CN104267187A - 检测尿液Clusterin含量试纸条的制备及应用 - Google Patents

检测尿液Clusterin含量试纸条的制备及应用 Download PDF

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耿嘉男
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Abstract

本发明公开了一种检测尿液Clusterin含量试纸条的制备及应用，用于急性肾损伤和药物肾毒性安全性监测，属于疾病检测技术领域，本发明提供的Clusterin胶体金试纸条，基本原理为双抗夹心法，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的单克隆Clusterin抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的单克隆Clusterin抗体2，质控线包被有正常羊抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫，该试纸条操作简单，无需仪器，结果易于判断，且检测手段无创，制备试纸条所用单克隆抗体为杂交瘤技术自行制备，费用低，适用于工业化生产。

Description

检测尿液Clusterin含量试纸条的制备及应用
技术领域
本发明是一种急性肾脏损伤疾病的检测方法，具体涉及一种应用免疫胶体金技术研制的Clusterin检测试纸条，同时公开了其制备方法，属于疾病检测技术领域。
背景技术
急性肾损伤在临床是常见而严重的肾脏病变，其发病率和死亡率都很高，寻求具有高敏感性、特异性、易检测的新的肾损伤标志物一直是研究热点之一。簇集蛋白(Clusterin)是一种分子量为80KD的异二聚体糖蛋白，广泛存在于人类及动物的许多组织中，急性肾损伤(acute kidney in jury,AKI)时，尿簇集蛋白表现出抗凋亡作用，并与脂肪利用、细胞聚集及黏附有关。虽然它在多种组织广泛表达，但由于其相对分子质量较大，不能从肾小球滤过，因此只有在肾损伤时才能在尿中检测。动物研究表明当肾毒素、肾切除术后、多囊肝性肾病和肾细胞瘤引起的急性肾损伤时，Clusterin能在肾损伤后的去分化肾细胞中表达增加，在鼠、狗和灵长类动物的尿中均可检测出来。因此检测尿中Clusterin水平可以间接评价急性肾损伤和药物肾毒性的情况。
目前国内外检测Clusterin的方法包括免疫组化、ELISA、Western blot、PCR等，但用于临床则存在很多弊端，如有创、操作程序复杂、时间较长等。
发明内容：
本发明的目的是公开一种用于检测尿液Clusterin含量的胶体金试纸条及制备方法，用于急性肾损伤和药物肾毒性安全性监测。
本发明提供的Clusterin的胶体金试纸条，适用于工业化生产，基本原理为双抗夹心法，具体安装方法参考了中国专利99203566.X、200510200394.6等，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的单克隆Clusterin抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的单克隆Clusterin抗体2，质控线包被有正常羊抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。
本Clusterin的胶体金试纸条的制备，包括以下步骤：
1将自行制备的纯化单克隆Clusterin抗体1用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将自行制备的纯化单克隆Clusterin抗体2和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有Clusterin抗原时，则于金标垫与胶体金标记的Clusterin抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的Clusterin抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。
本发明试剂盒的使用方法如下：取尿标本约0.1-0.5ml加入小试管中，然后***试纸条，待1-2分钟反应带清晰后观察结果(见图2)。出现1条红色(对照)沉淀线，为尿检诊断阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，为尿检诊断阳性，未出现沉淀线则为无效。
本发明的积极效果在于：应用免疫胶体金技术制备Clusterin试纸条,可以快速，灵敏检测尿中Clusterin蛋白含量，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，无专业技术人员均可操作。样本用量小，对操作者无毒性，并且检测手段无创，除可用于临床急性肾损伤的检测还可用于药物肾毒性安全性监测。制备试纸条所用单克隆抗体为杂交瘤技术自行制备，费用低。
附图说明
图1.为Clusterin检测装置示意图；
图2.为Clusterin试剂盒检测结果判定示意图；
图中：1-样品垫，2-金标垫，3-硝酸纤维素膜，4-吸水垫，5-PVC板，6-检测线，7-质控线。
具体实施方式
实施例1Clusterin单克隆抗体的制备
用Clusterin蛋白(美国BD公司)多次免疫Balb/c小鼠，最后一次加强免疫后第3天取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞株X63-Ag8.653杂交融合(融合剂为聚乙二醇)，制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌Clusterin单克隆抗体的细胞株制备抗Clusterin的单克隆抗体1、2，测定单克隆抗体1、2效价，ELISA验证2者混合后效价叠加，证明1、2是针对Clusterin蛋白抗原上不同的抗原决定簇。
实施例2Clusterin胶体金试纸条的制备:
根据图1所示，试纸条在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的单克隆Clusterin抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的单克隆Clusterin抗体2，质控线包被有正常羊抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。
(1)胶体金颗粒的制备：将1ml 1％氯金酸溶液与99ml超纯水混匀得终浓度为0.01％的氯金酸溶液，煮沸；吸取1％柠檬酸三钠1.6ml，将其一次并快速地加入煮沸的氯金酸溶液中，溶液继续加热至淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温下冷却，补充失水至原体积(见流程图)。在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均匀。测量100个胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。
胶体金颗粒的制备过程：
(2)免疫胶体金复合物的制备：目测法确定胶体金与单克隆Clusterin抗体1用量比例。用0.01mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值，由于胶体金易损坏pH计，而pH试纸调节pH值不精确，故以加入的0.01mol/L K2CO3的量为参考标准，1mL胶体金加入160μL K2CO3时抗体与胶体金结合最稳定。取11支洁净试管，每管加入调节好pH值的胶体金1mL，将浓度为200μg/mL的单克隆Clusterin抗体1用PB溶液分别按1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80比例稀释，依次缓慢加入2-10号装有胶体金的试管中吹打混匀；5min后，各管再分别加入100μL 10％NaCl溶液，吹打混匀，室温静置2h后观察颜色变化；1号管既不加抗体也不加氯化钠溶液，为对照管；11号管仅不加抗体，也为对照(见表1)；未加抗体或加入抗体不足的试管，胶体金不稳定进而产生由红变蓝的聚沉现象，而加入量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变，以此使胶体金红色不变而抗体含量最低试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金最适蛋白量。在胶体金标记Clusterin抗体最适蛋白量的基础再加上10％即为稳定胶体金所需Clusterin抗体的实际用量，根据欲标记的胶体金实际用量计算出所需Clusterin抗体的总量。将调节好pH值的胶体金溶液置冰浴上，磁力搅拌器匀速搅拌的同时逐滴加入稀释好的单克隆Clusterin抗体1，5min内加完，置冰上反应30min；然后缓慢加入5％BSA使其终浓度为1％。
表1确定胶体金与Clusterin抗体用量比例
注：表中各溶液的单位均为mL
(3)免疫胶体金的纯化：采用低温超速离心法纯化金标Clusterin抗体，以除去溶液中未充分标记的Clusterin抗体和胶体金颗粒，以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。将制备好的金标单克隆Clusterin抗体1在4℃下，1000r/min低速离心15min，小心吸取上清液，弃去沉淀；上清液再以12000r/min 4℃离心20min，弃上清液保留沉淀，沉淀加入0.01mol/L PB溶液(pH 8.2，含1％BSA、0.1％PEG、0.3％tween-20、2.5％蔗糖、0.02％NaN3)重悬至原体积的1/10，混匀后4℃保存备用(见流程图)。
免疫胶体金的纯化过程：
(4)金标垫(结合释放垫)的制备：
将玻璃纤维素膜用0.01mol/L PB溶液(pH＝7.4，含2.5％蔗糖、0.5％T-20)浸润30min后干燥处理，然后将胶体金标记Clusterin的单克隆抗体1作不同比例稀释，均匀等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。为保证试纸条达敏感度要求，选择胶体金标记Clusterin单克隆抗体1复合物的最适稀释度为工作浓度。保存液稀释胶体金标记Clusterin单克隆抗体1原液至工作浓度，均匀浸于玻璃纤维素膜，冷冻真空干燥后密封保存备用。
(5)固相硝酸纤维素膜的制备：将Clusterin单克隆抗体2以直线形包被于硝酸纤维素膜上作为实验反应区，定义为检测带(T线)，距离检测带上端5mm处标记质控带(C线)，以直线形包被正常山羊抗小鼠IgG抗体，4℃干燥后密封保存。
(6)样品垫的处理：用含1％的BSA和0.5％Tween-20的PB溶液作为样品的处理液均匀浸于玻璃纤维素膜，37℃干燥后，密封保存备用。
(7)吸收垫用硬质吸水滤纸制备。
(8)材料组装：依次分别将吸尿用样品垫、冻干金标记抗Clusterin单克隆抗体1的玻璃纤维素膜、已标记抗Clusterin单克隆抗体2和山羊抗小鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜及硬质吸水滤纸按图1装配，并用双面胶或其它粘性材料将整合好的材料固定于塑料底板。纵向裁剪纸板为4mm条状检测试纸条，铝箔袋密封保持干燥，4℃贮存备用。
实施例3Clusterin胶体金试纸条在药物性动物急性肾损伤模型中的应用
大鼠皮下注射庆大霉素400mg/kg·d连续2天成功制备急性肾损伤模型，连续10d收集模型大鼠尿液，离心后取上清保存备用并于造模不同时间取模型大鼠肾脏进行病理学观察。病理学结果显示：正常组大鼠肾脏无明显病理改变；模型组全部造模成功，造模成功后1d可见间质炎症细胞浸润；第3d、5d时肾间质炎症细胞浸润明显，可见肾小管上皮细胞坏死、塌陷，肾间质明显增宽，间质水肿明显；第9d时炎症细胞浸润有所减轻。ELISA结果显示：检测大鼠造模后第1-2d尿液中Clusterin即有所增高，但无明显统计学意义，造模后第3-7d尿液中Clusterin均较正常尿液表达明显升高，造模后第8d尿液Clusterin含量有所下降，但仍维持在较高水平，造模后第9d尿液Clusterin含量下降近正常水平。结果表明给大鼠予庆大霉素后1-2d尿液中Clusterin即开始出现，第3d开始含量明显增加，第4-6d达到高峰，第7-8d开始Clusterin含量趋于下降，但仍高于正常水平，造模后第9d尿液Clusterin含量接近正常。[中国实验诊断学,2014,18(7),1072-1073]
胶体金试纸条应用：取大鼠尿液0.2ml，将制备的Clusterin胶体金试纸条***尿液，注意不要超过样品垫，待1分钟左右取出平放，5分钟读取结果。出现1条红色沉淀线(质控线)，为尿检诊断阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线(检测线，质控线)，为尿检诊断阳性，未出现沉淀线则为无效(见图2)。试纸条检测结果与ELISA结果重复性好，模型组动物全部在造模后3-4d出现明显阳性条带，造模后7-8d仍可见弱阳性条带。
实施例4Clusterin胶体金试纸条在临床急性肾损伤高危人群中的应用
动态收集临床急性肾损伤高危人群(严重感染、长期使用肾毒性药物病人等)尿液，使用自制Clusterin检测试纸条检测临床尿液标本中Clusterin表达，取尿液0.2ml，将制备的Clusterin胶体金试纸条***尿液，注意不要超过样品垫，待1分钟左右取出平放，5分钟读取结果。出现1条红色沉淀线(质控线)，为尿检诊断阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线(检测线，质控线)，为尿检诊断阳性，未出现沉淀线则为无效。最后经临床确诊(血肌酐异常)出现急性肾损伤的病例，Clusterin胶体金试纸条阳性率达到90％以上，且Clusterin阳性时间要早于血肌酐的变化。

Claims (5)

1.一种检测尿液Clusterin含量试纸条的制备，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，其特征在于：金标垫包被有纯化的自制Clusterin单克隆抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的自制Clusterin单克隆抗体2，质控线包被有正常羊抗小鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的Clusterin单克隆抗体1和单克隆抗体2，其特征在于Clusterin单克隆抗体1和Clusterin单克隆抗体2为分别针对Clusterin不同抗原决定簇的抗体，即结合位点不同。
3.根据权利要求1所述的Clusterin单克隆抗体1和Clusterin单克隆抗体2，其特征在于Clusterin单克隆抗体1和Clusterin单克隆抗体2均为采用小鼠杂交瘤细胞法制备。
4.根据权利要求1所述的一种检测Clusterin含量的胶体金试纸条，其特征在于该试纸条用于检测人或动物尿液样品。
5.根据权利要求1所述的一种检测Clusterin含量的胶体金试纸条，其特征在于该试纸条在临床急性肾损伤辅助诊断及药物研究中肾毒性安全性监测的应用。
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