CN104357547B - 一种豹纹鳃棘鲈微卫星dna分子标记的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，该方法通过转录组测序筛选到含有豹纹鳃棘鲈微卫星重复序列的Unigene，然后在Unigene序列中检测到微卫星位点；根据位点两端序列设计微卫星标记的特异性引物，并检测其多态性，开发豹纹鳃棘鲈多态性丰富的微卫星标记。并进一步验证了其中7个豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记，本发明中的豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记可应用于豹纹鳃棘鲈种群的种群遗传结构和遗传育种等研究。
Description
技术领域
本发明属于微卫星分子标记技术领域，具体涉及一种豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法。
背景技术
豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)隶属于鲈形目、鮨科、鳃棘鲈属，是我国重要南方重要的养殖鱼类。近些年来，高强度的捕捞压力已经使得豹纹鳃棘鲈资源处于过度捕捞状态。为了保护和管理豹纹鳃棘鲈渔业资源，研究其种群遗传结构和遗传变异水平是非常必要的。微卫星分子标记因具有多态性高、共显性等优点已经成为目前海水鱼类群体遗传分析最常用的手段。然而，迄今为止针对豹纹鳃棘鲈开发的微卫星分子标记只有35个(Molecular Ecology Resources 9:1485–1487；Conservation genetics Resources5:1067–1069；Conservation genetics Resources 2:101–103)，数量非常有限，亟待开发更多新的豹纹鳃棘鲈微卫星分子标记。另一方面，目前豹纹鳃棘鲈微卫星开发主要采用富集文库法，需要进行DNA提取、基因组文库构建、探针杂交富集、克隆筛选等步骤，费时费力，通常只能得到数十个标记。因此急需一种豹纹鳃棘鲈高效的微卫星分子标记开发技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，该方法高效、简便，耗时短，能一次开发较多豹纹鳃棘鲈微卫星分子标记。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，含有以下步骤：
(1)豹纹鳃棘鲈转录组测序提取豹纹鳃棘鲈样品的总RNA，经含mRNA富集、片段化mRNA、合成cDNA、末端修复以及加“A”连接工序，建立测序文库，采用Illumina Hi SeqTM2000测序，获得豹纹鳃棘鲈原始序列；
(2)豹纹鳃棘鲈Unigene的获得及微卫星位点的检测将转录组测序获得的原始序列去除接头和Q值≤10的低质量片段序列后获得高质量序列，高质量序列进行从头组装得到豹纹鳃棘鲈的Unigene，然后在Unigene序列中进行微卫星位点查找，得到多个微卫星位点；
(3)选取多个微卫星位点中的部分微卫星位点进行验证，根据该部分微卫星位点的两端序列设计该微卫星位点的特异性引物，提取豹纹鳃棘鲈基因组DNA，采用该微卫星位点的特异性引物进行PCR扩增，采用软件Cervus2.0进行检测，检测到的部分微卫星位点即为豹纹鳃棘鲈的部分微卫星DNA分子标记，根据不同的微卫星位点设计不同的特异性引物，即可逐一验证不同微卫星位点的DNA分子标记。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明步骤(2)中采用软件Trinity对高质量序列进行从头组装得到88813个豹纹鳃棘鲈的Unigene，然后用软件MicroSAtellite在Unigene序列中进行微卫星位点查找，得到14649个微卫星位点，微卫星位点查找时重复次数为4～39，其中3716个为单核苷酸重复序列，6332个为二核苷酸重复序列，4020个为三核苷酸重复序列，310个为四核苷酸重复序列，153个为五核苷酸重复序列，118个为六核苷酸重复序列。
实际上，根据不同的软件或者不同的测序条件Unigene和微卫星位点的数量会有稍微的变化，以上仅为采用本发明中的软件和测序条件而获得的一种优选的实施方式。
本发明步骤(3)中优选选取多个微卫星位点中的7个微卫星位点进行验证，该7个微卫星位点的特异性引物如SEQ ID：1～14所示。
实际上，根据检测到的14649个位点设计特异性引物会有成千上万，本发明提供这7对引物只是做验证，验证根据这些检测到的位点可以设计引物把它扩增出来，从而证明这种方法可以检测到大量的开发微卫星位点并可以根据这些位点设计特异性引物。
本发明对于剩余的其他位点，也需要设计其他引物扩增出来，本发明仅是随机检测了其中的7个，就是说明可以采用本发明中的方法，对所有的微卫星位点如14649个进行确认。
本发明步骤(3)中特异性引物的设计时引物长度优选为20～25bp，退火温度优选为50～60度，PCR扩增产物长度优选在100～400bp。
本发明步骤(3)中PCR扩增时采用的反应体系优选为：在20μL反应体系中包括：0.5μM特异性引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA，反应程序：94℃5min，94℃30s，每个微卫星位点的退火温度30s，72℃30s，最后延伸5min。
本发明步骤(3)中获得的豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记可应用于豹纹鳃棘鲈种群的种群遗传结构和遗传育种研究。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明可以一次性检测到大量的开发微卫星位点并可以根据这些位点设计特异性引物，该方法高效、简便，耗时短。
附图说明
图1是实施例1中转录组测序获得的豹纹鳃棘鲈Unigene；
图2是实施例1中在Unigene序列中检测到的豹纹鳃棘鲈微卫星位点；
图3是实施例1中位点DX1～DX7在30尾豹纹鳃棘鲈基因组DNA的MICROSATELLITE分型图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，含以下步骤：
1、豹纹鳃棘鲈转录组测序：
采用常规Trizol法提取样品总RNA，DNase I酶消化总RNA中的DNA，通过带有Oligo(dT)的磁珠与mRNA的3'polyA在相互吸附从而富集mRNA，加热下将mRNA与打断试剂作用后，在冰上用乙醇沉淀回收产物，在PCR仪上合成双链cDNA，在Thermomixer中进行末端修复，使修复产物在3'末端加上碱基A，再使adapter和加"A"产物连接，纯化回收扩增构建文库，使用Illumina Hi SeqTM2000测序。
2、豹纹鳃棘鲈Unigene的获得及微卫星位点的检测
将转录组测序获得的原始序列用去除接头和低质量(质量值Q≤10)片段序列之后获得高质量序列，再使用软件Trinity对序列进行从头组装得到豹纹鳃棘鲈88813个Unigene(图1)，然后用软件MicroSAtellite(MISA)在Unigene序列中检测14649个微卫星位点，其中，3716个为单核苷酸重复序列，6332个为二核苷酸重复序列，4020个为三核苷酸重复序列，310个为四核苷酸重复序列，153个为五核苷酸重复序列，118个为六核苷酸重复序列，重复次数4-39(表1，图2)，选取其中的7个微卫星位点，再用软件Primer3根据这7个微卫星位点两端序列设计微卫星标记的特异性引物。
3、豹纹鳃棘鲈多态性微卫星位点的验证
提取30尾豹纹鳃棘鲈基因组DNA，用7对特异性引物进行PCR扩增，反应体系为20μL：0.5μM引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA。反应程序：94℃5min，94℃30s，每个SSR位点最佳退火温度30s，72℃30s，最后延伸5min。PCR产物用ABI PRISM 3730 DNA自动测序仪分离，片段长度用软件GeneMapper根据内标ROX-500确定。软件Cervus2.0检测7个微卫星位点(DX1～DX7)的等位基因数目为4-12，观测杂合度和期望杂合度分别为0.1180-0.2432和0.7568-0.8820(表2，图3)。
表1豹纹鳃棘鲈转录组测序检测到的微卫星位点
软件Cervus2.0检测7个微卫星位点(DX1～DX7)的等位基因数目为4-12，观测杂合度和期望杂合度分别为0.1180-0.2432和0.7568-0.8820(表2，图3)，这些数值表明这7个位点具有较高的多态性。
本发明采用上述7对引物做验证，这7对引物可以扩增出这7个微卫星DNA分子标记，验证根据这些检测到的14649个微卫星位点可以设计引物并把它扩增出来，从而证明这种方法可以检测到大量的开发微卫星位点并可以根据这些位点设计特异性引物。
本发明获得的豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记可应用于豹纹鳃棘鲈种群的种群遗传结构和遗传育种等研究中。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，其特征是含有以下步骤：
（1）豹纹鳃棘鲈转录组测序 提取豹纹鳃棘鲈样品的总RNA，经含mRNA富集、片段化mRNA、合成cDNA、末端修复以及加“A”连接工序，建立测序文库，采用Illumina Hi Seq™2000测序，获得豹纹鳃棘鲈原始序列；
（2）豹纹鳃棘鲈Unigene的获得及微卫星位点的检测 将转录组测序获得的原始序列去除接头和Q值≤10的低质量片段序列后获得高质量序列，高质量序列进行从头组装得到豹纹鳃棘鲈的Unigene，然后在Unigene序列中进行微卫星位点查找，得到多个微卫星位点；
（3）选取多个微卫星位点中的部分微卫星位点进行验证，根据该部分微卫星位点的两端序列设计该微卫星位点的特异性引物，提取豹纹鳃棘鲈基因组DNA，采用该微卫星位点的特异性引物进行PCR扩增，采用软件Cervus2.0进行检测，检测到的部分微卫星位点即为豹纹鳃棘鲈的部分微卫星DNA分子标记，根据不同的微卫星位点设计不同的特异性引物，即可逐一验证不同微卫星位点的DNA分子标记；
步骤（2）中采用软件Trinity对高质量序列进行从头组装得到88813个豹纹鳃棘鲈的Unigene，然后用软件MicroSAtellite在Unigene序列中进行微卫星位点查找，得到14649个微卫星位点，微卫星位点查找时重复次数为4~39，其中3716个为单核苷酸重复序列，6332个为二核苷酸重复序列，4020个为三核苷酸重复序列，310个为四核苷酸重复序列，153个为五核苷酸重复序列，118个为六核苷酸重复序列；
步骤（3）中选取多个微卫星位点中的7个微卫星位点进行验证，该7个微卫星位点的特异性引物如SEQ ID：1~14所示。
2.根据权利要求1所述的豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，其特征是：步骤（3）中特异性引物的设计时引物长度20~25bp，退火温度50~60度，PCR扩增产物长度在100~400bp。
3.据权利要求1所述的豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，其特征是：步骤（3）中PCR扩增时采用的反应体系：在20μL反应体系中包括：0.5μM特异性引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA，反应程序：94℃ 5min，94℃ 30s，每个微卫星位点的退火温度30s，72℃ 30s，最后延伸5min。
4.据权利要求1所述的豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记的构建方法，其特征是：步骤（3）中获得的豹纹鳃棘鲈微卫星DNA分子标记可应用于豹纹鳃棘鲈种群的种群遗传结构和遗传育种研究。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |