CN104263657B - 一种捕食线虫性真菌的培养方法 - Google Patents
一种捕食线虫性真菌的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104263657B CN104263657B CN201410471011.8A CN201410471011A CN104263657B CN 104263657 B CN104263657 B CN 104263657B CN 201410471011 A CN201410471011 A CN 201410471011A CN 104263657 B CN104263657 B CN 104263657B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- sabouraud dextrose
- culture medium
- broth bouillon
- iblet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于微生物学领域,提出一种捕食线虫性真菌的培养方法,包括步骤:1)在无菌条件下,将生长在玉米粉琼脂培养基上的少孢节丛孢菌接种于沙氏葡萄糖肉汤培养基中,于22~26℃恒温培养箱中培养6‑7天;2)将培养后的沙氏葡萄糖肉汤培养基连同培养物混于玉米粒或大麦粒批量培养基中,于22~26℃恒温培养箱中进一步培养。本发明根据对捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌分生孢子的批量培养及所用培养基的性状分析后,采用沙氏葡萄糖肉汤培养基结合玉米粒或大麦粒批量培养基的双步培养方法,对少孢节丛孢菌分生孢子进行批量培养,确定了捕食性真菌的最适培养基和培养方法及培养时间,为今后进行少孢节丛孢菌分生孢子的大批量培养奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物学领域,具体涉及一种捕食线虫真菌的培养方法。
背景技术
大多数捕食性真菌属于半知菌纲,是自然界非常珍贵的生物资源,到目前已发现140余种,在土壤、动物粪便、苔藓及植物根部附近及动物残体上都有广泛的分布。此类真菌的营养方式为多样性,但大多属于兼性腐生菌[1]。
在家畜线虫病的生物控制中,很重要的一个方面就是利用存在于自然界的捕食线虫性真菌对线虫感染进行控制,这种生物控制方法目前已引起各国生物学家多年来极大的关注。但其应用首先需要解决的前提条件是对捕食线虫性真菌的孢子进行大批量的培养。
关于捕食线虫性真菌的实验室培养方法,主要包括在玉米粉琼脂培养基(CMA),水琼脂培养基(WA)或马铃薯琼脂培养基(PDA)等培养基中进行培养。而在批量培养方面,国外最早是将少孢节丛孢菌从CMA中转接到大麦粒培养基中培养3周,用于临床家畜线虫病防治研究[2];国内最早报道的方法主要是首先将少孢节丛孢菌(A.oligospora)在CMA中培养1周之后,再转接到玉米粒中培养3周[3]。
综合现有资料来看,虽然有关捕食性真菌的批量培养方法很多,但是究竟哪一种方法最适合,还需要通过试验研究进行验证。
参考文献
1.满达.捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌超微结构与生化组分的研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2004:2-6
2.Gronvold J,Wolstrup J,Larsen M,et al.Biological control ofOstertagia ostertagi by feeding selected nematode-trapping fungi to calves[J].Journal of Helminthology,1993,67(1):31-36
3.杨莲茹,考桂兰,杨晓野,等.少孢节丛孢菌孢子批量培养及通过动物消化道的试验[J].中国兽医科技,2004,34(1):50-53
发明内容
针对本领域存在的问题,本发明的目的是提出一种捕食线虫性真菌的培养方法。
实现本发明目的的技术方案为:
一种捕食线虫性真菌的培养方法,包括步骤:
1)在无菌条件下,将生长在玉米粉琼脂培养基上的少孢节丛孢菌接种于沙氏葡萄糖肉汤培养基中,于22~26℃恒温培养箱中培养6~7天;
2)将步骤1)培养后的沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物接种于玉米粒或大麦粒批量培养基中,于22~26℃恒温培养箱中培养。
其中,所述步骤1)中所述玉米粉琼脂培养基的制备方法为:按照玉米粉40g加入1000mL蒸馏水的比例,称取玉米粉,加入蒸馏水中加热煮沸,待溶液沸腾后,用微火持续煮沸1h,期间不断进行搅拌,最后用蒸馏水将溶液补足至1000mL,用450目纱网过滤,将滤液用蒸馏水稀释100倍,调节pH值至6.0~6.2,最后加入2%琼脂粉,于121℃条件下高压灭菌20min之后,于4℃放置备用。
其中,所述沙氏葡萄糖肉汤培养基的制备方法为:按照10g沙氏葡萄糖肉汤培养基、0.1g琼脂粉、200mL蒸馏水的比例,称取沙氏葡萄糖肉汤培养基和琼脂粉,加入蒸馏水,将溶液加热至沸腾时立即取出,使溶质充分溶解,于121℃条件下高压灭菌15min,放置备用。
优选地,所述步骤1)中,玉米粉琼脂培养基与沙氏葡萄糖肉汤培养基体积比为0.1~0.2cm3:10~20mL,于25℃下100r/min的恒温摇床中培养7d。
其中,所述步骤2)中,将已培养好的少孢节丛孢菌沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物倒入玉米粒或大麦粒批量培养基中,沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物的体积与玉米粒或大麦粒批量培养基质量比例为1ml:9~11g,最后分别将沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物与玉米粒或大麦粒搅拌均匀,于25℃恒温培养箱中培养。
为了评价培养的结果,优选地,所述步骤2)培养后,用孢子洗脱液少量多次地洗脱分生孢子,最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL,混匀后用白细胞计数板计数,得出每克批量培养基所含分生孢子的数量。
其中,所述孢子洗脱液制备方法为:吸取2mL吐温-80,加入1000mL蒸馏水中,于121℃条件下高压灭菌20min后,放于室温下备用。
本发明的有益效果在于:
本发明根据国内外捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌(A.oligospora)分生孢子的批量培养方法并对所用培养基的性状进行分析后,采用沙氏葡萄糖肉汤培养基结合玉米粒或大麦粒批量培养基的双步培养方法,对少孢节丛孢菌(A.oligospora)分生孢子进行批量培养,并分别在培养至第3周、4周和5周时对分生孢子进行计数及形态学观察,确定了菌株最适培养基和培养时间,为今后进行捕食性真菌孢子的大批量培养奠定了基础。
附图说明
图1为捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌在玉米粒上的培养结果照片。
图2为捕食线虫性真菌-少孢节丛孢菌在大麦粒上的培养结果照片。
具体实施方式
现以以下实施例来说明本发明,但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段,如无特别说明,均使用本领域常规的手段。
本发明涉及的捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora CIM1)菌株,该菌株的保藏号为:CGMCC No.8058,保藏日期:2013年8月16日。
所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码100101,电话:(010)64807355。
实施例中,生化培养箱SP-02型,购自湖北黄石恒丰医疗有限公司;立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50FBS型,购自上海申安医疗器械厂;超净工作台,购自哈尔滨东联仪器有限公司;BX51TF-OLYMPUS显微镜,购自日本奥林巴斯公司;NHWY-2102C摇床,购自常州诺基仪器有限公司;血细胞计数器,购自上海求精生化试剂仪器有限公司;移液器,购自美国Thermo公司。
吐温-80、琼脂粉和沙氏葡萄糖肉汤培养基,购自北京化学试剂公司;新鲜玉米粉、玉米粒和大麦粒,购自集贸市场。
实施例1:
0.4g/L玉米粉琼脂培养基(CMA)制备:称取40g用筛网过滤后的玉米粉,加入1000mL蒸馏水中进行加热煮沸。待溶液沸腾后,用微火持续煮沸1h,期间不断进行搅拌,最后用蒸馏水将溶液补足至1000mL,用450目纱网过滤。取10mL滤液于三角瓶中,加入990mL蒸馏水,调节pH值至6.0~6.2,最后加入20g琼脂粉,于121℃条件下高压灭菌20min之后,在无菌条件下倒入直径为90mm的灭菌培养皿中,于4℃放置备用。
玉米粒和大麦粒批量培养基制备:将玉米粒和大麦粒用自来水清洗干净,于烘箱内烘干,分别装于250mL三角瓶内,每种培养基12瓶,每瓶70g,每瓶加70mL蒸馏水,于121℃条件下,高压灭菌20min备用。
单步培养法:
即在玉米粒培养基或大麦粒培养基批量培养。步骤如下:在无菌条件下,将少孢节丛孢菌接种于玉米粉琼脂培养基中,于25℃恒温培养箱中培养10d以上,后将长满菌丝和分生孢子的玉米粉琼脂培养基切成长和宽均为5mm、高5mm的小块,将玉米粒和大麦粒批量培养基分别取出3瓶、每瓶培养基重量140g,首先用灭菌后的大号镊子将玉米粒和大麦粒搅拌松散,再于每瓶中放入20块长有菌丝的琼脂块,最后用镊子分别将琼脂块与玉米粒或大麦粒培养基搅拌均匀,于25℃恒温培养箱中培养。
孢子洗脱液制备:吸取2mL吐温-80加入1000mL蒸馏水中,加热使油状吐温-80与蒸馏水混匀后,然后分装于500mL玻璃瓶中,于121℃条件下高压灭菌20min后,放于室温下备用。
分生孢子的洗脱与计数:将玉米粒和大麦粒培养基分别于第3周、第4周和第5周时,在无菌条件下每瓶取出3g带有菌落的培养基,用制备好的孢子洗脱液少量多次地洗脱分生孢子,最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL,混匀后用白细胞计数板计数,得出每克培养基所含分生孢子的数量。
实施例2.
玉米粒和大麦粒培养基、孢子洗脱液制备方法同实施例1。
沙氏葡萄糖肉汤培养基制备:分别称取10g沙氏葡萄糖肉汤培养基和0.1g琼脂粉,加入装有200mL蒸馏水的三角瓶中,将溶液加热至沸腾时立即取出,使溶质充分溶解,分装入50mL三角瓶中,每瓶15mL,于121℃条件下高压灭菌15min,放置备用。
双步培养法:
即液体培养基加固体培养基两阶段方式培养。步骤如下:取出6瓶事先已制备好的沙氏葡萄糖肉汤培养基,在无菌条件下将少孢节丛孢菌CMA琼脂培养基,平均切为5×5×5mm的6块,每个三角瓶中放1块,于100r/min的恒温摇床中,25℃条件下培养7d。另各取制备好的玉米粒和大麦粒批量培养基各3瓶,每瓶内培养基质量140g,用灭菌后的大号镊子先将玉米粒和大麦粒搅拌松散,然后将6瓶已培养好的少孢节丛孢菌沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物,分别倒入玉米粒和大麦粒批量培养基中,最后分别将沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物与玉米粒或大麦粒搅拌均匀,于25℃恒温培养箱中培养。培养效果参见图1和图2。
分生孢子的洗脱与计数:将玉米粒和大麦粒培养基分别于第3周、第4周和第5周时,在无菌条件下每瓶取出3g带有菌落的培养基,用制备好的孢子洗脱液少量多次地洗脱分生孢子,最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL,混匀后用白细胞计数板计数,得出每克培养基所含分生孢子的数量。
结果比较:少孢节丛孢菌分生孢子批量培养结果
单步培养法:将在玉米粉琼脂培养基中培养的少孢节丛孢菌(A.oligosporaCIM1)分别转接到玉米粒或大麦粒固体批量培养基上进行培养,培养结果见表1。由表中数据可知,在玉米粒批量培养基中,第3周时分生孢子的数量为3.0×106个/g,至第5周时为3.1×106个/g;在大麦粒批量培养基中,第3周时分生孢子的数量为2.7×106个/g,至第5周时为2.8×106个/g;经SAS软件分析发现,第3周、第4周和第5周时每克玉米粒培养基与每克大麦粒培养基所含分生孢子数量相比差异均不显著(P﹥0.1);就单一培养基而言,第3周、第4周和第5周时每克培养基所含分生孢子数相比差异也不显著(P﹥0.1)。
双步培养法:将在玉米粒琼脂培养基中培养的少孢节丛孢菌菌首先在沙氏葡萄糖肉汤培养基中培养1周,之后再分别转接到玉米粒和大麦粒固体批量培养基上进行培养,培养结果见表2。由表中数据可知,在玉米粒批量培养基中,第3周时分生孢子的数量为3.5×106个/g,至第5周时为3.6×106个/g;在大麦粒批量培养基中,第3周时分生孢子的数量为3.6×106个/g,至第5周时为3.5×106个/g;经SAS软件分析发现,第3周、第4周和第5周时每克玉米粒培养基和每克大麦粒培养基所含分生孢子数量相比差异均不显著(P﹥0.1);就某一种培养基来说,第3周、第4周和第5周时每克培养基所含分生孢子数量相比差异也不显著(P﹥0.1)。
但同一种培养基在两种不同的培养模式(单步培养和双步培养)下,在第3周、第4周和第5周时每克培养基所含分生孢子数量相比差异均极显著(P﹤0.01)。
表1 少孢节丛孢菌分生孢子单步培养法培养结果
表2 少孢节丛孢菌分生孢子双步培养法培养结果
由少孢节丛孢菌分生孢子固体批量培养基的培养结果可知,在单步培养法中,每克玉米粒培养基与每克大麦粒培养基在第3周、4周和5周时产生分生孢子的数量差别不大,且上述培养基中的分生孢子在形态上也无明显区别。在双步培养法中,尽管玉米粒批量培养基与大麦粒批量培养基所产生的分生孢子在数量和形态上也无明显区别,但数量要明显高于仅在玉米粒或大麦粒批量培养基中培养所得分生孢子的数量。
由以上结论可知,双步培养法培养所产生的孢子数量均明显高于在单步培养法中培养所得孢子数量。
另外,由试验结果得知,就培养时间来说,在培养至3周、4周、5周时,少孢节丛孢菌产生孢子的数量无明显差异,因此少孢节丛孢菌分生孢子的最佳培养时间3周即可。
综上所述,捕食性真菌-少孢节丛孢菌在玉米粒或大麦粒批量培养基中的产孢量无明显差异。以先将少孢节丛孢菌接种到含有0.05%琼脂粉的沙氏葡萄糖肉汤培养基中摇晃培养7d,再转接到玉米粒或大麦粒批量培养基中培养3周为佳。这一结果为今后批量生产捕食性真菌孢子及开展生物制剂的制备和利用,提供了必要前提条件。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种捕食线虫性真菌的培养方法,其特征在于,包括步骤:
1)在无菌条件下,将生长在玉米粉琼脂培养基上的少孢节丛孢菌接种于沙氏葡萄糖肉汤培养基中,玉米粉琼脂培养基与沙氏葡萄糖肉汤培养基体积比为0.1~0.2cm3:10~20mL,于25℃下,100r/min的恒温摇床中培养7d;所述少孢节丛孢菌为捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)CIM1菌株,该菌株的保藏号为:CGMCC No.8058;
其中,所述玉米粉琼脂培养基的制备方法为:按照玉米粉40g加入1000mL蒸馏水的比例称取玉米粉,加入蒸馏水中加热煮沸,待溶液沸腾后,用微火持续煮沸1h,期间不断进行搅拌,最后用蒸馏水将溶液补足至1000mL,用450目纱网过滤,将滤液用蒸馏水稀释100倍,调节pH值至6.0~6.2,最后加入2%琼脂粉,于121℃条件下高压灭菌20min之后,于4℃放置备用;所述沙氏葡萄糖肉汤培养基的制备方法为:按照10g沙氏葡萄糖肉汤培养基、0.1g琼脂粉、200mL蒸馏水的比例,称取沙氏葡萄糖肉汤培养基和琼脂粉,加入蒸馏水,将溶液加热至沸腾时立即取出,使溶质充分溶解,于121℃条件下高压灭菌15min,放置备用;
2)将步骤1)已培养好的少孢节丛孢菌沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物,倒入玉米粒或大麦粒批量培养基中,沙氏葡萄糖肉汤培养基的体积与玉米粒或大麦粒批量培养基质量比例为1ml:9~11g,最后分别将沙氏葡萄糖肉汤培养基混合物与玉米粒或大麦粒批量培养基搅拌均匀,于25℃恒温培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述步骤2)培养后,用孢子洗脱液少量多次地洗脱分生孢子,最后再用洗脱液将分生孢子悬液均定容到10mL,混匀后用白细胞计数板计数,得出每克培养基所含分生孢子的数量。
3.根据权利要求2所述的培养方法,其特征在于,所述孢子洗脱液制备方法为:吸取2mL吐温-80,加入1000mL蒸馏水中,于121℃条件下,高压灭菌20min后,放于室温下备用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410471011.8A CN104263657B (zh) | 2014-09-16 | 2014-09-16 | 一种捕食线虫性真菌的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410471011.8A CN104263657B (zh) | 2014-09-16 | 2014-09-16 | 一种捕食线虫性真菌的培养方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104263657A CN104263657A (zh) | 2015-01-07 |
CN104263657B true CN104263657B (zh) | 2017-10-13 |
Family
ID=52155241
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410471011.8A Active CN104263657B (zh) | 2014-09-16 | 2014-09-16 | 一种捕食线虫性真菌的培养方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104263657B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111197010A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-05-26 | 安徽大学 | 一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用 |
CN112522115B (zh) * | 2020-12-09 | 2022-09-02 | 云南大学 | 副氧化微杆菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用及方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102604838B (zh) * | 2011-12-23 | 2013-07-10 | 内蒙古大学 | 少孢节丛孢菌菌株n及其应用 |
-
2014
- 2014-09-16 CN CN201410471011.8A patent/CN104263657B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104263657A (zh) | 2015-01-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101423812B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌和微生物制剂及其制备方法 | |
CN102719383B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用 | |
CN104286032B (zh) | 一种黄色篮状菌孢子粉的制备方法、黄色篮状菌可湿性粉剂及其制备方法 | |
CN110157624B (zh) | 一种基于自动化种曲机的淡紫拟青霉规模化生产方法 | |
CN105316255B (zh) | 一种土壤有益微生物混合发酵的方法 | |
CN103301409B (zh) | 防治虾偷死病的组合物及其制备方法 | |
CN103333851B (zh) | 一种哈茨木霉固体发酵生产分生孢子的方法 | |
CN102286378B (zh) | 一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌及其应用 | |
CN106661539A (zh) | 利用有效及功能性微生物的微生物均质提取物及其制造方法 | |
CN101381685A (zh) | 一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法 | |
CN104263657B (zh) | 一种捕食线虫性真菌的培养方法 | |
CN103525748B (zh) | 哈茨木霉厚垣孢子的生产方法 | |
CN108795827B (zh) | 一种巨大芽孢杆菌bm22及其水分散粒剂和应用 | |
CN103392744A (zh) | 用于防治辣椒疫病的木霉制剂和含有该木霉制剂的田间桶混农药 | |
CN102021131B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌菌株及其应用 | |
CN109517755A (zh) | 一株耐酸地衣芽孢杆菌及其在堆肥中的应用 | |
CN110452859B (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌b4216及其应用 | |
Asiandu et al. | The Potential of Tofu Liquid Waste and Rice Washing Wastewater as Cheap Growth Media for Trichoderma sp. | |
CN102648714B (zh) | 液体发酵制备生物农药的方法 | |
CN107446829A (zh) | 一种绿僵菌袋式固体培养工艺 | |
CN105695342A (zh) | 拟康氏木霉菌tc-72及其在黄曲霉菌生物防治中的应用 | |
CN109207393A (zh) | 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治芹菜根腐病中的应用 | |
CN104726365A (zh) | 道地黄芪固氮菌新菌株t21及发酵液的制备方法 | |
CN107760629A (zh) | 一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其可湿性粉剂和应用 | |
CN108060088A (zh) | 一种用于稻瘟病菌培养、产孢的培养基及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |