发明内容
本发明提供了一种用于辅助抗糖尿病的多菌发酵脱脂驼乳及其生产方法,克服了上述现有技术之不足,因其营养丰富,含有益生菌、免疫调节肽、抗氧化肽等成份,具有抗糖尿病作用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的:一种用于辅助抗糖尿病的多菌发酵脱脂驼乳,向脱脂驼乳中加入瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)发酵剂、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)发酵剂、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)发酵剂、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)发酵剂、哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)发酵剂、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)发酵剂、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)发酵剂、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)发酵剂、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)发酵剂、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)发酵剂、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)发酵剂、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)发酵剂和乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)发酵剂发酵后得到;
其中,瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂的重量之和与脱脂驼乳之间的重量比为1:15至25;
其中,瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂之间的重量比为0.8至1.0:0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0: 0.8至1.0。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进:
上述多菌发酵脱脂驼乳按下述方法得到: 第一步,脱脂驼乳经过巴氏杀菌冷却至30℃至40℃左右备用;第二步,向经过巴氏杀菌后的脱脂驼乳中加入所需要量的瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂,于35℃至40℃下混合发酵8小时至12小时得到多菌发酵脱脂驼乳。
上述脱脂驼乳进行巴氏杀菌的条件为:在温度为90℃至95℃条件下保温5min至10min进行杀菌;或/和,脱脂驼乳按下述方法得到:将所需要量的新鲜驼乳,先在转速为2000r/min至3000r/min条件下离心15min至20min,然后弃去上层脂肪后,最后在压力为1.5Mpa至1.7Mpa条件下均质后得到脱脂驼乳;或/和,将瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂分别添加到经过巴氏杀菌后的脱脂驼乳中,或者将瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂混合到一起后添加到经过巴氏杀菌后的脱脂驼乳中。
上述瑞士乳杆菌发酵剂或植物乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂或粘膜乳杆菌发酵剂或哈尔滨乳杆菌发酵剂或希氏乳杆菌发酵剂或戊糖乳杆菌发酵剂或鼠李糖乳杆菌发酵剂或乳酸乳球菌发酵剂或东方伊萨酵母发酵剂或马克斯克鲁维酵母发酵剂或膜醭毕赤酵母发酵剂或乙醇假丝酵母发酵剂按下述原料重量比得到,瑞士乳杆菌冻干粉或植物乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌类坚韧亚种冻干粉或粘膜乳杆菌冻干粉或哈尔滨乳杆菌冻干粉或希氏乳杆菌冻干粉或戊糖乳杆菌冻干粉或鼠李糖乳杆菌冻干粉或乳酸乳球菌冻干粉或东方伊萨酵母冻干粉或马克斯克鲁维酵母冻干粉或膜醭毕赤酵母冻干粉或乙醇假丝酵母冻干粉与脱脂驼乳的重量比为1:100至200;
其中,瑞士乳杆菌发酵剂或植物乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂或粘膜乳杆菌发酵剂或哈尔滨乳杆菌发酵剂或希氏乳杆菌发酵剂或戊糖乳杆菌发酵剂或鼠李糖乳杆菌发酵剂或乳酸乳球菌发酵剂或东方伊萨酵母发酵剂或马克斯克鲁维酵母发酵剂或膜醭毕赤酵母发酵剂或乙醇假丝酵母发酵剂的具体获得方法为:首先将脱脂驼乳进行巴氏杀菌,然后将脱脂驼乳冷却到30℃至40℃,接着将所需量的瑞士乳杆菌冻干粉或植物乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌类坚韧亚种冻干粉或粘膜乳杆菌冻干粉或哈尔滨乳杆菌冻干粉或希氏乳杆菌冻干粉或戊糖乳杆菌冻干粉或鼠李糖乳杆菌冻干粉或乳酸乳球菌冻干粉或东方伊萨酵母冻干粉或马克斯克鲁维酵母冻干粉或膜醭毕赤酵母冻干粉或乙醇假丝酵母冻干粉加入到所需量的脱脂驼乳中,在35℃至40℃条件下发酵18小时至24小时得到瑞士乳杆菌发酵剂或植物乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂或粘膜乳杆菌发酵剂或哈尔滨乳杆菌发酵剂或希氏乳杆菌发酵剂或戊糖乳杆菌发酵剂或鼠李糖乳杆菌发酵剂或乳酸乳球菌发酵剂或东方伊萨酵母发酵剂或马克斯克鲁维酵母发酵剂或膜醭毕赤酵母发酵剂或乙醇假丝酵母发酵剂。
上述脱脂驼乳进行巴氏杀菌的条件为:在温度为90℃至95℃条件下保温30min至60min进行杀菌;或/和,脱脂驼乳按下述方法得到:将所需要量的新鲜驼乳,先在转速为2000r/min至3000r/min条件下离心15min至20min,然后弃去上层脂肪后,最后在压力为1.5Mpa至1.7Mpa条件下均质后得到脱脂驼乳。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的:一种多菌发酵脱脂驼乳的生产方法,按下述步骤进行: 第一步,脱脂驼乳经过巴氏杀菌冷却至30℃至40℃左右备用;第二步,向经过巴氏杀菌后的脱脂驼乳中加入所需要量的瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂,于35℃至40℃下混合发酵8小时至12小时得到多菌发酵脱脂驼乳。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进:
上述脱脂驼乳进行巴氏杀菌的条件为:在温度为90℃至95℃条件下保温5min至10min进行杀菌;或/和,脱脂驼乳按下述方法得到:将所需要量的新鲜驼乳,先在转速为2000r/min至3000r/min条件下离心15min至20min,然后弃去上层脂肪后,最后在压力为1.5Mpa至1.7Mpa条件下均质后得到脱脂驼乳;或/和,将瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂分别添加到经过巴氏杀菌后的脱脂驼乳中,或者将瑞士乳杆菌发酵剂、植物乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌发酵剂、副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂、粘膜乳杆菌发酵剂、哈尔滨乳杆菌发酵剂、希氏乳杆菌发酵剂、戊糖乳杆菌发酵剂、鼠李糖乳杆菌发酵剂、乳酸乳球菌发酵剂、东方伊萨酵母发酵剂、马克斯克鲁维酵母发酵剂、膜醭毕赤酵母发酵剂和乙醇假丝酵母发酵剂混合到一起后添加到经过巴氏杀菌后的脱脂驼乳中。
上述瑞士乳杆菌发酵剂或植物乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂或粘膜乳杆菌发酵剂或哈尔滨乳杆菌发酵剂或希氏乳杆菌发酵剂或戊糖乳杆菌发酵剂或鼠李糖乳杆菌发酵剂或乳酸乳球菌发酵剂或东方伊萨酵母发酵剂或马克斯克鲁维酵母发酵剂或膜醭毕赤酵母发酵剂或乙醇假丝酵母发酵剂按下述原料重量比得到,瑞士乳杆菌冻干粉或植物乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌类坚韧亚种冻干粉或粘膜乳杆菌冻干粉或哈尔滨乳杆菌冻干粉或希氏乳杆菌冻干粉或戊糖乳杆菌冻干粉或鼠李糖乳杆菌冻干粉或乳酸乳球菌冻干粉或东方伊萨酵母冻干粉或马克斯克鲁维酵母冻干粉或膜醭毕赤酵母冻干粉或乙醇假丝酵母冻干粉与脱脂驼乳的重量比为1:100至200;
其中,瑞士乳杆菌发酵剂或植物乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂或粘膜乳杆菌发酵剂或哈尔滨乳杆菌发酵剂或希氏乳杆菌发酵剂或戊糖乳杆菌发酵剂或鼠李糖乳杆菌发酵剂或乳酸乳球菌发酵剂或东方伊萨酵母发酵剂或马克斯克鲁维酵母发酵剂或膜醭毕赤酵母发酵剂或乙醇假丝酵母发酵剂的具体获得方法为:首先将脱脂驼乳进行巴氏杀菌,然后将脱脂驼乳冷却到30℃至40℃,接着将所需量的瑞士乳杆菌冻干粉或植物乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌冻干粉或副干酪乳杆菌类坚韧亚种冻干粉或粘膜乳杆菌冻干粉或哈尔滨乳杆菌冻干粉或希氏乳杆菌冻干粉或戊糖乳杆菌冻干粉或鼠李糖乳杆菌冻干粉或乳酸乳球菌冻干粉或东方伊萨酵母冻干粉或马克斯克鲁维酵母冻干粉或膜醭毕赤酵母冻干粉或乙醇假丝酵母冻干粉加入到所需量的脱脂驼乳中,在35℃至40℃条件下发酵18小时至24小时得到瑞士乳杆菌发酵剂或植物乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌发酵剂或副干酪乳杆菌类坚韧亚种发酵剂或粘膜乳杆菌发酵剂或哈尔滨乳杆菌发酵剂或希氏乳杆菌发酵剂或戊糖乳杆菌发酵剂或鼠李糖乳杆菌发酵剂或乳酸乳球菌发酵剂或东方伊萨酵母发酵剂或马克斯克鲁维酵母发酵剂或膜醭毕赤酵母发酵剂或乙醇假丝酵母发酵剂。
上述脱脂驼乳进行巴氏杀菌的条件为:在温度为90℃至95℃条件下保温30min至60min进行杀菌;或/和,脱脂驼乳按下述方法得到:将所需要量的新鲜驼乳,先在转速为2000r/min至3000r/min条件下离心15min至20min,然后弃去上层脂肪后,最后在压力为1.5Mpa至1.7Mpa条件下均质后得到脱脂驼乳。
本发明易于操作、生产方法简单,口感佳,所得多菌发酵脱脂驼乳营养丰富,含有益生菌、免疫调节肽、抗氧化肽等成份,具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化等作用, 能增强人的体质和整体活力。
实施例6,作为实施例5的优选,脱脂驼乳进行巴氏杀菌的条件为:在温度为90℃至95℃条件下保温30min至60min进行杀菌;或/和,脱脂驼乳按下述方法得到:将所需要量的新鲜驼乳,先在转速为2000r/min至3000r/min条件下离心15min至20min,然后弃去上层脂肪后,最后在压力为1.5Mpa至1.7Mpa条件下均质后得到脱脂驼乳。
根据本发明上述实施例所得本发明多菌发酵脱脂驼乳的保健功能成分的分析和药效学试验如下:
下述试验数据为根据本发明上述实施例所得本发明多菌发酵脱脂驼乳试验的平均数据。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳的保健功能成分的分析。
、营养成分
1.1.1、检测方法和依据
蛋白质用凯氏定氮仪测定,检测依据:GB/T5413.1.3-1997;
乳糖按GB/T5413.5-1997测定;
矿物质用 Avanta-PM型原子吸收分光光度计,按GB/ T5009.14-2003 测定锌的含量,按GB/T5009.90-2003测定铁和镁的含量,按GB/T5009.91,93-2003测定钙和硒的含量,按GB/ T5009.91- 2003测定钾和钠的含量,按GB/T5413.22-1997测定磷的含量;
氨基酸类用氨基酸自动分析仪按GB/T5009-2003测定;
维生素类用1525泵系列高效液相色谱仪,按GB/T6195-1986测定维生素C的含量;按GB/T5009.82-2003测定维生素AE的含量。
酵母菌活菌数计数,按GB 4789.15-2010测定;
乳酸菌活菌数计数,按GB 4789.35-2010测定;
酸度的测定,按GB 5413.34-2010 测定;
PH值测定,采用OAKTON PH仪测定。
、结果
1.1.2.1、总蛋白及17种氨基酸含量测定
测定结果表明:本发明多菌发酵脱脂驼乳中富含多种营养成分,总蛋白和氨基酸含量丰富,总蛋白含量为4.11%±0.33%,总氨基酸含量为3.92±0.45%,其中含有8种人体必需的氨基酸(含婴幼儿必需的组氨酸),含量为1.75±0.02%,与人乳(43.0%)相近。各氨基酸中,以谷氨酸的含量为最高,含量为0.81±0.07%,其次为脯氨酸,含量为0.42±0.06%。此外,亮氨酸(0.38%±0.05)、赖氨酸(0.32±0.04%)、天冬氨酸(0.26%±0.02%)、缬氨酸(0.24±0.02%)、异亮氨酸(0.21±0.03%)含量也较高,测定结果见表1。亮氨酸与异亮氨酸和缬氨酸都是支链氨基酸,它们能够一起合作修复肌肉,控制血糖,并给身体组织提供能量,而根据本发明上述实施例得到的多菌发酵脱脂驼乳亮氨酸与异亮氨酸和缬氨酸的含量都较高,因此,由此也可以看出,根据本发明上述实施例得到的多菌发酵脱脂驼乳能够在一定程度上控制血糖,对糖尿病人有益。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳中矿物质组成及含量
本发明多菌发酵脱脂驼乳中矿物质含量丰富,其中对人体有益的钾元素含量最高,为147.96±0.68mg/100g,其次为钙,含量为133.21±6.46mg/100g、镁9.37±0.26mg/100g,锌为6.4±3.24mg/100g,并且在本发明多菌发酵脱脂驼乳中还有硒检出为0.07±0.03μg。结果见表2。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳中维生素组成及含量
本发明多菌发酵脱脂驼乳中主要维生素含量中,维生素C和维生素E含量较高,结果见表3。
、益生菌
生长菌落数测定:乳酸菌采用稀释重叠平板培养法、酵母菌采用稀释平板培养法计数菌落,结果见表4。
本发明多菌发酵脱脂驼乳,富含10种乳酸菌分别为:瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、副干酪乳杆菌类坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis);4种酵母菌分别为:马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)。
结果: 将本发明的多菌发酵脱脂驼乳冷藏于4℃冰箱中保藏两周后,测得乳酸菌活菌数为8.63×108CFU/ml, 酵母菌活菌数为1.87×106CFU/ml。发现乳酸菌的活菌数,显著增多( p<0.05) ,酵母菌活菌数有所减少,但差异不显著。结果见表4,综合说明本发明多菌发酵脱脂驼乳在冷藏期间内,乳酸菌酵母菌之间存在共生作用,这种共生作用对于维持发酵驼乳的活菌数起到一定的作用。
、对本发明多菌发酵脱脂驼乳的酸度(。T)和PH值进行了测定,结果见表5。
结果:将本发明多菌发酵脱脂驼乳冷藏于4℃冰箱中保藏两周后,其pH值有所下降,说明乳酸菌在冷藏期间继续发酵产生乳酸;保藏两周后发酵驼乳pH值为4.31,总酸度为85.6 。T。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳调节血脂、抗糖尿病作用
4.1、材料与方法
4.1.1、实验动物与试剂
健康Wistar雄性大鼠80只,体重180±20g,购自新疆医科大学实验动物中心(合格证号:SCXK(新)2011-0004)。胆固醇(分析纯)、胆酸钠均购于北京奥博星生物技术责任有限公司,链尿佐菌素(STZ,批号:SLBH0076V,规格:1g)购于美国sigma公司,戊巴比妥钠(批号:1127H037,规格5g,)购于德国默克公司,磷酸西格列汀片(批号:V2361,规格:100mg)购自澳大利亚Merck Sharp & Dohme公司,柠檬酸、柠檬酸三钠均购于天津盛奥化学试剂有限公司,多聚甲醛(批号:20140422,规格:500ml)购于北京Solarbio公司,胰高血糖素样肽-1ELISA试剂盒(批号:2473256)购于U.S.A. EMD Millipore Corporation,C肽ELISA试剂盒(批号:C0520620164)、糖化血红蛋白ELISA试剂盒(批号:A2819697)均购于武汉华美生物工程有限公司。
磷酸西格列汀片是第一个批准用于治疗2型糖尿病的DPP-4抑制剂,可抑制β细胞凋亡,促进β细胞新生,增加2型糖尿病患者β细胞数量,明显降低患者血糖,并且对磺胺类药物失效的患者仍有显著的降糖作用。因此,本发明采用磷酸西格列汀片作为队长药物。
以下实验中,将根据本发明上述实施例得到的多菌发酵脱脂驼乳简称为发酵驼乳。
、雄性Wistar大鼠糖尿病模型的建立
健康Wistar雄性大鼠80只,体重180±20g,饲养环境光照12h/d,室温21±2℃,湿度45-55%。适应性饲养3天后,随机抽取10只大鼠做正常对照组,给予普通标准大鼠饲料喂养,剩余70只造模组大鼠给予高糖高脂饲料喂养,自由进水。饲养8周,每周称体重一次。第8周末,大鼠禁食不禁水12h,正常对照组的大鼠一次性腹腔注射0.1mol·L-1,PH4.4柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液,其余造模组大鼠一次性腹腔注射STZ 30mg·kg-1(STZ溶于0.1mol·L-1,PH4.4柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液中)。3天后,禁食12h,尾尖取血,用精密血糖仪测定空腹血糖(FBG)。若FBG大于等于11.1mmol·L-1暂定为糖尿病成模大鼠,注射STZ溶液1周、2周,分别禁食12h,测空腹血糖,3次FBG≧11.1mmol·L-1证明模型稳定,造模成功。
、动物分组及干预
70只造模的大鼠中,10只未达到成模标准予以剔除,将造模成功的60只大鼠,按血糖均衡随机分组5组,分别为:糖尿病模型组、阳性药西格列汀组(30mg·kg-1)、发酵驼乳高剂量组(108+106CFU·mL-1)、发酵驼乳中剂量组(107+105CFU·mL-1)、发酵驼乳低剂量组(106+104CFU·mL-1),取同批正常大鼠作为正常对照组,每天固定时间(10:00-12:00)灌胃给药,正常对照组大鼠给予等量蒸馏水,糖尿病模型组给予灭菌驼乳,灌胃容积为10mL·kg-1。除正常对照组外,其余5组继续喂食高脂高糖饲料,自由饮水,连续灌胃给药4周。
、一般情况观察
每日观察大鼠外观、进食量、进水量以及垫料的潮湿情况,每周测一次体重,尾尖取血,用One-Touch血糖仪,每周测一次空腹血糖(FBG)。
、动物处理方法
药物干预4周后,各组大鼠禁食不禁水12h,腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液30mg·kg-1麻醉,打开腹部经腹主动脉取全血置普通无菌采血管,室温静置2h后离心(3000r·min-1,15min,4℃),分离取血清,分装,-80℃保存;另取血置预冷的含EDTA的采血管,立即离心(10000r·min-1,10min,4℃),分离血浆,分装,-80℃保存,收集红细胞,加入预冷的纯水重悬至原来的体积,置-20℃冷冻60min,经过3轮反复冷触破坏细胞壁,然后将细胞悬液离心(10000r·min-1,10min,4℃),取上清液,分装,-20℃保存。取血完毕,立即打开腹腔取肝脏和肾脏,用生理盐水漂洗后,滤纸吸干并称重,分别计算肝指数(肝湿重/体量×102)和肾指数(肾湿重/体量×103);取胰腺置于4%多聚甲醛溶液中固定,待做病理切片检查。
、检测指标及方法
采用全自动生化仪测定各组大鼠血清中葡萄糖(GLu)、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)含量。酶联免疫法(ELISA法)测定大鼠血清中C肽(C-peptide)含量。ELISA法测定大鼠红细胞裂解液中糖化血红蛋白(GHbA1c)含量。ELISA法测定大鼠血清胰高血糖素样肽(GLP-1)的含量。
、统计学处理
数据以±s表示,各组间均数比较首先进行方差齐性检验,如结果满足方差齐性,则采用单因素方差分析或 t 检验方法,如不满足方差齐性,则采用秩转换检验方法。全部过程均通过SPSS17.0统计分析软件进行,以P<0.05 作为差异具有统计学意义的界限。
、实验结果:
4.3.1、本发明多菌发酵脱脂驼乳对实验性糖尿病大鼠一般情况和体重的影响
药物干预前,糖尿病模型组、阳性药西格列汀组、发酵驼乳高剂量组、发酵驼乳中剂量组、发酵驼乳低剂量组大鼠体重无统计学意义(p>0.05),糖尿病模型组、阳性药西格列汀组、发酵驼乳高剂量组、发酵驼乳中剂量组、发酵驼乳低剂量组大鼠因高脂高糖饲料喂养,干预前糖尿病模型组、阳性药西格列汀组、发酵驼乳高剂量组、发酵驼乳中剂量组、发酵驼乳低剂量组大鼠体重明显大于正常对照组(p<0.05),整个实验过程中大鼠共死亡7只,其中,糖尿病模型组死亡1只、阳性药西格列汀组死亡1只、发酵驼乳高剂量组死亡1只、发酵驼乳中剂量组死亡1只、发酵驼乳低剂量组死亡3只均为糖尿病各组,可能死亡原因:皮肤化脓性感染、酮症酸中毒、不明原因腹腔积液。最终,共63只大鼠最终完成实验。分别如下:
(1)对照组 (n=10):整个实验过程中,无死亡大鼠,饮食、饮水正常,尿量正常,毛皮光滑,较活泼易动,精神状态良好,体重增加明显。
糖尿病模型组 (n=11):实验过程中,糖尿病组大鼠饮食增加,饮水明显增加,每只大鼠每天饮水量>100ml,少动安静,精神萎靡,毛色晦暗,烂尾尖比例显著高于对照组,共死亡1只。
阳性药西格列汀组(n=11):饲养中,大鼠一般状态较糖尿病模型组明显改善。共1只大鼠死亡。大鼠饮食、饮水接近正常,尿量偏多,精神反应可,毛色接近正常,无烂尾尖、皮肤感染等发生。药物干预4周后,与糖尿病模型组比较,体重显著增加(p<0.05,结果见表6)。
发酵驼乳低剂量组(n=9):实验饲养过程中,大鼠一般状态良好,大鼠饮食、饮水偏多,尿量较多,精神反应略好于糖尿病模型组。饲养过程中,共死亡3只,大鼠死亡数最多的一组。
发酵驼乳中剂量组(n=11):饲养中,大鼠一般状态较糖尿病模型组组改善。共1只大鼠死亡。大鼠饮食、饮水较多,尿量偏多,精神反应可,毛色晦暗,无烂尾尖、皮肤感染等发生。药物干预4周后,中剂量组与糖尿病模型组比较,体重增加 (p<0.05,结果见表6)。
发酵驼乳高剂量组(n=11):饲养中,大鼠一般状态较糖尿病模型组明显改善。共1只大鼠死亡。大鼠饮食、饮水接近正常,尿量偏多,精神反应可,毛色接近正常,无烂尾尖、皮肤感染等发生。药物干预4周后,与糖尿病模型组比较,体重显著增加(p<0.05,结果见表6)。
、发明多菌发酵脱脂驼乳对糖尿病大鼠空腹血糖的影响
注射STZ后各组糖尿病大鼠FBG都在11.1mmol·L-1以上,显著高于正常空白组(P<0.05):药物干预前,糖尿病模型组、阳性药西格列汀组、发酵驼乳高剂量组、发酵驼乳中剂量组、发酵驼乳低剂量组大鼠空腹血糖无统计学意义(p>0.05)。药物干预4周后,发酵驼乳高剂量组和阳性药组大鼠空腹血糖显著低于糖尿病模型组(P<0.05),发酵驼乳中剂量组空腹血糖也显著低于糖尿病模型组(P<0.05),结果见表7。
以下实验中,在实验过程中,正常对照组大鼠死亡1只、发酵驼乳中剂量组死亡1只,予以剔除。
、发明多菌发酵脱脂驼乳对实验性糖尿病大鼠血脂的影响
大鼠糖尿病模型组与正常对照组相比,血清胆固醇值、甘油三酯值及低密度脂蛋白水平升高。本发明发酵驼乳大、小剂量组及西格列汀组(20 mg·kg-1)的胆固醇(TC)水平降低、 LDL-C水平降低、TG水平降低。糖尿病模型组、西格列汀组、本发明发酵驼乳中剂量组、本发明发酵驼乳高剂量组及与正常对照组比较均可升高HDL—C,差异有统计学意义,结果见表8。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳对实验性糖尿病大鼠肾功能的影响
糖尿病模型组大鼠肾脏指数,血清BUN、SCr含量均显著高于正常对照组(P<0.05)。西格列汀组,发酵驼乳高、中剂量组肾脏指数,血清BUN含量均显著低于糖尿病模型组(P<0.05),西格列汀组,发酵驼乳高、中、低剂量组血清SCr含量均显著低于糖尿病模型组(P<0.05),结果见表结果见表9。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳对实验性糖尿病大鼠肝功能的影响
实验结束时糖尿病模型组大鼠肝脏指数、血清AST、ALT含量均显著高于正常对照组(P<0.05)。西格列汀组,发酵驼乳高、中、低剂量组血清AST、ALT含量均显著低于糖尿病模型组(P<0.05),结果见表10。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳对实验性糖尿病大鼠CP、 IRI、 HOMA-IS的影响
实验结束时糖尿病模型组大鼠CP值低于正常对照组(P<0.05),西格列汀组,发酵驼乳高剂量组CP值显著高于糖尿病模型组(P<0.05)。用空腹CP代替胰岛素改良HOMA(CP)公式评价胰岛素抵抗程度,公式为IRI=1.5+FBG×空腹CP(ng· mL-1×333)/2800。糖尿病模型组IRI值显著高于正常对照组(P<0.05),西格列汀组,发酵驼乳高剂量组IRI值显著高于糖尿病模型组(P<0.05)。用空腹CP代替胰岛素改良HOMA(CP)公式评价胰岛β细胞功能强弱,公式为HOMA-IS(Normal)=0.27×空腹CP(ng·mL-1×333)/(FBG-3.5)+50; HOMA-IS(DM)=0.27×空腹CP(ng·mL-1×333)/FBG-3.5。糖尿病模型组HOMA-IS值显著高于正常对照组(P<0.05),西格列汀组,发酵驼乳高剂量组HOMA-IS值显著高于糖尿病模型组(P<0.05),结果见11。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳对实验性糖尿病大鼠Glu、GHbAIc、GLP-1的影响
实验结束时糖尿病模型组大鼠Glu、GHbAIc含量均非常显著高于正常对照组,GLP-1含量显著低于正常对照组(P<0.05)。西格列汀组Glu、GHbAIc,发酵驼乳中、高剂量组Glu含量,发酵驼乳高剂量组GHbAIc含量显著低于糖尿病模型组,西格列汀组,发酵驼乳高、中、低剂量组GLP-1含量均显著高于糖尿病模型组 (P<0.05),结果见表12。
、本发明多菌发酵脱脂驼乳对实验性糖尿病大鼠胰腺组织的影响
大鼠胰腺组织进行HE染色,正常对照组大鼠胰腺小叶结构正常,胰岛圆形、类圆形,数目正常,岛内结构完整,界限清晰。糖尿病模型组与对照组比较,胰岛形态不规则,数目明显减少,岛内细胞肿胀,部分呈空泡样变,岛内血管扩张、充血。西格列汀组,发酵驼乳中、高剂量组与糖尿病模型组比较胰岛数目增多,体积增大,岛内细胞数目增加,阳性药组和高剂量药物干预组改善则更明显,结果见图1至图6。
本发明利用分离得到10株乳酸菌和4种酵母菌制备发酵脱脂驼乳,利用高脂高糖饲料喂养8周,腹腔注射小剂量STZ的方法建立糖尿病大鼠模型,观察发酵脱脂驼乳对各模型大鼠体重(BW)、空腹血糖(FBG)、血清中葡萄糖(GLu)、红细胞裂解液中糖化血红蛋白(GHbAIc)、血清C肽(CP)和血脂四项等指标的影响,并用空腹C肽代替胰岛素改良HOMA(CP)公式评价胰岛素抵抗指数(IRI)和胰岛β细胞功能(HOMA-IS);测量各组大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的含量,计算肝肾脏指数,分析发酵脱脂驼乳对模型大鼠肝肾功能的影响;测量各组大鼠血清胰高血糖素样肽(GLP-1)的含量变化,分析发酵脱脂驼乳对糖尿病大鼠的作用机制;胰腺组织病理学检测,进行HE染色,观察胰腺组织结构、胰岛细胞形态、数量等,分析发酵脱脂驼乳对模型大鼠胰腺组织的影响。
结果表明:
1.药物干预4周后,发酵脱脂驼乳高剂量可以明显改善模型大鼠体重减轻现象,非常显著降低FBG、GLu和低密度脂蛋白(LDL-C)含量(p<0.01),降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、GHbAIc和IRI(p<0.05),明显增加高密度脂蛋白(HDL-C)含量(p<0.01),增加CP含量、HOMA-IS(p<0.05)。
发酵脱脂驼乳低、中、高剂量均非常显著降低模型大鼠SCr、ALT,中、高剂量可非常显著降低AST(p<0.01),低、中、高剂量均显著降低肝脏指数,低剂量显著降低AST,中、高剂量均显著降低肾脏指数和BUN(p<0.05)。
发酵脱脂驼乳中、高剂量均显著增加血清GLP-1含量(p<0.01),低剂量可显著增加血清GLP-1含量(p<0.05)。
胰腺组织HE染色可见中、高剂量组胰腺小叶结构完整,胰岛细胞数目较糖尿病模型组增多。结论:发酵脱脂驼乳可以降低糖尿病大鼠血糖,改善血糖紊乱和糖尿病肝肾功能异常,及升高血清胰高血糖素样肽水平和改善胰腺组织结构、增加胰岛细胞。
本发明易于操作、生产方法简单,口感佳,所得多菌发酵脱脂驼乳营养丰富,含有益生菌、免疫调节肽、抗氧化肽等成份,具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化等作用, 能增强人的体质和整体活力。
以上技术特征构成了本发明的实施例,其具有较强的适应性和实施效果,可根据实际需要增减非必要的技术特征,来满足不同情况的需求。