CN1907340B - 一种测定肾石通制剂中槲皮素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定“肾石通”(《中华人民共和国***标准》中药成方制剂第02册所载品种“肾石通冲剂”)制剂中金钱草、萹蓄含量的方法及其测定的标准，属于中药制剂领域。本发明测定方法及其测定的标准是通过采用高效液相色谱法测定“肾石通”制剂中槲皮素含量实现；其中检测标准为每次所制剂含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计不得少于0.2mg。本发明测定方法使“肾石通”制剂质量更稳定、可控。
Description
技术领域 制药技术
背景技术 “肾石通冲剂”为临床治疗肾结石、输尿管结石、膀胱结石、尿道结石的常用中成药，但其制剂质量标准中无含量测定，制剂质量可控性差，采用高效液相法可以更好的控制制剂质量，以确保临床用药的安全性、有效性、可控性。
发明内容 “肾石通”处方来源于《中华人民共和国***标准》中药成方制剂第02册WS3-B-0304-90所载品种“肾石通冲剂”，其制剂常用的剂型有冲剂(颗粒、泡腾颗粒)、硬(软)胶囊剂、(微)丸剂、片剂(还包括咀嚼片、***片、泡腾片、分散片)等，处方中金钱草、萹蓄含主要成分为槲皮素，因此须对制剂中槲皮素的含量进行测定。以“肾石通丸”为样品，建立高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定“肾石通”制剂中槲皮素含量。
“肾石通冲剂”处方：
金钱草100g 王不留行(炒)100g 萹蓄60g
延胡索(醋制)30g 鸡内金(烫)40g 丹参40g
木香20g 瞿麦50g 牛膝30g
海金砂40g
槲皮素 照高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定。
金钱草为方中主药，含有槲皮素化合物，另方中萹蓄亦有槲皮素化合物，因此需对制剂中槲皮素含量进行测定，以控制制剂质量。
槲皮素对照品(供含量测定用)：由中国药品生物制品检定所提供，批号：081-9304。
1.游离槲皮素含量测定
色谱条件：日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪，Diamonsil C18(250×4.6mm)。
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相，检测波长370nm，理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品5mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含槲皮素0.02mg)。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取细粉约3g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液40ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
阴性样品溶液制备：取缺金钱草、萹蓄样品，研细，同法制成阴性样品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
在以上色谱条件下，取对照品溶液和供试品溶液进样，记录色谱图，结果见表1。
表1游离槲皮素含量测定 
由表1可得，三批制剂中游离槲皮素含量甚少。
2.结合槲皮素含量测定
(1)色谱条件：日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪，Diamonsil C18(250×4.6mm)。
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相，检测波长370nm，理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品5mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含槲皮素0.05mg)。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取细粉约3g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
阴性样品溶液制备：取缺金钱草、萹蓄样品，研细，同法制成阴性样品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
在以上条件下，取对照品溶液、供试品溶液、甲醇溶剂、辅料和阴性样品溶液进样，记录色谱图，从色谱图可得，槲皮素和样品中的其它组分可以完全分离，且甲醇溶剂无干扰，阴性样品溶液干扰较少(＜5％)。
(2)色谱***适用性试验
柱效：按槲皮素峰计算，色谱***的理论板数为5000。
分离度：测得槲皮素与其前相邻色谱峰的分离度为1.86，槲皮素与相邻的色谱峰可以完全分离(图15-12)。
拖尾因子：测得槲皮素的拖尾因子为1.02，峰形对称。
(3)供试品溶液制备
①提取溶剂选择：
供试品溶液制备：取样品(030401)，研细，取细粉约3g(5份)，精密称定，置100ml锥形瓶中，加分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、水溶液30ml和盐酸各1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
对照品溶液制备：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml约含0.02mg的溶液。
在选定的色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样，记录色谱图，计算含量，结果见表2。
表2 提取溶剂选择 
由表2可得，甲醇提取含量最高，故以甲醇为提取溶剂。
②回流(水解)时间考察：
供试品溶液制备：取样品(030401)，研细，取细粉约3g(5份)，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上，分别回流0.5、1.0、1.5、2.0、3.0小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。在选定的色谱条件下，取供试品溶液各10μl进样，记录色谱图，计算含量，结果见表3。
表3 提取时间考察 
由表3可得，回流(水解)提取1小时后，含量不再变化，故回流(水解)提取时间确定为1小时。
③加酸量考察：
供试品溶液制备：取样品(030401)，研细，取细粉约3g(4份)，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇30ml，分别加盐酸1.0、2.0、3.0、4.0ml，置85℃水浴上，分别回流1.0小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。在选定的色谱条件下，取供试品溶液各10μl进样，记录色谱图，计算含量，结果见表4。
表4 加酸量考察 
由表4可得，加酸量1～4.0ml，槲皮素无明显差别，故加酸量确定为1ml。
(4)检测波长
将阿魏酸对照品溶液于200～400nm范围内进行光谱扫描，在371nm处有最大吸收峰，参照《中华人民共和国***药品标准中药成方制剂》第13册“肝苏颗粒”(第87页)槲 皮素含量测定检测波长370nm，故选370nm作为检测波长。
(5)精密度
对照品溶液制备：精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.02mg的溶液。
供试品溶液制备：取本品适量，研细，取细粉约3g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
分别取对照品溶液和供试品溶液各10μl，连续进样5次，记录色谱图，测定峰面积，计算平均峰面积值和RSD，结果见表5。
表5 精密度考察 
结果表明精密度良好。
(6)稳定性
①日内稳定性：
对照品溶液制备：同精密度项下
供试品溶液制备：同精密度项下
在选定色谱条件下，分别于0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样，记录色谱图，测定峰面积值，计算平均峰面积和RSD，结果见表6。
表6 日内稳定性考察 
②日间稳定性：
在选定色谱条件下，分别于0天、1天、2天、3天、15天，取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样，记录色谱图，测定峰面积值，计算平均峰面积和RSD，结果见表7。
表7 日间稳定性考察 
结果表6、7可得，对照品溶液1天内稳定，供试品溶液在5天内稳定。
(7)重复性
对照品溶液制备：同精密度项下。
供试品溶液制备：同精密度项下，共5份。
取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样，测定峰面积值，用外标法计算含量，结果见表8。
表8 重复性测定结果 
重复性RSD为1.37％，表明重复性良好。
(8)线性和范围
对照品溶液制备：精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解并分别稀释制成每1ml含0.00194mg、0.0194mg、0.194mg的对照品溶液。
分别取对照品溶液0.00194mg/ml进样3μl，对照品溶液0.0194mg/ml进样1μl、3μl、6μl、9μl，对照品溶液0.0194mg/ml进3μl、6μl，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积(Y)对进样量(X，μg)回归，结果见表9。
表9 线性和范围测定结果 
回归方程：Y＝-59199.57+13917179.62X r＝0.9996
以上结果表明，进样量在0.00582～1.1640ug范围内，峰面积与进样量呈良好线性关系。
(9)加样回收试验
对照品溶液制备：精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解并分别稀释制成每1ml含0.02mg的对照品溶液。
供试品溶液制备：精称取已知含量样品(030401)，分别准确加入对照品溶液(1号、2号、3号样品加槲皮素对照品0.2mg/ml×2ml，4号、5号、6号样品加槲皮素对照品0.2mg/ml×2.5ml，7号、8号、9号样品加槲皮素对照品0.2mg/ml×3ml)适量，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
在选定色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液各10μl进样，测定峰面积值，按外标法计算含量，并计算加样回收率，测定结果见表10。
表10 回收率测定结果 
加样平均回收率为97.25％，RSD为1.44％。
(10)样品测定
仪器：日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相，检测波长370nm，理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解并分别稀释制成每1ml含0.02mg的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取细粉约3g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
按以上方法测10批样品中槲皮素含量见表11。
表11 样品含量测定
由表11可得，10批样品“肾石通微丸”含量均高于0.36mg/g，故规定本品每袋含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计，不得少于0.36mg。
具体实施方式
1、“肾石通冲剂”中槲皮素含量测定
槲皮素 照高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定。
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相，检测波长370nm，理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml约含0.02mg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取细粉约3g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计，不得少于0.36mg。
2、“肾石通微丸”中槲皮素含量测定
槲皮素 照高效液相色谱法(中国药典2000年一部附录VI D)测定。
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相，检测波长370nm，理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml约含0.02mg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取细粉约3g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸2ml于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过微孔滤膜(0.45um)，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含金钱草、萹蓄以槲皮素(C15O10H7)计，不得少于0.36mg。
Claims (1)
1.一种测定肾石通制剂中槲皮素含量的方法，其特征在于：采用高效液相色谱法测定，其中：
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相，检测波长370nm，理论板数以槲皮素峰计算应不低于2500；
对照品溶液的制备：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含0.02mg的溶液；
供试品溶液的制备：取肾石通制剂，研细，取细粉约3g，精密称定，置100ml锥形瓶中，加甲醇溶液30ml和盐酸1ml，置85℃水浴上回流1小时，冷却至室温，转入50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，过0.45μm微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
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