CN110616169B - 一种具有促生作用的同温层芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开属于植物根际促生菌技术领域，具体涉及一种具有促生作用的同温层芽孢杆菌及其应用。土壤盐碱化对于农田持续发展和农作物产量具有严重的影响，通过农田覆盖盐碱化土壤是目前常用的治理手段。其中，根际促生菌可以有效地提高农作物的生长状况和耐盐碱生存能力。针对现有技术中的促生菌往往促生效果较为单一等不足，本公开经过大量筛选获得了一株同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)35W2，该菌株具有产蛋白酶、铁载体，分解环境中有机磷的功效，还具有良好的耐盐碱生存能力，能够提高农作物在盐碱土壤中的成活率和农艺性状，应用于农田盐碱化的治理具有重要的意义。

Description

一种具有促生作用的同温层芽孢杆菌及其应用
技术领域
本公开属于植物根际促生菌技术领域，具体涉及一种具有产蛋白酶、铁载体及解磷，提高植物耐盐碱生存能力的同温层芽孢杆菌及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
土壤盐碱化是指土壤中含盐量太高(超过0.3％)，从而使农作物低产或无法生长。由于地下水矿化程度较高，随着气候的改变，地下水通过毛细作用来到浅表层，随着水分的蒸发，盐分不断向土壤表层聚集形成盐渍土壤。随着人口的剧增以及不合理的开垦，土壤表皮原本结构被破坏，造成土地荒漠化和盐碱化加重。中国盐渍土地总面积14.87亿亩，其中现代盐渍土壤5.54亿亩，潜在盐渍化土壤2.60亿亩；中国受盐碱化危害的耕地达1.4亿亩，主要分布在新疆、河西走廊、柴达木盆地、河套平原、银川平原、黄淮海平原、东北平原西部，以及滨海地区。其中西北内陆地区盐碱化耕地面积占总耕地总面积的15％。
针对农田盐碱化的问题，现有研究表明根际促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)会通过诱导植物建立抵抗或忍耐机制，增强植物在盐胁迫条件下的生存能力，从而通过农田覆盖减少土壤盐碱化程度，提高盐碱农田的产量。根际促生菌(PGPR)是指寄生在植物根系或根际土壤，直接或者间接参与植物生长，提高作物品质或抵抗逆境胁迫的一类有益微生物，目前，我国已分离到的PGPR有27属53种，其中假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)是常见的根际促生菌种群，这些菌属菌株具有独特的生理生态功能和较强的环境适应能力，能够定植于植物根际，促进养分利用，提高植物抵抗生物和非生物胁迫的能力。然而PGPR能否增强植物盐碱抗性，受菌种特异性、土壤环境、宿主植物等多种因素的影响，各种类型的土壤中都存在PGPR，但其种类和群落结构与土壤理化性质、菌种特异性、植物盐碱抗性等多种因素相关。
植物根际促生菌PGPR刺激植物生长的机制涉及源自遗传过程的营养物的可用性，例如生物固氮和磷酸盐降解或者是通过调节ACC脱氨酶的表达来减轻植物生长抑制，以及产生植物激素和铁载体等。其促生机制一般是通过增加生物固氮、磷的溶解、解钾、合成植物激素、铁载体生成以及生物防治等作用。同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)是一种较为常见的促生菌，葛婵婵曾报告过一种具有消除玉米赤霉烯酮功效的同温层芽孢杆菌T-246；候贞曾报道在烟草根际土壤中分离的一种同温层芽孢杆菌PR1，该同温层芽孢杆菌具有产蛋白酶及解磷的效果。针对目前的研究现状，发明人发现，目前公开的根际促生菌往往效果较为单一，为了提高农作物的产量，往往需要多种促生菌复合使用。
发明内容
针对上述研究背景，发明人认为，进一步开展对根际促生菌的研究、筛选具有多种促生功能的促生菌可以有效降低种植成本，提高农作物的产量，改善土壤盐碱化程度，维持农业经济的可持续发展。发明人经不断筛选和研究，获得一种具有促生效果的同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)35W2，该菌株具有产蛋白酶、铁载体，分解土壤环境中有机磷的功效，该菌株还具有良好的耐盐碱生存能力，提高农作物在盐碱土壤中的成活率和农艺性状。
为了实现上述技术效果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一株同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)35W2，该菌株已于2019年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC No.18362。
第一方面所述的同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)35W2具有SEQ IDNO:1所示的16S rDNA序列。
本公开提供的菌株序列与其他已知同种的同温层芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％～100％的相似性，根据生理生化特征鉴定为同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus)35W2。所述菌株的形态学特征如下：
菌体特征：菌体形态呈杆状，革兰氏阳性，有芽孢；
菌落特征：在LB平板培养基(酵母粉，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，琼脂，1.6％，蒸馏水，121℃灭菌20min，pH7.0)上培养24h后菌落呈圆形，表面光滑无***，湿润有光泽，呈乳白色，边缘锯齿状。
所述菌株的生理生化特征为：接触酶阳性，V-P实验阴性，D-葡萄糖阳性，L-***糖阳性，D-甘露醇阳性，水解淀粉酶阳性，柠檬酸盐利用阳性。
优选的，所述菌株采用LB培养基进行培养；所述LB培养基经115～116℃灭菌15～25min，pH为6.8～7.2。
优选的，所述菌株的培养温度为35～39℃。
本公开第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂为第一方面所述同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)35W2和/或第一方面所述菌株的培养物。
优选的，所述菌的培养物制备方法如下：将活化后的菌株接种至培养基中培养得到。
进一步优选的，所述活化的操作如下：将菌株接种于液体培养基中恒温培养一段时间。
在一些具体的实施例中，所述液体培养基的体积为4～6mL。
在一些具体的实施例中，所述恒温的温度为35～39℃，或培养时间为12～14h。
优选的，所述活化后的菌株接种于培养基中，35～39℃培养22～26h。
本公开第三方面，提供第一方面所述菌株及第二方面所述菌剂在农作物促生方面的应用。
优选的，所述应用包括在产蛋白酶方面的应用、或在产铁载体方面的应用、或解磷方面的应用、或促进农作物在盐碱土壤中生存方面的应用、或提高作物农艺性状方面的作用。
优选的，所述农作物为小麦。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.针对现有技术中农田土壤盐碱化的问题，本公开提供了一种具有良好耐盐碱能力的促生菌株，该菌株在高浓度的盐碱环境下(pH12-10％NaCl)依然可以生存，可以显著提高农作物在盐碱土壤中的定植率，可适用于中度盐碱化土壤的治理，对于农田盐碱化改善具有重要的意义。
2.现有技术中提供的同温层芽孢杆菌通常只具有产蛋白酶或解磷、解钾等单一的促生功效。本公开提供的同温层芽孢杆菌具有促进植物耐盐碱生长的功效，在平板试验中也显示出产蛋白酶、铁载体，分解环境中有机磷成分的特性。该菌株同时具有多种促生功效，单用即可实现对农作物生长的促进作用和提高植物耐盐碱生存的能力，对于提高盐碱土壤中农作物的产量，降低种植成本具有重要的意义。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中同温层芽孢杆菌35W2镜检图片；
图2为实施例1中同温层芽孢杆菌35W2菌落照片图；
图3为实施例1中同温层芽孢杆菌35W2解蛋白能力照片图；
图4为实施例1中同温层芽孢杆菌35W2解有机磷能力照片图；
图5为实施例1中同温层芽孢杆菌35W2盆栽实验根系扫描对比图；
其中,图5中CK为对照组盆栽小麦；图5中35W2为实验组盆栽小麦。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中公开的根际促生菌功能较为单一，本公开提供了一株同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)35W2，具有优良的耐盐碱生存能力和农作物促生作用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
如图1和2所示，该菌株在LB平板培养基(酵母粉，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，琼脂，1.6％，蒸馏水，121℃灭菌20min，pH7.0)上培养24h后菌落呈圆形，表面光滑，湿润，扁平，呈淡黄色，边缘规则；菌体形态呈杆状，革兰氏阴性，无芽孢。
另外，经生理生化实验检测，该菌株的生理生化特征为：接触酶阳性，V-P实验阴性，D-葡萄糖阳性，L-***糖阳性，D-甘露醇阳性，水解淀粉酶阳性，柠檬酸盐利用阳性。
本实施例中还提供一种菌的发酵液，将斜面保存的同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus)35W2转接到装有5ml液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12-14h，温度：37℃，转速：180-200rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到100-200mL LB培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180-200rpm，制成发酵液。
LB培养基：酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，琼脂，1.6％，蒸馏水，121℃灭菌20min，pH7.0。
本实施例通过盆栽实验，以盐碱土壤种植小麦为试验样品验证该菌株对小麦的促生作用。所述盐碱土壤取自滨州无棣县盐碱地的盐碱土。土壤pH大于8.6，呈碱性。对照组(CK)为盐碱土壤中定苗后的小麦，不施用任何肥料，取1mlLB液体培养基用水稀释到20ml进行灌根处理。实验组采用上述发酵液在小麦定苗后取1ml稀释至20ml后进行灌根处理，灌根时的用量为：盆栽实验中每株1ml发酵液(20ml稀释液)。
分别在灌根处理后20d、40d通过检测盆栽小麦株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，结果如表1-3所示。
表1施菌20d促生效果
Figure GDA0002820089290000081
表2施菌40d促生效果
Figure GDA0002820089290000082
表3小麦叶片叶绿素含量检测结果
Figure GDA0002820089290000083
由上述结果可以看出，施用该菌株发酵液后，小麦的各项农艺性状相比对照组具有显著的提升，证明该菌株具有切实的促生效果。如图5所示，实验组的小麦根系相比对照组更加茁壮。
为了进一步明确该菌株的促生机制，本公开针对该菌株的产蛋白酶能力、解磷能力、产铁载体能力进行了考察，结果如表4～6所示，表4产蛋白酶检测结果
Figure GDA0002820089290000084
表5解磷能力检测结果
Figure GDA0002820089290000091
表6菌株产铁载体能力检测结果
Figure GDA0002820089290000092
分别将菌落接种于平板培养基中，用灭菌牙签蘸取少量菌泥点种到脱脂奶粉平板培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养72h。结果如图3-4所示，所述同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)35W2具有产蛋白酶效果，经检测，其蛋白酶活性能够达到80.728μg/mL，该菌株还具有产铁载体，分解环境中有机磷的作用。
本实施例进一步对该菌株耐盐、耐碱的能力进行验证，结果如表7-9所示：
表7菌株耐盐能力检测结果
Figure GDA0002820089290000093
注：“+++”表示生长旺盛；“++”表示生长较好；“+”表示生长；“*”表示微量生长；
“-”表示不生长
表8菌株耐碱能力检测结果
Figure GDA0002820089290000094
注：“+++”表示生长旺盛；“++”表示生长较好；“+”表示生长；“*”表示微量生长；
“-”表示不生长
表9菌株耐盐碱能力检测结果
Figure GDA0002820089290000101
注：“+++”表示生长旺盛；“++”表示生长较好；“+”表示生长；“*”表示微量生长；
“-”表示不生长
由表7～9的结果可以看出，该菌株在7～10％NaCl、pH9～12条件的土壤中依然可以生长。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种具有促生作用的同温层芽孢杆菌及其应用
<130> 2010
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1430
<212> DNA
<213> 同温层芽孢杆菌（Bacillus stratosphericus）35W2 16S rDNA
<400> 1
ctataatgca agtcgagcgg acagaaggga gcttgctccc ggatgttagc ggcggacggg 60
tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggagctaa 120
taccggatag ttccttgaac cgcatggttc aaggatgaaa gacggtttcg gctgtcactt 180
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ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac 600
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agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200
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ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320
tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1380
caacacccga agtcggtgag gtaaccttta tggagccagc cgccgaaggt 1430

Claims (7)

1.一株同温层芽孢杆菌（Bacillus stratosphericus）35W2，其特征在于，该菌株已于2019年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，其生物保藏号为： CGMCC No.18362。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂为权利要求1所述同温层芽孢杆菌（Bacillus stratosphericus）35W2和/或所述菌株的发酵液。
3.如权利要求2所述菌剂，其特征在于，所述菌株的发酵液的制备方法如下：将活化后的菌株接种至培养基中培养得到。
4.如权利要求3所述菌剂，其特征在于，所述活化的操作如下：将菌株接种于液体培养基中恒温培养一段时间。
5.如权利要求4所述菌剂，其特征在于，所述恒温的温度为35~39℃，或培养时间为12~14h。
6.如权利要求4所述菌剂，其特征在于，所述活化后的菌株接种于培养基中，35~39℃培养22~26h。
7.权利要求1所述同温层芽孢杆菌（Bacillus stratosphericus）35W2及权利要求2-6任一项所述菌剂在促进小麦在盐碱土壤中生存方面的应用。
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