CN104335898A

CN104335898A - 一种红星茵芋离体快速繁殖的方法

Info

Publication number: CN104335898A
Application number: CN201410050810.8A
Authority: CN
Inventors: 李其友; 阳永学; 曾红霞; 肖康飞; 祝菊红; 程维舜; 张娜; 杨皓琼; 毕秋荣
Original assignee: WUHAN INSTITUTE OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: WUHAN INSTITUTE OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2034-02-14
Also published as: CN104335898B

Abstract

本发明公开了一种红星茵芋离体快速繁殖的方法，其步骤：（1）外植体选择和消毒，以红星茵芋成熟种子为外植体，用70%酒精消毒后，再用浓度为0.1%HgCl₂消毒，用无菌水冲洗；（2）种子萌发，将消毒好的种子接入萌发培养基中，经过培养，种子萌发长出子叶与真叶；（3）丛芽诱导与增殖，切取带真叶的顶芽，接种到增殖培养基上，进行继代培养，使丛芽不断增殖；（4）生根培养，将扩繁得到的试管苗，接种到生根培养基中，幼苗经过培养分化出白色不定根；（5）驯化移栽。该方法简便易行，繁殖系数大，生产成本低，周期短，平均繁殖系数达4.5，生根率90％，移栽成活率95％，操作简便，繁殖系数大，为红星茵芋种苗产业化生产奠定了基础。

Description

一种红星茵芋离体快速繁殖的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，更具体涉及一种红星茵芋离体快速繁殖的方法。

背景技术

红星茵芋(Skimmia japonica Rubella),又名红玉珠，属芸香科茵芋属植物，是近年颇受欢迎的高档观赏花卉之一。红星茵芋叶片翠绿光亮，初夏的红褐色花蕾玲珑可爱，花香浓郁；秋冬季节红星满枝，鲜艳欲滴，挂果期可长达半年以上，是观叶、观花、观果俱佳的优良花卉品种（吴棣飞，年宵观果佳卉一红星菌芋。中国花卉盆景，2007,(2):5-5）。

红星茵芋可播种和扦插进行繁殖，采用种子繁殖，后代会出现分离，不能保持母株的优良特性，而且从播种至开花所需周期较长，现在生产上很少采用。扦插繁殖成活率不到20%，而且需要大量的母本，远远不能满足生产需求，而且长期营养繁殖易出现品种退化现象。若从荷兰进口，高10cm小苗每株10元以上（孟艳琼，李仁杰，伊兴凯，梅俊，李静雅，红星茵芋离体花梗腋芽诱导及丛生芽增殖研究。中国农学通报，2007,23（11）：81-85），种苗价格昂贵，导致企业生产成本增加。采用植物组织培养技术，工厂化生产红星茵芋种苗，不仅可以克服播种和扦插带来的品种混杂、种性退化等问题，而且可以不受自然气候的影响全年生长优质种苗，为红星茵芋的育种研究提供材料和技术支持，对推动红星茵芋产业的快速发展具有重要意义。

目前，关于红星茵芋的组培快繁仅有一篇报道，孟艳琼等（2007）采用红星茵芋的花梗为外植体，在MS+2,4-D0.3mg/L+IAA0.2mg/L+BA3.0mg/L+KT2.0mg/L培养基诱导花梗腋芽萌发，诱导率可达91.1%。在MS+NAA0.8mg/L+BA3.0mg/L+KT2.0mg/L上继代增殖，增殖系数可达8.73（孟艳琼，李仁杰，伊兴凯，梅俊，李静雅，红星茵芋离体花梗腋芽诱导及丛生芽增殖研究。中国农学通报，2007,23（11）：81-85）。由于红星茵芋开花受时间限制，采用花梗取材有限，且实验中没有进行生根培养方面的试验，在实际工厂育苗中受到限制。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种红星茵芋离体快速繁殖的方法，该方法简便易行，繁殖系数大，生产成本低，周期短，平均繁殖系数达4.5，繁殖周期20～25d，生根率90％左右，移栽成活率95％。采用种子无菌萌发的芽苗，在人为可控条件下进行组培苗的工厂化生产，不受自然条件的影响，操作简便，繁殖系数高，生产成本低，周期短，为红星茵芋种苗产业化生产奠定了基础。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

（1）外植体选择和消毒：

以红星茵芋成熟种子为外植体，流水下冲洗30min，将其用70%（体积比）酒精消毒后，再用浓度为0.1%（质量体积比）氯化汞（HgCl₂）消毒8～10min，然后用无菌水冲洗4次。

（2）种子萌发：

将消毒好的种子接入萌发培养基中，在温度为24－26℃、湿度为35－45%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14～16h，经过25～30d培养，种子萌发长出子叶，经过15～20d后，长出1～2片真叶。

所述的种子萌发培养基包括MS基本培养基+0.5mg/L GA₃+蔗糖30g/L，PH值为5.8～6.0。

（3）丛芽诱导与增殖：

切取1～2片真叶及以上的顶芽，接种到丛芽诱导培养基上，在温度为24－26℃、湿度为35－45%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14～16h，经过25～30d培养，获得丛生芽。挑选正常发育的丛生茎芽，每隔20～25d切割成1-2个茎芽进行继代培养，平均每次继代1瓶可转接4-5瓶，使丛芽不断增殖。

所述的丛芽诱导和增殖培养基包括MS基本培养基+1.0～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+0.5mg/L GA₃+蔗糖30g/L，PH值为5.8～6.0。

（4）生根培养：

将株高3～5cm长的试管苗，接种到生根培养基中，在温度为24－26℃、湿度为35－45%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14-16h，经过14－16d幼苗就会分化出4～6条白色不定根。

所述的生根培养基包括1/2MS+0.5～1.0mg/L IBA+蔗糖30g/L，PH值为5.8～6.0。

（5）驯化移栽：

在温室内，生根培养25－30d后，将生长健壮，具有3条以上新根的红星茵芋组培苗进行驯化移栽，移栽用的混合基质配方为由泥炭：珍珠岩：蛭石=3:1：1（V/V）。移栽后，用喷雾器喷水，使根系和基质紧密接触，然后遮阴一周后移入全光照下。温室条件为20℃～25℃，光照14～16h，光照强度为2000μmol m^-2s^-1。

本发明以种子无菌萌发的顶芽为外植体，建立红星茵芋组培快繁体系，增值率较高（4～5倍），增殖稳定，根系健壮，移栽成活率较高，在红星茵芋种苗工厂化繁育中具有重要的应用价值。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明与现有技术相比，种子取材简单方便，数量大，容易萌发。

2、本发明得到丛芽繁殖率高，每继代一次扩大4～5倍。

3、本发明建立红星茵芋组培快繁技术，为后续红星茵芋遗传育种和转基因工作打下良好基础。

附图说明

图1为一种红星茵芋优良盆栽植株示意图。

红色果实去皮后的成熟种子用于实验，白色箭头所指为红色果实。

图2为一种种子萌发长出子叶示意图。

图3为一种种子萌发长出真叶后示意图。

幼苗长出真叶，用于增殖的顶芽。

图4为一种顶芽增殖后的丛生芽示意图。

图5为一种试管苗生根培养示意图。

图6为一种正常生根的试管苗示意图。

图7为一种生根移栽后正常生长的红星茵芋幼苗示意图。

具体实施方法

为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例和附图来进一步说明本发明的实质，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

一种红星茵芋离体快速繁殖的方法，其步骤是：

1、培养基配制：

1.1基本培养基配制：

所述的培养基为MS，分别取大量元素母液100ml；MS微量元素母液10ml；MS有机母液10ml；MS铁盐10ml；肌醇10ml；母液成分如下表1：

表1MS培养基母液配方

1.2生长激素配制：

将所需的细胞***素6-BA（6-苄基腺嘌呤）\生长素NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、GA₃(赤霉素)用0.1mol/L的NaOH或酒精溶解，再用蒸溜水稀释后分别配制成0.5mg/ml的母液，装入容量瓶中，置于冰箱保存。

1.3培养基配制：

所有培养基均添加琼脂粉7g/L和蔗糖30g/L及不同浓度的植物生长调节剂，将配制好的培养基用0.1mol/L的NaOH调pH值至6.0左右，除GA₃外需过滤灭菌外，其他的附加物都在高压灭菌前加入，压力1.1kg/cm^-2并于121℃时计时20min。

2、植株种子选择与消毒：

于12月份从武汉维尔福生物科技股份有限公司购买红星茵芋优良盆栽植株（图1），取红色种子，去皮洗净后，去壳，流水下冲洗30min，将其用70%（体积比）酒精消毒后，再用浓度为0.1%（质量体积比）HgCl₂消毒8～10min，用无菌水冲洗4次。

3、种子萌发：

将消毒好的种子接入萌发培养基中，在温度为25℃、湿度为40%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14～16h，经过25～30d培养，种子萌发长出子叶（图2），经过10～15d后，长出1～2片真叶（图3）。

4、丛芽诱导与增殖：

切取1～2片真叶及以上的顶芽，接种到丛芽诱导培养基上，在温度为25℃、湿度为40%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14～16h，经过25～30d培养，获得丛生芽（图4），增殖系数为4～6。挑选正常发育的丛生茎芽，每隔20～25d切割成1～2个茎芽进行继代培养，平均每次继代1瓶可转接4～5瓶，使丛芽不断增殖。

5、生根培养：

将株高2～3cm长的试管苗，接种到生根培养基中，在温度为25℃，湿度为40%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14～16h，14～16d幼苗开始生根，20d后每个小苗会分化出4～6条，长度在3cm以上的白色不定根，生根率在90%以上（图5，图6）。

6、驯化移栽：

当不定根长至4cm以上时，将具有3条以上新根的红星茵芋试管苗在室内自然光照下部开盖进行炼苗，3d后进行移栽。移栽后，用喷雾器喷水，使根系和基质紧密接触，然后遮阴一周后移入全光照下，植株生长正常（图7）。移栽用的基质为泥炭：珍珠岩：蛭石=3:1：1（V/V）混合基质。温度条件为20℃～25℃，光照14～16h，光照强度为3000～5000μmol m^-2s^-1。

通过本发明平均繁殖系数达4.5，繁殖周期20～25d，生根率90％左右，移栽成活率95％。采用种子无菌萌发的芽苗，在人为可控条件下进行组培苗的工厂化生产，不受自然条件的影响，操作简便，繁殖系数大，生产成本低，周期短，为红星茵芋种苗产业化生产奠定了基础。

Claims

1.一种红星茵芋离体快速繁殖的方法，其步骤是：

（1）外植体选择和消毒：

以红星茵芋成熟种子为外植体，流水下冲洗30min，将其用70%体积比酒精消毒后，再用浓度为0.1%质量体积比氯化汞消毒8～10min，然后用无菌水冲洗4 次；

（2）种子萌发：

将消毒的种子接入萌发培养基中，在温度为24－26℃、湿度为35－45%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14～16h，经过25～30d 培养，种子萌发长出子叶，经过15～20d后，长出1～2片真叶；

所述的种子萌发培养基包括MS 基本培养基+ 0.5mg/L GA₃ +蔗糖30g/L，PH值为5.8～6.0；

（3）丛芽诱导与增殖：

切取1～2片真叶的顶芽，接种到丛芽诱导培养基上，在温度为24－26℃、湿度为35－45%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14～16h，经过25～30d 培养，获得丛生芽，挑选丛生茎芽，每隔20～25d 切割成1-2个茎芽进行继代培养，平均每次继代1瓶转接4-5瓶，使丛芽不断增殖；

所述的丛芽诱导和增殖培养基包括MS 基本培养基+1.0～1.5mg/L 6-BA +0.1～0.3 mg/L NAA +0.5mg/L GA₃+蔗糖30g/L，PH值为5.8～6.0；

（4）生根培养：

将株高3～5cm 长的试管苗，接种到生根培养基中，在温度为24－26℃、湿度为35－45%，光照强度3000～5000μmol m^-2s^-1，每天光照14-16h，经过14－16d幼苗就会分化出4～6条白色不定根；

所述的生根培养基包括1/2MS+0.5～1.0mg/L IBA +蔗糖30g/L，PH值为5.8～6.0；

（5）驯化移栽：

在温室内，生根培养25－30d 后，将3条以上新根的红星茵芋组培苗进行驯化移栽，移栽用的混合基质配方为由泥炭：珍珠岩：蛭石=3:1：1V/V，移栽后，用喷雾器喷水，使根系和基质接触，然后遮阴一周后移入全光照下，温室条件为20℃～25℃，光照14～16h，光照强度为2000μmol m^-2s^-1。