CN105527431A - B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置及制备方法，属于医疗检测设备领域。由固相有纯化的高特异性B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原和羊抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记鼠抗人IgG的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。采用多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜进行预处理，将B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原先与二氧化硅纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，并配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。检测试纸灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置及制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及一种B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗体快速检测装置及其制备方法，可实现B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗体的灵敏、特异、快速检测。
背景技术
B族溶血性链球菌(groupBstreptococcus，GBS)又名无乳链球菌，自上世纪70年代后，发现该菌能感染人类，尤其是新生儿。该菌可导致新生儿败血症、脑膜炎、肺炎等，死亡率极高，且可能有神经***后遗症，因此被医学界重视。目前该菌已被认为是围生期严重感染性疾病的主要病原菌。B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白(SCPB)是一种链球菌特有的多功能表面结合蛋白酶,由个氨基酸组成,它同时存在于其他各类血清型,是重要的毒力因子,它可以阻止与中性粒细胞的结合,抑制炎症时调理吞噬细胞的化学攻击作用,可特异裂解吞噬细胞趋化因子,从而阻断补体的替代激活途径,并且证实SCPB抗体具有调理吞噬作用,用此蛋白免疫小鼠能诱导产生不依赖血清型的保护作用。SCPB是一种几乎存在于所有菌株上的较保守的表面蛋白抗原,有高度的保守性,且免疫原性良好,它可刺激机体产生保护性抗体,并可通过胎盘。因此SCPB抗体是B族溶血性链球菌感染的重要指标。
我国已有相关指南推荐对围生期孕妇进行GBS检查，但是目前常规的细菌鉴定技术较耗时，大大限制了其临床应用。
胶体金免疫层析技术(goldimmunochromatographyassay，GICA)是一种将胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的固相膜免疫分析技术。胶体金免疫层析技术是一种常用的免疫层析检测方法，由于其操作简单、省时、制造成本较低、结果易判读等特点，非常适合于现场检测，广泛用于生物、医药、食品等领域。由于胶体金免疫层析技术是一步完成检测，因此检测过程的干扰因素较多，其灵敏度低是限制胶体金免疫层析应用范围的主要因素，传统的胶体金免疫层析技术的检测限高于ELISA等方法。
在胶体金免疫层析检测中，蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置及制备方法，以解决现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。
本发明采取的技术方案是：
B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述硝酸纤维素膜3上设置检测线T和质控线C；所述的检测线T固相有纯化的B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原；所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG抗体。
本发明B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，包括如下步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记鼠抗人IgG抗体，获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(d)B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原与二氧化硅纳米颗粒结合，方法是：以二氧化硅作为载体，取1mL高特异性B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
本发明步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
本发明步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，BSA浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
本发明步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)中二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
本发明制备的B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗体快速检测装置可检测患者体内B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗体，为临床B族溶血性链球菌感染诊断具有重要意义。
本发明由固相有纯化的B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原(检测线T)和羊抗鼠IgG抗体(质控线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记鼠抗人IgG的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成，具有特异、快速、灵敏的特点。采用多聚赖氨酸对硝酸纤维素膜进行预处理，并配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)的结构中含有多个氨基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。多聚赖氨酸带有大量的正电荷，可以显著增加NC膜上活性位点的正电荷数量，而抗体在常规包被条件下是带负电荷的，这样单位面积的NC膜上可以结合更多数量的抗体，这可以显著增加抗体的包被效率。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用多聚赖氨酸处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。研究发现甲醇具有良好的重润湿性，可以保证在预处理NC膜的时候不产生气泡以免气泡的存在导致NC膜处理局部不充分，同时也能够活化NC膜，让NC膜带正电荷，这个与聚赖氨酸相似，两者协同作用，效果更好。PEG20000可与NC膜的位点发生吸附作用，在蛋白包被后，可以吸收蛋白的结合水，导致蛋白更加疏水，这样蛋白与NC膜的结合更加牢固，通过疏水作用明显提高蛋白的包被效率。综上，多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组合配方，可以从电荷作用和疏水作用两方面来提高NC膜蛋白的包被效率。
为了提高胶体金免疫层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液进行了预处理，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构新颖，将B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强。
2、免疫胶体金制备步骤中，通过配制合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
3、本发明对硝酸纤维素膜进行预处理，提高了检测试纸灵敏度、特异性。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
具体实施方式
如图1所示，本发明B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置结构是，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接，所述硝酸纤维素膜3上设置检测线T和质控线C，所述的检测线T固相有纯化的B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG抗体。
实施例1
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：0.5，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为20nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升20nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入鼠抗人IgG抗体，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
3)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
(e)组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例2：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：1，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为40nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升40nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在40nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入鼠抗人IgG抗体，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
3)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5-1％、酪蛋白浓度为0.1-0.2％、表面活性剂浓度为0.5-1％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
(e)组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例3：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金
在加热的100ml纯化水中快速加入氯化金，待溶液再次沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠，氯化金：柠檬酸三钠1：2，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可，胶体金颗粒为60nm；
(b)免疫胶体金制备
1)分别取100毫升60nm胶体金溶液，加入pH调节剂140μl，混匀；静置5min；
2)在20nm胶体金溶液中，按照每毫升胶体金溶液14μg的比例加入鼠抗人IgG抗体，共1.4mg，混匀；静置5min；
3)分别按照0.4％的比例加入胶体金稳定剂0.4毫升，混匀，静置5分钟；
4)10000、12000、14000rpm离心10min，分别收集沉淀，合并三次收集的沉淀；
(c)采用优化的喷金缓冲液稀释免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体玻璃纤维膜；所述的喷金缓冲液包括：浓度为20mMTris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)固相硝酸纤维素膜
1)多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜
配制多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)、浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
多聚赖氨酸处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
3)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5-1％、酪蛋白浓度为0.1-0.2％、表面活性剂浓度为0.5-1％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
(e)组装
将预处理的样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例4
步骤(d)中：还包括
2)二氧化硅纳米颗粒修饰B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原
二氧化硅纳米颗粒制备：将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
二氧化硅纳米颗粒修饰B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原：
以二氧化硅作为载体，取1mLB族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍；
其余同实施例1或2或3。
实施例5：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例6：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例7：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
其余同实施例2。
实施例8：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例9：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,200KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
实施例10：
配制多聚赖氨酸处理液：由多聚赖氨酸(SIGMA,300KD)、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
其余同实施例2。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1：
1、多聚赖氨酸处理液对硝酸纤维素膜蛋白吸附能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)购自Sigma公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制多聚赖氨酸处理液
配制三种多聚赖氨酸处理液：多聚赖氨酸组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成；多聚赖氨酸处理液甲醇组，多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％；多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000组，，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入多聚赖氨酸处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗体快速检测检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后吸附力和稳定性指标差异。
1.4结果
1.4.1蛋白吸附力比较
取3组处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，处理后膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。多聚赖氨酸、甲醇和PEG20000处理组吸附效果明显优于多聚赖氨酸组和多聚赖氨酸甲醇组。
表1硝酸纤维素膜吸附能力比较
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取3组处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
实验例2：
2、二氧化硅纳米颗粒修饰B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原
2.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，正硅酸乙酯购自汕头陇西化工厂
2.2.1二氧化硅纳米颗粒制备
将2.48mL氨水(体积分数25)和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴人3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径均一的粒子(120nm)。分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性。最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
2.2.2二氧化硅纳米颗粒修饰B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原
以二氧化硅作为载体，取1mLB族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
2.3实验方法
分别将二氧化硅纳米颗粒修饰的B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原与未修饰的B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗原按照上述实施例工艺流程制备B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白IgG抗体快速检测检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较二氧化硅纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
2.4结果
2.4.1蛋白吸附力比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，二氧化硅纳米颗粒修饰组膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3二氧化硅纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
2.4.2稳定性比较
取二氧化硅纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断二氧化硅修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置，其特征在于：样品垫(1)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)分别粘贴在塑料板(5)，所述硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸收垫(4)、免疫胶体金玻璃纤维膜(2)搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜(2)的另一端与样品垫(1)搭接；所述硝酸纤维素膜(3)上设置检测线(T)和质控线(C)，所述的检测线(T)上固相有纯化的高特异性B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原，所述的质控线(C)上喷点和羊抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜。
2.如权利要求1所述B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(a)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
(b)采用步骤(a)中制得的胶体金标记鼠抗人IgG抗体，获得免疫胶体金；
(c)采用喷金缓冲液稀释步骤(b)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理后，喷点B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
3.根据权利要求2所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原与二氧化硅纳米颗粒结合，方法是：以二氧化硅作为载体，取1mL高特异性B族溶血性链球菌C5a肽酶蛋白抗原溶液，与乙醇和去离子水搅拌混匀，再加入定量氨水和0.3mL正硅酸已酯，搅拌1小时后，补加剩余正硅酸已酯，持续搅拌，整个反应避光进行，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，无水乙醇、去离子水各洗2遍。
4.根据权利要求2或3所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述的采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒粒径为20～60nm。
5.根据权利要求2或3所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述的喷金缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，BSA浓度为0.5～1％。
6.根据权利要求2或3所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用多聚赖氨酸处理液预处理是：用多聚赖氨酸处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
7.根据权利要求2或3所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚浓度为0.5～1％。
8.根据权利要求2或3所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
9.根据权利要求2或3所述的一种B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸与甲醇混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
10.根据权利要求2或3所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的多聚赖氨酸处理液由多聚赖氨酸、甲醇、PEG20000混合组成，其中多聚赖氨酸浓度为0.5％组成，甲醇浓度为10％，PEG20000浓度为0.2％，经0.22μm滤膜过滤，其中多聚赖氨酸，SIGMA,150KD～300KD，备用。
11.根据权利要求3所述的B族溶血性链球菌IgG抗体快速检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述二氧化硅纳米颗粒的制备是：将2.48mL体积分数25的氨水和43.2mL无水乙醇混合于锥形瓶中，在35℃左右和超声条件下，以0.4mL/min的速度滴入3.5mL正硅酸乙酯，滴完后再超声5分钟，即可制得粒径120nm均一的粒子，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，倒掉上清液，再加水超声分散.反复多次洗涤至近中性，最后用水定容至体积与刚制备好时的体积相同，存放待用。
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