CN104330575B - 一种肌钙蛋白i检测试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肌钙蛋白I检测试剂及其制备方法,其由试剂一和试剂二配合而成,其中,所述试剂一和试剂二的体积比为5∶1;所述试剂一中包括:20~50mmol/L的缓冲液、2%w/v的促凝剂、2%w/v的BSA、0.1%~0.5%w/v的防腐剂;所述试剂二中包括:0.1%~0.5%w/v标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒、2%~5%w/v的稳定剂、20~50mmol/L的缓冲液、0.1%~0.5%w/v的防腐剂;所述标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒的直径为60nm~90nm。本发明具有可操作性强、高分析灵敏度、高线性和快速简单方便等诸多优点。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种肌钙蛋白I检测试剂及其制备方法,具体涉及一种用于检测血清或血浆中cTnI的匀相溶胶颗粒型cTnI免疫测定试剂及其制备方法,属于医疗器械中的体外诊断领域。
【背景技术】
肌钙蛋白I分子量为23000,是肌动蛋白抑制亚基,它有3种亚型:快骨骼肌亚型、慢骨骼肌亚型和心肌亚型。这3种TnI亚型分别源于3种不同的基因。心肌亚型(cTnI)相对两种骨骼肌亚型约有40%的不同源性AMI后cTnI的释放形式(游离形式还是与其他肌钙蛋白结合成复合物,氧化形式还是还原形式)迄今为止还不完全清楚。
对心肌损伤的诊断在诸多诊断急性心肌梗死(AMI)的临床生化指标中,CK-MB(血清心肌酶)曾一度被认为是诊断AMI的“金标准”,已广泛应用多年。随着对心肌肌钙蛋白(cTn)深入研究,无论是对心肌的特异性还是诊断敏感性,CK-MB的地位都受到了严重挑战。cTn被认为是目前最好的确定标志物,正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断“金标准”。
患有各种冠状动脉疾患的病人必然会发生心肌细胞损伤,有些病人的临床表现可能不完全符合WHO关于AMI诊断标准(不稳定心绞痛就是其中之一),但却伴有某些心肌损伤标志物(如cTnT等)升高,从而导致细胞内的组成成分渗漏入外周血循环。这使得心肌细胞损伤标志物的检测成为可能。cTnT和cTnI在AMI后(3~6h)血中浓度很快升高,和CK-MB(3~8h)相当或稍早,它们测定的特异性和灵敏度明显高于CK-MB。cTn具有相当长的诊断窗口期(cTnI7~9天,cTnT更长)。cTn对急性胸痛病人(无论有无骨骼肌损伤)的诊断均优于CK-MB。研究表明:在对AMI的诊断方面cTnI和cTnT无显著差异,都能鉴别出CK-MB所不能检测出的心肌损伤。相对cTnT而言,cTnI显示出较低的初始灵敏性和较高的特异性。就上升的相对值来说,cTnT比cTnI高;在不稳定心绞痛病人中cTnT上升的频度比cTnI高。在AMI后30天死亡率的预报方面,cTnT优于cTnI。
无论是不稳定心绞痛还是无Q波的心肌梗死,最初24小时的cTnT最具预后价值。对不稳定冠状动脉疾患病人的随访发现,cTnT和运动试验两项都正常者,死亡或AMI的仅1%;若异常,死亡或AMI可达50%。对急性冠状动脉疾患(包括心肌梗死)病人的随访研究发现,cTnT小于0.1μg/L的病人的死亡率仅4%,相比而言,大于0.1μg/L的病人的死亡率则大3倍,发生休克的百分率大3倍,发生充血性心功能衰竭的百分率也增加1倍。对cTnI的观察研究得到了类似的结果。不稳定冠状动脉疾患病人中,cTnI大于0.1μg/L的病人死亡率较cTnI小于0.1μg/L的病人的死亡率大3倍多。因此,任何急性冠状动脉疾患病人同时测得cTn增高,应视为高危险性。
【发明内容】
为解决上述问题,本发明的目的在于提供一种分析灵敏度高,检测线性范围大,使用方便且检测快速的基于胶体金匀相免疫法的肌钙蛋白I检测试剂。
本发明的第二目的在于提供一种肌钙蛋白I检测试剂的制备方法。
为实现上述第一目的,本发明采取的技术方案为:一种肌钙蛋白I检测试剂,其由试剂一和试剂二配合而成,其中,所述试剂一和试剂二的体积比为5∶1;所述试剂I中包括:20~50mmol/L的缓冲液、2%w/v的促凝剂、2%w/v的BSA、0.1%~0.5%w/v的防腐剂;所述试剂二中包括:0.1%~0.5%w/v标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒、2%~5%w/v的稳定剂、20~50mmol/L的缓冲液、0.1%~0.5%w/v的防腐剂;所述标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒的直径为60nm~90nm。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂进一步为:所述试剂一和试剂二中的缓冲液具体为含有0.5%~5.0%w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂进一步为:所述试剂一、试剂二的pH值为7.0~9.0。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂进一步为:所述BSA浓度为1%w/v,试剂一、试剂二的pH值为8.0±0.2。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂进一步为:所述试剂一中的促凝剂为PEG6000或Brij-35中的至少任一种。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂进一步为:所述试剂二中的胶体金颗粒直径为75nm~85nm,颗粒含量为0.08~0.8mg/mL。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂进一步为:所述胶体金颗粒含量为0.4mg/mL。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂还为:所述标记有抗人cTnI抗体为具有不同免疫活性位点多个克隆株单抗的混合物。
为实现上述第二目的,本发明采取的技术方案为:一种肌钙蛋白I检测试剂的制备方法,其包括如下步骤:
1),将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液,制得试剂一;
2),将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1∶1加热煮沸制得胶体金溶液;将cTnI抗体加入到胶体金溶液中,并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂,制得试剂二;
3),将试剂一和试剂二按照5∶1的体积比配合使用,即得肌钙蛋白I检测试剂。
本发明的肌钙蛋白I检测试剂的制备方法进一步为:所述步骤2)中,配制氯金酸与柠檬酸三钠溶液时,使用0.2μm滤膜过滤。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.本发明利用胶体金匀相颗粒特性,将特定的cTnI抗体标记于胶体金颗粒表面,当检测***或检测环境中存在cTnI时,胶体金颗粒表面的抗体即将与之对应的抗原捕获,并形成抗原-抗体复合物,进而造成局部胶体金颗粒的聚合或堆积,使胶体金匀相试剂透光光谱由红色向蓝色光谱移动,这种移动主要反应为540nm处吸光度的降低和660nm处吸光度的升高,从而达到定量检测检体中cTnI抗原的目的,同时避免了同类检测项目乳胶增强免疫比浊法试剂在反应后产生胶乳微球交联物吸附比色杯不易清洗的缺点。
2.本发明可用于检测血清或血浆中cTnI含量,适用于临床检测过程中使用的分光光度计、半自动生化分析仪和全自动生化分析仪等仪器。
3.本发明检测cTnI的灵敏度可以达到0.1ng/mL,检测线性范围达0.1~30ng/mL,具有高分析灵敏度,高特异性等特点。
【附图说明】
图1是为不同颗粒大小的胶体金标记物校准曲线图。
图2是本发明试剂与市售相关试剂分析线性比较图。
【具体实施方式】
首先,需要说明的是,本发明中涉及的重量体积比记为“w/v”,单位为“g/mL”。
本发明为一种肌钙蛋白I检测试剂,其由试剂一和试剂二配合而成,其中,所述试剂一和试剂二的体积比为5∶1。
所述试剂一中包括:20~50mmol/L的缓冲液、2%w/v的促凝剂、2%w/v的BSA、0.1%~0.5%w/v的防腐剂。其中,所述试剂一的缓冲液具体为含有0.5%~5.0%w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。所述试剂一的pH值为7.0~9.0,优选的pH值为8.0±0.2。所述BSA浓度为2%w/v。所述促凝剂为PEG6000或Brij-35中的至少任一种。
所述试剂二中包括:0.1%~0.5%w/v标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒、2%~5%w/v的稳定剂、20~50mmol/L的缓冲液、0.1%~0.5%w/v的防腐剂。其中,所述标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒的直径为60nm~90nm。所述试剂二的缓冲液具体为含有0.5%~5.0%w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。所述试剂二的pH值为7.0~9.0,优选的pH值为8.0±0.2。优先的胶体金颗粒直径为75nm~85nm,颗粒不宜过小,否则会造成反应速度变慢;颗粒也不宜过大,会造成标记物聚集沉降进一步影响测定结果。所述胶体金颗粒颗粒含量为0.08~0.8mg/mL,优先的颗粒含量为0.4mg/mL。所述标记有抗人cTnI抗体为多抗或具有不同免疫活性位点多个克隆株单抗的混合物。
所述肌钙蛋白I检测试剂的制备方法如下:
1),将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液,制得试剂一;
2),将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1∶1加热煮沸制得胶体金溶液;将cTnI抗体加入到胶体金溶液中,并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂,制得试剂二;其中,配置氯金酸与柠檬酸三钠溶液时,使用0.2μm滤膜过滤;
3),将试剂一和试剂二按照5∶1的体积比配合使用,即得肌钙蛋白I检测试剂。
以下为本发明的肌钙蛋白I检测试剂的具体实施例。
实施例一
胶体金颗粒的制备(以下所有操作需在高洁净度无尘空间内完成)
1)准备工作:所有用到的玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净,然后用硅化试剂浸泡过夜,对所以制金器皿的内表面做硅化处理,再用蒸馏水冲洗干净,备用;
2)配制1%(w/v)氯金酸和1%(w/v)柠檬酸钠溶液,使用0.2μm滤膜过滤;
3)在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚,加入1000ml超纯水;
4)加入一定体积浓度为1%(w/v)氯金酸,600rpm左右高速搅拌,并加热至溶液沸腾,然后迅速将一定体积浓度为1%柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中,保持加热和剧烈搅拌10min,溶液颜色先变黑色,然后逐渐变***;
5)冷却:关闭加热开关并继续搅拌10min,然后停止搅拌冷却至室温,用超纯水恢复到原体积;
6)不同粒径的胶体金颗粒可根据加入氯金酸和柠檬酸钠的比例进行控制,最终以电子粒度仪检测10mL胶体金溶液,以粒度仪显示结果为金颗粒的粒径结果使用。
实施例二
试剂一的制备
试剂一的配方如下:Tris-Hcl缓冲液、0.9%NaCl(w/v)、2%BSA(w/v)、0.1%NaN3(w/v)、0.05%Tween20(w/v),可根据Tris的质量控制缓冲液的浓度,根据HCl的使用量来调整缓冲液的pH值。
实施例三
标记物的制备
1)取1毫升制备好的胶体金液体加入到1.5毫升的离心管内;
2)用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH8.0~10.0之间;
3)将一定量抗体到上述的离心管中,震荡30分钟;
4)向上述溶液中加入100uL 10%的NaCl溶液,混匀,静置2h后观察各管是否有颜色改变或者沉淀析出,当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求量;
5)将500ml胶体金溶液加入三角瓶中,边搅拌边用10%的碳酸钾调整溶液的pH值至8.0~10.0,并用精密pH试纸检测调整过程;
6)按所述的方法将确定的抗体用量加入到上述溶液中,继续搅拌30分钟,超滤收集标记物。
实施例四
试剂二的制备
试剂二缓冲液中溶解的生物大分子和化学物质为Tris-Hcl缓冲液、0.9%(w/v)NaCl、2%(w/v)BSA、0.1%(w/v)NaN3、0.05%(w/v)Tween20,5%(w/v)蔗糖或海藻糖,2%(w/v)甘氨酸,2%(w/v)PEG6000,本部分缓冲液配制同试剂一保持一致,再次不再赘述。
将配制好的试剂儿缓冲溶液同超滤收集得到的标记物相混合,最终控制标记物金颗粒浓度为0.4mg/mL即可。
实施例五
校准品的制备
将市售的人源cTnI蛋白纯品用2%(w/v)BSA溶液溶解或稀释,制得1200ng/mL校准品,使用时根据所需要浓度梯度用0.9%(w/v)NaCl稀释即可。
实施例六
不同颗粒度胶体金颗粒的选择
根据以上实施例中胶体金颗粒的制备不同粒径的胶体金颗粒完成标记制得试剂二,选择同一缓冲液浓度和pH进行实验。
实验方法:
1、将校准品、试剂一和试剂二按照体积比为3∶250∶50依次混合,37℃下充分反应。
2、在7180全自动生化分析仪上记录540±10nm处吸光度值。
3、比较不同颗粒大小胶体金标记物校准曲线最终确定最佳颗粒大小。
根据校准曲线判断选择75nm~85nm范围的金颗粒较为合适,大颗粒分析灵敏度较好但是易产生HOOK效应不利于检测,而小颗粒在高值区的分析能力却明显不如75nm~85nm颗粒。
附图一为本发明试剂与市售相关项目试剂分析线性比较图。
试验方法:以一临床高值样本为例,将其倍比稀释如下梯度,分别用对照试剂和本发明试剂检测,并拟合其线性,结果如附图二:
表1 线性数据结果
本发明试剂线性y=0.9637x-0.623 r=0.9900
对照方法试剂线性y=0.7416x-5.8988 r=0.8362
从相关数据统计可以看出,本发明试剂线性结果明显优于对照试剂线性测试结果。
实施例七
(4)干扰试验
在正常人血清中各自添加一定量的胆红素、牛血红蛋白、脂肪乳剂和类风湿因子,先测定样本初始值,之后根据下表干扰物质浓度添加干扰物质在样本中,每次只添加一种干扰物,使其达下表中所示的浓度,同时根据测量结果和体积变化反算稀释倍数计算测量后的结果,结果见表2。
表2 抗干扰检测结果
根据以上数据表明,本发明试剂在此干扰物存在范围内满足临床检测要求,说明本发明试剂具有良好的抗干扰性能。
以上的具体实施方式仅为本创作的较佳实施例,并不用以限制本创作,凡在本创作的精神及原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本创作的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种肌钙蛋白I检测试剂的制备方法,其特征在于:所述肌钙蛋白I检测试剂由试剂一和试剂二配合而成,其中,所述试剂一和试剂二的体积比为5∶1;所述试剂I中包括:20~50mmol/L的缓冲液、2%w/v的促凝剂、2%w/v的BSA、0.1%~0.5%w/v的防腐剂;所述试剂二中包括:0.1%~0.5%w/v标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒、2%~5%w/v的稳定剂、20~50mmol/L的缓冲液、0.1%~0.5%w/v的防腐剂;所述标记有抗人cTnI抗体的胶体金颗粒的直径为75nm~85nm,颗粒含量为0.4mg/mL;所述标记有抗人cTnI抗体为具有不同免疫活性位点多个克隆株单抗的混合物;
所述制备方法包括如下步骤:
1)准备工作:所有用到的玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净,然后用硅化试剂浸泡过夜,对所以制金器皿的内表面做硅化处理,再用蒸馏水冲洗干净,备用;
2)配制1%(w/v)氯金酸和1%(w/v)柠檬酸钠溶液,使用0.2μm滤膜过滤;
3)在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚,加入1000ml超纯水;
4)加入一定体积浓度为1%(w/v)氯金酸,600rpm高速搅拌,并加热至溶液沸腾,然后迅速将一定体积浓度为1%柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中,保持加热和剧烈搅拌10min,溶液颜色先变黑色,然后逐渐变***;
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6)不同粒径的胶体金颗粒可根据加入氯金酸和柠檬酸钠的比例进行控制,最终以电子粒度仪检测10mL胶体金溶液,以粒度仪显示结果为金颗粒的粒径结果使用。
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