CN104345111A - 一种中药组合物制剂中多种活性成分含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物制剂中多种成分含量的测定方法，属于中药领域，具体制备步骤为：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、UPLC检测、标准曲线的制定及结果计算。本发明的测定方法周期短、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域，具体涉及中药成分的含量测定方法。
背景技术
该中药组合物具有清瘟解毒，宣肺泄热的功效，适用于流行性感冒治疗，症见：发热或高热，恶寒，肌肉酸痛，鼻塞流涕，咳嗽，头痛，咽干咽痛，舌偏红，苔黄或黄腻等。主要成分包括连翘、金银花、炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、鱼腥草、广藿香、大黄、红景天、薄荷脑、甘草。
为了能够有效的控制产品质量，保证公众的用药安全，必须对生产工艺的中间环节进行质量控制，但是该中药组合物中成分比较多，而采用HPLC检验周期长，重复性、灵敏度等无法满足连续生产的需要。
发明内容
本发明目的是提供一种周期短、灵敏度高的检测一种中药组合物中多种成分含量的方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种中药组合物制剂中多种活性成分含量的测定方法，该中药组合物制剂由下列重量份的原料药制成: 连翘200-300 金银花200-300 板蓝根200-300 大黄40-60 广藿香60-100 绵马贯众200-300 红景天60-100 薄荷脑5-9 麻黄60-100 苦杏仁60-100 鱼腥草200-300 甘草60-100 石膏200-300，该含量测定方法由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备：称取该中药组合物制剂1-2g，加甲醇50mL，称定重量，超声提取10-30min，放冷、称重，用甲醇补足重量，过滤，摇匀，即得；
B、对照样品溶液的制备：分别称取绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，加70%甲醇，摇匀，即得不同浓度的各对照品溶液；
C、UPLC检测：色谱柱为C18，柱温40℃，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-2min，3%甲醇，3%乙腈，94%的0.1%磷酸；2-3min，3%-5%甲醇，3%-5%乙腈，94%-90%的0.1%磷酸；3-10min，5%-20%甲醇，5%乙腈，90%-75%的0.1%磷酸；10-13.5min，20%甲醇，5%乙腈，75%的0.1%磷酸；13.5-22.5min，85%甲醇，5%乙腈，10%的0.1%磷酸；检测波长237nm，流速为0.2-0.4mL/min；
D、标准曲线的制定及计算结果:分别将绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液0.5-10mL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得到各对照品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液注入超高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量。
优选地，所述步骤C中色谱柱为ACQUITY BEH C18 ，规格为1.7μm，2.1×100mm，流速为0.4 mL/min。
作为优选方式，中药组合物制剂中多种活性成分含量的测定方法有以下步骤构成：
A、供试品溶液的制备：称取该中药组合物制剂1-2g，加甲醇50mL，称定重量，超声提取10-30min，放冷、称重，用甲醇补足重量，过滤，摇匀，即得；
B、对照样品溶液的制备：分别称取绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，加70%甲醇，摇匀，即得不同浓度的各对照品溶液，绿原酸浓度为0.70mg.mL-1、连翘酯苷A 为0.21mg.mL-1、隐绿原酸为0.61mg.mL-1、3,4-二咖啡酰奎宁酸为0.83mg.mL-1、4,5-二咖啡酰奎宁酸为0.18mg.mL-1；
C、UPLC检测：色谱柱为C18，柱温40℃，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-2min，3%甲醇，3%乙腈，94%的0.1%磷酸；2-3min，3%-5%甲醇，3%-5%乙腈，94%-90%的0.1%磷酸；3-10min，5-20%甲醇，5%乙腈，90%-75%的0.1%磷酸；10-13.5min，20%甲醇，5%乙腈，75%的0.1%磷酸；13.5-22.5min，85%甲醇，5%乙腈，10%的0.1%磷酸；检测波长237nm，流速为0.2-0.4mL/min；
D、标准曲线的制定及计算结果:分别将绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液0.5-10mL注入步骤c中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得到各对照品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液注入超高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量。
作为优选，该中药组合物由下列重量份的原料药制成:
连翘 200 金银花 300 板蓝根 200 大黄 60 广藿香 60
绵马贯众 300 红景天 60 薄荷脑 9 麻黄 60 苦杏仁 100
鱼腥草 200 甘草 100 石膏 200。
作为优选，该中药组合物由下列重量份的原料药制成:
连翘 300 金银花 200 板蓝根 300 大黄 60 广藿香 100
绵马贯众 200 红景天 60 薄荷脑 5 麻黄 100 苦杏仁 60
鱼腥草 300 甘草 60 石膏 300。
作为优选，该中药组合物由下列重量份的原料药制成:
连翘 255 金银花 255 板蓝根 255 大黄 51 广藿香 85
绵马贯众 255 红景天 85 薄荷脑 7.5 麻黄 85 苦杏仁 85
鱼腥草 255 甘草 85 石膏 255。
为了验证本发明的方法的可行性和精确度，作了如下的试验：
精密度考察
分别吸取1μL绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，分别连续进样6次，测定峰面积，结果绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积的RSD分别为1.48%、1.30%、1.20、1.09%%和2.06%，说明仪器精密度良好。
稳定性试验
吸取实施例1中的供试品溶液，于0、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积，结果供试品中绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积的RSD分别为1.10%、1.15%、1.56%、1.47%和1.71%，说明24h内供试品溶液稳定。
重复性试验
取同一批样品，按照实施例1中供试品溶液的制备方法制备6份，测定，结果样品中绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为1.77%，1.94%，1.48%，0.97%和1.07%，说明方法重复性良好。
加样回收率试验
采用加样回收试验，精密称取实施例1中的中药组合物样品6份，每份都加入绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，测定，计算回收率，结果绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的回收率分别为：97.2%、98.2%、98.1%、97.5%和96.5%，RSD分别为1.77%，1.94%，1.48%，0.97%和1.07%。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明采用UPLC同时测定该中药组合物中多种成分的含量，重复性好、精密度高、分析速度快，可以在比较短的周期内检测出各成分的含量，可以更方便的控制药物的质量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明：
仪器和试药
仪器
超高效液相色谱仪（型号ACQUITY UPLC H CLASS，美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower3色谱工作站）；超声波清洗器（KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司）；分析天平（AG135，METTLER TO-LEDO）。
试药
对照品：绿原酸、连翘酯苷A、（批号分别为：110753-200413、111810-201001），均购于中国药品生物制品检定所。隐绿原酸，3.4二咖啡酰奎宁酸，4.5-二咖啡酰奎宁酸购于成都曼思特生物科技有限公司（纯度>98%）。该中药组合物（石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号110121、110601、110807、110610、110710、110220、110725、110147、110817、110910、110241、120515）。乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），磷酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
实施例1：
原料药配方为：
连翘 255 g 金银花 255 g 板蓝根 255 g 大黄 51 g 广藿香 85 g
绵马贯众 255 g 红景天 85 g 薄荷脑 7.5 g 蜜麻黄 85 g
苦杏仁 85 g 鱼腥草 255 g 甘草 85 g 石膏 255 g
中药组合物胶囊剂的制备方法为：
(1) 按照上述处方称取中药材，净选；
(2) 广藿香碎断，加6倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
(3) 连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用8倍量70%的乙醇提取2次，第一次2小时，第二次1.5小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
(4) 金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加9倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次1.5小时，第二次1小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置24小时，过滤，回收乙醇至无醇味，所得滤液与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15的清膏，喷雾干燥，得干膏粉，备用；
(5) 将步骤(4)所得干膏粉加入淀粉138克，用85%乙醇制粒；
(6) 将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(5)所得颗粒，密闭，混匀，装入1000粒胶囊，即得。
中药组合物制剂中多种成分含量的测定方法，由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物胶囊，倒出内容物，研细，称取1g，加甲醇50mL，称定重量，超声提取30min，放冷、称重，用甲醇补足重量，过滤，摇匀，即得；
B、对照样品溶液的制备：分别称取绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，加70%甲醇，摇匀，即得不同浓度的各对照品溶液，绿原酸浓度为0.70mg.mL-1、连翘酯苷A 为0.21mg.mL-1、隐绿原酸为0.61mg.mL-1、3,4-二咖啡酰奎宁酸为0.83mg.mL-1、4,5-二咖啡酰奎宁酸为0.18mg.mL-1；
C、UPLC检测：色谱柱为C18，色谱柱为ACQUITY BEH C18，规格为1.7μm，2.1×100mm，柱温40℃，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-2min，3%甲醇，3%乙腈，94%的0.1%磷酸；2-3min，3%-5%甲醇，3%-5%乙腈，94%-90%的0.1%磷酸；3-10min，5%-20%甲醇，5%乙腈，90%-75%的0.1%磷酸；10-13.5min，20%甲醇，5%乙腈，75%的0.1%磷酸；13.5-22.5min，85%甲醇，5%乙腈，10%的0.1%磷酸；检测波长237nm，流速为0.4mL/min；
D、标准曲线的制定及计算结果:分别精密吸取0.5mL的绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液注入步骤c中超高效色谱仪中分析，然后分别吸取1.0mL的各对照品溶液、2.0 mL的各对照品溶液、5.0 mL的各对照品溶液、8.0 mL的各对照品溶液、10 mL的各对照品溶液，注入超高效色谱仪中进行色谱分析，以色谱峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液注入超高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量，分别为3.29mg/g、4.21mg/g、0.95mg/g、2.19 mg/g、1.15 mg/g。
表1
取12批该中药组合物胶囊样品，按照上述方法测定，结果如表2
实施例2：
原料药配方为：
连翘 300 g 金银花 200 g 板蓝根 300 g 大黄 60 g 广藿香 100 g
绵马贯众 200 g 红景天 60 g 薄荷脑 5 g 麻黄 100 g
苦杏仁 60 g 鱼腥草 300 g 甘草 60 g 石膏 300 g
中药组合物片剂的制备方法为：
(1) 按照上述处方称取中药材，净选；
(2) 广藿香碎断，加5倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
(3) 连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用6倍量50%的乙醇提取2次，第一次3小时，第二次1小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
(4) 金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加7倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次0.5小时，第二次2.5小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.10的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置24小时，过滤，回收乙醇至无醇味，所得滤液与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.15的清膏，喷雾干燥，得干膏粉，备用；
(5) 将步骤(4)所得干膏粉加入淀粉134克，用85%乙醇制粒；
(6) 将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(5)所得颗粒，按常规制剂方法制成片剂即得。
中药组合物制剂中多种成分含量的测定方法，由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物片剂，研细，称取1.5g，加甲醇50mL，称定重量，超声提取10min，放冷、称重，用甲醇补足重量，过滤，摇匀，即得；
B、对照样品溶液的制备：分别称取绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，加70%甲醇，摇匀，即得不同浓度的各对照品溶液，绿原酸浓度为0.70mg.mL-1、连翘酯苷A 为0.21mg.mL-1、隐绿原酸为0.61mg.mL-1、3,4-二咖啡酰奎宁酸为0.83mg.mL-1、4,5-二咖啡酰奎宁酸为0.18mg.mL-1；
C、UPLC检测：色谱柱为C18，色谱柱为ACQUITY BEH C18，规格为1.7μm，2.1×100mm，柱温40℃，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-2min，3%甲醇，3%乙腈，94%的0.1%磷酸；2-3min，3%-5%甲醇，3%-5%乙腈，94%-90%的0.1%磷酸；3-10min，5%-20%甲醇，5%乙腈，90%-75%的0.1%磷酸；10-13.5min，20%甲醇，5%乙腈，75%的0.1%磷酸；13.5-22.5min，85%甲醇，5%乙腈，10%的0.1%磷酸；检测波长237nm，流速为0.2mL/min；
D、标准曲线的制定及计算结果: 分别精密吸取0.5mL的绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液注入步骤c中超高效色谱仪中分析，然后分别吸取1.0mL的各对照品溶液、2.0 mL的各对照品溶液、5.0 mL的各对照品溶液、8.0 mL的各对照品溶液、10 mL的各对照品溶液，注入超高效色谱仪中进行色谱分析，以色谱峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液注入超高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量, 分别为2.79mg/g、4.01mg/g、0.85mg/g、2.09 mg/g、1.12 mg/g。。
精密度考察
分别吸取1μL绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，分别连续进样6次，测定峰面积，结果绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积的RSD分别为1.47%、1.30%、1.21、1.09%%和2.05%，说明仪器精密度良好。
稳定性试验
吸取本实施例中的供试品溶液，于0、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积，结果供试品中绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积的RSD分别为1.12%、1.13%、1.55%、1.47%和1.73%，说明24h内供试品溶液稳定。
重复性试验
取同一批样品，按照本实施例中供试品溶液的制备方法制备6份，测定，结果样品中绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为1.76%，1.95%，1.47%，0.97%和1.06%，说明方法重复性良好。
加样回收率试验
采用加样回收试验，精密称取本实施例中的中药组合物样品6份，每份都加入绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，测定，计算回收率，结果绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的回收率分别为：97.1%、98.1%、98.2%、97.6%和96.4%，RSD分别为1.72%，1.91%，1.47%，0.97%和1.08%
实施例3：
原料药配方为：
连翘 200 g 金银花 300g 板蓝根 200g 大黄 60g 广藿香 60g
绵马贯众 300g 红景天 60g 薄荷脑 9g 麻黄 60g 苦杏仁 100g
鱼腥草 200g 甘草 100g 石膏 200g。
中药组合物的丸剂制备方法为：
(1) 按照上述处方称取中药材，净选；
(2) 广藿香碎断，加10倍量水提取挥发油，提油时间4小时，收集挥发油，备用；提取液过滤后，残渣弃去，滤液备用；
(3) 连翘、麻黄、鱼腥草、大黄，用10倍量90%的乙醇提取2次，第一次1小时，第二次3小时，提取液合并过滤，回收乙醇，滤液备用；
(4) 金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天，加11倍量水煎煮至沸，加入苦杏仁煎煮2次，第一次2.5小时，第二次0.5小时，提取液合并过滤，所得滤液与步骤（2）广藿香提油后的滤液合并，浓缩成在60℃时测定相对密度为1.12的清膏，加乙醇，调节至醇浓度为70%，冷藏放置24小时，过滤，回收乙醇至无醇味，所得滤液与步骤（3）所得醇提液合并，浓缩至在60℃时测定相对密度为1.17的清膏，喷雾干燥，得干膏粉，备用；
(5) 将薄荷脑、步骤（2）所得挥发油加入乙醇溶解，喷入步骤(4)所得干膏粉，按常规制剂方法制成丸剂即得。
中药组合物制剂中多种成分含量的测定方法，由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备：取该中药组合物丸剂，研细，称取2g，加甲醇50mL，称定重量，超声提取20min，放冷、称重，用甲醇补足重量，过滤，摇匀，即得；
B、对照样品溶液的制备：分别称取绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，加70%甲醇，摇匀，即得不同浓度的各对照品溶液，绿原酸浓度为0.70mg.mL-1、连翘酯苷A 为0.21mg.mL-1、隐绿原酸为0.61mg.mL-1、3,4-二咖啡酰奎宁酸为0.83mg.mL-1、4,5-二咖啡酰奎宁酸为0.18mg.mL-1；
C、UPLC检测：色谱柱为C18，色谱柱为ACQUITY BEH C18，规格为1.7μm，2.1×100mm，柱温40℃，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-2min，3%甲醇，3%乙腈，94%的0.1%磷酸；2-3min，3%-5%甲醇，3%-5%乙腈，94%-90%的0.1%磷酸；3-10min，5%-20%甲醇，5%乙腈，90%-75%的0.1%磷酸；10-13.5min，20%甲醇，5%乙腈，75%的0.1%磷酸；13.5-22.5min，85%甲醇，5%乙腈，10%的0.1%磷酸；检测波长237nm，流速为0.3mL/min；
D、标准曲线的制定及计算结果: 分别精密吸取0.5ml的绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液注入步骤C中超高效色谱仪中分析，然后分别吸取1.0mL的各对照品溶液、2.0 mL的各对照品溶液、5.0 mL的各对照品溶液、8.0 mL的各对照品溶液、10 mL的各对照品溶液，注入超高效色谱仪中进行色谱分析，以色谱峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得到各对照样品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液注入超高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量, 分别为2.99mg/g、3.21mg/g、0.85mg/g、2.49 mg/g、0.95 mg/g。
精密度考察
分别吸取1μL绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，分别连续进样6次，测定峰面积，结果绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积的RSD分别为1.49%、1.30%、1.20、1.08%和2.05%，说明仪器精密度良好。
稳定性试验
吸取本实施例中的供试品溶液，于0、2、4、8、12、24h进样，测定峰面积，结果供试品中绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品峰面积的RSD分别为1.11%、1.14%、1.55%、1.48%和1.71%，说明24h内供试品溶液稳定。
重复性试验
取同一批样品，按照本实施例中供试品溶液的制备方法制备6份，测定，结果样品中绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的RSD分别为1.76%，1.93%，1.45%，0.96%和1.08%，说明方法重复性良好。
加样回收率试验
采用加样回收试验，精密称取本实施例中的中药组合物样品6份，每份都加入绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液，测定，计算回收率，结果绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的回收率分别为：97.3%、98.3%、98.2%、97.4%和96.4%，RSD分别为1.76%，1.93%，1.47%，0.96%和1.06% 。
Claims (7)
1.一种中药组合物制剂中多种活性成分含量的测定方法，该中药组合物制剂由下列重量份的原料药制成: 连翘200-300 金银花200-300 板蓝根200-300 大黄40-60 广藿香60-100 绵马贯众200-300 红景天60-100 薄荷脑5-9 麻黄60-100 苦杏仁60-100 鱼腥草200-300 甘草60-100 石膏200-300，其特征在于该测定方法由以下步骤组成：
A、供试品溶液的制备：称取该中药组合物制剂1-2g，加甲醇50mL，称定重量，超声提取10-30min，放冷、称重，用甲醇补足重量，过滤，摇匀，即得；
B、对照样品溶液的制备：分别称取绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，加70%甲醇，摇匀，即得不同浓度的各对照品溶液；
C、UPLC检测：色谱柱为C18，柱温40℃，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-2min，3%甲醇，3%乙腈，94%的0.1%磷酸；2-3min，3%-5%甲醇，3%-5%乙腈，94%-90%的0.1%磷酸；3-10min，5%-20%甲醇，5%乙腈，90%-75%的0.1%磷酸；10-13.5min，20%甲醇，5%乙腈，75%的0.1%磷酸；13.5-22.5min，85%甲醇，5%乙腈，10%的0.1%磷酸；检测波长237nm，流速为0.2-0.4mL/min；
D、标准曲线的制定及计算结果:分别将绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液0.5-10mL注入步骤C中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，进样量横坐标，得到各对照品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液注入超高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤C中色谱柱为ACQUITY BEH C18 ，规格为1.7μm，2.1×100mm，流速为0.4 mL/min。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：
A、供试品溶液的制备：称取该中药组合物制剂1-2g，加甲醇50mL，称定重量，超声提取10-30min，放冷、称重，用甲醇补足重量，过滤，摇匀，即得；
B、对照样品溶液的制备：分别称取绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品，加70%甲醇，摇匀，即得不同浓度的各对照品溶液，绿原酸浓度为0.70mg.mL-1、连翘酯苷A 为0.21mg.mL-1、隐绿原酸为0.61mg.mL-1、3,4-二咖啡酰奎宁酸为0.83mg.mL-1、4,5-二咖啡酰奎宁酸为0.18mg.mL-1；
C、UPLC检测：色谱柱为C18，柱温40℃，流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0-2min，3%甲醇，3%乙腈，94%的0.1%磷酸；2-3min，3%-5%甲醇，3%-5%乙腈，94%-90%的0.1%磷酸；3-10min，5%-20%甲醇，5%乙腈，90%-75%的0.1%磷酸；10-13.5min，20%甲醇，5%乙腈，75%的0.1%磷酸；13.5-22.5min，85%甲醇，5%乙腈，10%的0.1%磷酸；检测波长237nm，流速为0.2-0.4ml/min；
D、标准曲线的制定及计算结果:分别将绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液0.5-10mL注入步骤C中超高效色谱仪中分析，以色谱峰面积为纵坐标，进样量横坐标，得到各对照品溶液的标准曲线；然后将供试样品溶液注入超高效色谱仪中分析，将各成分峰面积带入标准曲线中，得到绿原酸、连翘酯苷A、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量。
4.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于该中药组合物由下列重量份的原料药制成:
连翘 200 金银花 300 板蓝根 200 大黄 60 广藿香 60
绵马贯众 300 红景天 60 薄荷脑 9 麻黄 60 苦杏仁 100
鱼腥草 200 甘草 100 石膏 200。
5.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于该中药组合物由下列重量份的原料药制成:
连翘 300 金银花 200 板蓝根 300 大黄 60 广藿香 100
绵马贯众 200 红景天 60 薄荷脑 5 麻黄 100 苦杏仁 60
鱼腥草 300 甘草 60 石膏 300。
6.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于该中药组合物由下列重量份的原料药制成:
连翘 255 金银花 255 板蓝根 255 大黄 51 广藿香 85
绵马贯众 255 红景天 85 薄荷脑 7.5 麻黄 85 苦杏仁 85
鱼腥草 255 甘草 85 石膏 255。
7.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于所述中药组合物剂型为胶囊剂、片剂或丸剂。
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