CN105431448B - IL-1β抑制剂组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了可用于治疗或预防与人IL‑1β的活性的调节有关的疾病的治疗组合物。在某些方面,所公开的本发明基于能够结合至人IL‑1β并削弱其功能的异源二聚体蛋白组装的设计。该异源二聚体蛋白组装包含人IL1‑R1和人IL‑1RAcP的细胞外部分或者它们的功能片段。分别地,IL1‑R1部分和IL‑1RAcP部分融合至人Ig Gamma‑1的Fc片段的不同突变体。异源二聚体蛋白质组装中的两个不同的Fc突变体被设计为利于在两个Fc突变体之间形成异源二聚体,而不是同源组装。本发明还提供了用于哺乳动物细胞中的多肽的过量产生的DNA表达载体和表达***。
Description
技术领域
总体上,本发明涉及生物制药领域以及它们在与炎性疾病(例如类风湿性关节炎、克罗恩病等)、糖尿病、心血管疾病和痛风相关的情况中的应用。更具体地,本发明涉及一种能够抑制IL-1β细胞因子的异源二聚体IL-1Rl/IL-1RAcP-衍生的组合物。
背景技术
细胞因子的白细胞介素-1(IL-1)家族包含由人和小鼠中的11个不同基因编码的11种蛋白质(IL-1F1至IL-1F11)。IL-1-型细胞因子是天然免疫反应的主要介体,并且由白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)引起的组成成分IL-1或IL-1β的阻断证明了IL-1在一些人类自身炎症性疾病中的重要的作用。IL-1或IL-1β在多种不同的细胞类型中快速增加了数百个基因的信使RNA表达。IL-1和IL-1β的有效促炎活性被限制在三个主要水平上:(i)合成和释放,(ii)膜受体和(iii)细胞内信号传导。该途径概括了IL-1或IL-1β的细胞外和细胞内的信号传导,包括放大或终止IL-1响应的正反馈和负反馈机制。响应于配体结合受体,组合的磷酸化和泛素化事件的复杂的序列导致激活了核因子kappa-B的信号传导,以及通过转录和转录后机制、合作地诱导标准IL-1靶基因(例如IL-6、IL-8、MCP-1、COX-2、IB、IL-1、IL-1β、MKP-1)的表达的JNK和p38促***原活化蛋白激酶途径。值得注意的是,参加针对IL-1的细胞响应的大部分细胞内成分也将响应介导至其他细胞因子(IL-18和IL-33)、Toll样受体(TLRs)和许多形式的细胞毒性压力(参见Weber A等人,Sci Signal杂志,2010年1月19日;3(105),其全部教导以参考引用的方式结合于此)。
IL-1和IL-1β独立地结合被泛表达的类型I的IL-1受体(IL-1R1)。第三特定配体,IL-1受体拮抗剂(IL-1RA),结合具有类似特异性和亲和力的IL-1RI而不激活受体和触发下游信号传导。IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)充当IL-1/IL-1RI复合物的信号传导所必需的辅助受体,并且该辅助受体也是由其他IL-1族成员——特别是IL-18和IL-33——激活IL-1R1所必需的。类型II的IL-1受体(IL-1R2)结合IL-1和IL-1β,但缺少有能力进行信号传导的细胞溶质部分,由此充当诱饵受体。IL-1RA、质膜锚定的IL-1R2和自然出现的每个细胞外IL-1受体链(称为sIL-1RI、sIL-1RII和sIL-1RAcP,其中“s”表示可溶性)的“分水岭(shed)”区域提供细胞外间隙中的IL-1信号传导的可诱导的负调控因子,由增加的转录和控制的释放的结合来控制的负调控因子的丰度能够限制或终止IL-1效果。
IL-1信号转导中的初始步骤是促进IL-1RacP的补充的IL-1RI的第一细胞外区域中的配体诱导的构象改变。通过称为Toll样和IL-1R样(TIR)区域的保守的细胞溶质区域,三聚复合物快速地装配两种细胞内信号传导蛋白质、骨髓分化初反应基因88(MYD88)和白细胞介素-1受体活化蛋白激酶(IRAK)4。缺少MYD88或IRAK4的小鼠显示出在IL-1信号传导中的严重缺陷。类似地,具有IRAK4基因中的突变的人在IL-1RI和Toll样受体(TLR)信号传导中具有缺陷。IL-1、IL-1RI、IL-RAcP、MYD88和IRAK4形成稳定的IL-1诱导的第一信号传导模块。这与IRAK4的(自)磷酸化并行,其中IRAK4随后将IRAK1和IRAK2磷酸化,然后接着是肿瘤坏死因子相关因子(TRAF)6的补充和寡聚反应(oligomerization)。IRAK1和2同时用作衔接子(adaptors)和蛋白激酶,以传送下游信号。IRAK1、IRAK2和TRAF6的复合物从初始受体复合物中分离,并且缺少这些蛋白质的细胞削弱了核因子kappa-B(NF-kappa-B)和激活蛋白1(AP-1)的转录因子的活化。
IL-1的过量产生是许多炎性疾病的原因。例如,IL-1已经与糖尿病、心血管疾病、痛风和某些类型的关节炎(例如类风湿性关节炎(RA))的病理学关联起来。
利洛纳塞(Rilonacept)是包括IL-1-特异性融合蛋白的IL-1拮抗剂,所述IL-1-特异性融合蛋白包含人IL1-RAcP的细胞外区域的IL-1结合部分、人IL-1RI的细胞外区域的IL-1结合部分以及多聚化(multimerizing)成分。该IL-1-特异性融合蛋白在专利号为No.6,472,179的美国专利文献、2003年7月31日公开的、公开号为No.2003/0143697的美国专利文献、专利号为No.7,361,350的美国专利文献以及2005年9月8日公开的、公开号为No.2005/0197293的美国专利文献(上述文献在其整体上以参考引用的方式结合于此)中做出了说明。以ARCALYST为商标名的利洛纳塞被美国食品和药物管理局(FDA)批准,以用于冷吡啉相关周期性综合征(Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes,CAPS)的治疗,包括成人和12岁及以上儿童的家族性冷自主炎症综合征(FCAS)和马克尔-威尔斯综合征(MWS)。利洛纳塞的进一步的临床试验正在进行,即用于痛风。
发明内容
提供发明内容用于以简化形式介绍选择的构思,其将在下文的具体实施方式中进一步说明。本发明内容既不是为了确定所要求保护的主题的主要特征或基本特征,也不是为了用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
在某些方面,本发明提供了一种能够结合人IL-1β(GenBank:AAH08678.1)的异源二聚体蛋白质组合物。该蛋白质组合物包含含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的第一多肽,其中第一氨基酸序列含有人IL1-R1的18至333位氨基酸(GenBank:AAM88423.1),第二氨基酸序列含有人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第一突变体(GenBank:J00228.1)。该蛋白质组合物还包含含有另一第一氨基酸序列和另一第二氨基酸序列的第二多肽,其中另一第一氨基酸序列含有人IL1-RAcP的21至358位氨基酸(GenBank:BAA25421.1),另一第二氨基酸序列含有人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第二突变体。在该蛋白质组合物中,第一和第二突变体被筛选为利于第一与第二突变体之间的异源二聚体组装,而不是任何同源二聚体组装。该蛋白质组合物能够显示出人IL-1β在酶联免疫吸附法(ELISA)测定中与约50ng/ml的EC50的结合活性。该蛋白质组合物的第一多肽可以含有SEQ ID NO.1的氨基酸序列,而第二多肽可以含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
在某些方面,本发明提供了一种治疗组合物。该治疗组合物包含能够结合人IL-1β的异源二聚体蛋白质组合物。该蛋白质组合物包含含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的第一多肽,其中第一氨基酸序列含有人IL1-R1的18至333位氨基酸,第二氨基酸序列含有人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第一突变体。该蛋白质组合物还包含含有另一第一氨基酸序列和另一第二氨基酸序列的第二多肽,其中另一第一氨基酸序列含有人IL1-RAcP的21至358位氨基酸,另一第二氨基酸序列含有人免疫球蛋白gamma-1Fc的Fc片段的第二突变体。在该蛋白质组合物中,第一和第二突变体被筛选为利于第一与第二突变体之间的异源二聚体组装,而不是任何同源二聚体组装。该治疗组合物可以显示出,通过人Fc ELISA的测定,异源二聚体蛋白质组合物在小鼠皮下注射了5mg/kg的剂量之后的体循环中的至少约88小时的半衰期。该治疗组合物可以包含由第一多肽和第二多肽组成的异源二聚体蛋白质,其中第一多肽含有SEQ ID NO.1的氨基酸序列,第二多肽可有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
在某些方面,本发明提供了一种编码包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。该核酸的密码子使用可以被优化为在哺乳动物细胞中的多肽的高表达。该核酸可以含有SEQ ID NO.5的序列。该核酸可以包含表达载体。
在某些方面,本发明提供了一种编码包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列的多肽的分离的核酸。该核酸的密码子使用可以被优化为在哺乳动物细胞中的多肽的高效表达。该核酸可以含有SEQ ID NO.6的序列。该核酸可以包含表达载体。
在某些方面,本发明提供了一种SEQ ID NO.7的分离的核酸。
在某些方面,本发明提供了一种异源表达***。该表达***包含表达载体,所述表达载体包含编码含有SEQ ID NO.3的氨基酸序列的第一多肽的核酸序列以及另一编码含有SEQ ID NO.4的氨基酸序列的第二多肽的核酸序列。该表达***的表达载体可以包含在哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞可以是CHO细胞。该表达***能够表达包含含有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的第一多肽和含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的第二多肽的异源二聚体蛋白质。异源二聚体蛋白质的表达水平可以是每升细胞培养物至少300mg。
在某些方面,本发明提供了用于制造治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病的药物的物质的用途。该物质包含由第一多肽和第二多肽组成的异源二聚体蛋白质,其中第一多肽含有SEQ ID NO.1的氨基酸序列,第二多肽含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。与人IL-1β的活性的调节有关的疾病可以是关节炎、痛风、类风湿性关节炎、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、硬皮病、糖尿病、动脉硬化、干眼症、眼部过敏(ocular allergy)或葡萄膜炎。
在某些方面,本发明提供了一种治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病或状况的方法。该方法包含向需要治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病的患者给药在治疗上有效量的药物组合物。该药物组合物包含由第一多肽和第二多肽组成的异源二聚体蛋白质,其中第一多肽含有SEQ ID NO.1的氨基酸序列,第二多肽含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。与人IL-1β的活性的调节有关的疾病可以是关节炎、痛风、类风湿性关节炎、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、硬皮病、糖尿病、动脉硬化、干眼症、眼部过敏(ocularallergy)或葡萄膜炎。
在某些方面,本发明提供了一种能够结合人IL-1β的异源二聚体蛋白质组合物。该蛋白质组合物能够响应于用人IL-1β处理成纤维细胞而抑制在人肺成纤维细胞中产生人IL-6。该抑制的特征在于IC50值为2.3pM。
附图说明
以下附图和说明有助于理解本发明:
图1说明性地示出了目前教导的异源二聚体蛋白质组装,其包含通过柔性接头(flexible linker)与IgG-Fc区域(Fc-II)融合的IL1-R1的细胞外部分,以及通过另一柔性接头与另一IgG-Fc区域(Fc-V)融合的IL1-RAcP的细胞外部分;
图2示意性地示出了PKN012质粒的图谱以及本发明的多肽的克隆中所使用的标注的序列;
图3示出了在生成表达本发明的多肽的稳定的细胞系的过程中获得的典型的转染增长曲线;
图4示出了经过阴离子交换色谱法纯化步骤之后的含有包含SEQ ID NO.1的多肽和SEQ ID NO.2的多肽的异源二聚体的样本的体积排阻高效液相色谱法(HPLC)分析色谱;
图5示出了经过阴离子交换色谱法纯化步骤之后的含有包含SEQ ID NO.1的多肽和SEQ ID NO.2的多肽的异源二聚体的样本的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析;
图6示出了使用商业上可获得的人IL-1β在ELISA测定中的含有包含SEQ ID NO.1的多肽和SEQ ID NO.2的多肽的异源二聚体的纯化样本的典型结合曲线;
图7示出了IL-6生成测定实验的IL-1抗体介导抑制中所获得的校正曲线;
图8示出了IL-1β-介导的IL-6生成和从培养基复原的IL-6的结果,其中MRC5细胞用最终浓度为50pg/ml(IL-1单独)的IL-1β培养24小时,或者未处理(细胞对照),同时未暴露于该细胞的培养基加入了最终浓度为20pg/ml的IL-6,以估算IL-6复原;
图9示出了IL-1β-介导的IL-6生成和从培养基复原的IL-6的测量结果,其中MRC5细胞用最终浓度为50pg/ml(IL-1单独)的IL-1β培养24小时,或者未处理(细胞对照)。未暴露于该细胞的培养基加入了最终浓度为20pg/ml的IL-6,以估算IL-6复原;
图10示出了以当前教导的IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体实施的抑制IL-6生成测定中所获得的校正曲线;
图11示出了用IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体对IL-1β-介导的IL-6生成的抑制测量和从培养基复原的IL-6的结果,其中MRC5细胞用最终浓度为50pg/ml(IL-1单独)的IL-1β培养24小时,或者未处理(细胞对照),同时未暴露于该细胞的培养基加入了最终浓度为30pg/ml的IL-6,以估算IL-6复原(RPH-10+30pg/ml IL6);为确保用于该实验的两个细胞培养板之间的一致性,IL-1对于从两个板生成的IL-6的效果进行了比较(IL-1单独并且IL1单独板2,分别对于板1和板2);IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体的最高浓度(20μg/ml对于IL-6生成的效果也被检测(RPH-10单独);对应于204.8ng/ml的最终浓度的IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体稀释液也被包括,以证明两个板(RPH10板2)之间的数据的一致性;并且
图12示出了用于L1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体实验的滴定曲线测量的结果,其中MRC5细胞用IL-1β或以各种浓度的L1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体预先混合的IL-1β培养;IL-6生成由Quantakine ELISA测量,并且使用4-参数拟合算法(4-parameter fitalgorithm)来分析数据;产生的方程的系数C数量上等于0.3ng/ml或者约2.4pM的IC50值。
具体实施方式
这里所公开的教导部分基于能够结合至人IL-1β并削弱其功能的异源二聚体蛋白质组装。当前教导的异源二聚体蛋白质组装包含IL1-R1(GenBank(基因库):AAM88423.1)和IL-1RAcP(GenBank:BAA25421.1)的细胞外部分或其功能片段。分别地,IL1-R 1部分和IL-1RAcP部分融于人Ig Gamma-1(GenBank:J00228.1)的Fc段的不同突变体。异源二聚体蛋白质组装中的两个不同的Fc突变体被设计为利于在两个Fc突变体之间形成异源二聚体,而不是任何同源组装。为了允许当前教导的异源二聚体蛋白质组装的重组产生,已经构建了DNA表达载体,以用于过量产生异源蛋白质表达***中的异源二聚体蛋白质组装,并且已经制备了哺乳动物细胞,其以高表达水平稳定地表达异源二聚体蛋白质组装。已经设计了蛋白质纯化过程,其允许获得当前教导的异源二聚体蛋白质组装的生理相关的实质上纯的制备。因此,在酶联免疫吸附法(ELISA)中使用人IL-1β(GenBank:AAH08678.1)纯化的蛋白质分子证明了高等级的体外比活度。意料之外地,蛋白质分子展示出基于皮下动物注射的可接受的药代动力学模式,而不导致任何体重减轻或不良临床事件。
本说明书中使用的术语在本发明的语境以及每个术语所使用的特定的语境中,总体上具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下文或本说明书的别处做出了说明,其中说明了本发明的组合物和方法以及如何制造并使用它们,以给实施者提供额外的指导。术语的任何用途的含义在该术语所使用的特定语境中将是明显的。“约”和“近似”应当总体上表示对于所测量的给出测量的本质或精密度的量的可接受的误差度。一般来讲,示例性的误差度为给定值或值的范围的百分之20(%)以内,优选地为10%以内,并且更优选地为5%以内。可选地且特别地,在生物***中,术语“约”和“近似”可以表示在某一数量级以内,优选地为给定值的5倍以内,并且更优选地为2倍以内。除非另有说明,这里所给定的数值量是近似的,当没有明确说明时,可以推测术语“约”和“近似”的含义。
本发明的方法可以包括相互比较序列,包括一个或多个突变体(序列变化)的野生型序列。这种比较一般包含聚合物序列的比对,例如使用本领域中公知的序列比对程序和/或算法(例如BLAST,FASTA和MEGALIGN,仅举几例)。本领域技术人员可以容易地领会在这种比对中,其中突变含有残基***或删除,序列比对将在不含有***或删除的残留的聚合物序列中引入“间隙”(一般用破折号或“A”来表示)。
本发明的方法包括统计计算,例如IC50或EC50值等的计算。本领域技术人员能够容易地领会,这可以使用各种商业上可获得的软件来执行,例如PRISM(美国加利福尼亚州拉荷亚的GraphPad软件股份有限公司生产)或类似物。
“同源”,在其所有的语法形式和拼写变化中,指的是具有“共同进化起源”的两种蛋白质——包括来自相同种类的生物中的超家族的蛋白质以及来自不同种类的生物的同源蛋白质——之间的关系。这种蛋白质(以及它们的编码氨基酸)具有如由它们的序列相似性所反映的序列同源性,不论是根据相同度或通过特定残基或基序以及保守位置的存在。然而在通常使用以及在当前应用中,术语“同源的”当通过例如“高度”这样的副词修饰时,可以指的是序列相似度并且可以或者可以不涉及共同的进化起源。
术语“序列相似性”,在其所有的语法形式中,指的是或共享或不共享共同的进化起源核酸或氨基酸序列之间的同一度或一致。
术语“蛋白质”和“多肽”被可交换地使用。这里所述的多肽可以由多于一个连续的氨基酸链组成,由此形成二聚体或其他低聚物形式。一般来讲,用于哺乳动物的当前教导的多肽以哺乳动物细胞表达,其中哺乳动物细胞允许适当的翻译后修饰,例如CHO或HEK293细胞系,尽管也预期其他哺乳动物表达细胞系是可用的。因此可以预料到,当前教导的多肽可以是翻译后修饰的,而实质上不影响其生物学功能。
在某些方面,当前教导的异源二聚体蛋白质组装的功能变化包括具有人IL1-R1或IL-1RAcP或其功能片段的至少生物活性部分以及一个或多个融合区域的融合蛋白质。这种融合区域的公知的实例包括,但不限于,多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G、免疫球蛋白重链恒定区(例如Fc)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)或人血清蛋白。可以筛选融合区域以赋予想要的特性。例如,IL1-R1或IL-1RAcP多肽部分可以融于稳定活体中的IL1-R1或IL-1RAcP的区域(“稳定剂”区域),可选地通过适当的多肽接头(peptide linker)。术语“稳定”表示增加体循环中的多肽的半衰期的任何物质,不管这是因为减少的破坏、减少的清除还是因为其他药代动力学效应。已知与免疫球蛋白的Fc片段的融合用于为某些蛋白质赋予想要的药代动力学特性。同样,融合至人血清白蛋白可以赋予想要的特性。可以筛选的其他类型的融合域包括多聚化(例如二聚化、四聚化)区域和功能区域,其赋予额外的生物学功能,例如促进在活体中的作用的靶位点处的积聚。
在某些方面,当前教导的异源二聚体蛋白质组装包含融于IgG-Fc区域的IL1-R1的细胞外部分或其功能片段,以及融于另一IgG-Fc区域的IL-1RAcP的细胞外部分或其功能片段。IgG-Fc区域和另一IgG-Fc区域被挑选为利于异源二聚体蛋白质组装,而不是任何同源二聚体蛋白质组装。IL1-R1的细胞外部分可以通过柔性接头与IgG-Fc域融合,而IL-1RAcP或其功能片段可以通过同一氨基酸序列的柔性接头或者通过另一柔性接头与另一IgG-Fc域融合。
在示例性实施例中,图1中说明性地示出,通过柔性接头与IgG-Fc区域(Fc-II)融合的IL1-R1的细胞外部分可以包含SEQ.ID NO.1的氨基酸序列,而通过柔性接头与IgG-Fc区域(Fc-V)融合的IL-1RAcP可以包含SEQ.ID NO.2的氨基酸序列。
hIL1-R1-hlgG1-Fc多肽(SEQ ID NO.1)
hIL-1RAcP-hlgG1-Fc多肽(SEQ ID NO.2)
在某些方面,当前的教导提供了一种重组DNA分子,其具有编码多肽的开放阅读框,其中多肽包含通过柔性接头与IgG-Fc区域(Fc-II)融合的人IL1-R1的前333个氨基酸,并提供了另一种重组DNA分子,其具有编码另一多肽的开放阅读框,其中另一多肽包含通过柔性接头与另一IgG-Fc区域(Fc-V)融合的人IL-1RAcP的前358个氨基酸。
在一示例性实施例中,包含通过柔性接头与IgG-Fc区域(Fc-II)融合的人IL1-R1的前333个氨基酸的多肽包含SEQ.ID NO.3的氨基酸序列。其相应的DNA分子可以包含SEQID NO.4的核苷酸序列。包含通过柔性接头与另一IgG-Fc区域(Fc-V)融合的人IL-1RAcP的前358个氨基酸的另一多肽可以包含SEQ.ID NO.5.的氨基酸序列。其相应的DNA分子可以包含SEQ ID NO.6的核苷酸序列。
hIL1-R1-hlgG1-Fc多肽(SEQ ID NO.3)
hIL1-R1-hlgG1-Fc DNA(SEQ ID NO.4)
hIL-1RAcP-hlgG1-Fc多肽(SEQ ID NO.5)
hIL-1RAcP-hlgG1-Fc DNA(SEQ ID NO.6)
在某些方面,本发明提供了重组哺乳动物表达质粒,以用于包含通过柔性接头与IgG-Fc区域(Fc-II)融合的人IL1-R1的前333个氨基酸的多肽的高效表达,并且提供了另一种重组DNA分子,其具有编码另一多肽的开放阅读框,其中另一多肽包含通过柔性接头与另一IgG-Fc区域(Fc-V)融合的人IL-1RAcP的前358个氨基酸。该质粒包含两种巨细胞病毒(CMV)启动子,以促进编码所述多肽和所述另一多肽的两种基因的转录,之后接着是转录终止序列和聚腺苷酸序列。该质粒还含有复制起点和赋予氨苄西林抗性的基因,以用于辅助质粒在细菌中增殖和筛选。该质粒进一步含有用于谷氨酰胺合成酶的基因、筛选标记,其广泛用于构建稳定的CHOK1和NSO细胞系。本发明的质粒在图2中说明性地示出。
在示例性实施例中,当前教导的哺乳动物表达质粒包含SEQ ID NO.7的核苷酸序列。
hIL1-R1-hlgG1-Fc-II/IL-1RAcP-hlgG1-Fc-V表达质粒(SEQ ID NO.7)
在某些方面,当前的教导提供了一种用于生成异源二聚体蛋白质组装的哺乳动物表达***,该异源二聚体蛋白质组装包含含有通过柔性接头与IgG-Fc区域(Fc-II)融合的人IL1-R1的18至333位氨基酸残基的多肽,以及含有通过柔性接头与另一IgG-Fc区域(Fc-V)融合的人IL-1RAcP的21至358位氨基酸残基的另一多肽。
在示例性实施例中,本发明的哺乳动物表达***包含中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1),其具有包含SEQ ID NO.7的核苷酸序列的质粒。
在某些方面,当前的教导提供了一种用于治疗受到下列与人IL-1β的调节有关的疾病影响的哺乳动物的方法:关节炎、痛风、类风湿性关节炎、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、硬皮病、糖尿病、动脉硬化、干眼症、眼部过敏(ocular allergy)或葡萄膜炎。
实施例
以下实施例说明了当前教导的上述方面和其他方面。给出这些非限制性实施例以便为本领域技术人员提供关于如何制造和评估这里所要求保护的化合物、成分、物质、装置和/或方法的说明性实施例。实施例对于这里所公开的本发明是纯粹示例性的,并且不限于发明人所认为的本发明的范围。已经做出了努力来确保关于数字(例如量、温度等)的精确度,但是依然允许出现误差和偏差。
实施例1:用于本发明的多肽的表达的质粒的构建。
包含编码IL-1R1的1至333位氨基酸残基的残基的序列,或者IL-1RAcP的1至358位残基的序列的优化的基因序列被化学合成。通过Hindlll和BspEI限制性位点,生成的片段被框内克隆成包含编码Fc-V或Fc-II的序列的受体中间载体。所获得的阳性克隆通过DNA测序验证。最终的构建被分别称为PKN001'-IL-1R-FcV和PKN001'-RAcP-FcII。
通过Hindlll和EcoRI限制性位点,编码IL-1R1-Fc-V的基因接着被克隆成被称为PKN002的第二中间载体。阳性克隆通过双酶切被筛选,并且正确的质粒的***序列通过DNA测序验证。最终的构建被称为PKN002-IL-1R-FcV。
最后,通过Notl和Sail限制性位点,用于来自PKN001'-RAcP-FcII的RAcP-FcII的表达盒(expression cassette)被结合至PKN002-IL-1R-FcV质粒中,并且产生了含有用于RAcP-FcII和IL-1R-FcV的表达元件的新的重组构建。最终的克隆通过Notl和Sail双酶切、接着通过DNA凝胶电泳被筛选,正确的克隆显示出近似8kb DNA片段迁移的一个带以及近似4kbDNA片段迁移的另一个带。最终的质粒被称为PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII。
重组质粒PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII结合了用于RAcP-FcII和IL-1R-FcV的表达盒。在CMV启动子(CMV promoter)的控制下,该质粒能够用于将RAcP-FcII和IL-1R-FcV蛋白质1比1共表达。在分泌之后,这些两种融合蛋白中的大多数将接着形成IL1R-FcV/RAcP-FcII异源二聚体。该质粒还通过SV40启动子表达了谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白质,其能够用作筛选标记,以生成用于IL1R-FcV/RAcP-FcII异源二聚体产生的稳定的细胞系。用于PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII的质粒图谱在图2中说明性地示出。
实施例2:用于表达本发明的多肽的稳定细胞系的生成。
共表达SEQ ID NO.1的hIL1-R1-hlgG1-Fc多肽和SEQ ID NO.2的hIL-1RAcP-hlgG1-Fc多肽的CHO-K1细胞的稳定克隆已经通过标准细胞生物实验方案(standard cellbiology protocols)被生成。实施例1中所述的表达质粒PKN012-IL1R-FcV-RAcP-FcII用于生成稳定的细胞系,以用于所述多肽的高效表达。多个克隆中的所述多肽的表达水平在7-天分批培养中约为或超过100mg/L。一个克隆细胞系显示出在摇瓶分批培养中的约为或超过300mg/L的表达水平。
材料
中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)被获得作为来自ATCC(CCL-61TM)的冷冻物料。细胞在内部被适应培养于CD CHO培养基。培养基和试剂从商业来源获得。基于完全适应,细胞增长为高密度持续几代。最终的细胞被亚克隆。其中一个具有低于20小时的倍增时间和形态良好的最终克隆被筛选为亲本细胞系。
方法
第4代的CHO-K1细胞在含有6mM左旋谷酰胺(L-Glutamine)的CD-CHO化学限定培养基(chemically defined media)(英杰公司(Invitrogen))中被培养。在到达4xl06细胞/ml的细胞密度之后,细胞被1:3***保持。细胞通过离心分离和再悬浮至1ml的CD-CHO化学限定培养基(英杰公司)被跨越(span down)。
使用了以下电穿孔方案:
-100ul的无菌TE缓冲液中的40ug质粒DNA用于电穿孔;在细胞活力的转染为至少95%的那天;
-细胞以800转每分钟(rpm)被离心分离5分钟;上清被移除并且细胞在10ml CDCHO培养基中被再悬浮并再次离心;
-上清被移除,并且细胞在小体积的CD CHO培养基中被再悬浮成1.43x107细胞/ml;
-0.7ml细胞(107细胞)被加入DNA,并且通过移液(pipetting)被轻柔混合,以避免产生气泡。
-细胞紧接着通过将300伏特、900uF的单脉冲传送至每个试管(cuvette)被电穿孔。
-50ml CD CHO(无左旋谷氨酰胺)紧接着被加入电穿孔的细胞,并被轻柔混合;
-细胞悬液以50ul/孔(ul/well)被分到十个96孔板(96well plates),第二天,含有3.3uM MSX的150ul CD CHO被加入每个孔中。
在潜在IL1R-FcV-RAcP-FcII表达细胞系的传代过程中,一些转染在CHO-K1细胞中执行;典型的转染增长曲线在图3中示出,并且数据在表1中示出。蛋白质表达水平通过SDS-PAGE分析。具有高水平的蛋白质过度表达(overexpression)的细胞系显示出具有约180kDa的表观分子量的强带。基于初步分析,筛选了四个克隆,以用于进一步的分析,其中表达水平通过SDS-PAGE和ELISA被进一步评估。良好表达的克隆被接种至125ml摇瓶中,细胞被膨化(expanded)和冷冻。
被选定的最高产量细胞系被筛选并融化成CD-CHO。细胞系上的增长曲线被评估,并且样本被每天收集,以用于细胞计数、细胞活性和IL1R-FcV-RAcP-FcII生产率。基于这些研究,可以确定,所筛选的最高生产率的细胞系表达辅助商业生产必要量的CD-CHO培养基中的IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体。纯化之后的异源二聚体的产量为至少约300mg/L(无任何生产优化)。
实施例3:本发明的多肽的纯化。
SEQ ID NO.1的hIL1-Rl-hlgG1-Fc多肽和SEQ ID NO.2的hIL-1RAcP-hlgG1-Fc多肽实质上被共表达为CHO-K1,如前述实施例2中所述。利用完善建立的方案,细胞被收集和裂解。在细胞裂解液澄清之后,含有表达的hlL1-R1-hlgG1-Fc/hIL-1RAcP-hlgG1-Fc的多肽的蛋白质浓度为约0.4mg/ml的上清液被施加至蛋白质A亲和柱(Protein A affinitycolumn)。亲和纯化步骤根据表2中所概述的程序被执行。含有pH约为3.5-3.7的hIL1-Rl-hlgG1-Fc/hIL-1RAcP-hlgG1-Fc的蛋白质A洗脱液被培养45-60分钟,以潜在地使污染材料中的存在物失去活性。
在室温、pH 3.6的情况下的材料培养约45分钟之后,其pH通过2M Tris-HCl pH9.5(稀释的蛋白质A洗脱液的~3.5%v/v)被调节至约7.9-8.1。使用pH 9.0的1M Tris-HCl,低pH处理的蛋白质A洗脱液被pH-调节至约8.0的pH。如果需要,使用去离子水(dH2O)使传导性被调节至约5.5mS/cm。
为了还原DNA、HCP、内毒素和潜在病毒污染物的内容,pH调节的蛋白质A柱洗脱液利用Q琼脂糖树脂(Q Sepharose resin)通过阴离子交换色谱法(AIEX)被进一步纯化。AIEX步骤根据表3中所概述的分步洗脱(step-elution)程序被执行。合并的洗脱峰部分通过微滤被集中为约20mg/ml的浓度,接着加入20%的蔗糖物料溶液,以获得约1%(w/v)的最终的蔗糖浓度并以-80℃冰冻。
由此纯化的蛋白质的样本通过体积排阻HPLC(SEC-HPLC)和SDS-PAGE(还原和非还原)被分析。分析的结果分别显示在图4和图5中。在图5中,线1、3示出了在非还原条件下的hIL1-R1-hlgG1-Fc/hIL-1RAcP-hlgG1-Fc SDS-PAGE,而线4、6对应在还原条件下。线2、5示出了分子量标记。hIL1-R1-hlgG1-Fc/hIL-1RAcP-hlgG1-Fc异源二聚体具有约180kDa的表观分子量,其由二硫连接的单体(di-sulfide linked monomers)组成,每个单体具有约90kDa的表观分子量。
SEC-HPLC操作程序在表4中概述。加载样品被流动相稀释,以达到约5mg/ml的蛋白质浓度。hIL1-R1-hlgG1-Fc/hIL-1RAcP-hlgG1-Fc异源二聚体的生物学相关形式由主峰表示,其中保留时间RT=14.979分钟。
表2:蛋白质A亲和色谱法的操作程序
表3:AIEX的操作程序
表4:SEC-HPLC的操作程序
由此纯化的样本的活性使用商业上可获得的人IL-1β(中国上海的PrimGene;Cat#:101-01B)以标准ELISA测定检测,其中所述样本如该实施例中所述被实质上表达和纯化。在该测定中获得的典型结合曲线在图6中示出。基于曲线分析,计算的EC50值约为50ng/ml。
实施例4:在人类细胞中IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体对IL-1β-诱导的IL-6产生的抑制表征
该实施例证明了靶人IL-1β中的IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体的有效功能(抑制)特性。作为功能比较器,使用了之前所表征的针对IL-1β的小鼠单克隆抗体。响应于使用IL-1β处理,人肺成纤维细胞MRC5产生IL-6。使用了定量的MRC5中的IL-1β-诱导的IL-6产生作为测定功能输出。通过IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体和控制抗IL-1β抗体对IL-6产生的抑制提供了IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体制备的抑制特性的定量测量。
IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体的多肽(SEQ ID NO.l and SEQ ID NO.2)如前文实施例中所述被实质上共表达和纯化。样本中所使用的实质上纯的IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体的蛋白质浓度为0.9mg/ml,在100mM NaCl、25mM NaH2PO4/Na2HPO4、25mM盐酸精氨酸(Arginine hydrochloride)、1%蔗糖中;pH=6.3。
测定中使用了以下材料:
细胞:MRC5细胞,人肺成纤维细胞,ATCC Cat#CCL-171,Lot#59474707。
培养基:DMEM,伊格尔培养基(Eagle's Medium)的杜尔贝科变化(Dulbecco'sModification),高糖(4.5g/L),联发科公司(Mediatech),Cat#10-017-CM,Lot#10017204,用作补充的是左旋谷氨酰胺和1倍的penn/strep以及10%的胎牛血清,欧米茄科技公司(Omega Scientific),Cat#FB-05,Lot#105104。
试剂:IL-1β、人重组、大肠杆菌得出的(E.coli-derived),A1a117-Ser269,增加(Accession)#NP 000567,R&D***,Cat#201-LB,Lot#ADM1411062;针对人IL-1β的单克隆抗体,克隆#8516,R&D***,Cat#MAB201,Lot#AWE1011081;人IL-6Quantakine免疫测定,R&D***,Cat#D6050,Lot#300070。
测定中使用了以下程序:
细胞维持:
1.根据制造商的推荐,在T75烧瓶上含有10%FBS的DMEM中增殖MRC5细胞。记录传代数;
2.使细胞胰蛋白酶化,在含有10%>FBS的DMEM中再悬浮;
3.使用Guava ViaCount试剂测试细胞活力。标准活力应当>85%,如果较小的话,不要使用这批细胞;
4.制备用于平板接种至48-孔板的想要浓度的每孔2x 103细胞/孔或5x 103每ml的稀释液;
5.允许细胞在37℃下贴壁16-24小时,5%CO2,然后移除培养基;
6.用新鲜的DMEM培养基代替,用作补充的是10%FBS、用于48-孔板的0.4ml/孔,培养5-10分钟,并用相同的量再次代替培养基;
7.将IL-1β、与IL-1β预先混合的测试物质和适当对照加入孔中;
8.处理之后培养细胞24小时,然后收集上清液;
9.以300x g离心分离上清液10分钟,收集干净的上清液并使用它们直接用于ELISA或如果适当的话使用1/3稀释液。
ELISA方案:
测定的原理:测定采用定量的夹心酶免疫分析法技术(sandwich enzymeimmunoassay technique)。微板预涂有特定用于IL-6的单克隆抗体。标准和样本被吸入微板的孔中,并且任何IL-6当前结合至固相抗体。在清洗掉未附着的物质之后,特定用于IL-6的酶联多克隆抗体被加入到孔中。在清洗以移除任何未附着的抗体-酶试剂之后,基质溶液被加入到孔中,并且彩色显影与附着的IL-6成比例。彩色显影停止并且彩色强度被测量。
测定程序:
1.准备制造商手册中所述的所有试剂和工作标准(http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=D6050)
2.从板框移除多余的微板带(microplate strips),将他们返回到含有干燥剂包的铝箔袋,并且重新密封。
3.每个孔加入100μL的测定稀释液RD 1W。
4.每个孔加入100μL标准、样本或对照。用提供的粘合带覆盖。在室温下培养2小时。提供板布局以记录测定的标准和样本。
5.抽吸每个孔并清洗,重复该过程三次以达到四次清洗的总数。通过使用喷水瓶、歧管分液器(manifold dispenser)、自动清洗机以清洗缓冲液(400μL)填充每个孔来清洗。在每个步骤完全移除液体对于良好的性能是必不可少的。在最后一次清洗之后,通过抽吸或倾倒来移除任何剩余的清洗缓冲液。倒置板并将其置于干净的纸巾上。
6.每个孔加入200μL的IL-6缀合物(Conjugate)。用新的粘合带覆盖。在室温下培养2小时。
7.在步骤5中重复抽吸/清洗。
8.每个孔加入200μL的基质溶液。在室温下培养20分钟。避光保存。
9.每个孔加入50μL停止溶液(Stop Solution).孔中的色彩应当从蓝色变为换色。如果孔中的色彩是绿色,或者色彩变化不统一,则轻拍板以确保彻底混合。
10.在30分钟内确定每个孔的光密度,使用设置为450nm的微板读取仪。如果波长修正可用,则设置为540nm或570nm。如果波长修正不可用,则从450nm处的读数减去540nm或570nm处的读数。该减法将修正板中的光学缺陷(optical imperfections)。在450nm处直接得出的、未修正的读数会更高,并且不太精确。
以下内容为所获得的实验数据:
通过控制抗-IL-1β抗体的IL-6产生的抑制:
1.MRC5细胞(第5代)以2x 103细胞每孔、0.4ml每孔被平板接种入48-孔板(Costar,Cat#3548)上,且被培养24小时;
2.在测定的那天,来自孔的培养基被抽吸并且用10%FBS补充的0.4ml的DMEM代替,培养10-15分钟并且再次用相同量的相同的新鲜的培养基来代替;
3.整个实验使用了最终浓度为50pg/ml的IL-1β;
4.使用了最终浓度为0.192、0.96、4.8、24、120和600ng/ml的抗-人IL-1β抗体;
5.IL-1β和抗-人IL-1β抗体都被制备成10倍浓度的溶液;
6.在将测试物质加入细胞之前,55μl的10倍IL-1β与55μl的10倍相应的抗-人IL-1β抗体溶液混合(或适当的对照),并且在室温下培养30分钟;
7.在培养之后,将每种混合物的100μl加入含有0.4ml生长培养基的孔中;
8.在测试物质存在的情况下,细胞被培养24小时,并且上清液被收集,以300x g离心分离10分钟并用于IL-6ELISA测定;
9.为了检测在抗-IL-1β抗体存在的情况下IL-6的复原,使用最终浓度为600ng/ml的抗-IL-1β抗体,并且加入IL-6标准以达到20pg/ml的最终浓度。
IL-6产生测定的IL-1抗体介导抑制中所获得的校正曲线在图7中示出。IL-1β-介导的IL-6产生和从实验中的培养基中复原的IL-6的测量结果在图8和图9中示出。所获得的用于IL-6产生的数值连同它们的标准差在表5中给出。
表5:IL-6产生值的概要
前述实验揭示了:(1)对照抗-IL-1β抗体是IC50值约为2.1ng/ml或约为14pM的IL-1β信号传导路径的非常有力的抑制剂;(2)2x 103个细胞每孔的平板细胞密度在测定启动之前24小时是足够的;(3)以20pg/ml的最终浓度加入培养基中的IL-6的复原约为114%。
通过IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体制备物对IL-6产生的抑制:
1.MRC5细胞((第6代))以2x 103个细胞每孔、0.4ml每孔被加入48-孔板(Costar,Cat#3548)上,并培养24小时;
2.将用于该实验的平板接种重复执行。每次平板接种复制都在ELISA板上的复制中测量,导致每次处理具有4个实验点;
3.在测定的那天,来自孔的培养基被抽吸并且用以10%FBS补充的的0.4ml的DMEM代替,培养10-15分钟并且再次用相同量的相同的新鲜的培养基代替;
4.整个实验使用了最终浓度为50pg/ml的IL-1β;
5.使用了最终浓度为0.0536、0.134、0.335、0.839、2.097、5.24、13.1、32.8、81.9、204.8、512、1280、3200和20000ng/ml的IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体;
6.IL-1β和IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体都被制备成10倍浓度的溶液;
7.在将测试物质加入细胞之前,120μl的10倍IL-1β/IL-1F2与120μl的10倍相应的ILlR-FcV-RAcP-FcII异源二聚体溶液混合(或适当的对照),并且在室温下培养30分钟;
8.在培养之后,将每种混合物的100μl加入含有0.4ml生长培养基的孔中;
9.在测试物质存在的情况下,细胞被培养24小时,并且上清液被收集,以300x g离心分离10分钟并用于IL-6ELISA测定。
IL-6产生测定的IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体介导抑制中所获得的校正曲线在图10中示出。IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体-介导的IL-6产生和从实验中的培养基中复原的IL-6的测量结果在图11和图12中示出。所获得的用于IL-6产生的数值连同它们的标准差在表6中给出。
表5:IL-6产生值的概要
R–表示测定校正范围之外的值
每个实验点都以复制形式被平板接种,并且IL-6产生以复制形式被进一步测量,这导致每个浓度点具有4个实验读取。所获得数据证明了实验程序和测定的高复制性。前述实验揭示了用于该实验的IL1R-FcV-RAcP-FcII heterodimer异源二聚体的IC50值约为0.3mg/ml或约为2.4pM。
实施例5:在小鼠皮下注射IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体之后的药代动力学(PK)
IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体的多肽(SEQ ID NO.1and SEQ ID NO.2)如前文实施例中所述被实质上共表达和纯化。为了注射到动物中,多肽配置到以下缓冲液中:1%w/v蔗糖、100mM氯化钠、20mM左旋盐酸精氨酸(L-Arginine Hydrochloride)、25mM碳酸氢钠,pH 6.3。使用的配量物料浓度为0.5mg/mL的多肽。
在研究的第0天,基于体重将十四只雌性无胸腺裸鼠(Balb/c nu/nu)小鼠随机分为七组,其中每组两只动物。在第0天多肽(5mg/kg)的单一处理被皮下注射(背部)到除了第1组中的小鼠之外的所有组,第1组中的小鼠通过心脏穿刺被放血(bled)以用于第0天的血浆制备。
在处理日(第0天)为所有的动物记录了体重,然后每组每周三次,包括终止日。
几组小鼠在特定时间点被挑选出来,以用于血浆制备。用于样本收集所挑选出来的组的体重变化在0小时和剂量注射的36小时之内不被测量。所有其他小鼠获得体重,并且在研究周期过程中没有报告不利的临床症状。
在研究的存活期(in-life phase)之后,血浆样本通过ELISA for Hu-Fc蛋白质被分析。通过ELISA的小鼠血浆样本中定量的Hu-Fc被用作读出信息(read-out),以用于多肽的循环水平。测定在来自研究中的所有小鼠的样本上执行。
在注射后1小时,多肽在动物的血浆中被检测到。接着使用一个具有Prism 5.0c(美国加利福尼亚州的拉荷亚的GraphPad软件公司)的衰变模型方程,以确定如由Hu-FcELISA检测的多肽的药代动力学。Hu-Fc(Cmax)的尖峰循环水平被确定为1.65μg/mL,并且到达尖峰循环水平的时间(Tmax)是处理之后36小时。半衰期(T1/2)为88.15小时,并且速率常数(K)为0.0079hr-1。Hu-Fc水平在未处理的第1组动物的血浆中可以忽略。该研究的结果在表7中概述。
表7:注射后各时间的平均人-Fc蛋白质浓度±SEM(μg/mL)
*不能计算为Hu-Fc的水平的SEM低于用于组中的一个样本的ELISA的可检测出的限度。
人-Fc蛋白质浓度基于三重样本(triplicate samples)的平均吸收率通过Prism软件来确定。
^通过眶窦放血
#通过终端心脏穿刺来放血
实施例6:28天重复给药之后IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体在C57BL6小鼠中的毒性的估算。
在重复剂量之后,鼠毒性估算研究产生了概述。C57BL6小鼠用TL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体的多肽(SEQ ID NO.1and SEQ ID NO.2)测试样品以10、30和100mg/kg的剂量水平进行每周两次的皮下注射的处理与毒性的发病率或临床症状无关。对于体重,没有一致的性别或处理有关的影响。发现摄食量增加了,这被认为是处理的可能影响,当时这并不被认为是不利的。
尽管证明了涉及临床生物化学的参数的功能变化,但是这些并不被认为是毒理学的标志,因为存在大多数这些参数可逆的证据,尽管在某些中不完全。缺少毒理动力学评估时,不可能评价这些区别中的其中一些的表面不可逆性的标志。然而,没有区别于组织病理学变化有关,或者被认为是不利的。该观察到的区别属于这种类型:典型可逆,并且可能可逆性周期不足以证明这些。
可以得出结论,在老鼠28天IL1R-FcV-RAcP-FcII异源二聚体给药研究的无明显有害作用水平(NOAEL)由此被认为是100mg/kg。
这里所提及的所有公开物和专利都以其全文以引用的方式结合于此,如同每篇单独的公开物或专利都被具体且单独地表明以引用的方式结合于此。
虽然已经描述了主题的特定实施例,上述说明书是说明性的且不是限制性的。对于本领域技术人员来说,基于该说明书和下文的权利要求书,许多变化将是显而易见的。本发明的整个范围应当通过权利要求书及其等同物的整个范围以及说明书及这些变化的内容确定。
Claims (38)
1.一种能够结合人IL-1β的异源二聚体蛋白质组合物,其特征在于,所述蛋白质组合物包含:
第一多肽,其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成,及
第二多肽,其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的蛋白质组合物,其特征在于,所述蛋白质组合物显示出在酶联免疫吸附法测定中的人IL-1β的结合活性,EC50为50ng/ml。
3.一种治疗组合物,其特征在于,该组合物包含能够结合人IL-1β的异源二聚体蛋白质组合物,所述异源二聚体蛋白质组合物包含:
第一多肽,其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成,及
第二多肽,其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求3所述的治疗组合物,其特征在于,在皮下给药5mg/kg的剂量之后,通过人Fc酶联免疫吸附法的测定,小鼠的体循环中的所述异源二聚体蛋白质组合物的半衰期为至少88小时。
5.一种分离的核酸,其特征在于,其编码由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的多肽。
6.一种分离的核酸,其特征在于,其编码由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的多肽。
7.根据权利要求5或6所述的核酸,其特征在于,密码子使用被优化为使所述多肽在哺乳动物细胞中高效表达。
8.根据权利要求5所述的核酸,其特征在于,核酸序列由SEQ ID NO:4的序列组成。
9.根据权利要求6所述的核酸,其特征在于,核酸序列由SEQ ID NO:6的序列组成。
10.根据权利要求8或9所述的核酸,其特征在于,所述核酸包含表达载体。
11.一种分离的核酸,其特征在于,其是SEQ ID NO:7的分离的核酸。
12.一种异源表达***,其特征在于,该表达***具有表达载体,所述表达载体包含编码第一多肽的核酸序列以及编码第二多肽的另一核酸序列,其中
第一多肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成,且
第二多肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
13.根据权利要求12所述的表达***,其特征在于,所述表达载体包含在哺乳动物细胞中。
14.根据权利要求13所述的表达***,其特征在于,所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
15.根据权利要求13所述的表达***,其特征在于,所述表达***能够表达包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体蛋白质,其中
第一多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成,且
第二多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成,并且
其中所述异源二聚体蛋白质的表达水平为每升细胞培养物中至少300mg。
16.用于制造治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病的药物的物质的用途,其特征在于,所述物质包含含有第一多肽和第二多肽的异源二聚体蛋白质,其中
第一多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成,且
第二多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
17.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为关节炎。
18.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为痛风。
19.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为类风湿性关节炎。
20.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)。
21.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为硬皮病。
22.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为糖尿病。
23.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为动脉硬化。
24.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为干眼症。
25.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为眼部过敏。
26.根据权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病为葡萄膜炎。
27.一种用于治疗或预防与人IL-1β的活性的调节有关的疾病或状况的药物组合物,所述药物组合物包含含有第一多肽和第二多肽的异源二聚体蛋白质,其中
第一多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成,且
第二多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
28.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为关节炎。
29.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为痛风。
30.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为类风湿性关节炎。
31.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)。
32.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为硬皮病。
33.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为糖尿病。
34.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为动脉硬化。
35.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为干眼症。
36.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为眼部过敏。
37.根据权利要求27所述的组合物,其特征在于,所述疾病为葡萄膜炎。
38.一种能够结合人IL-1β的异源二聚体蛋白质组合物,其特征在于,所述蛋白质组合物能够抑制响应于用人IL-1β处理成纤维细胞而在人肺成纤维细胞中人IL-6的产生,所述抑制具有2.3pM的IC50值,其中所述蛋白质组合物包含含有第一多肽和第二多肽的异源二聚体蛋白质,其中
第一多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成,且
第二多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
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