CN106967652A - 一株促进箭筈豌豆生长的根瘤菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株促进箭筈豌豆生长的根瘤菌及其应用。该根瘤菌是豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，其菌株号为JW1401，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.11876。试验证明豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401 CGMCC 11876与箭筈豌豆接种组合对箭筈豌豆具有显著的增产效果，具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为箭筈豌豆根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在箭筈豌豆种植业中具有广阔的应用前景。

Description

一株促进箭筈豌豆生长的根瘤菌及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物领域中一株促进箭筈豌豆生长的根瘤菌及其应用。
背景技术
箭筈豌豆(Vicia sativa L.)又名大巢菜、春巢菜、普通巢菜、野豌豆、救荒野豌豆等)是一年生或越年生豆科草本植物。箭筈豌豆适于气候干燥、耐寒喜温凉、排水良好的砂土、粘土上生长，适宜土壤pH值6.5-8.5，适应性广泛。比苕子抗逆力稍差。早发、速生、早熟、产种量高而稳定,鲜物质养分含量为N 0.64％，P2O5 0.1％，K 0.59％。箭筈豌豆为绿肥及优良牧草。在我国江苏、江西、台湾、陕西、云南、青海、甘肃等省(区)的草原和山地均有野生分布，其生于海拔50-3000米荒山、田边草丛及林中。
氮是一切生命的要素，无机氮素转化为有机氮化物是植物生长中最重要的营养元素之一，在生物界三大类群中，植物不能直接利用分子态氮，而一部分微生物即固氮微生物能够利用分子态氮，活的生物体将大气中的分子态氮转化为氨的作用称为生物固氮作用。自然界的生物固氮主要有两种形式，自生固氮和共生固氮。共生固氮微生物在自然条件下必须与另一种生物配合才能固氮生活。生物固氮是地球化学中氮元素循环转化的一个重要环节，在自然界的氮素循环过程中起着十分重要的作用。根瘤菌是一类能侵染豆科植物根部(少数是茎部)形成根瘤进行生物固氮的细菌，根瘤菌与豆科植物共生体系是生物固氮中作用最强的体系。自生固氮细菌的固氮能力比共生固氮的根瘤菌差很多，只是普通根瘤菌的几十分之一。土壤中的固氮微生物将空气中的氮气转化为植物可吸收的氨，所固定的氮约为生物固氮总量的65％。通过豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用可以提高土壤肥力，接种根瘤菌能够提高豆科植物的产量和氮储藏量。如果种植的豆科植物没有相应的高效根瘤菌株与之共生结瘤并固定空气中的氮素，它们将完全依赖土壤中的结合态氮，不但不能补充反而会消耗土壤中的氮素，导致土壤肥力下降。因此，为了充分发挥根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，以维持土壤氮素平衡，需要筛选高效菌株进行人工接种。在生物固氮过程中，依据根瘤菌对寄主植物的专一性，把适于同一种根瘤菌结瘤固氮的植物列为一族，根瘤菌在族内各植物间可以转接，称为互接种族。毛叶苕子和豌豆在根瘤菌应用上是互接种族，豌豆根瘤菌既可以接种不同毛叶苕子也可以接种不同品种豌豆，由于品种不同接种效果差异较大。
箭筈豌豆接瘤多而早，因此，苗期根瘤菌就有一定的固氮能力，随着营养生长加速，固氮活性不断提高。一般在2-3片真叶时形成根瘤，苗期发育的根瘤多数为单瘤；箭筈豌豆根瘤数量、质量的变化，与其根瘤的固氮活性一般成正相关；营养生长阶段的固氮量占全生育期的95％以上。南方秋播的在返青期、北方春播的在伸长期的根瘤固氮活性的高峰。进入花期后，多数箭筈豌豆品种的根瘤自然衰亡，固氮活性很弱。作为绿肥作物的箭筈豌豆同时也是豆科作物，豆科根瘤菌的研究和应用在世界已有一百多年历史，几乎在全世界范围内都提倡对豆科作物进行根瘤菌接种。目前，接种箭筈豌豆根瘤菌仍是提高鲜草产量的重要技术措施。近十年来，我国箭筈豌豆种植面积不断扩大，各地加大重视箭筈豌豆的栽培和利用，箭筈豌豆接种根瘤菌技术的研究和应用也不断提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何显著促进箭筈豌豆增长。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一株根瘤菌。
本发明所提供的用于接种箭筈豌豆的根瘤菌菌株是(Rhizobiumleguminosarum)，其菌株号为JW1401，该菌株已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11876，以下简称豌豆根瘤菌JW1401。
豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401 CGMCC11876属革兰氏染色阴性，小短杆状，无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.9)×(1.0-3.0)微米，在不同环境中生长的菌体形态各异。在培养条件下，该菌呈小的短杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量较高。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，无色半透明或浅乳白色，菌苔较浓。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了促进箭筈豌豆生长的菌剂。
本发明所提供的促进箭筈豌豆生长的菌剂，含有豌豆根瘤菌JW1401或/和豌豆根瘤菌JW1401的代谢物。
上述菌剂中，所述菌剂为提高箭筈豌豆产量和/或提高箭筈豌豆株高的菌剂。
上述菌剂的活性成分可为豌豆根瘤菌JW1401或/和豌豆根瘤菌JW1401的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂对箭筈豌豆产量和/或植株高度促进效果确定。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，豌豆根瘤菌JW1401或/和豌豆根瘤菌JW1401的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
其中，豌豆根瘤菌JW1401的代谢物是将豌豆根瘤菌JW1401在微生物液体发酵培养基中培养得到的物质。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
含有所述菌剂的生物有机肥也属于本发明的保护范围。
豌豆根瘤菌JW1401或所述菌剂在制备促进箭筈豌豆生长的产品(如生物肥料)中的应用和豌豆根瘤菌JW1401或所述菌剂或所述生物有机肥在促进箭筈豌豆生长中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述促进箭筈豌豆生长为提高箭筈豌豆产量和/或提高箭筈豌豆株高。
上文中，所述箭筈豌豆的品种可为青海白箭或青海灰箭。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了一种培养豌豆根瘤菌JW1401的方法。
本发明所提供的培养豌豆根瘤菌JW1401的方法，包括在用于培养根瘤菌的培养基中培养豌豆根瘤菌JW1401的步骤。
所述用于培养根瘤菌的培养基可按照如下方法配制：丙三醇3-5ml，甘露醇2-5g，酵母浸粉0.8-1g，K2HPO4 0.5-1g，无水MgSO4 0.1-0.2g，CaSO4·2H2O 0.1-0.2g，NaCl 0.1-0.2g，1％(NH4)6Mo7O24·4H2O 1-1.5ml、1％H3BO3 1-1.5ml，琼脂20g，用水定容至1000ml，调pH值为6.8-7.0，灭菌得到用于培养根瘤菌的培养基。
本发明提供了一株促进箭筈豌豆生长的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401 CGMCC 11876，该菌及以该菌为活性成分的菌剂可用于箭筈豌豆的根瘤菌接种。箭筈豌豆接种组合效果的水培试验证明将该菌接种箭筈豌豆种子后，箭筈豌豆植株高度、植株鲜重和植株干重比不接菌的对照植株分别平均增长8.62％、32.59％和56.67％；在小区田间试验中，豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海白箭与不接菌对照处理的青海白箭相比，株高增加了6.26％，小区产量增加了62.62％；豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海灰箭与不接菌对照处理的青灰箭相比，株高增加了10.11％，小区产量增加了66.77％。上述试验证明豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401 CGMCC 11876与箭筈豌豆接种组合对箭筈豌豆具有显著的增产效果，具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为箭筈豌豆根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在箭筈豌豆种植业中具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)ACCC 16505于1990年4月1日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)ACCC 16505在下文中简称豌豆根瘤菌ACCC16505。
下述实施例中的固体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，K2HPO4 0.5g，无水MgSO4 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g，NaCl 0.1g，1％(NH4)6Mo7O24·4H2O 1ml、1％H3BO3 1ml，琼脂20g，用水定容至1000ml，调pH值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。
下述实施例中的液体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，K2HPO4 0.5g，无水MgSO4 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g，NaCl 0.1g，1％(NH4)6Mo7O24·4H2O 1ml、1％H3BO3 1ml，用水定容至1000ml，调pH值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。
实施例1、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401 CGMCC11876的的分离及鉴定
1、菌株的分离
从青海省海东市互助土族自治县和平安区采集野生箭筈豌豆根瘤样品，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)划线分离得到菌株JW1401。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株JW1401进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株JW1401，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明菌株JW1401属革兰氏染色阴性，小短杆状，无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.9)×(1.0-3.0)微米，在不同环境中生长的菌体形态各异。在培养条件下，该菌呈小的短杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量较高。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长，菌落呈圆形，边缘整齐，稍突起，无色半透明或浅乳白色，菌苔较浓。
2.2、16S rDNA序列同源性分析
采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株JW1401的16S rDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株JW1401的16SrDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株JW1401的16S rDNA与豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarumbv.viciae)CCBAU 75042的16S ribosomal RNA基因部分序列(SequenceID:DQ835299.2)的相似性最高为100％。
2.3、生理生化特征鉴定
参考《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌***鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定菌株JW1401的生理生化特征。结果表明菌株JW1401为化能异养型，能利用各种碳水化合物和有机酸的盐作为碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、D-核糖、D-纤维二糖、D-***糖、甘露醇、木糖、D-半乳糖、果糖、卫矛醇和肌醇；能利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸作为氮源；刚果红吸色反应微吸色；石蕊牛奶反应不凝结，不产酸；不能利用纤维素和淀粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；从甘露醇产酸；在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液；不产生硫化氢；不在甘油磷酸钙培养基产生沉淀。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株JW1401鉴定为豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)。该豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11876，以下简称为豌豆根瘤菌JW1401。
实施例2、豌豆根瘤菌JW1401菌剂的制备
1、豌豆根瘤菌JW1401的斜面培养
挑取实施例1的豌豆根瘤菌JW1401接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的豌豆根瘤菌JW1401。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌JW1401，将其接种于500mL液体培养基中，在28℃下培养48小时，得到豌豆根瘤菌JW1401菌液。
3、种子罐培养
取3L步骤2的豌豆根瘤菌JW1401菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养56小时培养，得到豌豆根瘤菌JW1401种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌JW1401种子液接入1000L发酵罐中(含有600L液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养56小时，得到豌豆根瘤菌JW1401发酵液，该豌豆根瘤菌JW1401发酵液中豌豆根瘤菌JW1401的含量为30亿cfu/mL。
5、豌豆根瘤菌JW1401菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的豌豆根瘤菌JW1401发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌JW1401菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌JW1401菌剂中的豌豆根瘤菌JW1401的含量为2.0×108cfu/克。
对比例1、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)H10 CGMCC No.11878的分离及鉴定
1、菌株的分离
从青海省乐都县采集野生豌豆根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)划线分离得到菌株H10。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株H10进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株H10，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明菌株H10属革兰氏染色阴性，小短杆状，菌体大小为0.5～0.9微米×1.2～6.0微米，在不同环境中生长的菌体形态不同。一般含有聚-β-羟基丁酸盐颗粒。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，运动，好氧。最适生长温度25～30℃，最适pH6.0～7.0。菌落呈圆形，边缘整齐，微凸起，无色半透明或浅乳白色，粘稠。在酵母汁甘露醇无机盐琼脂培养基平板上生长3-6天后直径2～4mm。在含糖培养基上的生长物常伴有丰富的胞外粘液。
2.2、16S rDNA序列同源性分析
采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株H10的16S rDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株H10的16S rDNA具有序列表中序列2的核苷酸序列。菌株H10的16S rDNA与豌豆根瘤菌Rhizobiumleguminosarum strain INTA D156的16S rRNA基因(Sequence ID:KX066064.1)的相似性最高为99％。
2.3、生理生化特征鉴定
参考《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌***鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定菌株H10的生理生化特征。结果表明菌株H10是化能异养型，能利用各种碳水化合物和有机酸的盐类作为碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、D-核糖、D-纤维二糖、D-***糖、甘露醇、木糖、D-半乳糖、果糖、卫矛醇和肌醇；能利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸可作为氮源；刚果红吸色反应微吸色；石蕊牛奶反应不凝结，不产酸；不能利用纤维素和淀粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；从甘露醇产酸；在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液；不产生硫化氢；不在甘油磷酸钙培养基产生沉淀。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株H10鉴定为豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)。该豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)H10已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11878，以下简称为豌豆根瘤菌H10。豌豆根瘤菌H10已于2016年11月28日由本申请的申请人提出中国发明专利申请，申请号为201611072530.2。
对比例2、豌豆根瘤菌H10菌剂的制备
1、豌豆根瘤菌H10的斜面培养
挑取对比例1的豌豆根瘤菌H10接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的豌豆根瘤菌H10。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌H10，将其接种于500mL液体培养基中，在28℃下培养72小时，得到豌豆根瘤菌H10菌液。
3、种子罐培养
取3L步骤2的豌豆根瘤菌H10菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养60小时培养，得到豌豆根瘤菌H10种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌H10种子液接入1000L发酵罐中(含有600L液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60小时，得到豌豆根瘤菌H10发酵液，该豌豆根瘤菌H10发酵液中豌豆根瘤菌H10的含量为30亿cfu/mL。
5、豌豆根瘤菌H10菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的豌豆根瘤菌H10发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌H10菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌H10菌剂中的豌豆根瘤菌H10的含量为2.0×108cfu/克。
对比例3、豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂的制备
1、豌豆根瘤菌ACCC16505的斜面培养
挑取豌豆根瘤菌ACCC16505接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的豌豆根瘤菌ACCC16505。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌ACCC16505，将其接种于500mL液体培养基中，在28℃下培养72小时，得到豌豆根瘤菌ACCC16505菌液。
3、种子罐培养
取3L步骤2的豌豆根瘤菌ACCC16505菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养60小时培养，得到豌豆根瘤菌ACCC16505种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌ACCC16505种子液接入1000L发酵罐中(含有600L液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60小时，得到豌豆根瘤菌ACCC16505发酵液，该豌豆根瘤菌ACCC16505发酵液中豌豆根瘤菌ACCC16505的含量为30亿cfu/mL。
5、豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的豌豆根瘤菌ACCC16505发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂中的豌豆根瘤菌ACCC16505的含量为2.0×108cfu/克。
对比例4、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)m1-10-3 CGMCC11877的分离及鉴定
1、菌株的分离
从青海省海东市平安区采集野生毛叶苕子根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)划线分离得到菌株m1-10-3。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株m1-10-3进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株m1-10-3，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明菌株m1-10-3属革兰氏染色阴性，短小杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量较高。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.8)×(1.1-2.9)微米。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长，菌落呈圆形凸起，边缘整齐，较湿润表面光滑，质地均一，浅乳白色，菌苔粘稠。
2.2、16S rDNA序列同源性分析
采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株m1-10-3的16S rDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株m1-10-3的16SrDNA具有序列表中序列2的核苷酸序列。菌株m1-10-3的16S rRNA基因片段与豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)菌株CCBAU 85022的16S rRNA基因部分序列(Sequence ID:EU256422.1)的相似性最高为99％。
2.3、生理生化特征鉴定
参考《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌***鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定菌株m1-10-3的生理生化特征。结果表明菌株m1-10-3为化能异养型，能利用各种碳水化合物和有机酸的盐作为碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、D-核糖、D-纤维二糖、D-***糖、甘露醇、木糖、D-半乳糖、果糖、卫矛醇和肌醇；能利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸作为氮源；刚果红吸色反应微吸色；石蕊牛奶反应不凝结，不产酸；不能利用纤维素和淀粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；从甘露醇产酸；在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液；不产生硫化氢；不在甘油磷酸钙培养基产生沉淀。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株m1-10-3鉴定为豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)。该豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)m1-10-3已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11877，以下简称为豌豆根瘤菌m1-10-3。
对比例5、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂的制备
1、豌豆根瘤菌m1-10-3的斜面培养
挑取实施例1的豌豆根瘤菌m1-10-3接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的豌豆根瘤菌m1-10-3。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌m1-10-3，将其接种于500mL液体培养基中，在28℃下培养48小时，得到豌豆根瘤菌m1-10-3菌液。
3、种子罐培养
取3L步骤2的豌豆根瘤菌m1-10-3菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养56小时培养，得到豌豆根瘤菌m1-10-3种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌m1-10-3种子液接入1000L发酵罐中(含有600L液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养56小时，得到豌豆根瘤菌m1-10-3发酵液，该豌豆根瘤菌m1-10-3发酵液中豌豆根瘤菌m1-10-3的含量为30亿cfu/mL。
5、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的豌豆根瘤菌m1-10-3发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂中的豌豆根瘤菌m1-10-3的含量为2.0×108cfu/克。
实施例3、豌豆根瘤菌JW1401菌剂接种箭筈豌豆的水培试验
箭筈豌豆采用滤纸桥试管水培法。将滤纸裁成条状，其宽度分别为1.6cm,制成M型，中间凹处根据幼苗的大小制成V型小孔，M型滤纸的高度为试管的长度减去4cm。所用试管为2.0cm×20cm。
将配制好的无氮营养液分别装入带有滤纸支撑物的试管中，其高度位于M型滤纸的凹处，每个处理重复4个试管，并设对照管4个，灌装后用耐高温高压的塑料薄膜封好后，121℃灭菌1小时备用。
选择大小均一的青海当地箭筈豌豆品种青海灰箭种子，用95％乙醇浸泡5min后用0.1％HgCl2表面灭菌5min,再用无菌水冲洗10次。
将消毒的种子置于28—30℃温箱中保温催芽。光照要求从顶部照射，根部避光，可放置温室或光照箱中，光照照强度约7000lux—8000lux；温度：20—30℃；催芽长度为0.8-1.5cm。
实验设不接菌对照处理和豌豆根瘤菌JW1401处理。实验设三次重复，每次重复的实验方法如下：
豌豆根瘤菌JW1401处理：将10粒催芽成功的种子放入菌悬液(用液体培养基稀释实施例2步骤4的豌豆根瘤菌JW1401发酵液至豌豆根瘤菌JW1401的含量为2.0×107cfu/mL得到菌悬液)中浸泡30min,用无菌的镊子小心夹出种子放入水培液试管的滤纸桥中固定好播种，将菌悬液平均吸入试管中。封口后于光照箱中光照培养，光照从顶部照射，光照时间14h/10h，根部避光，光照强度为7000lux—8000lux；温度：25—30℃。
不接菌对照处理：与豌豆根瘤菌JW1401处理的区别仅在于将菌悬液替换为液体培养基，其他操作完全相同。
表1、箭筈豌豆接种根瘤菌JW1401水培试验结果
结果如表1所示，箭筈豌豆种子接种豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401 CGMCC 11876后，植株高度、植株鲜重和植株干重比不接菌的对照植株分别平均增长8.62％、32.59％和56.67％，表明本发明的箭筈豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)JW1401 CGMCC 11876对箭筈豌豆具有显著的增产效果。
实施例4、豌豆根瘤菌JW1401与豌豆根瘤菌H10、豌豆根瘤菌m1-10-3和豌豆根瘤菌ACCC16505接种箭筈豌豆品种的效果比较试验
选择青海当地箭筈豌豆品种青海白箭和青海灰箭这两个箭筈豌豆品种进行促进生长实验。
本试验采用随机区组设计，随机设置10个处理区，每个处理区设三个小区重复。10个处理区分别为JW1401-青海白箭处理区和JW1401-青海灰箭处理区这两个豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理区，m1-10-3-青海白箭处理区和m1-10-3-青海灰箭处理区这两个豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理区，H10-青海白箭处理区和H10-青海灰箭处理区这两个豌豆根瘤菌H10菌剂处理区，ACCC16505-青海白箭处理区和ACCC16505-青海灰箭处理区这两个豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理区，对照-青海白箭处理区和对照-青海灰箭处理区这两个不接菌对照处理区。
每个小区大小为4㎡,土壤pH8.3，土著根瘤菌平均数量2.0×103cfu/g干土。按照毛叶苕子播种量为7.5kg/hm2准备种子。
JW1401-青海白箭处理区和JW1401-青海灰箭处理区分别播种青海白箭种子和青海灰箭种子(将实施例2的豌豆根瘤菌JW1401菌剂分别和青海白箭种子、青海灰箭种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为JW1401-青海白箭种子、JW1401-青海灰箭种子。
m1-10-3-青海白箭处理区和m1-10-3-青海灰箭处理区分别播种青海白箭种子和青海灰箭种子(将对比例5的豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂分别和青海白箭种子、青海灰箭种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为m1-10-3-青海白箭种子、m1-10-3-青海灰箭种子。
H10-青海白箭处理区和H10-青海灰箭处理区分别播种青海白箭种子和青海灰箭种子(将对比例2的豌豆根瘤菌H10菌剂分别和青海白箭种子、青海灰箭种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为H10-青海白箭种子、H10-青海灰箭种子。
ACCC16505-青海白箭处理区和ACCC16505-青海灰箭处理区分别播种青海白箭种子和青海灰箭种子(将对比例3的豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂分别和青海白箭种子、青海灰箭种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为ACCC16505-青海白箭种子、ACCC16505-青海灰箭种子。
对照-青海白箭处理区和对照-青海灰箭处理区分别播种对照-青海白箭种子和对照-青海灰箭种子(将实施例2中的无菌草炭分别和青海白箭种子、青海灰箭种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为对照-青海白箭种子和对照-青海灰箭种子)。
将上述种子按照小区设计均匀播种到土壤中，播种方法为条播，行距为10cm。上述各处理区除所播种的种子不同外，其他条件完全相同。播种后在相同条件下培养至开花期，记录各个小区植株地上部分高度(植株高度)、根瘤数和地上部分干重，并计算出各处理区的平均值，分别得到植株平均高度、植株平均根瘤数和小区产量。
表2、箭筈豌豆接种组合田间小区效果试验数据
注：小区产量以干重计。
表3、豌豆根瘤菌JW1401菌剂与豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂、豌豆根瘤菌H10菌剂、豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂的促生长比较效果
注：小区产量以干重计。注：JW1401表示豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理区，m1-10-3表示豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理区，H10表示豌豆根瘤菌H10菌剂处理区，ACCC16505表示豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理区，对照表示不接菌对照处理区。
结果如表2和表3所示，表明：
1、豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海白箭与不接菌对照处理的青海白箭相比，株高增加了6.26％，小区产量增加了62.62％；豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海灰箭与不接菌对照处理的青灰箭相比，株高增加了10.11％，小区产量增加了66.77％；
2、豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海白箭与豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理的青海白箭相比，株高增加了6.33％，小区产量增加了71.08％；豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海灰箭与豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理的青海灰箭相比，株高增加了20.64％，小区产量增加了80.59％；
3、豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海白箭与豌豆根瘤菌H10菌剂处理的青海白箭相比，株高增加了18.61％，小区产量增加了60.39％；
4、豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海白箭与豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的青海白箭相比，株高增加了4.32％，小区产量增加了58.09％；豌豆根瘤菌JW1401菌剂处理的青海灰箭与豌豆根瘤菌H10菌剂处理的青海灰箭相比，株高增加了-1.34％，小区产量增加了56.43％。
上述结果表明本发明的豌豆根瘤菌JW1401对箭筈豌豆比豌豆根瘤菌m1-10-3、豌豆根瘤菌H10和豌豆根瘤菌ACCC16505具有更显著的促进生长和增产效果。
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 一株促进箭筈豌豆生长的根瘤菌及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)
<400> 1
tctgctcgca gcttacacat gcaagtcgag cgcgtagcaa tacgagcggc agacgggtga 60
gtaacgcgtg ggaatctacc cttgactacg gaataacgca gggaaacttg tgctaatacc 120
gtatgtgtcc ttcgggagaa agatttatcg gtcaaggatg agcccgcgtt ggattagcta 180
gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatccatagc tggtctgaga ggatgatcag 240
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg 300
acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg atgaaggccc tagggttgta 360
aagctctttc accggagaag ataatgacgg tatccggaga agaagccccg gctaacttcg 420
tgccagcagc cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag 480
cgcacgtagg cggatcgatc agtcaggggt gaaatcccag ggctcaaccc tggaactgcc 540
tttgatactg tcgatctgga gtatggaaga ggtgagtgga attccgagtg tagaggtgaa 600
attcgtagat attcggagga acaccagtgg cgaaggcggc tcactggtcc attactgacg 660
ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 720
acgatgaatg ttagccgtcg ggcagtatac tgttcggtgg cgcagctaac gcattaaaca 780
ttccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 840
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gcccttgaca 900
tgcccggcta cttgcagaga tgcaaggttc ccttcgggga ccgggacaca ggtgctgcat 960
ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 1020
gcccttagtt gccagcattg agttgggcac tctaagggga ctgccggtga taagccgaga 1080
ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac acacgtgcta 1140
caatggtggt gacagtgggc agcgagcacg cgagtgtgag ctaatctcca aaagccatct 1200
cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag taatcgcgga 1260
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1320
agttggtttt acccgaaggt agtgcgctaa ccgcaaggag gcagctaacc acgagacgcc 1380
gaaa 1384
<210> 2
<211> 1364
<212> DNA
<213> 豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)
<400> 2
tgcgctacca tgcaagtcga gcgcgtagca atacgagcgg cagacgggtg agtaacgcgt 60
gggaatctac ccttgactac ggaataacgc agggaaactt gtgctaatac cgtatgtgtc 120
cttcgggaga aagatttatc ggtcaaggat gagcccgcgt tggattagct agttggtggg 180
gtaaaggcct accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg 240
gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc 300
gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt aaagctcttt 360
caccggagaa gataatgacg gtatccggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag 420
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tacccgaagg tagtgcgcta accgcaagga ggcagcaacc gcga 1364

Claims (10)

1.豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，其菌株号为JW1401，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.11876。
2.促进箭筈豌豆生长的菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的豌豆根瘤菌或/和所述豌豆根瘤菌的代谢物。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为提高箭筈豌豆产量和/或提高箭筈豌豆株高的菌剂。
4.权利要求1所述的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)或权利要求2或3所述的菌剂在制备促进箭筈豌豆生长的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述促进箭筈豌豆生长为提高箭筈豌豆产量和/或提高箭筈豌豆株高。
6.含有权利要求2或3所述的菌剂的生物有机肥。
7.权利要求1所述的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)或权利要求2或3所述的菌剂或权利要求6所述的生物有机肥在促进箭筈豌豆生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述促进箭筈豌豆生长为提高箭筈豌豆产量和/或提高箭筈豌豆株高。
9.培养权利要求1所述的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)的方法，包括将权利要求1所述的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)在用于培养根瘤菌的培养基中培养的步骤。
10.制备权利要求2或3所述菌剂的方法，包括将权利要求1所述的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)和/或所述豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)的代谢物作为所述菌剂的活性成分的步骤。
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