。发明人通过PCR扩增得到巨大芽孢杆菌的一种具有S-异构体立体选择性的酯水解酶基因BMEST，测定了其核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所示，其中编码序列（CDS）从DNA第1个碱基起至第1401终止，ATG为转录起始密码子，TAA为转录终止密码；并得到相应的氨基酸序列，如列表中SEQ ID No.2所示。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、***或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还涉及所述酯水解酶的编码基因。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
所述重组载体是用常规方法将本发明的酯水解酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，该载体可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，如pUC，pBluescript(Stratagene)，pLEX(Novagen,Inc.,Madison,Wis.)，PQE(Qiagen)，pREP，pSE420和pLEX(Invitrogen），但不是仅限于这些载体。较佳的是将PCR扩增到的BMEST基因产物通过TA克隆和表达载体pEASY-E1连接，形成BMEST基因的表达载体（质粒）pEASY-E1-BMEST。表达载体pEASY-E1-BMEST转化Trans1-T1感受态细胞，扩增质粒。
所述工程菌是将包含本发明酯水解酶基因核苷酸序列的表达载体转化到感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到的基因工程菌株，如将质粒pEASY-E1-BMEST转化其中得到含有pEASY-E1-BMEST的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST。
本发明还涉及所述基因在制备重组酯水解酶中的应用。具体的应用包括用上述本发明表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的酯水解酶。其中，该宿主细胞可以为原核、真核微生物或昆虫等。较佳的是大肠杆菌，得到相应的转化体为上述的基因工程菌株：大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST。此菌株可在常规的IPTG诱导下（在OD600=0.5～0.6左右时加入，至其浓度为0.1～1mmol/L均可）高效表达酯水解酶蛋白，即为本发明的重组酯水解酶。
本发明还涉及所述的酯水解酶在立体选择性催化拆分外消旋底物制备手性化合物中的应用。所述外消旋底物为下列之一：4-氯-3-羟基丁酸酯、3-羟基丁酸酯、四氢糠酸酯。本发明的酯水解酶可以用于制备光学纯的手性化合物。
本发明的有益效果主要体现在：本发明的酯水解酶可以用于制备光学纯的手性化合物，具有较高的催化活力和立体选择性。
（四）附图说明
图1为本发明BMEST的PCR扩增电泳图谱，其中，1、DNA Marker（λ-HindⅢdigest,TakaRa公司）；2、BMEST的PCR扩增产物。
图2为本发明质粒pEASY-E1-BMEST PCR验证电泳图谱，其中，1、DNA Marker（λ-HindⅢdigest,TakaRa公司）；2、重组质粒pEASY-E1-BMEST PCR产物；
图3为本发明基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST表达产物的PAGE电泳图，其中，1、基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST诱导前产物；2、基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST经IPTG诱导后产物；3、低分子量标准蛋白质（TakaRa公司）。
图4为表达质粒pEASY-E1-BMEST构建示意图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中的材料与方法为：
所采用的分子克隆技术参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
TransStartTM Taq DNA Polymerase购于TransGen Biotech公司。DNAmarker、基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、琼脂糖电泳试剂均购自TaKaRa，大连宝生物公司，使用方法参考商品说明书。
Trans1-T1感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司。
大肠埃希氏菌BL21(DE3)，TakaRa，大连宝生物公司。
Ni-NTA Sefinose Kit，Bio Basic INC公司。
实施例1：从巨大芽孢杆菌克隆BMEST基因
根据Bacillus megaterium DSM319脂肪酶的DNA序列（GenBank:CP001982.1）设计简并引物1和引物2。
引物1序列：ATGAATATCACAACGTTTGACG
引物2序列：TTATTTTTCTGTTGATATGCTTTTC
以巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）DSM319基因组DNA为模板进行PCR扩增（利用TakaRa试剂盒），PCR反应体系和反应条件如表1和表2所示。步骤2到4重复25次。
表1：PCR扩增反应体系
表2：PCR扩增反应条件
用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，产物为单一条带，大小约为1400bp（如图1所示）。对PCR产物进行纯化回收，具体步骤参照北京博大泰克基因组DNA快速纯化回收试剂盒说明书，然后用微量核酸蛋白测量仪检测浓度及纯度。
实施例2：表达载体和转化体的构建
将目的片段与pEASY-E1表达载体进行A-T连接，连接体系如下表3：
表3：pEASY-E1Expression Vector连接体系
连接体系于25℃下反应15min，加连接产物于50μL刚解冻的Trans-T1感受态细胞中克隆，具体操作参照pEASY-E1Expression Kit说明书。PCR法鉴定正确表达方向的阳性重组子（如图2所示），转接至LB培养基扩增载体。用TaKaRa质粒提取试剂盒从Trans1-T1菌体中提取重组质粒pEASY-E1-BMEST，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经Amp抗性培养基筛选得到阳性克隆并经PCR克隆鉴定，含有正确的重组质粒（如图3所示），从而得到转化体一表达本发明酯水解酶的基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST。
实施例3：酯水解酶的表达
将基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pEASY-E1-BMEST接于50mL、含80μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。取500μL培养液接至50mL、含80μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB培养基，培养至OD600约为0.5-0.6时，加入IPTG至其浓度为0.1mmol/L诱导，25℃，200rpm继续培养10-12h过量表达目的蛋白，离心收集菌体。
实施例4：重组酯水解酶的应用
取实施例3中的重组大肠杆菌，经超声破壁，离心去除菌体，上清液经HisTrapTMFF亲和层析柱后得到部分纯化的重组酯水解酶。取得到的该重组酯水解酶，水解外消旋的4-氯-3-羟基丁酸乙酯等底物，反应溶剂为50mM pH8.0Tris盐酸缓冲液、底物浓度分别为2%（体积比），酶用量为20mg/L缓冲液，水浴反应温度30℃，反应120min后，反应产物经气相色谱（Agilent公司出品的6890N和BGB-174手性气相色谱柱）分析转化率和产物的光学纯度，结果见表4。
野生型的巨大芽孢杆菌WZ009（CCTCC NO：M2010171）接种至发酵培养基，50mL装液量/250mL摇瓶、温度30℃、摇床转速200rpm的条件下培养12小时，得到发酵液，离心收集菌体，经超声破壁，离心去除菌体，上清液即为粗酶液，作为对照，在相同条件下水解外消旋的4-氯-3-羟基丁酸乙酯等底物，结果见表5；发酵培养基：葡萄糖7.2g/L、酵母膏7g/L、CaCl21.25g/L，溶剂为水，初始pH6.5。
气相色谱运行条件如下：载气为氮气。进样口温度：220℃。空气流量300mL/min，尾吹气流量30mL/min。分流比1:20，进样量1μL。柱箱升温程序：初始温度100℃保持2min，2.5℃/min升温至150℃，保持2min，5℃/min升温至210℃，保持4min。FID检测其温度：220℃。
表4：纯化的重组酯水解酶转化不同底物的产率和e.e.值
表5：野生菌株粗酶液转化不同底物的产率和e.e.值
从结果可知，不同的底物经过重组酶水解酶催化水解后，分别得到光学纯度＞99%的R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯、R-3-羟基丁酸乙酯和R-四氢糠酸甲酯。反应结果与野生型的B.megaterium WZ009分离到的粗酯水解酶催化效果相比较，反应在R-构型底物的产率和光学纯度上都有较大的提高。说明利用重组酯水解酶进行反应可以消除野生菌产生的其它同工酶的副反应，提高手性化合物的光学纯度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种具有S-异构体立体选择性的酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.编码权利要求1所述酯水解酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
6.权利要求2或3所述基因在制备重组酯水解酶中的应用。
7.权利要求1所述的酯水解酶在立体选择性催化拆分外消旋底物制备手性化合物中的应用，其特征在于所述外消旋底物为下列之一：4-氯-3-羟基丁酸酯、3-羟基丁酸酯、四氢糠酸酯。
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