CN104316641A - 酮苯丙氨酸钙中杂质含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酮苯丙氨酸钙原料药中杂质的检测方法，属于药物化学技术领域。本发明所述杂质为苯乙酸，即为酮苯丙氨酸钙合成过程中的副产物，也为氧化降解产物，提供了该化合物的杂质检测方法，检测方法适用于酮苯丙氨酸钙原料药的杂质控制。杂质含量测定方法灵敏度高、重现性好，可更加准确的控制产品质量。

Description

酮苯丙氨酸钙中杂质含量的检测方法

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，涉及一种酮苯丙氨酸钙原料药的杂质含量的测定方法。

背景技术

复方α-酮酸片为复方制剂，含有4种α-酮酸、1种α-羟酸和5种人体必需氨基酸，其中酮酸和羟酸以钙盐形式存在。德国Fresenius公司以开同为商品名，1996年首次在德国上市，临床上用于慢性肾衰患者的营养，延缓肾衰进展，纠正代谢紊乱的药物。

酮苯丙氨酸钙(Calcium phenylpyruvate，简称KTP)，是复方α-酮酸片的主要原料之一，其化学名称为2-氧代-3苯基丙酸钙，结构如式I所示，具有降低血氨、纠正氨基酸不平衡、改善慢性肾衰等效果。

目前酮苯丙氨酸钙的合成工艺普遍采用乙内酰脲和苯甲醛反应制得，国内现行标准中采用离子交换色谱法对酮苯丙氨酸钙原料药有关物质进行检查，但仅对其杂质含量进行控制，并未确定有关物质(即该杂质)结构(国家食品药品监督管理局标准YBH01512010，有关物质部分)。

并且，现有的检测分析方法(如离子交换色谱法)都采用主成分自身对照法，该方法适用于无法获得对照品，且杂质与主成分在同一波长下吸收相应因子接近时方可实现较为准确的定量，现有的色谱分析都忽略了杂质成分相应因子的问题，采用不加校因子的主成分自身对照法，存在一定局限性，无法对杂质进行准确的定量测定，因而无法科学的对酮苯丙氨酸钙原料药进行质量控制。

本发明人对该路线合成的产物进行高效液相色谱分析发现有一个明显杂质存在，在氧化条件下该杂质显著增加，该杂质即为酮苯丙氨酸钙合成中的副产物，也为氧化降解产物。

为了严格控制原料药的质量，本发明人认为有必要对杂质进行化学结构确认，获得杂质对照品，并提供一种高准确度的杂质检测方法，以便精确指导生产工艺，提高产品安全性。

公开号为CN102297924B，中国专利号为201110168695.0，名称为3-异苯并二氢吡喃酮中邻-甲基苯乙酸和2-氯甲基苯乙酸杂质含量的高效液相色谱分析方法的中国专利公开了一种3-异苯并二氢吡喃酮中邻-甲基苯乙酸和2-氯甲基苯乙酸杂质含量的高效液相色谱分析(HPLC)方法，所述3-异苯并二氢吡喃酮采用重量百分比浓度为20％～40％乙腈水溶液溶解，配制的样品浓度为10mg/ml～50mg/ml，采用反相高效液相色谱法，测定3-异苯并二氢吡喃酮中邻甲基苯乙酸和2-氯甲基苯乙酸杂质含量。本发明采用C18反相色谱柱，以液相色谱方法准确测定3-异苯并二氢吡喃酮中邻-甲基苯乙酸和2-氯甲基苯乙酸杂质的含量。

专利201110168695.0的缺陷在于没有完整的做方法学考察，以验证方法的重现性及准确可靠性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酮苯丙氨酸钙中杂质含量的检测方法。

本发明是针对之前采用离子交换色谱法分析酮苯丙氨酸钙杂质，无法用于苯乙酸杂质制备以确定结构，因此才建立反向法相色谱法测定药物中降解杂质/副产物，对于酮苯丙氨酸钙来说，首次采用反相色谱法测定杂质—苯乙酸的含量。

本申请的技术方案克服了现有技术中杂质结构不明确、杂质定量方法不准确的缺点，提供一种高准确度的杂质检测方法，利于全面客观评价酮苯丙氨酸钙原料药的质量，保证人体用药安全。

本发明人对前期研究中发现酮苯丙氨酸钙的合成工艺中产生的明显杂质进行化学结构的确认，该杂质为苯乙酸。

本发明提供一种酮苯丙氨酸钙原料药的杂质，该杂质为苯乙酸，其结构如式Ⅱ所示：

该杂质是发明人对反应过程分析后进行预测，并通过制备液相色谱制备得到对照品，用液相-质谱仪分析、核磁共振确证结构。

进一步地，本发明人通过液相色谱方法获得苯乙酸的对照品，再进行酮苯丙氨酸钙原料药的质量控制研究。

本发明提供了一种酮苯丙氨酸钙中苯乙酸杂质含量的检测方法，具体步骤为：

精密称取酮苯丙氨酸钙原料药适量，加水超声溶解，用水稀释成酮苯丙氨酸钙浓度为1mg·mL^-1的供试品溶液；

精密称取苯乙酸对照品适量，加水超声溶解，用水稀释成苯乙酸浓度为20μg·mL^-1的对照品溶液；

按照以下色谱条件对供试品溶液进行分析，按外标法以峰面积计算苯乙酸含量。

色谱条件为：

(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱

(2)流动相：20mmol·L^-1磷酸二氢钾(磷酸调节至pH 3.3)-乙腈(85:15,v/v)为流动相等度洗脱；

(3)流速：1mL·min^-1；

(4)检测波长：205nm；

(5)柱温：30℃；

(6)进样量：10uL。

所述的外标法，参见教科书(《仪器分析》，高等教育出版社，第四版)。

其中所述的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，优选型号为Agilent XDB C₁₈色谱柱；

其中所述的苯乙酸，在酮苯丙氨酸钙原料药中含量不得超过0.2％。

其中，所述的苯乙酸对照品的制备方法为：

(1)制备方法：取酮苯丙氨酸钙原料药，加入0.5％的H₂O₂，室温放置2h，加适量水，超声溶解，采用制备液相色谱分离制备该杂质(苯乙酸)。收集30-35min含有目标物的洗脱液，合并，60℃减压浓缩至一定量，冷冻干燥3d，进一步除去甲酸铵，得白色片状固体，重结晶，得苯乙酸对照品；

(2)制备色谱条件为：用YMC-Pack ODS-A色谱柱，以10mmol·L^-1甲酸铵溶液(甲酸调pH至4.0)﹣乙腈(85:15，V/V)为流动相等度洗脱，流速为10mL·min^-1，检测波长205nm，柱温为30℃，进样量为2mL。

所述苯乙酸的HPLC纯度高于98.5％。

所述的酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸的测定方法，为证实其准确可靠、重复性好，进行了方法学验证，具体见本发明的实施例。

本发明提供的苯乙酸的杂质及其检测方法，具有如下优点：

首先明确了酮苯丙氨酸钙原料药中一种杂质的化学结构，确认为苯乙酸，摒弃不适用的主成分自身对照法，本发明提供一种对苯乙酸的定量检测方法，采用外标法测定含量，通过验证，该方法准确度高、重复性好，利于全面客观评价酮苯丙氨酸钙原料药的质量，对工艺改进有指导作用。

附图说明

图1为酮苯丙氨酸钙供试品的液相色谱图，其中a峰为酮苯丙氨酸钙，b峰为苯乙酸。

图2为苯乙酸的线性方程。

具体实施方式

实施例1 苯乙酸的制备及结构确认

杂质制备方法：取酮苯丙氨酸钙原料药(购自海门慧聚，批号为PKTP130101A)，加入0.5％的H₂O₂，室温放置2h，加适量水，超声溶解，采用制备液相色谱分离制备该杂质(苯乙酸)。收集30-35min含有目标物的洗脱液，合并，60℃减压浓缩至一定量，冷冻干燥3d，进一步除去甲酸铵，得白色片状固体，重结晶，得苯乙酸对照品。

制备色谱条件为：用YMC-Pack ODS-A色谱柱，以10mmol·L^-1甲酸铵溶液(甲酸调pH至4.0)﹣乙腈(85:15，V/V)为流动相等度洗脱，流速为10mL·min^-1，检测波长205nm，柱温为30℃，进样量为2mL。

所述苯乙酸的HPLC纯度高于98.5％。

取以上方法制备所得的杂质进行NMR和ESI-MS分析确证，证实该杂质结构为苯乙酸。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz,ppm):δ＝3.57(s,2H,methylene),7.41-7.13(m,5H,phenyl),12.31(br s,1H,COOH)

¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz,ppm):δ＝40.669,126.543,128.203,129.336,134.988,172.693

ESI-MS m/z:135.0457[M-H]^-

实施例2 酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸的测定

色谱条件与***适用性试验：色谱柱为Agilent XDB C₁₈色谱柱，规格为150mm×4.6mm(5μm)；以20mmol·L^-1磷酸二氢钾(磷酸调节至pH 3.3)-乙腈(85:15)为流动相等度洗脱，流速为1mL·min^-1，检测波长为205nm，柱温为30℃，进样量10μL。理论塔板数按酮苯丙氨酸钙峰计算不应低于2000，酮苯丙氨酸钙与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

测定法：精密称取酮苯丙氨酸钙原料药适量(购自海门慧聚，批号为PKTP130101A)，加水超声溶解，用水稀释成酮苯丙氨酸钙浓度为1mg·mL^-1的供试品溶液。精密称取苯乙酸对照品适量，加水超声溶解，用水稀释成苯乙酸浓度为20μg·mL^-1的对照品溶液。按照以上色谱条件对供试品溶液进行分析，按外标法以峰面积计算，色谱图见图1。分别测定海门慧聚三批原料药中苯乙酸的含量，结果如下：

表1 杂质检查结果

实施例3 分析方法学考察

(1)专属性实验

酸破坏：取酮苯丙氨酸钙原料药50mg，置于50mL容量瓶中，加2mol·L^-1HCl 5mL，室温放置4h，加2mol·L^-1 NaOH调节至中性，加水适量，超声溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤；

碱破坏：取酮苯丙氨酸钙原料药50mg，置于50mL容量瓶中，加1mol·L^-1 NaOH 5mL，室温放置1h，加1mol·L^-1 HCl调节至中性，加水适量，超声溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤；

氧化破坏：取酮苯丙氨酸钙原料药50mg，置于50mL容量瓶中，加入0.01％的H₂O₂溶液5mL，室温放置1h，加水适量，超声溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤；

高温破坏：取酮苯丙氨酸钙原料药50mg，平铺于称量瓶中，置于80℃烘箱中10h，高温破坏后，将样品转移至50mL容量瓶中，加水适量，超声溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤；

光照破坏：取酮苯丙氨酸钙原料药50mg，平铺于称量瓶中，置于约(4500±500)lx强光下照射10d，光照破坏后将样品转移至50mL容量瓶中。破坏后五份样品中分别，加水适量，超声溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，加水适量，超声溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤。

结果显示：采用酮苯丙氨酸钙原料药经酸、碱、氧化、高温、光照破坏后，苯乙酸色谱峰均能与酮苯丙氨酸钙原料药和各降解杂质达到基线分离，测定无干扰，分离度良好。

(3)定量限及检出限

取苯乙酸对照品溶液不断稀释，按照实施例2中色谱条件进样分析，记录色谱图，以信噪比为3:1时相应的浓度为检测限，以信噪比为10:1时相应的浓度为定量限，本方法的检出限为0.16μg·mL^-1，定量限为0.48μg·mL^-1L，本方法检测灵敏度较高。

(4)分析方法的线性与范围

精密称取苯乙酸对照品40mg，置于50mL容量瓶中，加水超声溶解，用水稀释至刻度，摇匀，再移取4mL置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液。精密量取该溶液1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、9.0mL分别置于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得系列对照品溶液。按照实施例2中色谱条件进样分析，记录色谱图。以峰面积Y对质量浓度X(μg·mL^-1)作图，进行回归计算，线性方程见附图2。

表2 线性数据

结论：线性方程Y＝37.237X-5.11，相关系数r为0.9995，苯乙酸在0.65～5.82μg·mL^-1的范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

(5)溶液稳定性

取酮苯丙氨酸钙原料药的供试品溶液，室温下放置12h，按照实施例2中色谱条件进样分析，每隔1h进样。结果发现12h内，主成分峰面积RSD为0.43％，而苯乙酸杂质含量由0.27％增加到0.60％，结果表明，供试品溶液不稳定，样品测定应临用现配。

(6)精密度试验

取苯乙酸对照品溶液，按照实施例2中色谱条件，连续进样6次，比较苯乙酸峰面积的变化。结果表明，仪器精密度良好。

表3 精密度试验

(7)重复性试验

取同一批次的酮苯丙氨酸钙原料药的供试品溶液6份，按照实施例2中色谱条件进样分析。结果表明，该方法具有良好的重复性。

表4 重复性试验

(8)分析方法加样回收率

分别精密移取酮苯丙氨酸钙供试品溶液10mL置于10个50mL容量瓶中，编号0-9号，其中0号加水稀释至刻度作为空白溶液，1-3号加入苯乙酸对照品溶液2.5mL，4-6号加入苯乙酸对照品溶液5mL，7-9号加入苯乙酸对照品溶液7.5mL，分别用水稀释至刻度，摇匀，得加样后供试品溶液。按照实施例2中色谱条件进样分析，记录苯乙酸峰面积，以各加样后供试品溶液中苯乙酸的峰面积减去空白溶液中苯乙酸的峰面积计算测得量，并计算回收率。结果表明，说明该方法准确度高，能对酮苯丙氨酸钙钙原料药中的苯乙酸准确测定。

表5 回收率试验(n＝9)

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并未对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员，在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸杂质含量的检测方法，具体步骤为：

称取酮苯丙氨酸钙原料药适量，加水超声溶解，用水稀释成酮苯丙氨酸钙浓度为1mg·mL^-1的供试品溶液；

称取苯乙酸对照品适量，加水超声溶解，用水稀释成苯乙酸浓度为20μg·mL^-1的对照品溶液；

按照以下色谱条件对供试品溶液进行分析，按外标法以峰面积计算苯乙酸含量；

色谱条件为：

(1)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

(2)流动相：磷酸调节至pH 3.3的20mmol·L^-1磷酸二氢钾：乙腈＝85:15v/v为流动相等度洗脱；

(3)流速：1mL·min^-1；

(4)检测波长：205nm；

(5)柱温：30℃；

(6)进样量：10uL。

2.根据权利要求1所述的一种酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸杂质含量的检测方法，其特征在于，其中所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的型号为Agilent XDB C₁₈色谱柱。

3.根据权利要求1所述的一种酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸杂质含量的检测方法，其特征在于，其中所述的苯乙酸，在酮苯丙氨酸钙原料药中含量不得超过0.2％。

4.根据权利要求1所述的一种酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸杂质含量的检测方法，其特征在于，其中所述的苯乙酸对照品的制备方法为：

(1)制备方法：取酮苯丙氨酸钙原料药，加入0.5％的H₂O₂，室温放置2h，加适量水，超声溶解，采用液相色谱分离制备该苯乙酸杂质；收集30-35min含有目标物的洗脱液，合并，60℃减压浓缩至一定量，冷冻干燥3d，进一步除去甲酸铵，得白色片状固体，重结晶，得苯乙酸对照品；

(2)色谱条件为：用YMC-Pack ODS-A色谱柱，以甲酸调pH至4.0的10mmol·L^-1甲酸铵溶液：乙腈＝85:15V/V为流动相等度洗脱，流速为10mL·min^-1，检测波长205nm，柱温为30℃，进样量为2mL。

5.根据权利要求1所述的一种酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸杂质含量的检测方法，其特征在于，以峰面积Y对质量浓度X作图，线性方程Y＝37.237X-5.11，相关系数r为0.9995，苯乙酸在0.65～5.82μg·mL^-1的范围内。

6.根据权利要求1至5任一所述的一种酮苯丙氨酸钙原料药中苯乙酸杂质含量的检测方法，其特征在于，所述的酮苯丙氨酸钙原料药是由乙内酰脲和苯甲醛反应制得。