CN104321355A - 用于测定应用的聚合物支架 - Google Patents

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CN104321355A CN201380020388.5A CN201380020388A CN104321355A CN 104321355 A CN104321355 A CN 104321355A CN 201380020388 A CN201380020388 A CN 201380020388A CN 104321355 A CN104321355 A CN 104321355A
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奥尔德里奇·N·K·劳
罗伯特·G·伊森
克里斯蒂安·斯卡布
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Abstract

提供了与固体支持物结合的反应性聚合物，修饰的固体支持物和反应性聚合物。还提供了包含上述的固体支持物，其用作用于检测和/或表征诸如生物分子的分析物的分析装置。

Description

用于测定应用的聚合物支架
政府利益声明
本文所述工作的部分资金基于第HSHQDC-10-C-00053和HSHQDC-11-C-00089号合同由美国国土***提供。美国政府具有本发明的某些权利。
相关申请的引用
本发明基于35U.S.C.§119(e)要求于2012年2月17日提交的第61/600,569号美国临时专利申请的权益；其申请的全部公开内容通过引入整体并入本文。
背景
发明领域
本发明一般涉及聚合物、包含该聚合物的固体支持物及其使用方法。
相关技术描述
生物测定用于探测分析物在生物样品中的存在和/或数量。在基于表面的测定中，在固体支持物或基底上捕获和检测分析物质。基于表面的测定的实例是DNA微阵列。DNA微阵列的应用已广泛用于基因表达和基因分型的研究中，这归因于同时监测大量基因的能力(Schena等人,Science 270:467-470(1995)；Pollack et al.,Nat.Genet.23:41-46(1999))。为了促进阵列形式(array format)的多种多样的生物测定，也可以使用其他结合部分如碳水化合物、抗体、蛋白、半抗原或适体来制造阵列。
用于生物测定应用的有效官能化材料必须具有充足的容量来固定足量的来自相关样品的分析物，从而在进行检测(例如聚合酶链反应)时提供适当的信号。合适的官能化材料还必须提供高度可再现表面，从而有利地用于剖析(profiling)实验，特别是在以下测定形式中，即，其中样品和对照必须在与其连接的不同支持表面(例如不同的支持物或在相同支持物上的不同位置)上进行分析。例如，未基于高度可再现表面化学的支持物当进行测定(例如剖析比较)时可产生显著的误差，这归因于支持物之间或相同支持物上不同位置的差异。
参考包含有机聚合物(例如水凝胶)组分的装置来说明本领域对新官能化材料，包含该材料的装置以及形成此类材料的方法的需求。通常，包含聚合物的装置通过在诸如微珠、颗粒、片等的基底上原位聚合前体单体或预聚物而形成。包含有机聚合物的装置的选择性和再现性经常高度取决于诸多实验变量，包括单体浓度、单体比例、引发剂浓度、溶剂蒸发率、环境湿度(在溶剂为水的情况下)、交联剂浓度、单体/交联剂/溶剂的纯度、实验室温度、移液时间、喷雾条件、反应温度(在热聚合的情况下)、反应湿度、紫外辐射均匀性(在UV光聚合的情况下)以及环境氧条件。尽管可以在制造设置中控制这些参数中的许多参数，但难以控制影响再生性的所有这些参数(如果有可能的话)。因此，原位聚合导致所有参数在场地间、芯片间和批次间的相对不良的再现性。
此外，尽管对使用基于二氧化硅的基底如玻璃、石英、熔融二氧化硅和硅来开发生物测定表面开展了大量的工作(参见例如，D.Cuschin等人,Anal.Biochem.1997,250,203-211；G.M.Harbers等人,Chem.Mater.2007,19,4405-4414；以及Shi等人的第6,790,613号美国专利、Boles等人的第5,932,711号美国专利、Bardhan等人的第6,994,972号美国专利、Frutos等人的第7,781,203号美国专利及Lewis等人的第7,217,512和7,541,146号美国专利)，但使用较廉价、更易于制造的基底如聚合物基底产生了额外的优势。然而，在选择和制备用于生物测定目的的此类基底方面，已遇到其它挑战。例如，聚合物基底由于额外的表面官能化而常常遭受更严重的问题，例如，增加的自体荧光性(参见例如Ofstead等人的第7,309,593号美国专利，描述了在聚合物中的含二苯甲酮或叠氮化物的三聚物、离去二苯甲酮残基、硝基或亚硝基副产物导致过量的荧光背景)、导致不期望的非特异性吸附的增加的疏水性、以及在使涂层与下面的聚合物基底附着或连接方面的挑战。
因此，需要官能化材料及包含这些材料的装置，所述材料提供测定之间的可再现结果，易于使用，且提供了多分析物***的定量数据。此外，为了变得广为接受，所述材料应是廉价且易于制备的，呈现低非特异性结合，并且能够形成多种功能装置形式。包含具有上述特性的材料的装置的可用性会显著影响研究、临床实验室、医疗诊所、医院诊所、养老院、门诊、急诊、个体床边诊断情形(医生办公室、急诊、非现场(out in the field)等)以及高通量测试应用。本发明提供了具有这些及其他期望特性官能化材料。
简述
简言之，本发明一般涉及包含固定于基底的聚合物的固体支持物及其使用方法。例如，聚合物可以通过一个或多个共价键而固定于基底。固体支持物在诸多应用中发现实用性，包括在固体基底上固定捕获探针(例如生物分子)以用于分析测定。还提供了包含适于与聚合物反应或相互作用的表面活性基团的固体基底，以及包含聚合物和任选的捕获探针的固体支持物。本文公开的聚合物、固体基底和固体支持物可用于多种分析应用，例如用于临床实验室、医疗诊所、医院诊所、养老院、门诊、急诊、个体床边诊断情形(医生办公室、急诊、现场(inthe field)等)、高通量测试及其他应用的DNA和蛋白微阵列。
本文描述的固体支持物及相关方法在多个实施方案中提供了诸多优势。例如，在某些实施方案中，聚合物通过在聚合物中存在的热化学反应性单体单元而共价结合于基底(例如塑料聚合物基底)。因此，聚合物可以共价结合于基底而不使用光化学连接物(即，在光反应性基团与基底之间的UV诱导的键形成)。因此，结合的聚合物通常基本不包含分子间和/或分子内交联，这是与将光化学活性基团用于与基底共价连接相关的常见副反应。不受任何理论限制，本发明人确信上述情形在具有更大流体动力学柔性的基底上形成聚合物涂层，所述基底对于捕获探针是更可渗透的并由此是更可进入的，因此促进聚合物与捕获探针之间的结合反应。缺少光化学反应性连接物基团还被认为促成本文固体支持物的更低的荧光背景信号。
此外，本发明的实施方案使聚合物固定于(共价或另外方式)除常用的载玻片之外的基底。例如，在某些实施方案中，本公开提供了与聚合物基底共价结合的聚合物。在某些实施方案中，这样的基底有利地具有400nm与800nm之间(常用于检测的波长)的高透明度(例如>91％)。此外，基底可以在PCR测定的典型测定温度(例如高达110℃)下使用，并通常具有低的水吸收(例如小于约0.05％)。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了固体支持物，其包含：
具有外部表面的非磁性基底；以及
与所述基底的外部表面共价结合的多个聚合物，所述聚合物各自包含多个稀释单体和多个反应性单体，每一稀释单体包含亲水性侧基，并且每一反应性单体包含热化学反应性侧基，其中所述聚合物通过所述基底的外表面与反应性单体或其经反应的片段中的至少一个之间的共价键、或通过所述基底的外表面与至少一个所述聚合物之间的离子相互作用而固定于所述基底的外表面，并且其中至少一个所述热化学反应性侧基可用于与捕获探针上的官能团共价连接。这样的固体支持物在诸多应用中发现实用性，例如多个分析物的多重检测。
在另一实施方案中，本发明涉及包括第一和第二表面的基底，其中所述第一表面是同质基底(native substrate)的外表面，并且所述第二表面具有以下结构之一，或其盐、立体异构体或互变异构体：
其中：
L2和L3各自独立地为包含亚烃基部分、氧化亚烃基部分、酰亚胺部分、醚部分、酯部分、胺部分或酰胺部分或其组合的任选的连接物；
R10和R11各自独立地为H、羟基、烃基、烃氧基或-OQ；
R12、R13、R14和R15各自独立地为H、烃基、卤素、卤代烃基、腈、硝基、烃基铵或卤代烃基铵；
P在每次出现时独立地表示单体亚单元；
A为直接键(direct bond)或-S(O)2-；
Q表示同质基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数。
这些基底可用于例如使所述的聚合物与其固定以用于形成固体支持物。
其他实施方案涉及制备任何所述固体支持物的方法，所述方法包括：
A)提供包含在其外表面上的多个反应性基团的基底；以及
B)使所述基底与多个聚合物接触，所述聚合物各自包含多个稀释单体和多个反应性单体，每一稀释单体包含亲水性侧基，并且每一反应性单体包含热化学反应性侧基；以及
C)在所述基底与所述多个聚合物中至少一个聚合物之间形成共价键，
其中在足以在不用UV辐射外部源进行辐射的情况下在所述基底表面上至少一个反应性基团与至少一个热化学反应性侧基之间形成共价键的条件下，使所述基底与所述多个聚合物接触。还提供了根据所公开的方法制备的固体支持物。
还提供了使用所述固体支持物的方法。例如，在一个实施方案中，本公开提供了用于测定靶标分析物分子存在或不存在的方法，所述方法包括：
a)提供本文所公开的固体支持物，其中所述聚合物包含至少一个与其共价结合的捕获探针；
b)使所述分析物探针与所述固体支持物接触；以及
c)检测由所述捕获探针与所述分析物探针之间的相互作用产生的信号的存在或不存在。
经参考下述详细描述，本发明的这些及其他方面会显而易见。对此，本文陈述了更详细描述某些背景信息、程序、化合物和/或组合物的各种参考，并且其各自通过引用整体并入本文。
附图简述
在附图中，相同的参考符号指定相似的要素。在附图中要素的尺寸和相对位置不必按比例绘制，并且这些要素中的一些被任意放大和放置以改善附图的可读性。此外，绘制的要素的特定形状并非旨在表达任何与特定要素的真实形状有关的信息，并且对其单独地进行选择以易于在附图中识别。
图1示出现有技术的预聚物在热解或光解之前的涂层。
图2示出在三聚物的UV接枝之前的现有技术的烃基甲硅烷基化玻璃表面。
图3示出用于UV接枝于烃基甲硅烷基化玻璃表面上的现有技术的三聚物。
图4示出用于结合生物分子的马来酸酐的现有技术的供替代的嵌段共聚物。
图5示出用于将生物分子与经有机硅烷处理的玻璃表面附着的带正电荷的部分。
图6是用于非共价生物分子固定的含胺的硅烷。
图7示出用于后续固定反应性共聚物以形成用于生物结合的第二表面的聚合物基底的胺化第一表面I。
图8示出用于后续制备用于生物结合的反应性3D支架的胺化第一表面II。
图9示出用于后续制备用于生物结合的反应性3D支架的胺化表面III。
图10示出用于制备3D支架的作为基质的共聚物IV。
图11示出用于制备反应性3D支架的作为基质的共聚物V。
图12示出通过反应I和IV制备的反应性3D支架。
图13示出通过反应I和V制备的反应性3D支架。
图14示出通过反应胺化表面II与反应性共聚物IV和V制备的3D反应性支架。
图15示出通过反应胺化表面III与反应性共聚物IV和V制备的3D反应性支架。
图16示出界面抑制的光接枝。
图17示出PCR反应室的组装件。
图18示出在阵列-热稳定性研究(不用酶或探针刺激的PCR，对每一斑点特异性的荧光DNA-侧翼(flaps)的混合物的捕获)结束时，在5种不同表面上DNA斑点的最终荧光成像。
图19示出在热循环期间5种不同表面上的斑点稳定性。
图20是示出在用于10种其他靶标的引物和探针的存在下、于1个靶标的扩增(OPC1)期间、在与接枝的氨基-PEG连接物(COP 1283C)锚固的3％PFPA-DMA-共聚物表面上点样(spotted)的阵列的qPCR性能的绘图。
详述
缩写词
ACN，乙腈；AIBN，偶氮二异丁腈；COC，环烯烃共聚物；COP，环烯烃聚合物；DCM，二氯甲烷；DI，去离子的；DMA，N,N-二甲基丙烯酰胺；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；DMSO-d6，二甲亚砜(氘代-)；EDC，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(HCl盐)；EtOAc，乙酸乙酯；EtOH，乙醇；MBA，亚甲基-双-丙烯酰胺；MeOH，甲醇；NMR，核磁共振；PCR，聚合酶链反应；PFPA，丙烯酸五氟苯酯；PSA，压敏粘合剂；SDS，月桂基硫酸钠；TEA，三乙胺；TLC，薄膜色谱法；THF，四氢呋喃；Tm，热变性温度；VAL，2-乙烯基-4,4’-二甲基吖内酯。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同涵义。通常，本文所用的术语以及下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学及核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知且常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。所述技术和程序通常根据本文件通篇提供的本领域常规方法和各种一般参考文献来进行。本文所用的术语以及下文描述的分析化学和有机合成中的实验室程序是本领域熟知和常用的那些。标准技术或其变体用于化学合成和化学分析。
当取代基由其从左向右书写的常用化学式来规定时，它们任选地同样包括由从右向左书写结构而产生的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-还任选地表述-OCH2-；-NHS(O)2-还任选地表示-S(O)2HN-，等。
本文所用的“固体支持物”是指包含与其固定的聚合物和/或捕获探针的基底。在一些实施方案中，聚合物在使用或不使用与基底固定的中间连接物部分的情况下通过共价键固定于基底。连接物可以通过一个或多个共价键或通过其他相互作用如离子相互作用而固定于基底。在整个说明书中，某些实施方案涉及装置形式的固体支持物。
“基底”或“固体基底”是指以支持物或基体形式用于固定所述聚合物的物体或物质。通常，基底是固体物体并且是非磁性的。基底可以根据期望的应用而具有任何形状，例如，基底可以以平面基底形式提供，尽管基底可以具有任何可用的形状或构造。本文以下提供用于基底的示例性材料。
“热化学反应性基团”是指其反应性是温度依赖性的并且不需要UV或用于反应性的其他辐射源的反应性基团。示例性热化学反应性基团包括但不限于活化酯(例如五氟苯基酯，“PFP”)、环氧化物、吖内酯、活化羟基、马来酰亚胺等。
基底的“外表面”或“表面”是指最外部分基底。在一些实例中，外表面将是同质基底的外表面。在其他实例中，基底将包括作为同质基底的外表面的第一表面，以及与其固定的被称为第二表面的连接物或“连系层(tie layer)”。与基底的“外表面”或“表面”固定(共价地或通过其他手段)的聚合物包括该聚合物与同质基底表面或与第二表面(连接物或连系层等)的固定或其组合。
关于支持物的“固定(immobilizing)”或“固定的(immobilized)”包括共价结合、非特异性连接、离子相互作用及使物质(例如聚合物)附着于基底的其他手段。
“聚合物”是指具有一个或多个重复单元的分子。亚单元(“单体”)可以相同或不同，并且可以以任何位置或次序出现在聚合物内。聚合物可以具有天然或合成来源。本发明包括多种类型的聚合物，包括具有有序重复亚单元的聚合物、无规共聚物和嵌段共聚物。具有两种不同单体类型的聚合物称为共聚物，并且具有三种不同类型的单体的聚合物称为三聚物，其余类推。
“无规聚合物”是指其中亚单元沿聚合物链以随机次序连接的聚合物。无规聚合物可以包括诸多不同的亚单元。在某些实施方案中，本文所述的聚合物是“无规共聚物”或“无规三元共聚物(co-terpolymer)”，即，聚合物包含分别以随机次序连接的两种或三种不同的亚单元。单独的亚单元可以以任何摩尔比存在于无规聚合物中，例如，每一亚单元可以相对于聚合物中其他亚单元的摩尔量以约0.1摩尔％至约99.8摩尔％存在。在一些实施方案中，无规共聚物的亚单元可以由以下一般结构表示：
其中X和Y独立地是唯一的单体亚单元，并且a和b是表示聚合物内每一亚单元数量的整数。为了易于说明，上述结构描述了X和Y的线性连接；然而，应强调本发明的无规共聚物(例如无规共聚物、无规三元共聚物等)不限于具有所述亚单元连接的聚合物，并且无规聚合物中的亚单元可以以任何随机顺序连接，并且聚合物可以是支化的。因此，本文所述的聚合物结构如结构(I)意指包括具有以任何次序连接的亚单元的聚合物。
“嵌段共聚物”是指包含两种或更多种亚单元的重复嵌段的聚合物。
“引发剂”是用于引发聚合反应的分子。用于制备所公开的聚合物的引发剂是本领域熟知的。典型的引发剂包括但不限于可用于原子转移自由基聚合(活性聚合)的引发剂、AIBN家族的引发剂和二苯甲酮引发剂。“引发剂残基”是引发剂与聚合物通过自由基或其他机制连接的部分。在一些实施方案中，引发剂残基与公开的聚合物的末端连接。
术语“烃基”自身或作为其他取代基一部分，除非另有规定，是指直链或支链或环状烃基团或其组合，其可以是完全饱和的、单-或多-不饱和的，并且可以包括具有规定碳原子数(即，C1-C10是指1个至10个碳)的二价和多价基团。饱和烃基团的实例包括但不限于诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基的基团，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烃基是具有一个或多个双键或叁键的基团。不饱和烃基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高的同系物和异构体。术语“烃基”，除非另外指出，也意指包括下文更详细定义的烃基的衍生物，例如“杂烃基”。不限于烃基团的烃基还称为“同烃基(homoalkyl)”。
除非另外规定，术语“杂烃基”，自身或与其他术语组合，意指由规定数量的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成的稳定的直连或支链或环状烃基团，或其组合，并且其中氮原子和硫原子可以任选地被氧化且氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子O、N和S及Si可以处于杂烃基的任何内部位置或处于烃基与分子其余部分连接的位置处。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“亚杂烃基”，自身或作为另一取代基的一部分，意指由杂烃基衍生的二价基团，例示但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烃基，杂原子可以占据链终点中的一个或两个(例如，亚烃氧基、亚烃二氧基、亚烃基氨基、亚烃基二氨基等)。此外，对于亚烃基和亚杂烃基连接基团，书写连接基团分子式的方向不暗示连接基团的取向。例如，分子式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
烃基和杂烃基的取代基(包括常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)可以为选自(但不限于)：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2的数量为0至(2m’+1)的多种基团中的一个或多个，其中m’为这样的基团中碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地是指氢、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的芳基，例如，被1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烃基、烃氧基或硫代烃氧基，或芳基烃基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，当存在多于一个的这些基团时，独立地选择各个R基团作为各个R’、R”、R”’和R””基团。当R’和R”与相同的氮原子连接时，它们可以与氮原子结合以形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”意指包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基上述讨论，本领域技术人员会理解术语“烃基”是指包括含与除氢之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烃基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。取代基本文称为“烃基取代基”。
术语“芳基”，除非另外规定，意指多不饱和芳香族烃取代基，其可以是单环或者稠合在一起或共价连接的多环(优选1至3个环)。术语“杂芳基”是指包含1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化且氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以与分子的其余部分通过杂原子连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异吲哚基、5-异吲哚基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。每一上述芳基和杂芳基环体系的取代基选自下述可接受的取代基。
出于简洁，术语“芳基”当与其他术语(例如芳氧基、芳基硫氧基、芳基烃基)组合使用时包括上文定义的芳基和杂芳基环。
与对烃基所述的取代基类似，芳基取代基和杂芳基取代基通常分别称为“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，并且是多样化的，且选自例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN及-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烃氧基和氟(C1-C4)烃基，数量为0至芳香环***上开放价态的总数；并且其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、(C1-C8)烃基和杂烃基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烃基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烃基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，当存在多于一个的这些基团时，独立地选择各个R基团作为各个R’、R”、R”’和R””基团。
芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可任选被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基替换，其中T和U独立地为-NH-、-O-、-CRR’-或单键，并且q为0至3的整数。或者，芳基或杂芳基环邻近原子上的两个取代基可任选被式-A-(CH2)r-B-的取代基替换，其中A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，并且r为1至4的整数。如此形成的新环的单键中的一个可任选被双键替换。或者，芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可任选被式-(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-的取代基替换，其中s和d独立地为0至3的整数，并且X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或者取代或未取代的(C1-C20)烃基。这些术语本文称为“芳基取代基”。
“立体异构体”是指由通过相同的键结合的相同原子组成的但具有不同三维结构的化合物，其不可互换的。本发明包括各种立体异构体及其混合物，并包括“对映异构体”，其是指其分子与另一个为非重叠镜像的两个立体异构体。
“互变异构体”是指质子从分子的一个原子转移至相同分子的另一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。
上述术语均意指包含指定基团的取代和未取代形式。
“部分”是指分子与另一部分连接的基团。
符号“R”是表示选自取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基及取代或未取代的杂环基团的取代基的一般缩写。
符号无论用作键或呈现出与键垂直，均表示所呈现的部分与分子、固体支持物、基底、第一表面、第二表面等连接的点。
上述术语均意指任选地包含指定基团的取代和未取代形式。
本文所用的术语“连接物”或“L”是指单个共价键(“零级”)或者包含1-200个选自C、N、O、S、Si和P的非氢原子的一系列稳定的共价键，其共价地将本发明化合物的组分连接在一起，例如，将基底与聚合物基质连接或者将聚合物基质与生物分子连接。示例性连接物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个非氢原子，但可以在骨架内包含甚至更多的非氢原子。连接物可以包含氢原子，条件是它们不在连接物骨架内。除非另外规定，“连接(linking)”、“连接的(linked)”、“连接(linkage)”、“结合(conjugating)”、“结合的(conjugated)”及与附着相关的类似术语是指利用连接物的技术和包括连接物的物质。示例性连接物包括本文所定义的连接片段。此外，连接物具有将本发明的一个组分附着于另一组分、例如支持物附着于聚合物或者聚合物附着于生物分子的用途。因此，本发明还提供了与本发明的支持物通过连接物附着的本发明的聚合物。本发明的固体支持物和聚合物任选地包含固体支持物和聚合物的两种组分之间(例如，低聚物与固体支持物之间、荧光团与低聚物之间、淬灭剂与低聚物之间、荧光团与淬灭剂之间，等)的可***的连接物。
如本文所用，术语“杂原子”意指包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
如本文所用，术语“聚合物(polymer)”和“聚合物(polymers)”包括“共聚物(copolymer)”和“共聚物(copolymers)”，并且与术语“低聚物(oligomer)”和“低聚物(oligomers)”可互换地使用。术语“共聚物”通常涉及由两种不同的共聚用单体组成的聚合物。
“附着的”和“固定的”可互换使用，并且包括连接相互作用，包括共价连接、亲和性相互作用，以及化学吸附作用和物理吸附作用。
“独立地选自”本文用于表示所述的基团可以是相同或不同的。
本文所用的术语“结合官能性(binding functionality)”意指对某一物质如“待测定的物质”具有亲和性的部分，即，能够与特定物质相互作用以将其固定在本发明的芯片上的部分。结合官能性可以是反应性官能团或生物特异性的。反应性官能团通过共价结合、电荷-电荷、亲水性-亲水性、疏水性-疏水性、范德华相互作用及其组合而结合物质。生物特异性结合官能性通常包括涉及上述相互作用中的一个或多个的互补三维结构。生物特异性相互作用之组合的实例包括但不限于抗原与相应的抗体分子、核酸序列与其互补序列、效应器分子与受体分子、酶与抑制剂、含糖链的化合物与凝集素、抗体分子与对先前抗体特异性的另一抗体分子、受体分子与相应的抗体分子，以及类似的组合。特异性结合物质的其他实例包括化学生物素修饰抗体分子或多核苷酸与抗生物素蛋白、抗生物素蛋白结合的抗体分子与生物素，以及类似的组合。结合官能性可以是测定组件。例如，用于将另一核酸与本发明的聚合物结合的经固定的核酸可以是用于本发明目的的测定组件。
“可聚合部分”是指能够参与聚合反应且通过聚合反应而转化成聚合物组分的官能团。典型的“可聚合部分”包括但不限于烯丙基、乙烯基、丙烯酸基、甲基丙烯酰基、缩水甘油基羧酸、胺、酸酐、醛、脲、硫脲、异氰酸酯及硫代异氰酸酯等。额外的“可聚合部分”是本领域技术人员已知的。参见，例如Seymour,R.等人,Polymer Chemistry 2nd Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1988。
本文所用的术语“检测手段”是指通过目视判断或根据信号性质通过使用合适的外部测量仪器来检测通过将待测定的物质固定于结合层上产生的信号。
“生物分子”或“生物有机分子”是指通常由活生物体产生的有机分子。其包括例如包含以下的分子：核酸、氨基酸、糖、多糖、脂肪酸、类固醇、肽、蛋白、适体、脂质及这些物质的组合(例如糖蛋白、核糖核酸蛋白、脂蛋白等)。生物分子可以源自生物材料(例如生物样品)，或在一些情况下是化学合成的。
术语“生物材料”是指源自生物体、器官、组织、细胞或病毒的任何材料。其包括生物流体如唾液、血液、尿液、淋巴液、***液或***、乳汁等，以及任何这些物质的提取物，例如细胞提取物、细胞培养基、分馏样品等。
“分析物”是指待检测和/或与污染物分离的样品的任何组分。该术语可以指样品中的单一组分或多种组分。分析物包括例如生物分子。示例性生物分子为核酸。
术语“测定混合物”和“样品”可互换使用以指代包含分析物和其他组分的混合物。其他组分是例如稀释剂、缓冲剂、洗涤剂、及污染物质、碎片，以及与靶标混合得到的类似物质。例示的实例包括尿、血清、血浆、全血、唾液、泪液、脑脊髓液、来自***的分泌液，等。还包括固体、凝胶或溶胶物质，例如粘液、体组织、细胞、以及悬浮或溶解在液体材料如缓冲剂、提取剂、溶剂等中的类似物质。
如本文所用，“核酸”表示DNA、RNA、单链的、双链的或更高度聚集的杂交基序，及其任何化学修饰。修饰包括但不限于向核酸配体碱基或整体向核酸配体提供包含额外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用、附着点和官能性的化学基团的那些。这样的修饰包括但不限于肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯)、2’-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在环外胺出的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；骨架修饰、甲基化、异常碱基对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸还可诱导非天然碱基，例如硝基吲哚。修饰还可以包括3’和5’修饰，例如用荧光团(例如量子点)、荧光淬灭剂、嵌入剂、小沟槽(minor-groove)粘合剂或另一部分进行封盖。
表述“多核苷酸的扩增”包括但不限于诸如聚合酶链反应(PCR)、连接扩增(或连接酶链反应，LCR)的方法以及基于使用Q-β复制酶的扩增方法。这些方法是熟知的，并且在本领域广泛实践。参见例如第4,683,195和4,683,202号美国专利以及Innis等人,1990(对于PCR)；和Wu等人,1989a(对于LCR)。用于进行PCR的试剂和硬件是可商购的。可用于扩增来自特定基因区域的序列的引物优选与靶标区域中或其侧面区域中的序列互补，并且与所述序列是特异性杂交。通过扩增产生的核酸序列可以直接测序。或者，可以在序列分析之前克隆扩增的序列。Scharf(1986)已描述了用于酶促扩增基因组片段的直接克隆和序列分析的方法。本发明提供了用于扩增方法的低聚物引物。此外，提供了用于合成这样的引物的固体支持物。除了引物之外，本发明还提供了探针以及使用这样的探针来检测、表征和/或量化扩增产物的方法：还提供了用于合成这些低聚物探针的固体支持物。
术语“杂交的”是指可以为或可以不为完全碱基配对的彼此相连的两个核酸链，该术语是指包括无论结合于固体支持物或在溶液中的本发明低聚物的连接。
本文所用的术语“探针”或“捕获探针”通常是指能够与样品中关注的靶标分子特异性连接以便可检测探针与靶标之间的连接相互作用的分子物质。例如，探针常包括能够与样品内特异性互补核酸序列杂交的核酸低聚物。杂交的识别可以包括一种标记的探针或标记的样品材料固定于固体支持物以指示样品的存在。或者，探针可以包括当与结合伴侣相互作用时产生可检测反应的一个标签部分或多个标签部分。例如，这样的探针可以包括至少一个可检测部分，或探针对其与结合伴侣相互作用反应的一些状态变化时形成可检测的能量转移对的一对部分。
本文所用的术语“可检测的反应”是指通过观察或通过使用仪器而可直接或间接检测的信号的改变或信号的出现，并且其的存在或优选其的大小随测试样品中探针的靶标结合伴侣的存在而变化。典型地，可检测的反应是由于荧光团在阵列中的位置而来自荧光团的光学反应，或通过导致以下而来自荧光团的光学反应：波长分布模式或者吸光强度或荧光强度的改变，或者光散射、荧光量子产率、荧光寿命、荧光极化的改变，激发或发射波长的转移，或者上述参数的组合。该给定的光谱性质中的可检测的变化通常是增加或降低。然而，导致荧光强度的增强和/或荧光发射或激发波长的转移的光谱改变也是可用的。荧光或离子结合的改变通常归因于可出现在荧光团激发态或基态的指示剂中构象或电子的改变，归因于在离子结合位点的电子强度的改变，归因于结合靶标金属离子淬灭荧光，或归因于这些或其他作用的任何组合。或者，可检测的反应是信号出现，其中荧光团是内在荧光的且当与金属离子或生物化学结合时产生信号的改变。本发明提供了提供可检测的反应的探针以及用于合成这样的探针的固体支持物。
“扩增引物”是可以在模板依赖性扩增反应中延长的部分(例如分子)。最典型地，引物将包括或将是在扩增条件下与模板结合的核酸。典型地，引物将包括可以通过聚合酶(例如通过在聚合酶链反应中的热稳性聚合酶)或通过连接酶(例如在连接酶链反应中)而延长的末端。
“检测室”是部分或完全封闭的结构，其中分析样品或检测靶标核酸。该室可以全部闭合，或可以包括与该室流体连接的流体端口或通道，例如用于递送试剂或反应物。该室的形状可以根据例如应用和可用的***设备而变化。室被“配置成降低与阵列邻近的信号背景”，当其经尺寸成形以降低信号背景时，例如通过在阵列附近包括窄尺寸(例如室深度)(由此降低与阵列邻近的溶液产生的信号的量)，或当该室仅经另外配置以降低背景时，例如通过使用涂层(例如光学涂层)或结构(例如与阵列邻近的挡板或其他有形状的结构)。典型地，该室经配置以具有与阵列接近的尺寸(例如深度)，以便溶液中的信号足以低至允许检测阵列处的信号差。例如，在一个实施方案中，室在阵列之上的深度小于约1mm；期望地，室的深度小于约500μm。典型地，室在阵列上的深度小于约400μm、小于约300μm、小于约200μm或者小于约150μm。在本文提供的一个实例中，室的深度为约142μm。
“标记的探针”是在扩增条件下与靶标核酸特异性杂交且包含可检测的部分或可处于可检测的部分的分子或化合物。最典型地，标记探针是包含光学标签如荧光团、染料、发光团、量子点等的核酸。标签可以是直接可检测的，或可以处于淬灭状态，例如在探针包含淬灭剂部分的情况下。在本文的许多实施方案中，标记的探针在靶标核酸扩增期间***以释放包含可检测的标签的探针片段。例如，标记探针可以包括荧光团和淬灭剂，例如在扩增反应导致探针***以释放标记的探针片段的情况下。最典型地，探针会包括“侧翼”区域。该侧翼区域在杂交期间不与靶标碱基配对，并且通过核酸酶(例如聚合酶的核酸酶活性)从其余探针***，从而形成探针片段。
“肽”是指其中单体是氨基酸并且通过酰胺键连接在一起的聚合物，或者称为“多肽”。非天然氨基酸如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸也包括在该定义内。非基因编码的氨基酸还可以用于本发明。此外，已经修饰以包括反应性基团的氨基酸还可以用于本发明。本发明中使用的所有氨基酸均可以是d-或l-异构体。l-异构体通常是优选的。此外，其他多肽模拟物也可用于本发明。对于一般性综述，参见Spatola,A.F.的Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides andProteins,B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和以与天然存在的氨基酸类似的方式运行的氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由基因密码编码的那些，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基础化合物结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但以与天然存在的氨基酸类似的方式运行的化学化合物。
“抗体”是指基本由特异性结合和识别表位(例如抗原)的一种免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体。经识别的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。抗体例如以完整免疫蛋白形式或以由多种肽酶消化而产生的多个完全表征的片段形式存在。这包括例如Fab’和F(ab)’2片段。本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰整个抗体产生的抗体片段或者使用重组DNA技术离体合成的抗体片段。其还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分是指免疫球蛋白重链包含一个或多个重链恒定区结构域(CH1、CH2和CH3)但不包含重链可变区的部分。
本文所用的“免疫结合物”意指在化学或生物学上与荧光团、细胞毒素、抗肿瘤药物、治疗剂等连接的诸如抗体或生长因子(例如激素)的任何分子或配体。免疫结合物的实例包括免疫毒素和抗体结合物。
固体支持物、聚合物及其相关方法
本发明通常提供特别可用于生物分析操作的聚合物、固体支持物、***和方法。特别地，本发明的实施方案涉及此外还可用于基底的涂层表面、用于结合捕获探针(例如可用于连接测定如核酸杂交、蛋白相互作用、抗体结合及其他分析测定的生物分子)的反应性聚合物组合物。本发明的示例性固体支持物和聚合物可用作生物芯片或者生物芯片和涉及生物芯片的分析方法中的组件。生物芯片是用于迅速、灵敏、可靠且任选多重检测在生物样品中存在的多种生物分子及其他化合物的有利装置。因此，大量尝试集中于开发将功能性生物分子固定在诸如载玻片的固体支持物上以检测蛋白和核酸的新策略。
在多个实施方案中，本发明利用以下发现，即，对官能化固相测定装置的缺点的解决方案在于将合成反应性聚合物的过程与将反应性聚合物并入装置(例如附着于芯片基底)所用的过程分开。通过将反应性聚合物的合成和附着与包含聚合物的固体载体的制造分开，单独的过程更易于控制，允许合成过程的更大的再现性。因此，本发明提供了在生物分子固定方面具有更高再现性的生物芯片。此外，因为本发明的某些方面采用了具有更稳定的反应性基团的聚合物，所以聚合物和由其生产的固体支持物的保存期得益于改善的保存期。
在多个实施方案中，本发明提供了与商购微阵列载片(活化为NHS酯)相比具有更大反应性和增加的水解稳定性的生物相容表面，导致更长的产品保存期和生物分子固定方面更高的再现性。
此外，本发明提供了允许简易改变和改造功能表面的相对疏水性(其可以通过调节用于合成共聚物的单体百分比而微调以优化诸如斑点尺寸和生物分子密度的参数)的方法和聚合物。这种固有的组成柔性当开发用于固定不同类型的生物分子时具有特别的优势。
在多个实施方案中，本发明的聚合物和表面利用经保护的氨基-PEG-芳基叠氮化物连接物，其共同起到表面活性剂的作用。因此，可以在水溶液中用连接物薄膜涂覆聚合物(例如COP或COC)基底的疏水表面，使其干燥，然后连接物可以共价光交联于基底，在脱保护后提供胺功能表面，随后用生物相容性胺-反应性共聚物涂覆。每一化学组分可以在溶液中合成，分批表征和验证(qualified)，并且无限期贮存，提供多步表面涂覆过程再现性方面的置信度以及可以储备临界制造中间体。
所用的化学方法是迅速的，有效利用中间体，并且需要极少有害溶剂，特别在初始基底(例如COP/COC)表面胺化步骤期间。可与另外未反应COP/COC基底光交联的水溶性表面活性剂类连接物的沉积允许在没有等离子预处理、昂贵的无空气反应室或大量有害有机溶剂的情况下内部进行表面处理。
在示例性实施方案中，本发明提供了聚合物，其为通过共聚稀释剂共聚用单体和反应性共聚用单体(其在一些实施方案中处于小摩尔分数)形成的共聚物，所述稀释剂共聚用单体是水溶性水凝胶前体，所述反应性共聚用单体具有至少一个用于形成共聚物的反应性官能团如反应性酯、吖内酯或其组合。将共聚物固定在基底表面上，即，第一表面。共聚物包含至少一个可用于将后续相互作用(例如核酸杂交)所用的生物分子或其他捕获分子与诸如分析物的物质结合的反应性官能团。在多个实施方案中，这种物质是核酸，例如可检测标记的核酸。
在示例性实施方案中，本发明提供了包含反应性官能团的聚合物。尽管不必在所有实施方案中，但在某些优选实施方案中，聚合物是携带多个反应性官能团的水溶性共聚物。
本发明还提供了固体支持物，其包含反应性聚合物，例如本文所述的那些。本发明的示例性固体支持物包括基底和反应性聚合物，所述反应性聚合物与所述基底直接地或通过连接物共价连接。基底的性质取决于固体支持物的意欲应用。在示例性实施方案中，基底是片或芯片形式。在示例性实施方案中，固体支持物是用于与检测荧光信号联用的芯片，并且基底优选由基本光学透明的材料如聚合物、石英、玻璃等形成。
基底的表面或第一表面通常具有官能团，所述反应性聚合物通过所述官能团而固定以提供第二表面。例如，硅芯片包含表面Si-OH基团。此外，在多个实施方案中，基底表面涂覆有二氧化硅(或者第一表面涂覆有二氧化硅)。涂覆可以是连续或不连续的。或者，基底可以由有机聚合物(塑料)组成，在该情况下，聚合物表面(第一表面)可以经修饰以添加官能团，或官能团可以以基底的完整表面组分形式存在。可以添加官能团并随后衍生化，或者它们可以在基底外衍生化，并随后利用本领域技术人员熟知的方法添加至基底。本发明的固体支持物还可以包含与第一表面结合连接物臂，其用于将反应性聚合物锚固于基底。
在某些实施方案中，本发明涉及新颖的包含具有第一表面的基底的固体支持物。聚合物涂层被涂覆或提供在第一表面上以形成第二表面，其中所述聚合物涂层包含多个第一反应性官能团。第一子集的多个反应性官能团提供了对第一表面上的第二官能团的共价连接，而第二子集的多个反应性官能团可用于与生物分子上的第三官能团共价连接。
在其他实施方案中，本发明提供了用于将生物分子附着于基底(例如聚合物基底)表面的方法。所述方法包括：提供具有第一表面的基底，所述第一表面在其上包含多个第一官能团；通过使所述第一表面与具有多个能同所述第一官能团形成共价键的活化结合基团的聚合物接触来形成涂覆的第一表面，以便第一部分的所述多个活化结合基团与一部分所述第一官能团形成共价键；使所述涂覆的表面与能够同所述聚合物上的活化结合基团形成共价键的第一生物分子接触，其中所述聚合物上的第二部分的所述活化结合基团与所述生物分子上的第二官能团形成共价键。
在其他实施方案中，本发明提供了共聚物涂层材料，其包含由第一组不具有反应性官能团的共聚用单体形成的聚合物骨架；和散布遍及仅具有第一类型的反应性官能团的聚合物骨架的第二组共聚用单体。
在一个实施方案中，本发明的聚合物组合物通常特征是具有包含第一共聚用单体的骨架和随机散布遍及聚合物骨架的携带一个或多个官能团的第二共聚用单体。结果是包含散布遍及聚合物骨架的多个反应性官能团的聚合物。反应性官能团提供了将聚合物固定于基底表面和将其他基团附着于聚合物骨架(例如生物分子)的共有附着点，以用于后续分析。附着可以通过与基底的共价键或与同其固定(共价地或通过其他连接)的连接物的共价键。通过将共有反应性官能团用于涂覆层的表面固定和捕获探针与该涂覆层的附着，可以显著简化用于制备采用这些材料的分析固体支持物的方法。
本发明的聚合物因此通常包括多个反应性官能团，其中第一子集的反应性官能团用于形成与基底表面上互补反应性基团的共价连接。第二子集的反应性官能团然后是可用的，并用于与待通过聚合物附着于支持物的生物分子上的互补官能团共价连接。在特别优选的方面，反应性官能团与基底表面上或生物分子内的氨基共价结合。
在优选的方面，本发明的聚合物是相对亲水性共聚物。使用这样的亲水性聚合物允许生物分子在水性分析溶液中且远离基底表面进行附着。此外，这样的聚合物向基底表面赋予相对亲水性，允许更好的湿润性，这在生物分析方法中是更有利的。本发明的示例性聚合物以及用于本发明的示例性聚合物是包含大部分形成水凝胶的共聚用单体和小部分官能共聚用单体。通常，本发明的反应性表面会具有特征在于接触角为约40度至约90度的湿润性。
在许多情况下，在相对亲水性方面调制聚合物涂层，以便当表面涂覆有该聚合物时，其不会过于容易湿润。特别地，以位置特异性的方式用生物分子接触表面或点样表面(例如用于生物分子测定)时，常期望使每一斑点防止每一斑点的过量液滴延展，从而避免斑点重叠。如此，通常调制涂层的亲水性以提供水接触角大于50度的反应性表面。如基于前述所认识到的，本发明的特别优选的固体支持物将包含接触角为约50度至约65度、约50度至约80度或约60度至约75度(包括端点)的反应性表面。
通常，并且如下文更详述所述，通常通过调节反应性或非反应性(“稀释剂”)共聚用单体的取代基或者这样的共聚用单体的分数来调节聚合物组合物的亲水性。这样的修饰的实例包括例如单体取代基(下文A和B)的取代。特别可用于调节亲水性的共聚用单体包括例如丙烯酸五氟苯酯、丙烯酸四氟苯酯或它们的磺化变体。
1.固体支持物
参考以下描述会更好地理解包含聚合物和任选的捕获探针的固体支持物。在一个实施方案中，固体支持物包含：
具有外部表面的非磁性基底；以及
与所述基底的外部表面共价结合的多个聚合物，所述聚合物各自包含多个稀释单体和多个反应性单体，每一稀释单体包含亲水性侧基，并且每一反应性单体包含热化学反应性侧基，其中所述聚合物通过所述基底的外表面与反应性单体或其经反应的片段中的至少一个之间的共价键、或通过所述基底的外表面与至少一个所述聚合物之间的离子相互作用而固定于所述基底的外表面，并且其中至少一个所述热化学反应性侧基可用于与捕获探针上的官能团共价连接。
聚合物可以以多种方式固定于基底。例如，在一个实施方案中，聚合物通过基底的外表面与至少一个热化学反应性基团的经反应的片段之间的共价键而固定于基底的外表面。在某些实例中，共价键与连接物部分的，并且该连接物部分转而共价结合于基底表面。在一些实施方案中，聚合物共价结合于热化学反应性基团的“片段”，因为当与基底表面上反应性基团进行键形成时消除热化学反应性基团的不稳定部分(“离去基团”)。例如，当热化学反应性基团是反应性酯(例如R(C＝O)OR’，其中R和R’独立地为烃基或芳基等)时，与羰基碳形成共价键，并且消除“OR”’片段。当基底在表面上包含胺时，所得的键是酰胺键。
在其他实施方案中，聚合物与连接部分形成共价键，并且连接部分与基底非共价连接。例如，在某些实施方案中，聚合物可以共价结合于第二聚合物(例如聚亚乙基亚胺或聚烯丙胺)中的胺基团，所述第二聚合物例如通过离子相互作用而非共价固定于基底。可用于此的基底包括玻璃，石英，二氧化硅，氧化硅和金属氧化物如氧化铟锡、二氧化钛、氧化锆、氧化铝，或其组合。
在某些实施方案中，聚合物独立地具有以下结构(I)或其盐、立体异构体或互变异构体：
其中：
A每次出现时独立地为热化学反应性侧基；
B每次出现时独立地为亲水性侧基；
R1、R2和R3每次出现时独立地为H或C1-C6烃基；
L1每次出现时独立地为连接物；
T1和T2各自独立地为不存在或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物端基；
Q表示基底的外表面；以及
x、y和z独立地为所述聚合物中各个单体的摩尔百分比，其中x、y和z各自大于0摩尔％并且x、y和z的总和为100摩尔％。
通常，聚合物会包含1至50,000个每一单体。对此，可以基于期望的功能和应用来设计聚合物的分子量。在某些实施方案中，聚合物的分子量为约40kD至约1.5×106D、约100kD至约1000kD、或约100kD至约700kD。在某些实施方案中，聚合物的分子量为约150kD。
用于本发明实践的热化学反应性基团的类型不受特别限制，条件是该热化学反应性基团能够与基底和与捕获探针形成共价键。在一些实施方案中，热化学反应性基团是活化酯或吖内酯。典型地，热化学反应性基团不需要UV辐射外源来与基底形成共价键(即，无光诱导反应)。
在一些特定实施方案中，活化酯是芳基酯。在其他实施方案中，热化学反应性基团具有以下结构之一：
其中R4a、R4b、R4c、R4d和R4e各自独立地为H、卤素、腈、硝基、-NCS、-NCO、-N(H)C(S)NH-PEG、-N(H)C(O)NH-PEG、-CONH-PEG、-SO2NH-PEG、CO2H、-SO3H或其盐。
在其他实施方案中，R4a、R4b、R4c、R4d和R4e各自独立地为H、卤素、腈或硝基。
在其他实施方案中，热化学反应性基团具有以下结构：
在一些实施方案中，R4a、R4b、R4c、R4d和R4e中的至少一个为氟。在其他实施方案中，R4a、R4b、R4c、R4d和R4e中的四个为氟。例如，在某些实施方案中，R4a、R4b、R4c、R4d和R4e中的四个为氟且R4a、R4b、R4c、R4d和R4e中的其余部分为H。例如，在一些实施方案中，R4a、R4b、R4d和R4e各自为氟且R4c为H。在上述结构的一些其他特定实施方案中，R4a、R4b、R4c、R4d和R4e各自为氟。有利地，包含这些类型的氟化反应性部分的聚合物可以通过19F和/或1H NMR技术分析以精确测定反应性单体与稀释单体之间的比例。包含四个氟基团和一个氢的部分尤其可用于这些技术。
在某些其他实施方案中，R4a、R4b、R4c、R4d和R4e之一为硝基。例如，在一些实施方案中，R4a、R4b、R4c、R4d和R4e之一为硝基且其余取代基为H。
在其他实施方案中，亲水性侧基具有以下结构之一：
其中：
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H、C1-C6烃基或C1-C6杂烃基，或者R6和R7或R8和R9连同它们所结合的氮原子一起形成杂环；以及
n为1至2,000的整数。
在一些实施方案中，R6和R7各自独立地为H或甲基。
在某些实施方案中，亲水性侧基具有以下结构之一：
在其他实施方案中，亲水性侧基具有以下结构之一：
在其他实施方案中，聚合物通过与连接物部分的共价键而结合于基底，所述连接物部分转而共价结合于基底。例如，基底可包括具有能够与热化学反应性基团形成共价键的反应性基团(例如胺)的外表面。在一些实施方案中，连接物(L1)包括硅-氧键、胺键、酰胺键、磺酰胺键、亚烷基键、聚合物或其组合。例如，在一些实施方案中，L1是与基底表面离子结合且与聚合物(如结构I所示)共价结合的连系层聚合物(例如聚烯丙胺或聚亚乙基亚胺)，所述聚合物可用于结合捕获探针。
在其他实施方案中，L1具有以下结构之一：
其中：
L2和L3各自独立地为任选的包含亚烃基部分、氧化亚烃基部分、酰亚胺部分、醚部分、酯部分、胺部分或酰胺部分或其组合的连接物；
R10和R11各自独立地为H、羟基、烃基、烃氧基或-OQ；
R12、R13、R14和R15各自独立地为H、烃基、卤素、卤代烃基、腈、硝基、烃基铵或卤代烃基铵；
P在每次出现时独立地表示单体亚单元；
A为直接键或-S(O)2-；
Q为基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数。出于清楚的目的，Q(基底)包括在L1的上述结构中；然而，本领域普通技术人员会认识到Q不包括在L1的定义中。
在L1的任一上述实施方案中，每一P独立地为-CH2-、-CH2CH(CH2NH2)-或-OCH2CH2-。
在某些更特定的实例中，L1具有以下结构之一：
其中：
Q表示基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数；以及
a和b各自独立地为1至1999的整数。在上述的一些实施方案中，为55至90。
在其他实施方案中，L1具有以下结构(A)、(B)或(C)之一：
其中：
Ra和Rb各自独立地选自C1、C2、C3、C4、C5和C6直链和支链烃基；
e为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
L5为键或式D，以及
L6为键或式E，其中式D和E具有以下结构：
其中：
k选自0、1、2、3和4；
A为键或-(SO2)-；
R17选自H、Cl、Br、F、NO2、CN、CF3和+NR18R19R20，其中R18、R19和R20各自独立地为C1至C6烃基或卤化烃基，或其中R18、R19或R20之一与R18、R19或R20中的另一个连接以形成杂环；
L7为连接物部分，其在多个实施方案中选自：
其中：
p为0至10的整数；
q为1至200的整数；
a和b为使a+b＝100mol％而选择的数字；以及
G选自：
在示例性实施方案中，当L1具有式A的分子式时，基底包含与L1结合的金属氧化物组分。
在一些实施方案中，通过基底外表面上反应性基团和至少一个热化学反应性侧基的反应形成共价键。反应性基团可以直接在基底的表面上，或反应性基团可以是一侧与基底结合(共价地或通过离子相互作用)的连接物(“连系层”)上的官能团。然后在一个或多个官能团或连接物(例如胺)与一个或多个热化学反应性侧基之间形成与聚合物的共价键。
如上所述，固体支持物在诸多应用中发现实用性，包括在固体支持物上结合“捕获探针”。捕获探针通常通过一种热化学反应性基团的片段与捕获探针上的反应性基团(例如胺)之间的共价键而共价结合于固体支持物。因此，在一个实施方案中，聚合物还包括与捕获探针的至少一个共价键。在一些实施方案中，通过在捕获探针上的反应性基团与至少一个热化学反应性侧基的反应形成与捕获探针的至少一个共价键。包括捕获探针的固体支持物可用于本文所述的分析方法。
在某些实施方案中，捕获探针是生物分子，例如多核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白、糖基化蛋白、适体、糖结合物、碳水化合物或抗体。在特定实施方案中，捕获探针是选自RNA、DNA和寡核苷酸的多核苷酸。例如，在一些方面，捕获探针是DNA。在其他实施方案中，捕获探针是蛋白。在某些实施方案中，捕获探针是抗体。
有利地，可以改变稀释单体在聚合物中的含量以控制聚合物的亲水性。对亲水性的控制提供了现有技术的固体支持物种未认识到的诸多优势，例如可以基于下文所讨论的特定应用来优化固体支持物的水接触角。此外，通过对相对于反应性单体的稀释单体浓度的控制，本申请人已经发现相对疏水性基底(例如塑料聚合物)可以用作基底，同时仍在水性环境中进行的测定中获得良好的结果。
在一些实施方案中，聚合物包含小于约40mol％的稀释单体。例如，在其他实施方案中，聚合物包含约35mol％或更低的稀释单体，而在其他实施方案中，聚合物包含至少约30mol％的稀释单体。更多的实施方案提供了包含约30mol％至小于约40mol％的聚合物。
在其他实施方案中，聚合物包含至少约75mol％的反应性单体。例如，在一些实施方案中，聚合物包含至少约90mol％的反应性单体。在其他实施方案中，聚合物包含至少约95mol％或至少约97％的反应性单体。
也已发现包含非常少量的稀释单体的聚合物可用于所述的固体支持物并且包括在本发明的范围内。例如，在一些实施方案中，聚合物包含小于约10％的稀释单体或甚至小于约1％的稀释单体。
仅出于例示的目的来提供上述结构(I)，并且例示结构(或任何其他例示结构)中所述的单体不意欲进行限制。单体可以以任何次序在聚合物内连接，包括嵌段聚合物和无规聚合物。在一些实施方案中，聚合物是无规聚合物，例如无规共聚物。在其他实施方案中，聚合物是无规三聚物。
聚合物不需要包含相同的反应性单体和相同的稀释单体。在某些应用中，期望包括结构上不同的反应性单体和/或稀释单体。例如，在一些实施方案中，聚合物包含多于一种类型的结构上不同的亲水性侧基。这样的聚合物的某些实例包括其中亲水性侧基具有以下结构的聚合物：
如上所述，本文固体支持物有利地提供迄今为止未获得的最佳水接触角，尤其当采用塑料(即聚合物)基底时。在某些实施方案中，最佳接触角当在支持物上点样试剂(例如捕获探针)时产生更小的斑点尺寸。更小的斑点尺寸有助于斑点之间更高的分辨率和/或支持物上更高的斑点密度(与已知的支持物相比)。在某些实施方案中，固体支持物具有40°至90°的水接触角。在其他实施方案中，固体支持物具有50°至80°的水接触角。例如，一些实施方案提供了水接触角为60°至75°、例如约70°的支持物。
有利地，本文描述的固体支持物可以包括由多种材料形成的基底。通常基于期望的应用以及聚合物与基底材料固定的方法来选择基底材料。在一些实施方案中，本发明人已经发现与使用更常用的玻璃基底相比，与使用有机聚合物(即塑料)基底相关的某些优势，例如最佳接触角和透明度。因此，某些实施方案涉及包含有机聚合物基底的塑料支持物。可用作有机聚合物基底的示例性材料包括：聚(苯乙烯)、聚(碳酸酯)、聚(醚砜)、聚(酮)、聚(脂肪醚)、聚(芳基醚)、聚(酰胺)、聚(酰亚胺)、聚(酯)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(烯烃)、聚(环烯烃)、聚(乙烯醇)及其聚合物、卤化衍生物或交联衍生物。卤化衍生物的实例包括卤化聚(芳基醚)、卤化聚(烯烃)和卤化聚(环烯烃)。在某些实施方案中还采用可商购的聚合物，例如AppearTM和AryLiteTM(FerraniaImaging Technologies)、APELTM和OPTICATM(Mitsui Chemicals)以及FS1700(Sumitoma Bakelite)。在一些特定实施方案中，基底包含环聚(烯烃)。
在其他实施方案中，基底包含氧化物。在其他实施方案中，基底包含硅、熔融二氧化硅、玻璃、石英、氧化铟锡、二氧化钛、氧化锆、氧化铝或其组合。如上所述，聚合物可以通过与连接物的共价键而固定于基底，所述连接物转而通过离子相互作用(而非共价键)而固定于基底。例如，在其中基底包含金属氧化物(例如硅、石英、氧化铟锡、二氧化钛、氧化锆、氧化铝等)的某些实施方案中，诸如聚烯丙胺或聚亚乙基亚胺的连接基团可以通过离子相互作用而连接于基底，并且聚合物通过至少一个热化学反应性侧基的片段与连接物之间的共价键(例如通过连接物上的胺部分)而共价结合于连接物基团。
在其他实施方案中，基底包含有机聚合物和氧化物的复合物。例如，某些实施方案提供了包含有机聚合物的支持物，在所述有机聚合物上沉积氧化物(例如二氧化硅)的层或颗粒。复合物还可以包含遍及基底的氧化物(例如二氧化硅)，而非仅在表面上。然后，聚合物可以通过硅-氧键和使用任选的连接物而固定于支持物。
有利地，某些实施方案提供了基本光学透明(例如大于90％、大于95％或大于99％)的基底，由此实现本文所述的分析方法。在某些实施方案中，基底在约400nm与约800nm之间是基本光学透明的。在其他示例性实施方案中，基底是小于约90％光学透明的。
固体支持物在微阵列分析领域发现特别的实用性。因此，在一个实施方案中，固体支持物包含不同位置的***阵列，每一不同位置独立地包括至少一个与基底外表面共价结合的聚合物。“共价结合”理解为聚合物还可以与连接物共价结合，所述连接物转而共价地或者通过离子相互作用而固定于基底。
在上述的其他实施方案中，每一不同的位置独立地包括多个与其共价结合的聚合物。例如，在一些实施方案中，在每一不同位置处的至少一个聚合物包含与其共价结合的捕获探针，而在其他实施方案中，每一不同位置包括多个结构不同的与其结合的捕获探针。
如上所述，本文聚合物通过至少一个热化学反应性基团与基底(或与其连接的连接物)的反应而固定于基底。因为未采用聚合物与基底的光诱导附着，因此所得的固体支持物由于不存在诸如二苯甲酮及其他荧光光敏连接剂(linking agent)而具有更低的背景荧光。此外，在某些实施方案中，所述多个聚合物基本不含其间的交联键，因为在不存在与基底的光诱导连接的情况下显著降低或消除了聚合物的自由基诱导的交联。在一些实施方案中，大于90％的聚合物不含分子间和分子内交联，例如，在其他实施方案中，大约95％或甚至大于99％的聚合物不含分子间和分子内交联。如上所述，基本不含分子间和分子内交联的聚合物认为在具有更大流体动力学柔性的基底上形成聚合物涂层，所述基底对于捕获探针是更可渗透的并由此是更可进入的，因此促进聚合物与捕获探针之间的结合反应。
在示例性实施方案中，本发明提供给了具有下式的反应性聚合物(即，在附着于基底之前的聚合物)：
其中A、B、R2、R3、T1、T2、y和z(及其所有所述的实施方案)如上文对附着于基底的聚合物所定义。会认识到本发明的聚合物可以在聚合物尺寸及反应性单体的相对浓度方面大幅变化。根据应用，会认识到聚合物的反应性单体部分通常为约1％至约99％，对于一些实施方案具有约5％至约95％、10％至90％、20％至80％的反应性单体。此外，该浓度可以在横跨整个范围而变化，以优化生物分子附着和装载，从而确保最佳密度，并且当通过聚合物结合时保存生物分子的构象性质。
在多个实施方案中，固体支持物和经固定的测定组件(“捕获探针”)被它们均共价连接的连接物分开。在示例性实施方案中，经固定的测定部件是核酸。在其他实施方案中，经固定的测定部件是抗体。聚合物与核酸之间的连接物的长度和化学稳定性在由支持物结合的核酸有效捕获标记的探针片段方面发挥重要作用。连接物优选足够长，以便不显著阻碍标记的探针片段对经固定的核酸的杂交。连接物的可用长度会取决于对所用的特定基底和聚合物的可测定度。
在一些方面，本发明的聚合物提供了散布遍及聚合物骨架的多个反应性官能团。这些反应性官能团提供了聚合物与基底表面的一个或多个位置的共价连接，以及提供了用于生物分子附着或捕获的多个点。通过控制聚合物的尺寸，例如通过提供分子量为200KDa至1.5MDa的亲水性聚合物骨架，允许远离支持物表面提供用于生物分子结合的反应性基团，从而提供用于生物分子结合的三维尺寸的聚合物基质。间隔和多价特性避免在与生物分子的寡核苷酸杂交或构象干扰期间于例如杂交的生物结合或反应动力学中的位阻。这是本发明的优异特性之一。
在示例性实施方案中，R6和R7独立地选自H和取代或未取代的C1、C2、C3、C4、C5和C6烃基。在多个实施方案中，R6和R7独立地选自H和取代或未取代的环烃基及取代或未取代的杂环烃基。在示例性实施方案中，R6和R7独立地选自CH3、CH2OH、CH2CH3、CH2CH2OH、CH2CH2CH3、CH(CH3)2和CH2CH2CH2CH3。
在多个实施方案中，本发明提供了固体支持物或聚合物，其中R6、R7、R8和R9中至少一个是亲水性聚合物部分，例如聚(氧化亚烃基)部分。
在多个实施方案中，本发明提供了固体支持物或聚合物，其中R8和R9中至少一个是选自H和CH3的成员。
本发明的方面包括固体支持物，其包含与直接共价结合基底表面并具有以下结构之一的聚合物：
其中A、B、R2、R3、Q和T2如上文对聚合物或固体支持物所定义，并且y+z为100mol％，其中y和z不为0mol％。这些反应性表面可以通过非反应性和反应性共聚用单体的直接UV-诱导的光接枝(photo-grating)而制备在基底(例如聚合物基底)的未经修饰的表面上。因此，本发明的聚合物提供了散布遍及聚合物骨架并束缚在溶液中以用于生物结合的多个反应性基团。
用合宜地指定为结合官能性的一个或多个基团，例如反应性官能团或结合部分来官能化本发明的示例性聚合物及用于本发明的示例性聚合物。通常，将这些官能性通过包含期望的官能性的官能单体而并入聚合物。
可以使用本领域公认的方法或本领域技术人员显而易见的对这些方法的变体，通过聚合聚合物的单体前体或低聚前体上的可聚合部分来形成本发明的聚合物。例如，在诸如vazo-52的适当引发剂的存在下，可以聚合两种反应性单体。在实施例中提供了用于制备聚合物并将其附着于基底的示例性方法。
如本领域技术人员所认识到的，尽管由示出与基底表面上的单一位点连接的单一聚合物的化学式来表示本发明的聚合物-表面方面的结构，但本发明的典型的固体支持物包括在基底表面上多个唯一位点处附着的多个聚合物。
2.结合官能性
用于本发明的结合官能性分为两类：与靶标形成共价键的反应性官能性和与靶标形成非共价键的吸附性官能性。在优选的方面，本发明的组合物包含用于使聚合物结合于基底并最终结合于生物分子的反应性官能性。
A.反应官能性
可用于时间本发明的反应性基团和反应类型通常是生物结合化学领域熟知的那些。通常，用于结合于基底和/或捕获探针的反应性基团将是热化学反应性部分。可用于本发明低聚物的反应性前体的当前有利的反应类型是在相对温和的条件下进行的那些。这些包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰基卤、反应性酯的反应)、亲电子取代(例如烯胺反应)和对碳-碳和碳-杂原子多个键的加成。这些及其他可用的反应在例如March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY,第3版,John Wiley&Sons,New York,1985；Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic Press,San Diego,1996；以及Feeney等人,MODIFICATION OFPROTEINS；Advances in Chemistry Series,Vol.198,American ChemicalSociety,Washington,D.C.,1982中讨论，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
以实例形式，用于本发明的反应性官能团包括但不限于烯烃、乙炔、醇、酚、卤化物、醛、酮、羧酸、酯(例如反应性酯)、芳基酯、酰胺、吖内酯、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮化物(diazo)、重氮鎓盐、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酸酐、次磺酸、异腈、脒、酰亚胺、酰亚胺化物(imidates)、硝酮、羟胺、肟、氧肟酸、硫代氧肟酸(thiohydroxamic acids)、丙二烯、原酸酯、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物、以及亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物结合物的那些，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。用于制备这些官能团中每一个官能团的方法是本领域熟知的，并且它们对特定目的的应用或修改在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Sandler and Karo,eds.ORGANIC FUNCTIONAL GROUPPREPARATIONS,Academic Press,San Diego,1989)。反应性官能团可用于使其他分子附着于水凝胶。例如，可以希望使诸如多肽、核酸、碳水化合物或脂质的生物分子附着于水凝胶。示例性反应性官能团包括：
(a)羧基衍生物，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并***酯、酰基卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香族酯(例如氟苯基酯(单-、二-、三-、四-和五-氟))，
(b)硫代烃基，其中可以稍后用亲核基团如溴乙酰基替代卤化物；
(c)醛或酮基团，可能通过形成羰基衍生物(例如酰亚胺、腙、缩氨基脲或肟)或通过诸如Grignard加成或烷基锂加成而后续衍生化的；
(d)磺酰卤基团，用于与胺的后续反应以例如形成磺酰胺；
(e)反应性硫醇基团，其可以与蛋白上的二硫化物反应，包括2-巯基吡啶和正吡啶基二硫化物；
(f)巯基，其可以例如被酰基化或烷基化(例如Michael加成)；
(g)烯烃，其可以经历例如Michael加成等(例如马来酰亚胺)；
(h)环氧化物，其可以与亲核物质(例如胺和羟基化合物)反应；
(i)肼基团，其与糖和糖蛋白反应；
(j)乙烯基砜；以及
(k)吖内酯。
可以选择反应性官能团以使它们不参与或不干扰它们不意欲参与的反应。或者，可以通过存在保护剂来保护反应性官能团以不参与反应。本领域技术人员会理解如何保护特定官能团以防止或降低对所选组的反应条件的干扰。对于可用的保护基团的实例，参见Greene等人,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,John Wiley&Sons,NewYork,1991。
本领域技术人员理解本文所讨论的反应性官能团仅表示可用于装配本发明芯片的官能团的子集。此外，技术人员理解反应性官能团还用作官能化膜或连接物臂的组分。
特别优选的反应性官能性的实例包括：
其中R4a、R4b、R4c、R4d和R4e各自独立地为H、卤素、腈、硝基、-NCS、-NCO、-N(H)C(S)NH-PEG、-N(H)C(O)NH-PEG、-CONH-PEG、-SO2NH-PEG、CO2H、-SO3H或其盐。
B.生物特异性结合部分
在示例性实施方案中，测定组件通过聚合物(第二表面)上反应性官能团和测定组件上反应性官能团的反应而共价固定于聚合物上。在多个实施方案中，经固定的测定组件是生物特异性结合官能性。
示例性生物特异性结合官能性是核酸，其化学结合于聚合物。在多个实施方案中，装置是包括与聚合物结合的多个核酸的核酸阵列。
用于本发明装置的核酸可以是任何合适的尺寸，例如约10个至约100个核苷酸、例如约10个至约80个核苷酸、例如约20个至约40个核苷酸的范围。本发明的核酸探针的精确序列和长度部分取决于其所结合的靶标多核苷酸的性质。
经固定的核酸可以包括DNA、RNA或者其嵌合混合物或衍生物或修饰变体。经固定的核酸可以以单链、双链、三链等形式存在。此外，核酸可以在碱基、糖部分或磷酸酯骨架处被诸如标记基团、小沟槽粘合剂、嵌入剂、能量供体和/或受体部分(例如荧光团和/或淬灭剂)等的其他基团修饰。
可以改变结合位置和长度以实现适于特定实施方案的退火和熔融性质。进行这样的设计选择的指导可以在许多现有技术公认的参考文献中得到。在一些实施方案中，经固定的核酸探针的3’-末端核苷酸被封闭或使其不能被核酸聚合酶延长。通过核酸经由核酸末端3’-位直接附着或通过连接物部分间接附着来合宜地实施这样的封闭。
多种其他生物分子可以类似地用作生物特异性官能性，条件是它们能够与关注的期望分子特异性连接。这样的基团包括例如抗体或其结合片段或它们的结合表位、特异性结合蛋白、酶、受体、或配体、凝集素、聚糖、糖结合物、适体、激素、合成产生的分析物靶标等。在本发明的优选方面的情形中，这样的生物特异性部分可以通过固有的氨基或使用上述反应性官能团来添加到特异性部分内的氨基而容易地结合于本发明的聚合物。
3.基底
在特别优选的方面，使用平面基底来形成本发明的示例性装置，尽管基底可以具有任何可用的形状或构造。反应性聚合物直接地共价连接于基底的表面，或通过与基底表面共价结合或离子结合的中间锚形物(连接物)部分而结合于基底表面。附着可以针对基底表面上的特征，例如升高(例如岛)或压低(例如孔、槽等)的区域。
可用于实践本发明的基底可以由任何合适的材料或材料组合制成。此外，可用的基底可以配置为具有任何合宜的几何形状或者结构特征的组合。基底可以是刚性或柔性的，并且可以是光学透明的或光学不透明的。基底还可以是电绝缘体、导体或半导体。当待施用于装置的样品是水基的时，优选的基底是水不溶性的。
示例性基底包括但不限于无机晶体、无机玻璃、无机氧化物、金属、有机聚合物及其组合。用于基底的无机玻璃和晶体包括但不限于LiF、NaF、NaCl、KBr、KI、CaF2、MgF2、HgF2、BN、AsS3、ZnS、Si3N4、AIN等。可以通过本领域标准技术制备晶体和玻璃。参见例如Goodman,CRYSTAL GROWTH THEORY AND TECHNIQUES,Plenum Press,New York 1974。或者，晶体可以是商购的(例如，Fischer Scientific)。用于本发明的无机氧化物包括但不限于硅、熔融二氧化硅、玻璃、石英、氧化铟锡、二氧化钛、氧化锆、氧化铝及其组合、Cs2O、Mg(OH)2、ZrO2、CeO2、Y2O3、Cr2O3、Fe2O3、NiO、ZnO、Ta2O5、In2O3、SnO2、PbO2等用于本发明的基底的金属包括但不限于金、银、铂、钯、镍、铜以及这些金属的合金和组合物。
形成可用的基底的有机聚合物包括例如聚(苯乙烯)、聚(碳酸酯)、聚(醚砜)、聚(脂肪醚)、卤化聚(脂肪醚)、聚(芳基醚)、卤化聚(芳基醚)、聚(酰胺)、聚(酰亚胺)、聚(酯)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(烯烃)、卤化聚(烯烃)、聚(环烯烃)、卤化聚(环烯烃)、聚(乙烯醇)及其聚合物、卤化和交联的衍生物。
优选的基底通常具有选自以下的多种性质：在250nm与800nm之间且优选在400nm与800nm之间的实质或基本光学透明度；在用于关注分析的相关激发波长下的低自体荧光；比装置最大操作温度高20℃的玻璃化转变温度(Tg)，例如对于热循环PCR应用的超过110℃、115℃或120℃的Tg；低吸水性(<0.05％)，在寡核苷酸点样、孵育和洗涤/封盖之后，固体支持物表面是亲水的(足以降低非特异性吸附)；基本对操作热环境有抗性，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、MEK、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、稀释的酸、稀释的碱、合成的中性表面活性剂以及高盐水性环境。特别优选的基底将包括前述性质中的多个，例如环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)基底。同时，这些环烯烃聚合物和共聚物是化学惰性的，并且不易受湿化学修饰的影响。本发明的方法提供了用于直接或间接修饰这些基底以包含用于生物结合的反应性表面的新颖的方法。
在多个实施方案中，基底由有机聚合物形成，并且还包含含有金属氧化物的结构组分，并且所述结构组分在基底表面与结合于聚合物的连接物(例如L1)之间。金属氧化物组分结合于表面和连接物。包含金属氧化物的结构组分是选自连续层和不连续层的成员。在多个实施方案中，基底还在所述基底与包含金属氧化物的结构组分之间包含结合于所述基底和结构组分的连系层。
在多个实施方案中，有利的是，装置的基底是基本光学透明的。在示例性实施方案中，基底在约400nm与约800nm之间是基本光学透明的。尽管多个光学透明度用于多个实施方案，但在示例性实施方案中，基底为至少约90％光学透明的。在示例性实施方案中，基本光学透明的基底由聚(环烯烃)形成。对于包括金属氧化物层的那些实施方案，会理解可以以透明厚度提供这样的层。
在多个实施方案中，本发明提供了具有胺化表面的基底，例如基底可以为聚合物基底。示例性基底I具有胺化表面(图7)、易受用于生物结合的预制反应性共聚物的固定的影响。通过UV光分解有机叠氮化物并随后氮烯***聚合物基底的同质表面C-H键中，从而制备示例性胺化表面。聚合物基底可以是聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚烯烃、环烯烃聚合物、聚(乙烯醇)、它们的卤化类似物、共聚物及其交联变体。
尽管在某些实施方案中，可以使用本文所述的反应性聚合物直接官能化基底表面，但在某些情况下，可以提供中间层以产生更适于结合反应性聚合物的表面。例如，在本发明的多个实施方案中，在使用或不使用等离子预处理的情况下，通过将一层二氧化硅溅射到聚合物基底或支持物的表面上，从而制备其他示例性胺化表面II(图8)。可以在聚合物表面与二氧化硅涂层之间沉积任选的中间层(连系层)以增强粘附。在多个实施方案中，二氧化硅涂层的厚度为0.5nm至500nm。可以由贵替代二氧化硅沉积。硅和二氧化硅低温沉积在聚合物基底上的技术是文献中充分记载的。聚合物基底的表面、任选的连系层、二氧化硅和二氧化硅的表面修饰形成第一表面。第一表面可以共价结合于反应性共聚物，导致形成反应性第二表面。
在多个实施方案中，可以用相对亲水性氨基烷基二异丙基乙氧基硅烷来修饰聚合物基底的二氧化硅表面，以提供带有胺基团的具有优异水解稳定性的第一面。在示例性实施方案中，具有反应性酯或吖内酯官能团的反应性共聚物可以共价固定到氨基甲硅烷基化第一表面以提供用于生物结合的反应性第二表面。
在本发明的多个实施方案中，通过用氨基丙基硅烷、优选3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷来甲硅烷化二氧化硅-聚合物复合物，从而衍生化示例性胺化表面III(图9)，这会产生优异的水解稳定性。
本发明还提供了可用于制备所公开的固体支持物的修饰基底。例如，基底可以具有包含共价结合于基底或在某些实施方案中与基底离子连接的连接物基团的外表面。连接物基团通常包含适于与一个或多个热化学反应性侧基形成共价键的反应性部分。例如，在某些实施方案中，基底包括具有共价结合于基底外表面的连接物基团的外表面，其中所述连接物部分包含可用于与一个或多个热化学反应性侧基形成共价键的胺基团。
在某些实施方案中，基底包含第一和第二表面，其中所述第一表面是同质基底的外表面，并且所述第二表面具有以下结构之一，或其盐、立体异构体或互变异构体：
其中：
L2和L3各自独立地为任选的包含亚烃基部分、氧化亚烃基部分、酰亚胺部分、醚部分、酯部分、胺部分或酰胺部分或其组合的连接物；
R10和R11各自独立地为H、羟基、烃基、烃氧基或-OQ；
R12、R13、R14和R15各自独立地为H、烷基、卤素、卤代烃基、腈、硝基、烃基铵或卤代烃基铵；
P在每次出现时独立地表示单体亚单元；
A为直接键或-S(O)2-；
Q表示基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数。
在上述基底的一些实施方案中，每一P独立地为-CH2-、-CH2CH(CH2NH2)-或-OCH2CH2-。
在上述基底的一些其他实施方案中，第二表面具有以下结构之一：
其中：
Q表示基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数；以及
a和b各自独立地为1至1999的整数。
在一些实施方案中，γ为55至90，并且可以经优化以获得期望的亲水性，以便接触角对与一个或多个上述聚合物的反应是最佳的。
在一些其他实施方案中，基底包含具有以下结构的第二表面：
其中：
A为键或-(SO2)-；
k为0至4的整数；
m为0至10的整数；
n为1至2,000的整数；以及
R17选自H、Cl、Br、F、NO2、CN、CF3和+NR18R19R20，其中R18、R19和R20各自独立地为C1至C6烃基或卤化烃基，或其中R18、R19或R20之一与R18、R19或R20中的另一个连接以形成杂环。
在本发明的示例性装置中，基底是检测室的组件。
可用于实践本发明的基底的表面优选是光滑的，以允许未扰动的光学评价。然而，在一些情况下，基底表面可以是平滑的、粗糙的和/或有图案的。基底可以包括流体通道或制成流体通道的光学元件。可以使用机械和/或化学技术来改造表面。例如，可以通过摩擦、蚀刻、印花、切槽、拉伸和倾斜沉积金属膜来粗糙化或构图表面。可以使用诸如影印法(Kleinfield等人,J.Neurosci.8:4098-120(1998))、光蚀刻、化学蚀刻和微接触印刷(Kumar等人,Langmuir 10:1498-511(1994))。用于在基底上形成图案的其他技术对本领域技术人员会是显而易见的。
可以通过所用的技术的分辨率和图案意欲的目的来控制基底上图案的尺寸和复杂性。例如，使用微接触印刷，将小至200nm的特征分层堆积在基底上。参见Xia,Y.；Whitesides,G.,J.Am.Chem.Soc.117:3274-75(1995)。同样地，点样(spotting)或喷墨沉积法也可用于构图基底。类似地，使用影印法，可以生产具有小至1μm的特征的图案。参见Hickman等人,J.Vac.Sci.Technol.12:607-16(1994)。可用于本发明的图案包括含有特征的那些，所述特征例如孔、围场、分区、凹陷、入口、出口、通道、槽、衍射光栅等。在一些情况下，可以使用相对疏水性或亲水性区域来构图表面，以促进期望位置的官能化，同时限制其他处。用于使用疏水性和亲水性区域构图基底的方法是本领域通常已知的。
在示例性实施方案中，构图用于产生具有多个邻近的可寻址特征的基底，其中每一特征分别是由检测手段可识别的。在另一示例性实施方案中，可寻址特征与其他邻近特征流体连通。因此，置于特定特征中的分析物或其他物质保持基本被限制于该特征。在另一优选的实施方案中，构图允许产生通过装置的通道，由此流体可以进入和/或排出该装置。
使用公认的技术，可以生产带有图案的基底，所述图案具有不同化学特性的区域。因此，例如，通过改变图案成分的疏水性/亲水性、电荷或其他化学特性来产生邻近且隔离的特征的阵列。例如，使用疏水性材料，通过在邻近的特征之间构图“墙壁”，可以将亲水性化合物限制于单独的亲水性特征。类似地，可以将带正电荷或带负电荷的化合物限制于具有“墙壁”的特征，所述“墙壁”由带有与受限制的化合物相似的电荷的化合物制成。通过将具有期望特性的层直接缩影在基底上，从而也获得类似的基底构造。参见Mrkish,M.；Whitesides,G.M.,Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.25:55-78(1996)。
在其中基底是聚合物的示例性实施方案中，基底由玻璃化转变温度Tg等于或大于120℃的聚合物形成。
4.制备装置
在多个实施方案中，本发明提供了用于制备本发明的聚合物、表面和装置的方法。例如，在一些实施方案中，用于制备本文所述的任一固体支持物的方法包括：
A)提供包含在其外表面上的多个反应性基团的基底；
B)使所述基底与多个聚合物接触，所述聚合物各自包含多个稀释单体和多个反应性单体，每一稀释单体包含亲水性侧基，并且每一反应性单体包含热化学反应性侧基；以及
C)在所述基底与所述多个聚合物中至少一个聚合物之间形成共价键，
其中在足以在不用UV辐射外部源进行辐射的情况下在所述基底上至少一个反应性基团与至少一个热化学反应性侧基之间形成共价键的条件下，使所述基底与所述多个聚合物接触。
在其他实施方案中，所述方法包括使固体支持物与捕获探针在足以在至少一个热化学反应性侧基与捕获探针上的反应性基团之间形成共价键的条件下接触。
在多个实施方案中，基底是本文所述的任何基底。还提供了根据本文所公开的方法制备的固体支持物。
本发明的固体支持物包括具有表面和与所述表面附着的反应性聚合物的基底。在示例性实施方案中，本发明提供了用于将测定组件固定于反应性聚合物表面的固体支持物。固体支持物包括基底和与该基地共价结合的反应性有机聚合物层。在多个实施方案中，通过使基底与具有多个反应性官能团的反应性聚合物在足以通过至少一个基底反应性官能团与至少一个反应性聚合物反应性官能团的反应形成共价键的条件下接触，从而制造固体支持物。
制备本发明的固体支持物的另一示例性方法包括形成反应性聚合物、将活化基底表面暴露于反应性聚合物溶液，由此将聚合物共价固定到基底上。在示例性实施方案中，反应性聚合物包含多个反应性酯或吖内酯部分，并且基底表面包含多个反应性胺部分。这两种类型的部分之间的反应导致在表面与聚合物之间形成胺键，从而产生第二表面。
当基底是芯片时，可以通过任何可用的方法，例如点样(对于离散的位置)、旋涂(以覆盖整个表面)、浸渍涂覆、喷射、轧制、延展、或通过长期浸渍来将聚合物施用于表面。
携带多个反应性官能团的水溶性共聚物在文献中是现存的，并且用于其合成的多种途径是公认的。可以通过N-(甲基)丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、反应性酯与丙烯酰胺或N,N-二甲基丙烯酰胺的自由基共聚来合成示例性反应性聚合物。参见例如R.L.Schnaar等人,Biochem.1975,14,2125；S.Picarra等人,Macromolecules 2003,36,8119；Y.Uemura等人,Macromolecules 1995,28,4150。然而，该类型的共聚物的一个劣势是N-氧基琥珀酰亚胺部分的水解不稳定性(参见例如Hermanson,BIOCONJUGATE TECHNIQUES,Academic Press,San Diego,2008,第179页)，导致短的保存期和非再现性。
在示例性实施方案中，本发明的聚合物是包含反应性酯或包含反应性吖内酯的共聚物。这样的反应性共聚物可以用于多种分析应用，包括结合寡核苷酸、抗体、酶和碳水化合物。参见例如E.Arca等人,Polym.Prepr.1994,35,71；F.K.Hansen等人,Colloids Surf A:Physicochem.Eng.Aspects 1996,112,85；M.N.Erout等人,BiocojugateChem.1996,7,568；C.Minard-Basquin等人,J.Appl.Polym.Sci.2004,92,3784；M.Monji等人,Appl.Biochem.Biotechnol.1987,14,107；F.M.Veronese等人,Appl.Biochem.Biotechnol.1985,11,269；R.L.Schnaar等人,Biochem.1975,14,2125。与其他聚合物不同，吖内酯通常对水解有抗性，即，在相对湿度下于周围环境中对通过下游过程的微阵列的期望特性。在一些实施方案中，还利用芳基酯(诸如五氟苯基酯的卤代苯基酯)获得类似的优势。
在多个实施方案中，本发明使用反应性共聚物IV来构建海草样支架以用于多价结合DNA和其他生物分子。在本发明的一些实施方案中，可以通过共聚丙烯酰胺与具有反应性酯官能性或吖内酯官能性的共聚用单体来制备反应性共聚物IV(图10)。可以通过R7的化学性质和r/s比来调制IV的疏水性。
在本发明的一些实施方案中，共聚物V可以用于构建用于多价生物结合的3D支架。可以通过共聚N-乙烯基酰胺连同包含活性酯或吖内酯官能性的共聚用单体来制备共聚物V(图11)。可以通过R11、R12的化学性质和w/z比来调制V的疏水性。
在本发明的多个实施方案中，使基底I与反应性共聚物IV反应产生用于多价生物结合DNA和其他生物分子的六种可能得3D支架(图12)。
在本发明的多个实施方案中，使基底I与反应性共聚物V反应产生用于多价生物结合DNA和其他生物分子的六种可能得3D支架(图13)。
在本发明的多个实施方案中，使基底II与反应性共聚物IV和V反应产生用于多价生物结合DNA和其他生物分子的四种可能得3D支架(图14)。
在本发明的多个实施方案中，使基底III与反应性共聚物IV反应产生用于多价生物结合DNA和其他生物分子的两种可能得3D支架(图15)。
在多个实施方案中，在没有连接物的情况下，可以通过UV辐射包含共聚用单体和光引发剂如二苯甲酮的表面涂层来使海草样反应性聚合物共聚并直接接枝到同质基底的表面上，如图16所示。涂层可以是厚度为1nm至1000nm的液相、半固体或固体薄膜。合宜的增稠剂或触变增稠剂可以用于在UV辐射之前调制液体涂层的粘度。还可以使用具有或不具有反应性官能团的其他聚合物增稠剂。还可以将无机填充剂如二氧化硅纳米颗粒加入涂层中。可以在UV辐射之前，通过向制剂添加二-官能或多-官能交联剂，例如分别将亚甲基双丙烯酰胺或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯加入涂层，从而制备3D交联支架。
如图16所示，一个共聚用单体中的取代基A为用于结合包含氨基的生物分子的反应性官能性。可以通过R2、R3、R8和R9的化学性质来调制接枝共聚物的疏水性。在一些实施方案中，B可以是能够降低非特异性吸附的氧化乙烯的低聚物或聚合物。
在制备支持物结合的反应性聚合物表面之后，使测定组件与聚合物上的反应性官能团反应。在示例性实施方案中，测定组件是核酸。
5.使用固体支持物的方法
本发明的固体支持物可用于离析和检测在测定混合物中的分析物。特别地，本发明的固体支持物可用于进行基本任何格式的测定，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、色谱捕获、免疫测定、竞争性测定、DNA或RNA结合测定、荧光原位杂交(FISH)、蛋白和核酸谱测定、夹心法测定等。以下讨论集中于本发明固体支持物用于实践示例性测定的用途。该焦点仅用于例示清楚，并且不意欲限定或限制本发明的范围。本领域技术人员会认识到本发明的方法可广泛地适于用于检测分析物的存在和/或量的任何测定技术。
例如，在某些实施方案中，本发明涉及用于测定靶标分析物分子存在或不存在的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求1至56中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含至少一个与其共价结合的捕获探针；
b)使所述分析物探针与所述固体支持物接触；以及
c)检测由所述捕获探针与所述分析物探针之间的相互作用产生的信号的存在或不存在。
捕获探针可以是本文所述的任何捕获探针。在某些特定实施方案中，捕获探针是多核苷酸。在一些实施方案中，分析物探针是多核苷酸。
在其他多个实施方案中，捕获探针是抗体，并且在一些实施方案中，分析物探针是蛋白。
在多个其他实施方案中，信号是荧光信号，例如可以由分析物探针与捕获探针的特异性杂交而产生荧光信号。在多个其他方面，分析物探针包含荧光团或荧光团淬灭剂。
在多个其他实施方案中，本发明提供了使用本发明的固体支持物检测靶标核酸的方法。所述方法包括将可检测标记的核酸探针片段结合于固定在本发明固体支持物的反应性聚合物上的互补序列的核酸。示例性方法包括：
(a)使扩增引物和可检测标记的探针与靶标核酸杂交；
(b)在引物依赖性扩增反应中扩增至少一部分所述靶标核酸，其中所述扩增反应导致所述标记的探针***并释放标记的探针片段；以及
(c)使所述标记的探针片段与经固定的测定组件杂交，其中所述组件是与所述标记的探针片段至少部分互补的核酸，由此检测所述核酸。
在多个实施方案中，所述方法包括使分析物(分析物探针)与本发明的固体支持物接触以允许由本发明固体支持物的反应性聚合物捕获分析物，并检测分析物的捕获。在某些实施方案中，分析物是生物分子，例如多肽、蛋白、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白或其杂交物。在其他实施方案中，分析物是有机分子，例如药物、药物候选物、辅因子或代谢物。在另一实施方案中，分析物是无机分子，例如金属络合物或辅因子。在示例性实施方案中，分析物是核酸，其是标记的探针。在另一实施方案中，分析物是蛋白。在另一示例性实施方案中，本发明提供了反应性表面，其共价固定蛋白、酶、抗体、抗原、激素、碳水化合物、糖结合物或合成产生的分析物靶标，例如合成产生的可用于在后续步骤中捕获和检测分析物的表位。
分析物的检测可以通过任何本领域公认的方法或固体支持物而完成。在某些实施方案中，通过由固定在固体支持物上的分析物或探针产生的荧光信号来检测分析物。在示例性实施方案中，本发明的固体支持物是核酸阵列，并且信号由与固定在固体支持物的反应性聚合物上的测定组件杂交的荧光标记的核酸产生。在多个实施方案中，经固定的测定组件是具有与荧光标记的核酸的序列至少部分互补的序列的核酸。在其中分析物是荧光标记的所选实施方案中，其通过诸如CCD阵列的荧光检测器检测。在某些实施方案中，所述方法包括通过将样品施用于固体支持物的一个或多个可寻址位置并检测在所述一个可寻址位置或多个可寻址位置处捕获的分析物，从而剖析(profiling)样品中某一类型的分析物(例如生物分子，如核酸)。利用本发明的特别优选的固体支持物和方法的实例包括于2011年11月17日提交的第61/561,198号美国临时专利申请和USSN 13/399,872中描述的那些，其全部公开内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
样品可以来自任何源，并且可以是生物样品，例如来自一个生物体或一组相同或不同物种的生物体的样品。生物样品可以是体液样品，例如血液样品、血清样品、淋巴液样品、骨髓样品、腹水、胸膜液、盆腔洗液、眼内液、尿液、***、痰或唾液。生物样品也可以是来自皮肤、鼻内、喉咙或生殖器棉签的提取物，或者粪便物的提取物。生物样品还可以是包括肿瘤在内的器官或组织的样品。生物样品还可以是细胞培养物的样品，包括细胞系和原核细胞和真核细胞的原代培养物。
样品可以来自环境，例如来自水体(a body of water)或来自土壤，或来自食物、饮料、或水源、工业源、车间区域、公共区域或生活区域。样品可以是提取物，例如土壤或食物样品的液体提取物。样品可以是通过洗涤或浸泡或悬浮来自诸如工具、衣着用品、人工制品或其他材料的物品的棉签而制成的溶液。
样品可以是未处理的或处理的样品；处理可以包括增加样品组分的纯度、浓度或可及性以有利于样品分析的步骤。作为非限制性实例，处理可以包括减小样品体积，除去或分离样品组分，溶解样品或者一个或多个样品组分，或者破坏、修饰、暴露、释放或离析样品组分的步骤。这样的程序的非限制性实例是离心、沉淀、过滤、均化、细胞溶解、抗体结合、细胞分离等。例如，在本发明的一些优选的实施方案中，样品是至少部分经处理的血液样品，例如通过除去红血细胞、通过浓缩、通过选择一个或多个细胞或病毒类型(例如，白血细胞或致病细胞)或通过溶解细胞等。
示例性样品包括至少部分纯化的核酸分子的溶液。核酸分子可以来自单一源或多个源，并且可以包括DNA、RNA或二者。例如，核酸分子的溶液可以是经历任何以下步骤的样品：细胞溶解、浓缩、提取、沉积、核酸选择(例如聚A RNA选择或包含Alu元件的DNA序列的选择)、或者用一种或多种酶处理。样品还可以是包含合成核酸分子的溶液。
在示例性实施方案中，当本发明的固体支持物用于检测和/或表征核酸时，本发明的固体支持物是具有与已知位置的表面结合的聚合物共价结合的不同序列的多个核酸的核酸阵列。在多个实施方案中，芯片是反应容器中的组件，其中在测定混合物中包含的靶标核酸样品上进行PCR。在示例性实施方案中，一个或多个核酸引物和可检测标记的核酸探针与靶标核酸杂交。在PCR模板延长期间，探针***，产生探针片段。探针片段从靶标核酸释放并被在表面结合的聚合物上的经固定的分析物组分捕获，所述经固定的分析物组分是核酸。探针序列通过其在阵列上的结合位置而测定。
在多个实施方案中，本发明的固体支持物用作用于检测在测定混合物中的一种或多种物质的多重测定的组件。本发明的固体支持物特别可用于进行多重型分析和测定。在示例性多重分析中，使用两个或更多个探针检测两个或更多个不同的物质(或者一个或多个物质的区域)，其中每一探针用不同的荧光团标记。本发明的固体支持物允许设计多重测定，其中多于一个的可检测标记的探针结构用于该测定。使用本发明的固体支持物的诸多不同的多重测定对于本领域技术人员是显而易见的。在一个示例性测定中，至少两个不同的荧光团中的每一个用于信号转导核酸探针片段对表面固定的核酸的杂交。
用于实践本发明方法的示例性标记的探针是核酸探针。可用的核酸探针包括在多种DNA扩增/量化策略中用作检测剂组分的那些以及在溶液相或固相(例如阵列)测定中用于直接检测靶标的那些，所述策略包括例如5’-核酸酶测定、链替代扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)。此外，固体支持物和低聚物可用于基本任何格式的探针，包括例如选自分子信标、Scorpion probesTM、SunriseprobesTM、构象辅助探针、发光探针(light up probe)、Invader Detection探针和TaqManTM探针的格式。参见例如Cardullo,R.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.Chem.Physics,21:836-850(1953)；Hochstrasser,R.A.,等人,Biophysical Chemistry,45:133-141(1992)；Selvin,P.,Methods in Enzymology,246:300-334(1995)；Steinberg,I.,Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.,Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang,G.,等人,TetrahedronLetters,31:6493-6496(1990)；Wang,Y.,等人,Anal.Chem.,67:1197-1203(1995)；Debouck,C.,等人,nature genetics增刊,21:48-50(1999)；Rehman,F.N.,等人,Nucleic Acids Research,27:649-655(1999)；Cooper,J.P.,等人,Biochemistry,29:9261-9268(1990)；Gibson,E.M.,等人,Genome Methods,6:995-1001(1996)；Hochstrasser,R.A.,等人,Biophysical Chemistry,45:133-141(1992)；Holland,P.M.,等人,ProcNatl.Acad.Sci USA,88:7276-7289(1991)；Lee,L.G.,等人,Nucleic AcidsRsch.,21:3761-3766(1993)；Livak,K.J.,等人,PCR Methods andApplications,Cold Spring Harbor Press(1995)；Vamosi,G.,等人,Biophysical Journal,71:972-994(1996)；Wittwer,C.T.,等人,Biotechniques,22:176-181(1997)；Wittwer,C.T.,等人,Biotechniques,22:130-38(1997)；Giesendorf,B.A.J.,等人,Clinical Chemistry,44:482-486(1998)；Kostrikis,L.G.,等人,Science,279:1228-1229(1998)；Matsuo,T.,Biochemica et Biophysica Acta,1379:178-184(1998)；Piatek,A.S.,等人,Nature Biotechnology,16:359-363(1998)；Schofield,P.,等人,Appl.Environ.Microbiology,63:1143-1147(1997)；Tyagi S.,等人,Nature Biotechnology,16:49-53(1998)；Tyagi,S.,等人,NatureBiotechnology,14:303-308(1996)；Nazarenko,I.A.,等人,Nucleic AcidsResearch,25:2516-2521(1997)；Uehara,H.,等人,Biotechniques,26:552-558(1999)；D.Whitcombe,等人,Nature Biotechnology,17:804-807(1999)；Lyamichev,V.,等人,Nature Biotechnology,17:292(1999)；Daubendiek,等人,Nature Biotechnology,15:273-277(1997)；Lizardi,P.M.,等人,Nature Genetics,19:225-232(1998)；Walker,G.,等人,Nucleic Acids Res.,20:1691-1696(1992)；Walker,G.T.,等人,ClinicalChemistry,42:9-13(1996)；and Compton,J.,Nature,350:91-92(1991)。
在多个实施方案中，本发明提供了检测靶标核酸序列中的多态性的方法。多态性是指在群体中出现两个或更多个遗传确定的可替代的序列或等位基因。多态标记物或位点是发生趋异的基因座。示例性标记物具有至少两个等位基因，每一个以所选群体的大于1％且更优选大于10％或20％的频率出现。多态基因座可以小至一个碱基对。多态标记物包括限制片段长度多态性、可变数量的串联重复序列(VNTR’s)、高变区、小卫星(minisatellites)、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列、简单序列重复序列以及诸如Alu的嵌入元件。第一识别等位基因形式任意指定为参考形式，并且其他等位基因形式指定为可替代或可变等位基因。在所选群体中最频繁出现的等位基因形式有时称为野生型形式。二倍体生物体对于等位基因形式可以是纯合的或杂合的。二对等位基因多态性具有两种形式。三对等位基因多态性具有三种形式。
在示例性实施方案中，本发明的固体支持物用于检测单一核苷酸多态性。单一核苷酸多态性发生在被单一核苷酸占据的多态位点，其是等位基因序列之间的变化位点。通常在位点之前和之后是等位基因的高保守序列(例如在小于1/100或1/1000的群体成员内变化的序列)。单一核苷酸多态性通常由于用一个核苷酸取代多态位点上的另一个核苷酸而产生。转换是一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一嘧啶替换。颠换是嘌呤被嘧啶替代或反之亦然。单一核苷酸多态性还可以通过相对于参考等位基因删除核苷酸或***核苷酸而产生。
在其中检测多态性的实施方案中，将多态核苷酸结合于固体支持物的可寻址位置。可检测的信号在特定位置的出现表示在靶标核酸序列中存在多态性。
在示例性实施方案中，用荧光团部分来可检测地标记探针。存在大量的文献中可得的用于对特定探针选择适当荧光团的实务指导，如以下参考文献所例示：Pesce等人,Eds.,FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker,New York,1971)；White等人,FLUORESCENCE ANALYSIS:A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker,New York,1970)；等。文献还包括为选择荧光团提供荧光团和发色分子以及它们的相关光学性质的详细列举的参考文献(参见例如,Berlman,HANDBOOK OF FLUORESCENCESPECTRA OF AROMATIC MOLECULES,第2版(Academic Press,New York,1971)；Griffiths,COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press,New York,1976)；Bishop,Ed.,INDICATORS(PergamonPress,Oxford,1972)；Haugland,HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes,Eugene,1992)Pringsheim,FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers,NewYork,1949)；等。此外，文献中存在用于衍生化荧光团分子以经由可向核酸添加的共有反应性基团而共价连接的大量指导，如以下参考文献所例示：Haugland(见上文)；Ullman等人,第3,996,345号美国专利；Khanna等人,第4,351,760号美国专利。因此，对特定应用选择能量交换对并使该对的成员结合于探针分子(例如核酸、肽或其他聚合物)完全在本领域技术人员能力之内。
鉴于与使小分子与核酸结合相关的大量完备的文献，将供体/受体对附着于核酸的许多其他方法对本领域技术人员会是显而易见的。例如，在经由用亚磷酰胺部分衍生化的染料的固相合成结束时，若丹明和荧光素染料合宜地附着于核酸的5’-羟基(参见例如,Woo等人,第5,231,191号美国专利；以及Hobbs,Jr.,第4,997,928号美国专利)。
更具体地，存在用于使基团附着于核酸的5’-或3’-末端的许多连接物部分和方法，如以下参考文献所例示：Eckstein,编辑,Nucleicacids and Analogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Zuckerman等人,Nucleic Acids Research,15:5305-5321(1987)(核酸上的3’-硫醇基团)；Sharma等人,Nucleic Acids Research,19:3019(1991)(3’-巯基)；Giusti等人,PCR Methods and Applications,2:223-227(1993)以及Fung等人,第4,757,141号美国专利(经由得自P.E.Biosystems,CA.的Aminolink TM II的5’-磷酸氨基)；Stabinsky,第4,739,044号美国专利(3-氨基烃基磷酰基)；Agrawal等人,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)(经由亚连酰胺键的附着)；Sproat等人,Nucleic AcidsResearch,15:4837(1987)(5-巯基)；Nelson等人,Nucleic AcidsResearch,17:7187-7194(1989)(3’-氨基)，等。
检测荧光标记的手段是本领域技术人员熟知的。因此，例如，可以通过用合适波长的光激发荧光团并检测所得的荧光来检测荧光标签。可以通过目视、通过感光胶片、通过使用电子检测器如电荷耦合固体支持物(CCD)或光电倍增管等来检测荧光。类似地，可以通过向酶提供适当的基底并检测所得的反应产物来检测酶标记。
尽管通过参考荧光标记的核酸的检测来进行例示，但本发明的芯片可用于检测分析物分子。当聚合物被结合基团官能化之后，芯片会在表面上捕获与特定基团结合的分析物。未结合的材料可以被洗掉，并且可以以诸多方式检测分析物，包括例如气相离子光谱测定法、光学方法、电化学方法、原子力显微镜检查以及射频方法。示例性光学方法包括例如检测荧光、发光、化学发光、吸光率、反射率、透光率、双折射率或折射率，例如表面等离子体共振、椭圆光度法、石英晶体微量天平、共振成像法、光栅耦合器波导法(例如波长询问光学传感器(“WIOS”)或干涉量度法)。光学方法包括显微镜检查(共焦和非共焦的)、成像法和非成像法。多种格式的免疫测定(例如ELISA)是用于检测在固相上捕获的分析物的通用方法。电化学方法包括伏安法和电流滴定法。射频方法包括多极共振光谱法或干涉量度法。光学方法包括显微镜检查(共焦和非共焦的)、成像法和非成像法。多种格式的免疫测定(例如ELISA)是用于检测在固相上捕获的分析物的通用方法。电化学方法包括伏安法和电流滴定法。射频方法包括多极共振光谱法。
有利于本发明低聚物与靶标核酸分子之间的杂交的条件可以由本领域技术人员经验地确定，并且包括最佳孵育温度、盐浓度、低聚物类似物探针的长度和碱基组成、以及样品的低聚物和核酸分子的浓度。优选地，在至少1毫摩的镁离子的存在下且在高于6.0的pH下进行杂交。在一些实施方案中，可以必须或期望地在杂交前处理样品以使样品中的核酸分子成为单链的。这样的处理的实例包括但不限于使用碱的处理(优选之后是中和)、高温孵育、或使用核酸酶的处理。
此外，因为对核酸杂交的盐依赖性很大程度上由杂交寡核苷酸类似物骨架的电荷密度决定，所以增加本发明的HypNA-pPNA低聚物或SerNA-pPNA低聚物中pPNA单体的比例可以增加杂交的盐依赖性。这可用于使本发明的方法处于优势，其中在某些方面，例如可以期望能够通过改变盐条件来增加杂交严格性，或通过降低盐浓度来释放杂交的核酸。在本发明的其他方面，可以期望在盐非常低时具有本发明寡核苷酸类似物与核酸的高亲和性结合。在该情况下，保持本发明低聚物类似物中HypNA与pPNA之比接近1:1是有利的。
本发明的低聚物在与靶标核酸分子结合方面的高度特异性允许从业者选择可有利于核酸序列与靶标核酸分子之间的鉴别的条件，所述核酸序列包括与一个或多个低聚物中至少一部分完全互补的一段序列，所述靶标核酸分子包括在基本互补的序列内的少量非互补碱基的一段序列。例如，可以选择允许本发明低聚物与靶标核酸分子(其沿着一段序列是完全互补的)之间的稳定杂交物、但促进本发明低聚物与靶标核酸分子(其不是完全互补的，包括含有沿着一段互补序列的一个或两个碱基错配的那些)之间解离的杂交或洗涤温度。用于杂交和洗涤的温度的选择可以至少部分地取决于其他条件，例如盐浓度、低聚物和靶标核酸分子的浓度、低聚物与靶标核酸分子的相对比例、待杂交的低聚物的长度、低聚物和靶标核酸分子的碱基组成、寡核苷酸类似物分子的单体组成，等。此外，当选择有利于完全互补的分子的稳定杂交物且不利于低聚物与靶标核酸分子(其错配了一个或多个碱基)之间的稳定杂交物的条件时，可以考虑额外的条件，并且若需要，可以改变所述额外的条件，包括但不限于，待杂交的寡核苷酸类似物的长度、低聚物与靶标核酸分子之间互补性的该段序列的长度、互补性的一段序列内非互补碱基的数量、错配的碱基的名称、在错配的碱基附近的碱基的名称、以及任何错配的碱基沿着互补性一段的相对位置。(参见例如实例20、27、28和29。)核酸杂交领域的技术人员能够确定在将本发明的低聚物用于与靶标核酸分子杂交时有利的杂交和洗涤条件，这取决于特定的应用。“有利的条件”可以是有利于低聚物与靶标核酸分子(其至少部分地是基本互补的，包括含有一个或多个错配的那些)之间的稳定杂交物的那些条件。
“有利的条件”可以是有利于低聚物与靶标核酸分子(其至少部分地是完全互补的)之间的稳定杂交物且不利于非完全互补的分子之间的杂交物或使该杂交物不稳定的那些条件。
使用诸如本文公开的那些方法的方法，可以确定与不同序列的靶标核酸分子杂交的本发明低聚物的熔融温度，并且可以用于确定给定应用的有利条件。还可以通过例如使靶标核酸分子与附着于固体支持物的低聚物杂交并检测杂交的复合物，从而经验地确定有利的杂交条件。
通过使低聚物探针直接或间接地附着于固体支持物，可以合宜且有效地将与本发明的固体支持物或低聚物探针结合的靶标核酸分子与调查总体(survey population)的未结合的核酸分子分开。固体支持物可以高严格性洗涤，以除去未与低聚物探针结合的核酸分子。然而，低聚物探针与固体支持物的附着不是本发明的必要条件。例如，在一些应用中，可以通过经由基质的离心，或通过相分离、或些许通过其他形式的分离(例如示差沉淀)来分离结合和未结合的核酸分子，其中可以任选地通过并入低聚物探针的化学基团来辅助所述其他形式的分离(参见例如Nie等人的第6,060,242号美国专利，发布于2000年5月9日)。
在示例性实施方案中，本发明的固体支持物用于实时PCR测定，例如共同拥有且共同待审的第13/399,872号美国专利申请所述的那些。
提供以下实施例来阐明本发明所选的实施方案，并且不应解释为限制其范围。
实施例
实施例1
合成BOC-NH-PEG57-乙酰-(4-叠氮)苯胺
将4-叠氮苯胺盐酸盐(51mg,300μmol,Sigma-Aldrich)溶解在水(10mL)和1N NaOH(10mL)中，然后萃取入EtOAc(3×20mL)。有机相用水洗涤，然后用饱和NaCl洗涤，然后经Na2SO4干燥。蒸发产生琥珀色油形式的叠氮苯胺的游离碱。玻璃器皿始终包裹在箔中，以使对室内光的暴露最小化。在单独的烧瓶(烘箱干燥的)中放置平均MW2800的Boc-氨基-PEG57-乙酸NHS酯(280mg,100μmol,Laysan Bio,Arab,AL)连同干燥的DMF(250μL)和TEA(27μL,200μmol)。向其添加在少量DMF中的叠氮苯胺。将烧瓶用Ar吹扫，然后密封，用箔覆盖，并且振荡过夜。通过TLC(DCM/MeOH/TEA,80:20:1)，观察单UV-活性产物(Rf＝0.25)连同未反应的叠氮苯胺(Rf＝0.88)。用EtOAc(5mL)稀释反应混合物，并且产物通过滴加至涡旋的己烷而沉淀，并且置于-20℃的冷冻箱中过夜。在玻璃熔块上收集沉淀物，用己烷洗涤，然后再溶解在EtOAc中并如先前那样再沉淀。在收集之后，由MeOH将产物再干燥至恒定重量(189mg,65％)。将米黄色吸湿固体密封并储存在黑暗中，直至使用。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.36(s,1H),7.69(d,2H),7.08(d,2H),6.62(dd,1H),4.07(s,2H),3.4-3.6(m,230H),2.91(dd,2H),1.37(s,9H)；13C-NMRδ:172.24,172.17,168.80,156.11,136.19,134.73,121.71,119.91,73.18,51.87,40.08,28.78。
实施例2
合成BOC-NH-PEG44-乙酰-(4-叠氮)苯胺
将4-叠氮苯胺盐酸盐(100mg,600μmol,Sigma-Aldrich)溶解在水(20mL)和1N NaOH(20mL)中，然后萃取入EtOAc(3×40mL)。如上那样处理萃取物以产生游离碱。在单独的烧瓶(烘箱干燥的)中放置平均MW 2000的Boc-氨基-PEG44-乙酸NHS酯(400mg,200μmol,LaysanBio,Arab,AL)连同干燥的DMF(1000μL)和TEA(55μL,400μmol)。向其添加在少量DMF中的叠氮苯胺。将烧瓶用Ar吹扫，密封，覆盖，并振荡过夜。通过TLC(DCM/MeOH/TEA,80:20:1)，观察单UV-活性产物(Rf＝0.38)连同未反应的叠氮苯胺(Rf＝0.88)。用EtOAc(10mL)稀释反应混合物，并且产物通过滴加至涡旋的戊烷而沉淀，并且置于-20℃的冷冻箱中过夜。在玻璃熔块上收集沉淀物，用己烷洗涤，然后再溶解在EtOAc中并如先前那样再沉淀。在收集之后，由MeOH将产物再干燥至恒定重量(272mg,65％)。将米黄色吸湿固体密封并储存在黑暗中，直至使用。1H-NMR(DMSO-d6)δ:9.69(s,1H),7.69(d,2H),7.08(d,2H),6.74(dd,1H),4.07(s,2H),3.53(s,2H),3.46-3.52(m,178H),3.05(dd,2H),1.37(s,9H)。
实施例3
合成N-(4-叠氮苯甲酰基)聚丙烯酰胺
程序改编自Sugawara等人,Macromolecules 27,7809-14,(1994)。制备KHCO3(0.28g,2.8mmol)于水(42mL)中的溶液。向其添加MW120-200K的聚丙烯酰胺盐酸盐(Alfa Aesar,0.69g,约9.4mmol胺)、4-叠氮苯甲酸(TCI,0.38g,2.8mmol)和DMF(14mL)。将混合物在冰浴中搅拌并冷却。然后，缓慢滴加EDC(0.59g,3.1mmol)于DMF(1mL)和水(0.5mL)的混合物中的溶液。将反应混合物搅拌至室温过夜，屏蔽环境光。过夜后，溶液的pH为6.7。将溶液转移至大型透析管(SnakeskinMWCO 7000,Pierce)中并在水(14L)中透析24小时。将水更换两次，总透析时间为72小时。将透析液在微型离心管中冷冻并冻干(Speedvac)以产生0.70g的叠氮苯甲酰基聚合物。1H-NMR(D2O)δ:7.87(s,2H),7.03(d,2H),3.01(br s,8.8H),1.96(br s,4.4H),1.48(br s,4.4H)。基于芳香族与脂肪族(聚合物骨架)质子之比，叠氮苯甲酰基取代为约1个/4.4个胺，或23％。
实施例4
载玻片的表面预处理
将显微镜载玻片(1”×3”×1mm)在包含0.5wt％SDS溶液的玻璃染色广口瓶中进行超声处理20分钟，并且用DI水彻底冲洗。接下来将其在1:1:5v/v比的29％NH4OH、30％H2O2和DI水的混合物中进行超声处理20分钟，并且用DI水彻底冲洗。然后将载片在1:1:6v/v比的38％HCl、30％H2O2和DI水的混合物中进行超声处理20分钟，并且用DI水彻底冲洗。将预处理的载片贮存在加盖的广口瓶的DI水中。在使用之前，将载片从其水贮存中移除，用氩气吹干，并且在110℃烘烤5分钟。预处理的载玻片呈现出水接触角<10°。
实施例5
用3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷将载玻片甲硅烷基化
将5个预处理的载玻片浸入在螺旋盖聚丙烯染色管中的无水EtOH(30mL)、3-氨基丙基二异丙基乙氧基(500μL)和三乙胺(TEA,20μL)的混合物中。在定轨振荡器上轻轻地旋转该管2至3小时。将载片从反应混合物移除，用足量的95％EtOH冲洗，用氩气风干，并且在110℃烘箱中退火5分钟。甲硅烷基化的载玻片呈现水接触角为55.8°±1.8°，并且其在制备之后立即使用。
实施例6
用于制备聚(N,N-二甲基丙烯酰胺-共-五氟苯基丙烯酸酯)，聚(DMA-共-PFPA)的一般程序
在使用之前，分别在58-60℃/3.5mm Hg和42-43℃/5托下通过真空蒸馏来纯化N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA,Sigma-Aldrich)和五氟苯基丙烯酸酯(PFPA,Monomer-Polymer Dajac)。向在玻璃安瓿中的包含DMA(991.3mg,10.0mmol)、PFPA(238.11mg,1.0mmol)、2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)(1.0mg)和ACN(3.0mL)的混合物鼓入超纯氩气，持续1分钟。然后，将安瓿密封且置于55℃油浴中22小时。将密封破坏，减压除去溶剂，并且将残余物溶解在最低量的THF中。在连续搅拌下，将THF溶液滴加入10倍体积的正戊烷中。将沉淀的聚合物离心并丢弃上清液。将聚合物在戊烷(40mL)中磨碎，过滤，并在40℃真空干燥。
该一般程序适用于制备DMA与PFPA单体供给比例为如100:3、100:7和100:20的多种共聚物。
实施例7
在35％DMA摩尔供给速率下制备聚(N,N-二甲基丙烯酰胺-共-五氟苯基丙烯酸酯),聚(DMA-共-PFPA)
根据上述一般程序制备包含约35摩尔％DMA的DMA/PFPA聚合物。用流率为约60mL/min的超纯氩气吹扫(鼓泡)在150-mL圆底玻璃烧瓶中的2.24g(22.58mmol)DMA和10.01g(42.03mmol)PFPA以及10.1mg(0.041mmol)2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)(Vazo-52,51℃10h t1/2,0.01g)于30mL无水乙腈中的溶液，并且在200rpm下磁力搅拌45分钟。然后，将反应烧瓶沉入55℃的油浴中。将氩气流率和磁力搅拌分别降低至约25mL/min和120rpm。在这样的条件下进行聚合19小时。将粘稠的反应混合物冷却至环境温度，并且在分离纯化(workup)之前暴露于环境大气。
在19小时结束时，在约55℃下于水浴中持续30分钟来减压除去(旋转蒸发)溶剂，并且在59℃下于高真空下持续3小时以除去残余单体。将聚合物产物再溶解在40mL无水THF中，同时在55℃油浴下在开放空气搅拌。通过磁力搅拌，滴加50mL正己烷，直至溶液变得稍微浑浊。通过22规格注射器针头以细流形式将浑浊的悬浮液添加至连续用干燥氮气充溢的2-L PP锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)中的1400-mL正己烷，同时使用2"PTFE搅拌桨叶剧烈搅拌。将沉淀的聚合物再搅拌5分钟，然后转移入600mL新鲜的正己烷中，并轻轻地搅拌5分钟。将聚合物转移入另一600mL的新鲜的正己烷中，并且浸泡15分钟。沉淀的聚合物为粗糙纤维形式。将其转移入500-mL广口玻璃瓶，并且在55℃真空干燥22小时，从而产生10.6792g(87.1％产率)的聚(DMA-共-PFPA)。
所用的一般程序可用于制备具有任何期望比例的稀释剂和反应性单体的聚合物。
实施例8
用于将聚(DMA-共-PFPA)表面固定在氨基甲硅烷基化载玻片上的一般程序
在包含ACN(30mL)的聚丙烯载片染色管中添加TEA(150μL)和聚(DMA-共-PFPA)(10.0mg,DMA摩尔供给比为100:3)。将四个氨基甲硅烷基化显微镜载玻片浸入该溶液中，并且轻轻地翻滚，持续4至16小时。将其移除，用足量的乙腈冲洗，并且用氩气风干。水接触角为58.4°±4.3°。
实施例9
制备聚(N,N-二甲基丙烯酰胺-共-2-乙烯基-4,4’-二甲基吖内酯),聚(DMA-共-VAL)，DMA与VAL单体摩尔供给比90:10
在26-27℃/600毫托下，通过真空蒸馏来纯化2-乙烯基-4,4’-二甲基吖内酯(VAL,Polysciences,Inc.)。将再蒸馏的DMA(4.80g,48.5mmol)、VAL(0.74g,5.39mmol)和AIBN(15.9mg,0.097mmol)在ACN(30mL)中的混合物置入150-mL 14/20三颈烧瓶中，其装备有水冷冷凝器、与超纯Ar连接的20cm 19-规格SS抽血针头(bleeding needle)以及与矿物油鼓泡器连接的排气19规格SS针头。将氩气通过溶液鼓泡20分钟，然后将烧瓶浸入71℃的油浴，并且连续搅拌3至4小时。在60℃下减压除去溶剂。将残余物在50℃真空下干燥2至3小时，以产生涂覆在烧杯壁上的玻璃状聚合物。然后，将聚合物再溶解在甲基乙基酮(15mL)中。通过连续搅拌，滴加石油醚，直至溶液变得浑浊。然后，向该浑浊悬浮液滴入过量的石油醚(200mL)并剧烈搅拌。将所得的上清液丢弃，并且将残余的聚合物在新鲜的石油醚(200mL)中研磨10分钟。将沉淀的聚合物过滤，用石油醚冲洗，并且真空干燥，从而产生4.30g(77.2％产率)的聚合物产物。
实施例10
制备聚(N,N-二甲基丙烯酰胺-共-2-乙烯基-4,4’-二甲基吖内酯),聚(DMA-共-VAL)，DMA与VAL单体摩尔供给比80:20
按照上述相同的程序，用含再蒸馏的DMA(3.21g,32.3mmol)、VAL(1.14g,8.17mmol)和偶氮双(2,4-二甲基戊腈)(22.4mg,0.090mmol)的ACN(30mL)制备另一批次的共聚物。产率为3.58g(82.1％)。
实施例11
制备聚(N,N-二甲基丙烯酰胺-共-2-乙烯基-4,4’-二甲基吖内酯),聚(DMA-共-VAL)，DMA与VAL单体摩尔供给比87:13
按照上述程序，用含再蒸馏的DMA(3.50g,38.3mmol)、VAL(0.750g,5.39mmol)和AIBN(10.5mg,0.064mmol)的ACN(30mL)制备另一批次的共聚物。产率为2.98g(70.0％)。
实施例12
制备聚(N,N-二甲基丙烯酰胺-共-2-乙烯基-4,4’-二甲基吖内酯),聚(DMA-共-VAL)，DMA与VAL单体摩尔供给比93:7
按照上述程序，用含再蒸馏的DMA(3.80g,38.3mmol)、VAL(0.406g,2.91mmol)和2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)(19.4mg,0.078mmol)的ACN(30mL)制备另一批次的共聚物。产率为4.10g(97.2％)。
实施例13
通过UV使叠氮苯甲酰基-(10mol％)-聚(烯丙胺)从溶液接枝到COC载片上，及后续表面固定DMA与PFPA单体摩尔供给比为100:3的聚(DMA-共-PFPA)
通过将包含约10mol％4-叠氮苯甲酰基团的N-叠氮苯甲酰-聚(烯丙胺)(4.0mg)溶解在DI水(180μL)中来制备接枝溶液。用95％EtOH彻底冲洗COC载片(1”×3”×1mm)，并用Ar风干。干燥的COC载片在UV-接枝之前呈现出水接触角大于85°。将等分部分的聚合物溶液(90μL)转移到COC载片的中心上，并且通过在其顶部上铺放石英载片(1”×3”×1mm)而将其延展以覆盖整个COC载片。制备总共两个样品用于UV接枝。将夹心组装件放在365nm UV光源(BondWang,Electro-Lite Corp.,10mW/cm2)下5cm处，并且暴露于UV辐射15分钟。将夹心组装件浸入DI水中，并且分离COC载片且用DI水充分冲洗。然后，将载片在0.5N HCl(30mL)中翻滚60分钟。替换0.5N HCl一次且再翻滚60分钟，然后将其用DI水冲洗并用Ar风干。接触角为31.7°±3.7°。
向在聚丙烯染色管中的无水乙腈(30mL)添加TEA(150μL)和DMA与PFPA摩尔供给比为100:3的聚(DMA-共-PFPA)(10.0mg)。将2个经洗涤且干燥的UV-接枝COC载片浸入这种溶液中，并且轻轻地翻滚4至16小时，然后移除，用乙腈充分冲洗，并且用氩气风干。水接触角为45.4°±3.2°。
该程序用于具有一定范围的4-叠氮苯甲酰基取代水平的多种叠氮苯甲酰基-聚(烯丙胺)组合物以用于后续UV-接枝到COC或COP表面上。
实施例14
通过UV使BOC-氨基-PEG57-乙酰-(4-叠氮)苯胺干燥膜接枝到COP载片上，脱保护氨基，及随后表面固定DMA与PFPA单体摩尔供给比为100:3的聚(DMA-共-PFPA)
通过将Boc-氨基-PEG57-乙酰-(4-叠氮)苯胺(20.1mg)溶解在DI水(200μL)中来制备接枝溶液。用95％EtOH彻底冲洗COC载片(”×3”×1mm)，并用Ar风干。干燥的载片呈现出水接触角大于90°。载片的一侧在开放空气中用电晕放电处理，使载片在电晕处理器(Electro-Technic Products,Inc.,Model BD-20)下0.5cm距离处通过7次。电晕处理的表面呈现出水接触角为40.0°±1.9°。向电晕处理的表面的中心放置等分部分的接枝溶液(100μL)，并且用不锈钢抹刀延展以覆盖整个表面。接枝溶液均匀地涂覆表面并干燥以在暗箱中于环境温度下蒸发过夜之后形成薄膜。通过将干燥膜面朝上，然后将载片放在365nm UV光源(BondWang,Electro-Lite Corp.,10mW/cm2)下5cm处，并且暴露于UV辐射15分钟。UV辐射的表面用乙腈充分冲洗，并且用氩气风干，从而产生水接触角为57.1°±1.6°的经接枝的表面。为了脱保护经接枝的氨基，将载片浸入含5％三氟乙酸的MeOH中，并且翻滚60分钟。然后，载片用足量MeOH冲洗，并且用Ar风干，从而产生水接触角为61.9°±3.7°的胺表面。将载片随后浸入聚(DMA-共-PFPA)(DMA与PFPA单体摩尔供给比为100:3)(17.9mg)和TEA(150μL)在ACN(30mL)的溶液中。将载片翻滚60分钟，用足量乙腈冲洗，并用氩气风干，从而产生水接触角为53.2°±3.9°的表面。
实施例15
氨基甲硅烷基化SiO2溅射的表面及随后固定DMA与PFPA单体摩尔供给比为100:3的PFPA共聚物
COC或COP载片的一面用等离子蚀刻处理，并随后在80℃下用板(palate)进行SiO2溅射(Hionix,Inc.,San Jose,CA)。沉积的SiO2的平均厚度为并且水接触角小于10°。将二氧化硅溅射的COC和COP载片浸入3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷(250μL)和TEA(20μL)在无水EtOH(30mL)中的溶液。将载片轻轻地翻滚2小时，用EtOH充分冲洗，并且用氩气风干，从而导致COC和COP载片的水接触角分别为58.2°±1.4°和55.9°±2.4°。将氨基甲硅烷基化COC或COP载片单独地浸入包含三乙胺(150μL)的乙腈(30mL)中。向浸入的COC或COP载片添加DMA与PFPA单体摩尔供给比为100:3的聚(DMA-共-PFPA)(对COC为28.6mg，或对COP为23.7mg)。将COC或COP载片翻滚过夜，然后用足量乙腈冲洗并用氩气风干，从而导致水接触角为45.5°±4.9°(COC)或45.3°±2.6°(COP)。
实施例16
在不使用交联剂的情况下在COC表面上UV-引发的DMA与PFPA的界面聚合
通过前述的真空蒸馏来纯化N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)和五氟苯基丙烯酸酯(PFPA)、通过将DMA(800mg,8.07mmol)、PFPA(68.0mg,0.286mmol)和二苯甲酮(31.8mg,0.175mmol)溶解在乙腈(1.0mL)中以制备单体溶液，从而产生96.6:3.4的DMA与PFPA摩尔比。将等分部分的单体溶液(150μL)置于COC载片的中心处，然后通过在其顶部上铺放PTFE载片(1”×3”×1mm)而延展以覆盖整个COC载片。然后将夹心组装件倒置且COC面朝上，并放在365nm UV光源(BondWang,Electro-Lite Corp.,10mW/cm2)下5cm处，并且暴露于UV辐射15分钟。然后将PTFE载片剥离，并且COC载片用乙腈彻底冲洗，然后用氩气风干，从而产生水接触角为58.4°±8.1°的经接枝的表面。
所述程序通常适用于制备具有各种单体摩尔比的DMA和PFPA的接枝共聚物。
实施例17
在使用交联剂的情况下在COC表面上UV-引发的DMA与PFPA的界面聚合
应用上述一般程序。通过将DMA(794.4mg,8.01mmol)、PFPA(668mg,0.281mmol)、亚甲基双丙烯酰胺(MBA,40.0mg,0.259mmol)和二苯甲酮(32.0mg,0.176mmol)溶解在ACN(10.0mL)中来制备单体溶液，产生93.7:3.3:3.0的单体摩尔比(DMA:PFPA:MBA)。将等分部分的单体溶液(50μL)涂覆在COC载片的中心处，然后通过如上所述的那样铺放PTFE载片而延展以覆盖整个COC载片。将夹心组装件倒置并用UV辐射(如上)。在洗涤和干燥之后，经接枝的表面呈现出水接触角为47.4°±3.5°。DMA:PFPA:MBA单体摩尔比为95.6:3.3:1.1的另一实验产生47.0°±4.0°的水接触角。
所述程序通常适用于在COC或COP上的采用各种单体摩尔比的DMA、PFPA和MBA的接枝共聚物。
实施例18
捕获寡核苷酸测定的点样
在384孔板中制备20μM胺修饰寡核苷酸在50mM磷酸钠(pH 8.5)中的点样溶液。然后，通过具有对期望的斑点尺寸而选择的适当点样针的阵列测微仪(Array-it SpotBot3)，以期望图案将寡核苷酸点样在1”×3”胺-反应性微阵列载片(SurModics)上。在载片长度的1/4点和3/4点且相对于载片宽度居中处对每一载片点样两个阵列。在点样之后，在75％相对湿度下孵育载片4至18小时，然后用DI水流冲洗，并且用氩气风干。
实施例19
由点样的载片组装PCR芯片
在干燥之后，将载片切成两半，产生两个1”×1.5”芯片且点样的阵列在每一芯片中心。组装其中点样的载片形成底部的小型单室装置(图17)。将合适尺寸的预切的两面PSA衬垫置于载片上，使阵列点样的部分暴露并且在其周围是固定尺寸的大致圆形区域。在该垫片的顶部，放置具有两个预先钻孔的填料端口的聚碳酸酯盖。将所得的组装件在室温下层压，从而确保在热循环期间的适当粘附。
实施例20
用PCR反应溶液填充装置
包含引物和探针混合物、缓冲剂、酶和靶标DNA的多重PCR溶液在管中预先混合，然后加入上述室内。典型的反应室容积为25至40μL。在添加PCR反应溶液之后，用光学透明膜密封芯片的聚碳酸酯盖中的端口。
实施例21
测试表面的热稳定性、杂交特性和PCR效率
在定制的热循环设备中测试由PCR反应溶液填充的装置，所述热循环设备允许在热循环期间通过落射荧光显微镜由数码相机对表面进行成像。当冷却至低于其杂交温度(Tm)时，***的荧光DNA-侧翼(以及全部探针)的典型杂交时间小于2分钟。通过测量与捕获探针阵列杂交的***的侧翼(或全部探针)的荧光强度来表征表面。以该方式，在典型地热循环条件下在缓冲剂中测量表面稳定性。图18示出在模拟热循环之后的阵列。稳定性数据绘制在图19中。还进行装置中的PCR，并且运行通常包括在95℃下活化期望时间，在95℃至60℃的40个循环的热循环(在95℃下15秒停留时间和在60℃下60秒停留时间)。在某些所选的循环内，将室冷冻至低于探针的Tm，允许在60℃延长步骤之后的杂交。由基于装置的PCR实验收集的数据示于图20中，示出在多重测定测试期间一个修饰的COP表面表现如何。
实施例22
数据分析
自动图像分析软件用于定位阵列的斑点并通过测量像素强度来定量信号。从斑点内部的平均像素强度减去实际斑点区域之外的平均像素强度，得到斑点区域的减去背景的像素强度。在整个热循环过程内监测这些强度，以检测对捕获探针特异性的***的DNA-侧翼。
可将上述各种实施方案进行组合以提供其他实施方案。本说明书提及的和/或申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物通过引用整体并入本文。若必要，则实施方案的方面可以经修改以采用各种专利、申请和出版物的概念，从而提供其他实施方案。根据上述详细描述，可以对实施方案进行这些及其他的改变。总之，在下文权利要求中，使用的术语不应解释为将权利要求限制在本说明书和权利要求中公开的具体实施方案，但应解释为包括所有可能的实施方案连同这样的权利要求所给予的等同物的所有范围。因此，权利要求不受本公开的限制。

Claims (71)

1.固体支持物，其包含：
具有外部表面的非磁性基底；以及
与所述基底的外部表面共价结合的多个聚合物，所述聚合物各自包含多个稀释单体和多个反应性单体，每一稀释单体包含亲水性侧基，并且每一反应性单体包含热化学反应性侧基，其中所述聚合物通过所述基底的外表面与所述反应性单体或其经反应的片段中的至少一个之间的共价键、或通过所述基底的外表面与至少一个所述聚合物之间的离子相互作用而固定于所述基底的外表面，并且其中至少一个所述热化学反应性侧基可用于与捕获探针上的官能团共价连接。
2.如权利要求1所述的固体支持物，其中所述聚合物通过所述基底的外表面与至少一个所述热化学反应性基团的经反应的片段之间的共价键而固定于所述基底的外表面。
3.如权利要求1或2中任一项所述的固体支持物，其中每一聚合物独立地具有以下结构(I)或其盐、立体异构体或互变异构体：
其中：
A每次出现时独立地为热化学反应性侧基；
B每次出现时独立地为亲水性侧基；
R1、R2和R3每次出现时独立地为H或C1-C6烃基；
L1每次出现时独立地为连接物；
T1和T2各自独立地为不存在或为选自H、烃基和引发剂残基的聚合物端基；
Q表示基底的外表面；以及
x、y和z独立地为所述聚合物中各个单体的摩尔百分比，其中x、y和z各自大于0摩尔％并且x、y和z的总和为100摩尔％。
4.如权利要求1至3中任一项所述的固体支持物，其中所述热化学反应性基团是活化酯或吖内酯。
5.如权利要求4所述的固体支持物，其中所述活化酯是芳基酯。
6.如权利要求1至4中任一项所述的固体支持物，其中所述热化学反应性基团具有以下结构之一：
其中R4a、R4b、R4c、R4d和R4e各自独立地为H、卤素、腈或硝基。
7.如权利要求6所述的固体支持物，其中所述热化学反应性基团具有以下结构：
8.如权利要求7所述的固体支持物，其中R4a、R4b、R4c、R4d和R4e各自为氟。
9.如权利要求1至8中任一项所述的固体支持物，其中所述亲水性侧基具有以下结构之一：
其中：
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H、C1-C6烃基或C1-C6杂烃基，或者R6和R7，或R8和R9连同它们所结合的氮原子一起形成杂环；以及
n为1至2,000的整数。
10.如权利要求9所述的支持物，其中R6和R7各自独立地为H或甲基。
11.如权利要求1至10中任一项所述的固体支持物，其中所述亲水性侧基具有以下结构之一：
12.如权利要求1至10中任一项所述的固体支持物，其中所述亲水性侧基具有以下结构之一：
13.如权利要求3至12中任一项所述的固体支持物，其中L1包括硅-氧键、胺键、酰胺键、磺酰胺键、亚烃基键、聚合物或其组合。
14.如权利要求13所述的固体支持物，其中所述聚合物是聚乙二醇、聚烯丙胺或聚亚乙基亚胺。
15.如权利要求14所述的固体支持物，其中所述聚乙二醇包括10至50,000个单体亚单元。
16.如权利要求15所述的固体支持物，其中所述聚乙二醇包括55至90个单体亚单元。
17.如权利要求3至16中任一项所述的固体支持物，其中L1具有以下结构：
其中：
L2和L3各自独立地为任选的包含亚烃基部分、氧化亚烃基部分、酰亚胺部分、醚部分、酯部分、胺部分或酰胺部分或其组合的连接物；
R10和R11各自独立地为H、羟基、烃基、烃氧基或-OQ；
R12、R13、R14和R15各自独立地为H、烃基、卤素、卤代烃基、腈、硝基、烷基铵或卤代烷基铵；
P在每次出现时独立地表示单体亚单元；
A为直接键或-S(O)2-；
Q为所述基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数。
18.如权利要求17所述的固体支持物，其中每一P独立地为-CH2-、-CH2CH(CH2NH2)-或-OCH2CH2-。
19.如权利要求3至18中任一项所述的固体支持物，其中L1具有以下结构之一：
其中：
Q表示所述基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数；以及
a和b各自独立地为1至1999的整数。
20.如权利要求19所述的固体支持物，其中γ为55至90。
21.如权利要求1至20中任一项所述的固体支持物，其中通过所述基底的外表面上反应性基团与至少一个所述热化学反应性侧基之间的反应形成所述共价键。
22.如权利要求1至21中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物还包含与捕获探针的至少一个共价键。
23.如权利要求22所述的固体支持物，其中通过在所述捕获探针上的反应性基团与至少一个所述热化学反应性侧基之间的反应形成与所述捕获探针的至少一个共价键。
24.如前述权利要求中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含小于约40mol％的所述稀释单体。
25.如前述权利要求中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含约35mol％或更少的所述稀释单体。
26.如权利要求1至23中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含至少约30mol％的所述稀释单体。
27.如权利要求1至23中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含至少约75mol％的所述反应性单体。
28.如权利要求1至23中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含至少约90mol％的所述反应性单体。
29.如权利要求1至23中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含至少约95mol％的所述反应性单体。
30.如权利要求1至29中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物是无规共聚物。
31.如权利要求1至29中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物是无规三聚物。
32.如权利要求31所述的固体支持物，其中所述聚合物包含多于一种类型的结构上不同的亲水性侧基。
33.如权利要求31所述的固体支持物，其中所述结构亲水性侧基具有以下结构：
34.如权利要求1至33中任一项所述的固体支持物，其中所述捕获探针是生物分子。
35.如权利要求1至34中任一项所述的固体支持物，其中所述捕获探针是多核苷酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白、糖基化蛋白、适体、糖结合物、碳水化合物或抗体。
36.如权利要求1至35中任一项所述的固体支持物，其中所述捕获探针是选自RNA、DNA和寡核苷酸的多核苷酸。
37.如权利要求1至36中任一项所述的固体支持物，其中所述捕获探针是抗体。
38.如权利要求1至37中任一项所述的固体支持物，其中所述固体支持物的水接触角为40°至90°。
39.如权利要求1至38中任一项所述的固体支持物，其中所述固体支持物的水接触角为50°至80°。
40.如权利要求1至39中任一项所述的固体支持物，其中所述固体支持物的水接触角为60°至75°。
41.如权利要求1至40中任一项所述的固体支持物，其中所述基底包含有机聚合物。
42.如权利要求41所述的固体支持物，其中所述基底包含：聚(苯乙烯)、聚(碳酸酯)、聚(醚砜)、聚(酮)、聚(脂肪醚)、聚(芳基醚)、聚(酰胺)、聚(酰亚胺)、聚(酯)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(烯烃)、聚(环烯烃)、聚(乙烯醇)或其聚合物、卤化衍生物或交联衍生物。
43.如权利要求42所述的固体支持物，其中所述卤化衍生物是卤化聚(芳基醚)、卤化聚(烯烃)或卤化聚(环烯烃)。
44.如权利要求43所述的固体支持物，其中所述基底包含环聚(烯烃)。
45.如权利要求1至40中任一项所述的固体支持物，其中所述基底包含氧化物。
46.如权利要求45所述的固体支持物，其中所述基底包含硅、熔融二氧化硅、玻璃、石英、氧化铟锡、二氧化钛、氧化锆、氧化铝或其组合。
47.如权利要求1至46中任一项所述的固体支持物，其中所述基底包含有机聚合物和氧化物的复合物。
48.如权利要求47所述的固体支持物，其中所述氧化物是二氧化硅。
49.如权利要求1至48中任一项所述的固体支持物，其中所述基底是基本光学透明的。
50.如权利要求1至49中任一项所述的固体支持物，其中所述基底在约400nm与约800nm之间是基本光学透明的。
51.如权利要求1至50中任一项所述的固体支持物，其中所述基底是至少约90％光学透明的。
52.如权利要求1至51中任一项所述的固体支持物，其中所述固体支持物包含不同位置的***阵列，每一不同位置独立地包括至少一个与所述基底的外表面共价结合的所述聚合物。
53.如权利要求52所述的固体支持物，其中每一不同位置独立地包括多个与其共价结合的所述聚合物。
54.如权利要求52或53中任一项所述的固体支持物，其中在每一不同位置处的至少一个聚合物独立地包含与其共价结合的捕获探针。
55.如权利要求54所述的固体支持物，其中每一不同位置包括多个结构上不同的与其结合的捕获探针。
56.如权利要求1至55中任一项所述的固体支持物，其中所述多个聚合物在其之间基本未交联。
57.具有第一和第二表面的基底，其中所述第一表面是同质基底的外表面，并且所述第二表面具有以下结构之一，或其盐、立体异构体或互变异构体：
其中：
L2和L3各自独立地为任选的包含亚烃基部分、氧化亚烃基部分、酰亚胺部分、醚部分、酯部分、胺部分或酰胺部分或其组合的连接物；
R10和R11各自独立地为H、羟基、烃基、烃氧基或-OQ；
R12、R13、R14和R15各自独立地为H、烃基、卤素、卤代烃基、腈、硝基、烃基铵或卤代烃基铵；
P在每次出现时独立地表示单体亚单元；
A为直接键或-S(O)2-；
Q表示所述基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数。
58.如权利要求57所述的基底，其中每一P独立地为-CH2-、-CH2CH(CH2NH2)-或-OCH2CH2-。
59.如权利要求57或58中任一项所述的基底，其中所述第二表面具有以下结构之一：
其中：
Q表示所述基底的外表面；以及
γ为1至2000的整数；以及
a和b各自独立地为1至1999的整数。
60.如权利要求59所述的基底，其中γ为55至90。
61.用于制备权利要求1至60中任一项所述的固体支持物的方法，所述方法包括：
A)提供基底，其包含在其外表面上的多个反应性基团；以及
B)使所述基底与多个聚合物接触，所述聚合物各自包含多个稀释单体和多个反应性单体，每一稀释单体包含亲水性侧基，并且每一反应性单体包含热化学反应性侧基；以及
C)在所述基底与所述多个聚合物中至少一个聚合物之间形成共价键，
其中在足以在不用UV辐射外部源进行辐射的情况下在所述基底上至少一个所述反应性基团与至少一个所述热化学反应性侧基之间形成共价键的条件下，使所述基底与所述多个聚合物接触。
62.如权利要求61所述的方法，其还包括在足以在至少一个所述热化学反应性侧基与所述捕获探针上的反应性基团之间形成共价键的条件下，使所述固体支持物与捕获探针接触。
63.如权利要求61或62中任一项所述的方法，其中所述基底是权利要求41至51或57至60中任一项所述的基底。
64.用于测定靶标分析物分子的存在或不存在的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求1至56中任一项所述的固体支持物，其中所述聚合物包含至少一个与其共价结合的捕获探针；
b)使分析物探针与所述固体支持物接触；以及
c)检测由所述捕获探针与所述分析物探针之间的相互作用产生的信号的存在或不存在。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述捕获探针是多核苷酸。
66.如权利要求64或65中任一项所述的方法，其中所述分析物探针是多核苷酸。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述捕获探针是抗体。
68.如权利要求64或67中任一项所述的方法，其中所述分析物探针是蛋白。
69.如权利要求64至68中任一项所述的方法，其中所述信号是荧光信号。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述荧光信号由所述分析物探针与所述捕获探针的特异性杂交而产生。
71.如权利要求64至70中任一项所述的方法，其中所述分析物探针包含荧光团或荧光团淬灭剂。
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