JP2009511862A - 反応性表面、基質および同表面、基質の製造および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年9月30日に出願されたロイトマン(Roitman)らの米国特許出願第11/240,662号明細書、「反応性表面、基質および同表面、基質の製造および使用方法」に対する優先権および利点を請求する。この先行出願は、あらゆる目的のために参照によって組み入れられる。
適用可能でない
この考えは材料科学者には耳慣れないものではない。表面の特性およびその環境とのその相互作用に関して、理解またはその欠如は歴史的な発見、および歴史的な失敗の中心であった。この問題は、工学、化学または生物学の分野であれ、ナノ材料技術、地球外探査、半導体工学、バイオテクノロジー製造または薬剤管理および供給に焦点を合わせられるのであれ、ほとんど全ての技術的な試みに広がっている。材料のバルク性質は1つの問題点、すなわち、その材料が無くなる箇所を生じることを理解しながら、その材料の表面の性質を理解および/または扱わなければならず、その表面がその環境とどのように相互作用するのかは、まったく異なったものである。
〔図面の簡単な説明〕
図1は低密度の反応性基をその上に有する表面の略図である。
A.概説
上に言及したように、表面が分子レベルでそれらの周囲と相互作用する能力および/または傾向は、化学および生物科学およびそれらの科学を利用する産業において特に重要である。例えば、表面上に存在する反応性基の操作のこれまでの試みは主に、一方の極端または他の極端に焦点が合わせられている。特に、特定の表面に結合した分子の密度を、その表面上の反応性基の数を最大にすることによって、例えば、高密度結合によって最大にすることから多数の適用が恩恵を受ける。他の適用において、所望の目標は、表面とそれらの表面に暴露された材料との間の、実質的に全ての結合または吸着などの他のカップリング相互作用を取り除き、表面上の反応性基をキャップするかあるいは他の方法でマスクすることによって、与えられた適用のために不活性表面を作り出すことであった。
本発明によって、表面上の選択された所望の反応性部分または化学基の低密度が特定の適用において、例えば、単一分子分析において使用するために比較的大きな領域内に、その領域の残部は実質的に非反応性のまま、単一反応性部分を提供するように設計される。典型的に、これは、当該の表面積の残部の上にほかの場合なら存在する一切の反応性基がキャップ、マスクされるか、あるいは他の方法で非反応性にされることを意味する。それ故に、低密度の反応性基が典型的に、表面積の1/1×106nm2超、約1/100nm2未満の反応性基の密度において基質表面上に存在する。より好ましい態様において、表面上の反応性基の密度は1/100,000nm2超、1/50,000nm2超、1/20,000nm2超および1/10,000nm2超であり、約1/100nm2未満、1/1000nm2未満、および1/10,000nm2未満である。特定の好ましい適用について、密度はしばしば約1/2500nm2〜約1/300nm2の間であり、いくつかの場合、約1/150nm2までである。
特に好ましい態様において、本発明は、モニタリングまたは観察を受ける領域(「観察領域」)内に1個、2個、3個または少数の反応性基が存在するような密度において表面上に反応性基を提供する。観察領域内に個々のまたは少数の反応性基を提供することによって、個々の特異的反応性基とのまたはそれによって触媒された反応を特異的にモニタすることができる。このような観察領域は、例えば、モニタリングを行なっている検出システム、例えば、反応、例えば蛍光性(fluorescent)、蛍光発生性(fluorogenic)、発光性、発色性または発色団反応体を製造、消費またはそれらに結合する反応をインテロゲートする(interrogate)ために基質表面上に向けられたレーザースポットサイズ、または光学モニタリングシステムの光ファイバーのファイバー先端領域、化学電界効果トランジスタ(ChemFET)センサーのゲート領域等によって決定されてもよく、またはそれらは、例えば、観察領域をさらに画定および表現する構造閉じ込めまたは光閉じ込めの使用によって別々に画定されてもよい。
本発明の表面上に存在する反応性基または部分は、外からの添加によって材料または基質の表面に結合されるかまたはこのような表面上に本来存在している、化学活性および/または生物活性を有する広範囲の異なったタイプの反応性基を含有する。これらの反応性基は、他の化学基に対する結合活性、例えば、特異的または非特異的相互作用によって、共有結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって別の化学的部分を結合する能力を有する表面上の基を包含する。表面上に広範囲の反応性基を提供することは本技術分野において容易に理解されるが、例えば、イオン性官能基、多イオン基、エポキシド、アミド、チオール、疎水性基、例えば、脂肪族基、単環式または多環式基等、例えば、逆相および/または疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)において一般に用いられる場合、スタウディンガーligation基(例えば、リン(Lin)ら著、J.Am.Chem.Soc.(2005年)、127:2686〜95ページを参照のこと)、化学選択的アジド−アセチレン結合を用いるクリックケミストリーカップリング(デヴェラジ(Deveraj)ら著、JACS 2005年、127:8600〜8601ページ;ルマーストーファー(Lummerstorfer)ら著、J.Phys.Chem.B(2004年)108:3963〜3966ページ、およびコールマン(Collman)ら著、ラングミュア(Langmuir)(2004年)20:1051〜1053ページ(その内容の各々を参照によって全ての目的のためにその全体において本願明細書に組み入れるものとする)を参照のこと)および非特異的に他の基と会合するかまたは結合されうるその他の基などがある。さらに、表面上の特異的結合基、例えば、相補的結合パートナーを特異的に認識する基、例えば、相補的核酸対、抗体−エピトープ対、特異的高分子構造、例えば、タンパク質の認識配列を認識する結合ペプチド、ペプチドまたは核酸、レクチン、キレーター、ビオチン−アビジン結合等の使用が記載されている。
何度も上に記載したように、反応性基は、上に示したように、基質の表面に直接に結合されるか、または所望の反応性基と支持材料の固有または自然表面との間に1つまたは複数の中間分子層を提供する1つまたは複数の中間連結基を介して結合されてもよい。再び述べると、表面の各成分は、反応性であろうと非反応性であろうと、成分の1つまたは複数の層から得られ、所望の得られた表面成分を提供することができる。
多数の方法を用いて本発明の表面を作製することができる。少なくとも第1の方法において、用いられる本発明の方法は、比または希釈に基づく処理を表面に適用して所望の密度を生じる。特に、簡単な表面改質プロトコルは少なくとも2つの異なった表面改質剤の混合物を使用し、そこで第1の薬剤は、表面にカップリングするための部分のほかに、目的の反応性基を含有し、その結果、表面への第1の薬剤のカップリングはまた、その反応性を維持するように反応性基を提供する。第2の薬剤または希釈剤は、表面に結合するその能力以外に、表面が置かれる適用の環境に対してほかの場合なら非反応性である。
本発明の選択的反応性表面は、個々の分子またはそれらの反応を互いに単離することが望ましい場合がある様々な異なった適用を有する。例えば、単一または少数の反応性分子を有するビード基質を、FACSまたは他のビード選別方法を用いて容易をインテロゲートし、例えば、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリ、定向進化ライブラリ、またはファージ・ディスプレイ・ライブラリにおいて所望の反応性基を確認することができる。本発明の表面改質技術はこのようなシステムに適用可能である。
実施例1:シラン−PEG20−ビオチン/アビジン表面
トリメトキシシランPEG20−ビオチン分子はバイオリンク・ライト・サイエンス(BioLink Lite Sciences)(ノースカロライナ州、ケアリー(Cary,North Carolina))によって合成され、そこで「20」は、反復エチレン(ethlylene)グリコール単位の数を指す。前駆試薬は市販されている。
α−ビオチニル−ω−トリメトキシシリル末端ポリ(エチレングリコール)(24単位)(PEG24−ビオチン)をポリマー・ソース(カナダ、モントリオールのドーバル(Dorval,Montreal Canada))によって合成した。
希釈プロトコルを用いて反応性官能基の表面密度を調節する能力を試験するためにシステムを作製した。特に、N−(3−トリエトキシシリルプロピル)グルコンアミド(TES−G)(市販品の試薬)(ペンシルベニア州、モリスビルのゲレスト社(Gelest Inc,PA)製品#SIT8189−0)の溶液中のPEG24−ビオチンの様々な希釈溶液を用いてPEG24−ビオチン表面を調製した。
表面の均一性を提供するために、構造的に似た基を用いて、表面の結合基または反応性基、ならびに非反応性成分を提供した。特に、他の分子と相互作用するその能力以外に、均一な特性、例えば、厚さを有する表面を提供するために、PEG24−ビオチンを(上記の)実施例2に記載されたPEG24基と同様な、PEG24−メトキシ基で希釈した。PEG24−メトキシはポリマー・ソース社(Polymer Source Inc.)(カナダ、モントリオールのドーバル)によって特注で合成され、受け取られたまま使用された。0.4%のメタノールを有するエタノール中に試薬0.6mgを含有する溶液中で室温において基質を培養することによって、PEG24−メトキシを溶融シリカスライドおよびSiウエハ上に堆積した。Si基質を異なった時間間隔において溶液から除去し、接触角およびフィルム厚さを測定した。堆積速度およびフィルム厚さは、同様な溶剤および濃度条件下で堆積されたPEG24−ビオチンフィルムと同等であった。
本発明の方法は、各導波路内にPEG24−ビオチン表面を提供する工程と、ストレプトアビジンとビオチニル化ポリメラーゼとの混合物を堆積する工程とによって、ゼロモード導波路アレイ内に比較的低密度のΦ29DNAポリメラーゼ酵素を堆積するのに用いられる。ニュートラアビジンの、ビオチニル化ポリメラーゼに対する比を調節して、過剰なニュートラアビジンで残りの表面をブロックしたまま、ポリメラーゼとPEG−24−ビオチン表面との間の所望のレベルのニュートラアビジン媒介結合をもたらした。
Claims (36)
- 第1の反応性部分が結合された表面
を含み、前記反応性部分が、50,000nm2当たり約1の反応性部分〜100nm2当たり1の反応性部分の間の密度において前記表面に結合される、基質。 - 前記反応性部分が、8000nm2当たり約1の反応性部分〜300nm2当たり1の反応性部分の間の密度において前記表面に結合される、請求項1に記載の基質。
- 前記反応性部分が、8000nm2当たり約1の反応性部分〜1000nm2当たり1の反応性部分の間の密度において前記表面に結合される、請求項1に記載の基質。
- 前記反応性部分以外の前記表面の残部が実質的に非反応性の表面である、請求項1に記載の基質。
- 前記反応性部分がリンカー基を介して前記表面に結合される、請求項1に記載の基質。
- 前記リンカー基がポリマーを含む、請求項5に記載の基質。
- 前記リンカー基がポリエチレングリコールを含む、請求項5に記載の基質。
- 前記反応性部分がリンカー基を介して前記表面に結合され、前記実質的に非反応性の表面が、前記反応性部分のない前記リンカー基を含む、請求項4に記載の基質。
- 前記第1の反応性部分が結合部分を含む、請求項1に記載の基質。
- 前記結合部分が非特異的結合部分を含む、請求項9に記載の基質。
- 前記結合部分が特異的結合部分を含む、請求項9に記載の基質。
- 前記結合部分が特異的結合対の一方のメンバーを含む、請求項11に記載の基質。
- 前記結合部分が抗原、抗体、抗体の結合フラグメント、ポリヌクレオチド、結合ペプチド、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項9に記載の基質。
- 前記第1の反応性部分が触媒部分を含む、請求項1に記載の基質。
- 前記触媒部分が触媒金属を含む、請求項14に記載の基質。
- 前記触媒部分が酵素を含む、請求項14に記載の基質。
- 前記酵素が核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択される、請求項16に記載の基質。
- 前記酵素がDNAポリメラーゼを含む、請求項16に記載の基質。
- 前記表面が観察領域を含む、請求項1に記載の基質。
- 前記表面が光閉じ込めの観察表面を含む、請求項1に記載の基質。
- 前記観察領域がゼロモード導波路の観察表面を含む、請求項19に記載の基質。
- 前記基質の前記表面がシリカを含む、請求項1に記載の基質。
- 前記基質の前記表面がガラス、石英、溶融シリカ、およびケイ素から選択される、請求項1に記載の基質。
- 少なくとも第1の観察領域が設けられた基質であって、前記観察領域が、約100nm2〜50000nm2の領域を有する、基質と、
前記観察領域内の前記表面に結合された1〜3の反応性部分と
を含む、デバイス。 - 前記観察領域が、光学的に不透明なクラッディングによって境界を定められる、請求項24に記載のデバイス。
- 前記反応性部分が酵素を含む、請求項24に記載のデバイス。
- 前記酵素がDNAポリメラーゼを含む、請求項26に記載のデバイス。
- 第1の反応性表面を有する基質を提供する工程と、
第1および第2の表面改質剤の混合物を提供する工程であって、前記第1および第2の表面改質剤が各々、前記反応性表面に結合可能であると共に、前記第1および第2の表面改質剤が第2の比において前記反応性表面に結合するように選択された第1の比において前記混合物中に存在する工程と、
前記反応性表面を前記混合物と接触させ、第1および第2の改質剤が前記第2の比において表面に結合された、改質された表面を製造する工程と
を含む、改質された表面を作製する方法。 - 改質される表面を提供する工程と、
改質される前記表面を表面改質組成物と接触させる工程と
を含み、前記表面改質組成物が、
所望の反応性部分に結合される第1の表面改質剤と、
前記所望の反応性部分に結合されない第2の表面改質剤と
を含み、
前記第1の表面改質剤および第2の表面改質剤が、改質された表面を製造する比において前記表面改質組成物中に存在し、前記反応性部分が、50,000nm2当たり約1の反応性部分〜100nm2当たり1の反応性部分の間の密度において前記改質された表面上に存在する、改質された表面を作製する方法。 - それに結合された反応性部分を有する表面を含み、前記反応性部分が100nm2当たり1未満の反応性部分の密度において前記表面に結合される、装置。
- 前記反応性部分が1000nm2当たり1未満の反応性部分の密度において前記表面に結合される、請求項30に記載の装置。
- 前記反応性部分が10000nm2当たり1未満の反応性部分の密度において前記表面に結合される、請求項30に記載の装置。
- 前記反応性部分が分子結合基を含む、請求項30に記載の装置。
- 前記分子結合基が特異的分子結合基を含む、請求項33に記載の装置。
- 前記特異的分子結合基が、抗体、抗原、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、結合ペプチドから選択される、請求項34に記載の装置。
- 表面に実質的に均一に結合する組成物で表面を処理する工程であって、前記組成物が、反応性部分を含有しない第1の成分と前記反応性部分を含む第2の成分とを含み、前記第2の成分が、前記反応性部分を所望の密度において前記表面上に提供するように前記第1の成分に対する濃度において前記組成物中に存在する工程を含む、反応性部分の所望の密度をその上に提供するように表面を構成する方法。
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