KR102218160B1 - 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시키고 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 다중으로 또는 코돈 콘텍스트 방식으로 코돈 최적화하여 도입함으로써 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체를 높은 수율로 생산할 수 재조합 효모 균주와 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 또한 상기 제작된 재조합 효모균주에 tHMG1, ERG2, ERG3, ERG27, 또는 UPC2-1 유전자를 추가로 도입시킴으로 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산 수율이 증가된 재조합 효모 균주 제조 방법 및 용도에 관한 것을 포함한다.
Description
본 발명은 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시키고 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 다중으로 또는 코돈 콘텍스트 방식으로 코돈 최적화하여 도입함으로써 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체를 높은 수율로 생산할 수 있는 재조합 효모 균주와 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 더 나아가 상기 제작된 재조합 효모균주에 tHMG1, ERG2, ERG3, ERG27, 또는 UPC2-1 유전자 등을 추가로 도입시킴으로 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산 수율이 증가된 재조합 효모 균주 제조 방법 및 용도에 관한 것을 포함한다.
효모는 다양한 이차대사산물 생합성 경로를 도입하여 발현시킬 수 있는 숙주로 관심을 받고 있다. 다양한 생명체들이 생산하는 이차대사산물은 고부가가치 화학화합물의 주요 공급처로서 많은 경우 중요한 의약적인 성질을 지니고 있다. 특히 식물의 대사산물들은 항산화제 또는 항생제 기능을 통해 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등의 감염을 막아주며, 또한 인체 건강에 유익한 기능성 물질로 치료제로서의 활용도가 높아 미생물을 활용한 대량생산 기술에 대한 수요가 높다. 이차대사 생합성 경로가 자체적으로 제한적인 효모는 유전공학을 통해 도입된 외래 대사 경로를 방해하거나 경쟁하지 않으며, 무엇보다 다양한 오믹스 분석 시스템이 잘 구축되어 있어 전사체와 대사체 분석을 통해 효모 숙주의 생리 상태에 대한 총체적인 정보를 확보할 수 있는 장점이 있다. 또한 대사과정에 대한 상세한 모델이 개발되어 변형된 대사 네트워크의 행동을 예측할 수 있는 인 실리코(in silico) 효모가 구축되어 있어 이를 활용한 인공 세포 디자인 및 제작이 더욱 용이한 점이 큰 장점이다. 더 나아가 단세포 진핵 미생물로서 효모는 소포체 및 미토콘드리아 같은 소기관에서 발현되어야만 활성을 갖게 되는 시트크롬(cytochrome) P450 같은 외래 효소 발현에 적합한 숙주이며, 식물 및 동물 유래의 효소 활성에 필수적인 단백질 번역 후 변형능이 있는 점도 원핵 미생물 숙주에 비해 갖는 장점이다. 한편 콜레스테롤은 포유동물에서 매우 중요한 생체구성 물질로서, 세포의 분열, 성장, 발육 및 분화의 조절에 관여하고, 각종 필수적인 대사 물질(예, 호르몬, 담즙산 등)의 전구체로 알려져 있으며 그 전구체가 발생 초기 및 노화과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에서는 콜레스테롤 및 그 전구체를 높은 수율로 생산할 수 있는 재조합 효모 균주를 제공하고자 한다.
본 발명은, 스테롤 (콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체) 생산능을 갖는 재조합 효모 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스테롤 (콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체) 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법과 이의 용도를 제공한다.
본 발명은, ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고, DHCR24 및 DHCR7 유전자가 도입된 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주를 제공한다.
상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)가 다중으로 도입되거나 또는 코돈 최적화된 DHCR24와 DHCR7 합성 유전자가 한 카피 이상으로 도입될 수 있다. 여기서 상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)가 다중으로 도입되는 경우, DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자 카피수(copy number)는 2 ~ 10일 수 있다. 더욱 바람직하게는 4 ~ 7일 수 있다. 유전자 카피수가 2 미만인 경우에는 기대하는 효과를 구현하기 어렵고 10 초과 시에는 효과의 변화가 미미하다.
상기 재조합 효모 균주에는 tHMG1, ERG3, ERG2, ERG27 및 UPC2-1 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 도입될 수 있다.
상기 재조합 효모 균주에는 ERG27-ERG2 융합 단백질을 코딩하는 합성 유전자가 추가로 도입될 수 있다.
상기 DHCR24 유전자는 ERG6 유전자 자리에 도입되고, 상기 DHCR7 유전자는 ERG5 유전자 자리에 도입될 수 있다. 상기와 같이 유전자 도입 위치를 구성하는 경우 콜레스테롤과 콜레스테롤 전구체를 보다 높은 수율로 생산할 수 있으며, 에탄올(ethanol)과 아세테이트(acetate)와 같은 부산물이 축적되지 않는 효과가 있다.
상기 스테롤은 콜레스테롤 전구체 또는 콜레스테롤 둘 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 콜레스테롤 전구체는 지모스테롤, 디하이드로콜레스테롤, 라쏘스테롤,디하이드로데스모스테롤 및 데스모스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 재조합 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae) rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 제조될 수 있다.
상기 유전자 다중 삽입 카세트의 rDNA NTS의 N 말단 단편 유전자는 서열번호 1(cacaagaggt aggtcgaaac agaacatgaa agttggtcgg taggtgc)로 표시되고, 상기 rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자는 서열번호 2(ggttttgcac catatcttca taacctgtca ccttgaaact acctctggc)로 표시될 수 있다.
상기 영양요구성 선택 표지 마커 유전자는 서열번호 3(gaaacgaaga taaatc)으로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 URA3 유전자, 서열번호 4(ttacctttta catttcagca a)로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 LEU2 유전자, 서열번호 5(cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg caagataaac gaaggcaaag)로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 HIS3 유전자 또는 서열번호 6(tattgagcac gtgagtatac gtgattaagc acacaaaggc agcttggagt)으로 표시되는 프로모터 영역을 포함하는 TRP1 유전자일 수 있다.
상기 DHCR24 유전자 및 DHCR7 유전자는 코돈 어댑테이션 인덱스 (Codon Adaptation Index) 방식 또는 코돈 콘텍스트 (codon context) 방식으로 코돈 최적화될 수 있다.
상기 코돈 코돈 어댑테이션 인덱스 (Codon Adaptation Index) 방식으로 최적화된 DHCR7 유전자는 서열번호 9로 구성되고, DHCR24 유전자는 서열번호 10으로 구성될 수 있다.
코돈 콘텍스트 (codon context) 방식으로 코돈 최적화된 DHCR24 유전자는 서열번호 17로 구성되고, DHCR7 유전자는 서열번호 18로 구성될 수 있다.
상기 재조합 효모 균주는 tHMG1 유전자가 추가로 도입된 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 효모 균주의 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시킨 후 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)를 다중으로 도입하는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법을 제공한다.
상기 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Sacchoromyces cerevisiae)일 수 있다.
상기 DHCR24 및 DHCR7 유전자 도입은, 사카로마이세스 세레비시애 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애 rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 수행할 수 있다. 구체적인 내용은 상기에서 설명한 바와 같다.
또한 본 발명은, 상기 재조합 효모 균주를 배지에 배양하여 스테롤을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 25 ~35℃에서 2 ~ 10일 동안 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면, ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고, DHCR24 및 DHCR7 유전자가 다중으로 도입된 재조합 균주, 또는 ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고 코돈 콘텍스트 방식에 의해 코돈 최적화된 DHCR24 및 DHCR7 유전자가 도입된 재조합 균주 에 의해 높은 수율로 콜레스테롤과 그 전구체들을 생산할 수 있다. 더 나아가 상기 제작된 재조합 효모 균주에 tHMG1, ERG2, ERG3, ERG27, 또는 UPC2-1 유전자를 추가로 도입시킴으로 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산 수율이 증가된 재조합 효모 균주 제조 방법 및 용도에 관한 것을 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 콜레스테롤 생합성 경로를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예예 따른 재조합 효모 균주의 제조 과정을 나타내는 것이다. (a)재조합 효모 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 제작 및 추가적으로 DHCR24가 다중삽입된 재조합 효모 균주 제작 모식도이다. (b) 재조합 효모 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7)에 추가적으로 DHCR24, DHCR7의 다중삽입 혹은 과발현 및 ERG3, ERG2, ERG27-2 fusion, UPC2-1 의 추가도입 재조합 효모 균주 제작 모식도 이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 제조 과정을 나타내는 것이다. (a) 사카로마이세스 세레비시애 야생형 균주에 DHCR24, DHCR7 다중삽입 도입한 재조합 효모 균주 제작 및 추가적인 ERG3, ERG2, ERG27-2 fusion, UPC2-1 도입한 재조합 효모 균주 제작 및 erg6 결손과 동시에 DHCR24, 다중삽입 도입한 재조합 효모 균주 제작 모식도이다. (b) 코돈 콘텍스트 (codon context) 방식으로 코돈 최적화된 DHCR24(cc), DHCR7(cc)를 이용한 재조합 효모 균주 #cc19(erg5::ccD24/erg6::ccD7)와 #ccS1(erg6::ccD24/erg5::ccD7) 제작 및 추가적으로 N-말단이 일부 제거된 tHMG1가 다중삽입된 재조합 효모 균주 제작 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 제작 시 사용된 벡터를 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주#19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7)의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다.(*:알 수 없는 피크(unknown peak), DD:디하이드로데스모스테롤(dehydrodesmosterol), D:데스모스테롤(desmosterol), Z:지모스테롤(zymosterol), C:콜레스테롤(cholesterol))
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 NTSD24/#19 (NTSD24/erg5::D24/erg6::D7) 및 NTSD24/#S1 (NTSD24/erg6::D24/erg5::D7)의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다(DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 NTSD24D7/#19 (NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7)의 삽입 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (b) 재조합 균주 #19와 NTSD24D7/#19 의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램). (c) 재조합 균주 2uD24D7/#S1 균주의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램). (DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤)
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19, UPC2-1/NTSD24D7/#19의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다(DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤).
도 9은 신규 구축한 HPLC-CAD 기반 LC 크로마토그램 분석 결과로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 분석한 것이다. (A) 표준품 3종(1: 지모스테롤, 2: 에르고스테롤, 3: 콜레스테롤)에 대한 LC 크로마토그램, (B) 표준품 4종(4: 7-디하이드로데스모스테롤, 5: 데스모스테롤, 6: 7-디하이드로콜레스테롤, 7: 라쏘스테롤)에 대한 LC 크로마토그램 (C) 야생형 균주(CEN.PK), (D) 재조합 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ARE2 결손 균주의 스테롤 프로파일을 분석한 결과이다. (a) 상동재조합 기법 기반의 ARE2 결손 균주 제작 모식도 (b) HPLC-UV/Vis 분석 기반 다른 스테롤 추출 방법으로 확보된 총 스테롤(total sterol)(KOH/EtOH)과 유리 스테롤(free sterol) (Chloroform/MeOH) 크로마토그램, (c) HPLC-UV/Vis 분석 기반 are2/NTSD24D7/#19 재조합 균주의 총 스테롤(total sterol) 크로마토그램. (DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤)
도 11a 내지 11c는 본 발명의 일 실시예 따라 제조된 재조합 효모 균주들의 카피수와 스테롤 생산량의 관계를 분석한 것이다. 도 11d는 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 균주의 스테롤 프로파일을 HPLC-UV/Vis로 분석 결과이다. *:알려지지 않은 피크(unknown peak), DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 제작에 사용된 카세트를 포함한 벡터. (b) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 삽입 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (c) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a)~(d) 재조합 균주 #cc19, #ccS1의 제작에 사용된 카세트를 포함한 벡터. (e)재조합 균주 #cc19, #ccS1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 제작에 사용된 tHMG1 다중삽입 카세트를 포함한 벡터. (b) 재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 다중 삽입된 tHMG1 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (C)재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
도 2는 본 발명의 일 실시예예 따른 재조합 효모 균주의 제조 과정을 나타내는 것이다. (a)재조합 효모 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 제작 및 추가적으로 DHCR24가 다중삽입된 재조합 효모 균주 제작 모식도이다. (b) 재조합 효모 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7)에 추가적으로 DHCR24, DHCR7의 다중삽입 혹은 과발현 및 ERG3, ERG2, ERG27-2 fusion, UPC2-1 의 추가도입 재조합 효모 균주 제작 모식도 이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 제조 과정을 나타내는 것이다. (a) 사카로마이세스 세레비시애 야생형 균주에 DHCR24, DHCR7 다중삽입 도입한 재조합 효모 균주 제작 및 추가적인 ERG3, ERG2, ERG27-2 fusion, UPC2-1 도입한 재조합 효모 균주 제작 및 erg6 결손과 동시에 DHCR24, 다중삽입 도입한 재조합 효모 균주 제작 모식도이다. (b) 코돈 콘텍스트 (codon context) 방식으로 코돈 최적화된 DHCR24(cc), DHCR7(cc)를 이용한 재조합 효모 균주 #cc19(erg5::ccD24/erg6::ccD7)와 #ccS1(erg6::ccD24/erg5::ccD7) 제작 및 추가적으로 N-말단이 일부 제거된 tHMG1가 다중삽입된 재조합 효모 균주 제작 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 제작 시 사용된 벡터를 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주#19(erg5::D24/erg6::D7)와 #S1(erg6::D24/erg5::D7)의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다.(*:알 수 없는 피크(unknown peak), DD:디하이드로데스모스테롤(dehydrodesmosterol), D:데스모스테롤(desmosterol), Z:지모스테롤(zymosterol), C:콜레스테롤(cholesterol))
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 NTSD24/#19 (NTSD24/erg5::D24/erg6::D7) 및 NTSD24/#S1 (NTSD24/erg6::D24/erg5::D7)의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다(DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 NTSD24D7/#19 (NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7)의 삽입 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (b) 재조합 균주 #19와 NTSD24D7/#19 의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램). (c) 재조합 균주 2uD24D7/#S1 균주의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램). (DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤)
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주 E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19, UPC2-1/NTSD24D7/#19의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량을 HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램으로 분석한 결과이다(DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤).
도 9은 신규 구축한 HPLC-CAD 기반 LC 크로마토그램 분석 결과로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 콜레스테롤 및 그 전구체의 생산량을 분석한 것이다. (A) 표준품 3종(1: 지모스테롤, 2: 에르고스테롤, 3: 콜레스테롤)에 대한 LC 크로마토그램, (B) 표준품 4종(4: 7-디하이드로데스모스테롤, 5: 데스모스테롤, 6: 7-디하이드로콜레스테롤, 7: 라쏘스테롤)에 대한 LC 크로마토그램 (C) 야생형 균주(CEN.PK), (D) 재조합 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 ARE2 결손 균주의 스테롤 프로파일을 분석한 결과이다. (a) 상동재조합 기법 기반의 ARE2 결손 균주 제작 모식도 (b) HPLC-UV/Vis 분석 기반 다른 스테롤 추출 방법으로 확보된 총 스테롤(total sterol)(KOH/EtOH)과 유리 스테롤(free sterol) (Chloroform/MeOH) 크로마토그램, (c) HPLC-UV/Vis 분석 기반 are2/NTSD24D7/#19 재조합 균주의 총 스테롤(total sterol) 크로마토그램. (DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤)
도 11a 내지 11c는 본 발명의 일 실시예 따라 제조된 재조합 효모 균주들의 카피수와 스테롤 생산량의 관계를 분석한 것이다. 도 11d는 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 균주의 스테롤 프로파일을 HPLC-UV/Vis로 분석 결과이다. *:알려지지 않은 피크(unknown peak), DD: 디하이드로데스모스테롤, D: 데스모스테롤, Z: 지모스테롤, C: 콜레스테롤
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 제작에 사용된 카세트를 포함한 벡터. (b) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 삽입 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (c) 재조합 균주 NTSD7/NTSD24/#S1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a)~(d) 재조합 균주 #cc19, #ccS1의 제작에 사용된 카세트를 포함한 벡터. (e)재조합 균주 #cc19, #ccS1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 효모 균주의 특성을 비교 분석한 것이다: (a) 재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 제작에 사용된 tHMG1 다중삽입 카세트를 포함한 벡터. (b) 재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 다중 삽입된 tHMG1 카세트 수에 따른 결과 분석(qPCR 분석). (C)재조합 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1의 콜레스테롤 및 그 전구체 생산량 분석 결과(HPLC-UV/Vis 분석 크로마토그램).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
본 실시예는 효모 특이적 스테롤(sterol)인 에르고스테롤(ergosterol) 대신 동물 세포의 콜레스테롤(cholesterol)과, 콜레스테롤의 전구체를 생산하는 재조합 효모 균주 제작을 목적으로 수행되었다. 이를 위해 전통 제빵 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 에르고스테롤 최종 생합성 단계를 차단하고 콜레스테롤 생합성 관련 외래유전자를 도입하여 콜레스테롤 생합성 경로를 지닌 재조합 효모 균주를 제작하였다(도 1). 본 실시예의 구체적인 전략으로는, 에르고스테롤 특이적 구조 22-카본 더블 본드 (22-carbone double bond) 형성에 관여하는 C-22 스테롤 디새츄라아제(C-22 sterol desaturase) 유전자 ERG5와 24-카본 메틸레이션(24-carbone methylation)에 관여하는 델타(24)-스테롤 C-메틸 트렌스퍼라아제(Delta(24)-sterol C-methyl transferase) 유전자 ERG6를 파쇄시키고 콜레스테롤(cholesterol) 생성에 필요한 동물세포 유래의 7-디하이드로콜레스테롤 리덕타아제(7-dehydrocholesterol reductase) 유전자 DHCR7와 24-디하이드로콜레스테롤 리덕타아제(24-dehydrocholesterol reductase) 유전자 DHCR24를 효모 숙주에 도입하여 다양한 형태로 도입된 재조합 사카로마이세스 세레비시애 (S. cerevisiae)균주를 제작하였다(도 2a). 또한 더 나아가 에르고스테롤 생합성 경로가 콜레스테롤 전구체 생합성 경로로 더 효율적으로 전환될 수 있도록 ERG3 (Delta(7)-sterol 5(6)-desaturase), ERG2 (C-8 sterol isomerase), ERG27 (3-keto-steroid reductase)와 에르고스테롤 생합성 경로 조절 전사인자인 UPC2-1 (Uptake Control Protein 2-1)를 추가로 도입된 재조합 균주를 제작하고자 하였다(도 2b). 또 다른 방법으로는 야생형 균주 배경에 DHCR7와 DHCR24 유전자를 다중으로 먼저 삽입시킨 후 ERG3, ERG2, ERG27 와 에르고스테롤 생합성 경로 조절 전사인자인 UPC2-1를 추가로 도입시킨 후 ERG6를 파쇄시켜 콜레스테롤 생산 균주를 제작하였다(도 3a). 더 나아가, 에르고스테롤 생합성 경로의 전구체 생합성 경로인 메발로네이트 생합성 경로(Mevalonate pathway)를 증폭시키기 위해 tHMG1 유전자를 숙주 염색체로 다중으로 추가 도입하였다(도 3b).
상기 ERG5, ERG6, DHCR7, DHCR24, ERG3, ERG2, ERG27, ARE2, ERG27-ERG2, UPC2-1, tHMG1는 각각 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 19로 표시되는 서열로 구성될 수 있다.
ERG27-ERG2 융합 유전자 서열(서열번호 15,
밑줄: ERG2 부분
)
atgaacaggaaagtagctatcgtaacgggtactaatagtaatcttggtctgaacattgtgttccgtctgattgaaactgaggacaccaatgtcagattgaccattgtggtgacttctagaacgcttcctcgagtgcaggaggtgattaaccagattaaagatttttacaacaaatcaggccgtgtagaggatttggaaatagactttgattatctgttggtggacttcaccaacatggtgagtgtcttgaacgcatattacgacatcaacaaaaagtacagggcgataaactaccttttcgtgaatgctgcgcaaggtatctttgacggtatagattggatcggagcggtcaaggaggttttcaccaatccattggaggcagtgacaaatccgacatacaagatacaactggtgggcgtcaagtctaaagatgacatggggcttattttccaggccaatgtgtttggtccgtactactttatcagtaaaattctgcctcaattgaccaggggaaaggcttatattgtttggatttcgagtattatgtccgatcctaagtatctttcgttgaacgatattgaactactaaagacaaatgcctcttatgagggctccaagcgtttagttgatttactgcatttggccacctacaaagacttgaaaaagctgggcataaatcagtatgtagttcaaccgggcatatttacaagccattccttctccgaatatttgaattttttcacctatttcggcatgctatgcttgttctatttggccaggctgttggggtctccatggcacaatattgatggttataaagctgccaatgccccagtatacgtaactagattggccaatccaaactttgagaaacaagacgtaaaatacggttctgctacctctagggatggtatgccatatatcaagacgcaggaaatagaccctactggaatgtctgatgtcttcgcttatatacagaagaagaaactggaatgggacgagaaactgaaagatcaaattgttgaaactagaacccccatt ccaaccaattacatgttcgatccaaaaactttgaacgaaatatgtaactcggtgattagcaaacacaacgcagcagaaggtttatccactgaagacctgttacaggatgtcagagacgcacttgcctctcattacggggacgaatacatcaacaggtacgtcaaagaagaatgggtcttcaacaatgctggtggtgcgatgggccaaatgatcatcctacacgcttccgtatccgagtacttaattctattcggaaccgctgttggtactgaagggcacacaggtgttcactttgctgacgactattttaccatcttacatggtacgcaaatcgcagcattgccatatgccactgaagccgaagtttacactcctggtatgactcatcacttgaagaagggatacgccaagcaatacagcatgccaggtggttcctttgcccttgaattggctcaaggctggattccatgtatgttgccattcgggtttttggacactttctccagtactcttgatttatacactctatatagaactgtctacctgactgccagggacatgggtaagaacttgttgcaaaacaaaaagttctaa
UPC2-1 서열(서열번호 16, 대문자 밑줄: G888D point mutation site (GGT to GAT)
atgagcgaagtcggtatacagaatcacaagaaagcggtgacaaaacccagaagaagagaaaaagtcatcgagctaattgaagtggacggcaaaaaggtgagtacgacttcaaccggtaaacgtaaattccataacaaatcaaagaatgggtgcgataactgtaaaagaagaagagttaagtgtgatgaagggaagccagcctgtaggaagtgcacaaatatgaagttggaatgtcagtatacaccaatccatttaaggaaaggtagaggagcaacagtagtgaagtatgtcacgagaaaggcagacggtagcgtggagtctgattcatcggtagatttacctcctacgatcaagaaggagcagacaccgttcaatgatatccaatcagcggtaaaagcttcaggctcatccaatgattcctttccatcaagcgcctctacaactaagagtgagagcgaggaaaagtcatcggcccctatagaggacaaaaacaatatgactcctctaagtatgggcctccagggtaccatcaataagaaagatatgatgaataactttttctctcaaaatggcactattggttttggttctcctgaaagattgaattcaggtatcgatggcttactattaccgccattgccttctggaaatatgggtgcgttccaacttcagcaacagcagcaagtgcagcagcaatctcaaccacagacccaagcgcagcaagcaagtggaactccaaacgagagatatggttcattcgatcttgcgggtagtcctgcattgcaatccacgggaatgagcttatcaaatagtctaagcgggatgttactatgtaacaggattccttccggccaaaactacactcaacaacaattacaatatcaattacaccagcagctgcaattgcaacagcatcagcaagttcagctgcagcagtatcaacaattacgtcaggaacaacaccaacaagttcagcaacaacaacaggaacaactccagcaataccaacaacattttttgcaacagcagcaacaagtactgcttcagcaagagcaacaacctaacgatgaggaaggtggcgttcaggaagaaaacagcaaaaaggtaaaggaagggcctttacaatcacaaacaagcgaaactactttaaacagcgatgctgctacattacaagctgatgcattatctcagttaagtaagatggggctaagcctaaagtcgttaagtacctttccaacagctggtattggtggtgtttcctatgactttcaggaactgttaggtattaagtttccaataaataacggcaattcaagagctactaaggccagcaacgcagaggaagctttggccaatatgcaagagcatcatgaacgtgcagctgcttctgtaaaggagaatgatggtcagctctctgatacgaagagtccagcgccatcgaataacgcccaagggggaagtgctagtattatggaacctcaggcggctgatgcggtttcgacaatggcgcctatatcaatgattgaaagaaacatgaacagaaacagcaacatttctccatcaacgccctctgcagtgttgaatgataggcaagagatgcaagattctataagttctctaggaaatctgacaaaagcagccttggagaacaacgaaccaacgataagtttacaaacatcacagacagagaatgaagacgatgcatcgcggcaagacatgacctcaaaaattaataacgaagctgaccgaagttctgtttctgctggtaccagtaacatcgctaagcttttagatctttctaccaaaggcaatctgaacctgatagacatgaaactgtttcatcattattgcacaaaggtctggcctacgattacagcggccaaagtttctgggcctgaaatatggagggactacataccggagttagcatttgactatccatttttaatgcacgctttgttggcattcagtgccacccatctttcgaggactgaaactggactggagcaatacgtttcatctcaccgcctagacgctctgagattattaagagaagctgttttagaaatatctgagaataacaccgatgcgctagttgccagcgccctgatactaatcatggactcgttagcaaatgctagtggtaacggcactgtaggaaaccaaagtttgaatagcatgtcaccaagcgcttggatctttcatgtcaaaggtgctgcaacaattttaaccgctgtgtggcctttgagtgaaagatctaaatttcataacattatatctgttgatcttagcgatttaggcgatgtcattaaccctgatgttggaacaattactgaattggtatgttttgatgaaagtattgccgatttgtatcctgtcggcttagattcgccatatttgataacactagcttatttagataaattgcaccgtgaaaaaaaccagggtgattttattctgcgggtatttacatttccagcattgctagacaagacattcctggcattactgatgacaggtgatttaggtgcaatgagaattatgagatcatattataaactacttcgaggatttgccacagaggtcaaggataaagtctggtttctcgaaggagtcacgcaggtgctgcctcaagatgttgacgaatacagtggaggtggtGATatgcatatgatgctagatttcctcggtggcggattaccatcgatgacaacaacaaatttctctgatttttcgtta
이하 더욱 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
<실시예>
재료
본 실시예에 사용된 프라이머, 발현 벡터, 효모 균주들은 표 1, 표 2, 표 3로 정리되어 있다. 본 실시예에서 제작된 발현 벡터들은 도 4에 도식으로 정리되어 있으며, 사용한 배지 및 시약은 하기와 같다.
- SC 배지 (Synthetic Complete medium;): 0.67% 아미노산이 없는 효모 질소 염기(yeast nitrogen base without amino acids) (BD, 291940), 2% 글루코오스(glucose) (JUNSEI, 64220S0650), 0.77 g/L 모든 필수 아미노산이 보충된 드롭-아웃 아미노산 혼합물(drop-out amino acid mixture supplemented with all required amino acids) (CLONTECH, 630425)
- 인 퓨전 클로닝 키트(In fusion cloning kit) (TAKARA 121416)
- KOH (JUNSEI, 39040-0350 / Sigma, P1767)
- 에탄올(Ethanol) (MERCK, 1.00983.1011)
- 메탄올(Methanol) (B&J, AH230-4)
- 헵탄(Heptane) (SIGMA, 246654)
- 석유 에탄올(Petroleum ether) (B&J, 317-4)
- 피로갈롤(Pyrogallol) (TCI, P0570)
- 아세톤(Acetone) (SIGMA, 650501)
- Cosmosil C18-PAQ (4.6 mm*250 mm) column
- HPLC 아세토니트릴(acetonitrile) (FISHER, A998-4)
- HPLC 워터(water) (FISHER, W5-4)
- HPLC 분석용 표준 콜레스테롤 전구체
: 라노스테롤(Lanosterol) (SIGMA, L5768)
: 에르고스테롤(Ergosterol) (SIGMA, 45480-10g-f)
: 지모스테롤(Zymosterol) (AVANTI, 700068P)
: 데스모스테롤(Desmosterol) (SIGMA, D6513)
: 콜레스테롤(Cholesterol) (SIGMA, C8667)
: 라쏘스테롤(Lathosterol) (SIGMA, C3652)
: 7-디하이드로데스모스테롤(7-Dehydrodesmosterol)(AVANTI, 700138P)
: 7-디하이드로콜레스테롤(7-Dehydrocholesterol) (SIGMA, 30800)
: 글루코오스 바이오(Glucose Bio) (Roche, 06343732001)
: 아세테이트 V2 바이오(Acetate V2 Bio) (COWIE, 7395442001)
: 에탄올 바이오(Ethanol bio) (Roche, 8055645001)
기기
- HPLC (Waters Separations Module 2695, Waters Dual λ Absorbance Detector 2487)
- PCR cycler (Eppendorf, AG 22331)
- 비드비터(Beadbeator) (BERTIN TECHNOLOGY, PrecellysR24)
- 워터 배스(Water bath) (TAITEC, SDN-B)
- 원심분리기(Centrifuge) (Eppendorf, 5424R)
- 회전진공농축기(Rotational vacuum concentrator) (CHRIST, RVC 2-25 CD plus)
- HPLC-CAD 시스템 (Thermo scientific, Dionex Ultimate 3000- Corona Veo RS)
- 바이오프로세스 애널라이저(Bioprocess analyzer) (Roche, Cedex Bio)
Primer | Sequence (5'->3') |
erg5 dN fw | ACATGCATGCCGCTATTGAAGAGAGCTCATG (서열번호 20) |
erg5 dN rv | GCGGCCGCGGGTCTAGAGGGGGATCCCCAGGATACTGAAGGCAGTAG (서열번호 21) |
erg5 dC fw | GGATCCCCCTCTAGACCCGCGGCCGC CATGATTACCTTCGCCGCTTTG (서열번호 22) |
erg5 dC rv | CGACGCGT GCTGGCAGGGTGAGTATTTG (서열번호 23) |
erg6 dN fw | ACGTGCATGCGCTGTTGCCGATAACTTCTTC (서열번호 24) |
erg6 dN rv | GCGGCCGCGGGTCTAGAGGGCTCGAGGGGGGATCCCTCAATTCTGTTTCACTCATC (서열번호 25) |
erg6 dC fw | GGATCCCCCCTCGAGCCCTCTAGACCCGCGGCCGCCCTCCCAAACTTCCCAAG (서열번호 26) |
erg6 dC rv | CGACGCGTCTTGCCGCTGTAGACAATAG (서열번호 27) |
DHCR7 fw | AACTGCAGATGATGGCCTCCGATAGAGTTAG (서열번호 28) |
DHCR7 rv | GCGTCGACTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAAAGATGTTTGGCAATAATCTATAGG (서열번호 29) |
DHCR24 fw | AACTGCAGATGGACCCTTTGTTGTATTTGGG (서열번호 30) |
DHCR24 rv | GCGTCGACTTACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGTGTCTGGCGGATTTACAG (서열번호 31) |
TEF1p fw | CCG CTCGAG AGCTCATAGCTTCAAAATGTTTC (서열번호 32) |
TEF1p rv | GC TCTAGA GGGGAAACTTAAAGAAATTC (서열번호 33) |
GAL7t fw | ACGC GTCGAC TTGAACGAAACTTGAACGGAG (서열번호 34) |
GAL7t rv | GC TCTAGA GGGGAAACTTAAAGAAATTC (서열번호 35) |
ACT1p fw | CGAAGTTATTAGGGCGGCCGCTTTGGACTCCACCAACGTC (서열번호 36) |
ACT1p rv | ATCGGAGGCCATCATTGTTAATTCAGTAAATTTTCGATCTTGGG (서열번호 37) |
DHCR7 fw2 | TGAATTAACAATGATGGCCTCCGATAGAGTTAG (서열번호 38) |
DHCR7 rv2 | CTTTAATTTGCGGCCTTACTTGTCGTCATCGTCTTTG (서열번호 39) |
CYC1t fw | GATGACGACAAGTAAGGCCGCAAATTAAAGCCTTC (서열번호 40) |
CYC1t rv | ACCTCTGGCGCGGCCTCATGTAATTAGTTATGTCACGC (서열번호 41) |
TDH3p fw | CGCGGATCCGTAGAATCATTTTGAATAAAAAACACGC (서열번호 42) |
TDH3p rv | ACTTCTAAGACCAAATCCATGAATTCTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC (서열번호 43) |
ERG3 fw | ACTTCTAAGACCAAATCCATGAATTCTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC (서열번호 44) |
ERG3 rv | AGAAAAGTCTTATCAATCTCCGTCGACTCAGTTGTTCTTCTTGGTATTTG (서열번호 45) |
TEF1t fw | CAAATACCAAGAAGAACAACTGAGTCGACGGAGATTGATAAGACTTTTCT (서열번호 46) |
TEF1t rv | CCGCTCGAGGTAAAAAATACGCCCGTAACGATG (서열번호 47) |
TEF2p fw | CCGCTCGAGTGCCATTAAAGGCGAATTTTTG (서열번호 48) |
TEF2p rv | AAGGAGTGGGAAAAACTTCATGCATGCGTTTAGTTAATTATAGTTCGTTG (서열번호 49) |
ERG2 fw | CAACGAACTATAATTAACTAAACGCATGCATGAAGTTTTTCCCACTCCTT (서열번호 50) |
ERG2 rv | AGATTTAAAGTAAATTCACGCATGCTTAGAACTTTTTGTTTTGCAACAAG (서열번호 51) |
TDH3t fw | CTTGTTGCAAAACAAAAAGTTCTAAGCATGCGTGAATTTACTTTAAATCT (서열번호 52) |
TDH3t rv | CCGCTCGAGTCTAGATATATGTTATCTTATCTTGG (서열번호 53) |
ERG27-2 fw1 | CGAACATGTAATTGGTTGGAATGGGGGTTCTAGTTTCAACAATTTG (서열번호 54) |
ERG27-2 rv1 | CTATAATTAACTAAACGCATGCATGAACAGGAAAGTAGCTATCGTAAC (서열번호 55) |
ERG27-2 fw2 | AAGATTTAAAGTAAATTCACGCATGCTTAGAACTTTTTGTTTTGCAACAAGTTC (서열번호 56) |
ERG27-2 rv2 | GTTGAAACTAGAACCCCCATTCCAACCAATTACATGTTCGATCC (서열번호 57) |
ARE2 dN fw1 | ACAT GCATGCCAAGTCGTAAACCTCGTCGG (서열번호 58) |
ARE2 dN rv1 | GATATCGCGCTCGAGGTTCTCCAGTAGATCCTTCTTC (서열번호 59) |
ARE2 dN fw2 | CTCGAGCGCGATATCGGACCAAGTGTCATGTGTACG (서열번호 60) |
ARE2 dN rv2 | CCG ACGCGTGGCAAATAGATTGGTTAAATCTGAAG (서열번호 61) |
101HIS fw | GCTATACGAAGTTATTAGGCCCGGGGATTGGCATTATCACATAATGAATTATAC (서열번호 62) |
101HIS rv | CACCTTGAAACTACCTCTGGCGCGGCCGCTCGAGTTCAAGAGAAAAAAAAAGAAAAAGCAAAAAG (서열번호 63) |
ccD7 fw | CTAATCTAAGTTTTCTAGCTGCAGATGATGGCCTCTGACAGAGTC (서열번호 64) |
ccD7 rv | GTCACTCCGTTCAAGTCGACTTAGAAAATGTTTGGTAGCAATCTGTAAG (서열번호 65) |
ccD24 fw | CTAAGTTTTCTAACTGCAGATGGACCCATTGCTATACTTAGGTG (서열번호 66) |
ccD24 rv | CAAGTTTCGTTCAAGTCGACCTAATGTCTGGCAGATTTGCAAATCTTG (서열번호 67) |
tHMG1-fw | GGAATTCATGCCAGTTTTAACCAATAA (서열번호 68) |
tHMG1-rv | GCGTCGACTTACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGGATTTAATGCAGGTGACGG (서열번호 69) |
Plasmid | Description | Reference |
pT-ERG5dNC | pGEM-Teasy vector containing ERG5 N and C partial fragments | this study |
pT-ERG6dNC | pGEM-Teasy vector containing ERG6 N and C partial fragments | this study |
pMKRQ-DrDHCR24 | pMKRQ containing S. cerevisiae-codon optimized zebrafish DHCR7 | 대웅 |
pMKRQ-DrDHCR7 | pMKRQ containing S. cerevisiae-codon optimized zebrafish DHCR24 | 대웅 |
pUG72 | loxP-pKlURA3-KlURA3-tKlURA3-loxP | Euroscarf |
pUG73 | loxP-pKlLEU2-KlLEU2-tKlLEU2-loxP | Euroscarf |
pT-DHCR24 | pGEM-Teasy-pTEF1-DHCR24-GAL7t | this study |
pT-DHCR7 | pGEM-Teasy-pACT1-DHCR7-CYC1t | this study |
pT-erg5::DHCR24-LEU2 | pGEM-Teasy-ERG5(N)-pTEF1-DHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG5(C) | this study |
pT-erg6::DHCR7-URA3 | pGEM-Teasy-ERG6(N)-pACT1-DHCR7-CYC1t- KlURA3-ERG6(C) |
this study |
pT-erg6::DHCR24-LEU2 | pGEM-Teasy-ERG6(N)-pTEF1-DHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG6(C) | this study |
pT-erg5::DHCR7-URA3 | pGEM-Teasy-ERG5(N)-pACT1-DHCR7-CYC1t- KlURA3-ERG5(C) |
this study |
pT-NTS-86TRP1 | pGEM-Teasy-5NTS2-TRP1 with 86bp promoter-3NTS2 | Moon et. al., 2016 |
pT-NTS-DHCR24-86TRP1 | pT-NTS-86TRP1 containing the DHCR24 expression cassette pTEF1-DHCR24-GAL7t | this study |
pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 | pT-NTS-DHCR24-86TRP1 containing the DHCR7 expression cassette pACT1-DHCR7-CYC1t | this study |
Y2pH | 2μ-based YEp351 derivative, containing the GAL10 promoter and GAL7 terminator and the HIS3 marker | this study |
Y2pH-DHCR7-DHCR24 | Y2pH containing pTEF1-DHCR24-GAL7t and pACT1-DHCR7-CYC1t | this study |
Y2pH-ERG3-ERG2 | Y2pH containing TDH3p-ERG3-TEF1t and TEF2p-ERG2-TDH3t | this study |
Y2pH-ERG3-ERG27-2 | Y2pH containing TDH3p-ERG3-TEF1t and TEF2p-ERG27-ERG2 fusion-TDH3t | this study |
YCpH-Tp | CEN-based pRE316 derivative containing the TEF1 promoter, the GAL7 terminater and the HIS3 marker | 출원번호 :10-2017-0182422 |
YCpH-np-UPC2 | YCpH derivative expressing UPC2-1 under the control of its own promoter | 출원번호 :10-2017-0182422 |
pT-ARE2dNC-HIS | pGEM-Teasy vector containing the ARE2 deletion cassette ARE2::HIS3 | this study |
pT-NTS-101HIS3-DHCR7 | pT-NTS-101HIS3 containing the DHCR7 expression cassette pACT1-DHCR7-CYC1t | this study |
pMKRQ-sDrDHCRc7(cc) | pMKRQ containing S. cerevisiae-codon context optimized DHCR7 gene from Danio rerio | this study |
pMKRQ-sDrDHCRc24(cc) | pMKRQ containing S. cerevisiae-codon context optimized DHCR24 gene from Danio rerio | this study |
pT-ERG5dNC-ccDHCR7 | pGEM-Teasy-ERG5(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t-ERG5(C) | this study |
pT-ERG5dNC-ccDHCR24 | pGEM-Teasy-ERG5(N)-pTEF1-ccDHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG5(C) | this study |
pT-ERG6dNC-ccDHCR7 | pGEM-Teasy-ERG6(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t-ERG6(C) | this study |
pT-ERG6dNC-ccDHCR24 | pGEM-Teasy-ERG6(N)-pTEF1-ccDHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG6(C) | this study |
pT-erg6::ccDHCR7-URA3 | pGEM-Teasy-ERG6(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t- KlURA3-ERG6(C) |
this study |
pT-erg6::ccDHCR24-LEU2 | pGEM-Teasy-ERG6(N)-pTEF1-ccDHCR24-GAL7t-KlLEU2-ERG6(C) | this study |
pT-erg5::ccDHCR7-URA3 | pGEM-Teasy-ERG5(N)-pACT1-ccDHCR7-CYC1t- KlURA3-ERG5(C) |
this study |
pT-NTS-86TRP1-tHMG1 | pT-NTS-86TRP1 containing the N-truncated HMG1 expression cassette pTEF1-tHMG1-GAL7t | this study |
Strain | Genotype | Reference | |
1 | CEN.PK (WT) | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 | Entian and Kotter (2007) |
2 | erg5::D24 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24 | this study |
3 | erg6::D7 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 | this study |
4 | erg6::D24 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24 | this study |
5 | erg5::D7 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 | this study |
6 | erg5::D24/erg6::D7 (#19) | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 | this study |
7 | erg6::D24/erg5::D7 (#S1) |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24 | this study |
8 | NTSD24/ erg5::D24/erg6::D7 (NTSD24/#19) |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-TRP1 | this study |
9 | NTSD24/ erg6::D24/erg5::D7 (NTSD24/#S1) |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24, NTS-DHCR24-TRP1 | this study |
10 | NTSD24D7/ erg5::D24/erg6::D7 (NTSD24D7/#19) |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1 | this study |
11 | 2uD24D7/ erg6::D24/erg5::D7 (2uD24D7/#S1) |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, ergΔ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24 /Y2pH-DHCR24-DHCR7 |
this study |
12 | E3E2/NTSD24D7 /erg5::D24/erg6::D7 |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 ergΔ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG2 | this study |
13 | E3E27-2/NTSD24D7/ erg5::D24/erg6::D7 |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG27-2 | this study |
14 | UPC2-1/NTSD24D7 /erg5::D24/erg6::D7 |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24, erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7, NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/Y2pH-ERG3-ERG2 | this study |
15 | NTSD24D7/WT | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1 | this study |
16 | E3E2/NTSD24D7/WT | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/ Y2pH-ERG3-ERG2 |
this study |
17 | E3E27-2/ NTSD24D7/WT |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/ Y2pH-ERG3-ERG27ERG2 fusion |
this study |
18 | UPC2-1/NTSD24D7/WT | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/ Y2pH-ERG3-ERG27ERG2 fusion |
this study |
19 | erg6::D7/UPC2-1/ NTSD24D7 |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1/ Y2pH-ERG3-ERG27ERG2 fusion/ erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 |
this study |
20 | are2Δ | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 are2Δ::HIS3 | this study |
21 | are2Δ/NTSD24D7/ erg5::D24/erg6::D7 |
MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24 erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7 NTS-DHCR24-DHCR7-TRP1 are2Δ::HIS3 | this study |
22 | NTSD7/NTSD24/#S1 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7, ergΔ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24, NTS-DHCR24-TRP1/NTS-DHCR7-HIS3 |
this study |
23 | erg5::ccD24 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc) |
this study |
24 | erg6::ccD7 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc) |
this study |
25 | erg6::ccD24 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg6Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc) |
this study |
26 | erg5::ccD7 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc) |
this study |
27 | erg5::ccD24/erg6::ccD7 (#cc19) | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc) |
this study |
28 | erg6::ccD24/erg5::ccD7 (#ccS1) | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24(cc) |
this study |
29 | tHMG1/#cc19 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR24(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR7(cc) /NTS-tHMG1-TRP1 |
this study |
30 | tHMG1/#ccS1 | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3-D1 MAL2-8C SUC2 erg5Δ::KlLEU2-TEF1p-sDrDHCR7(cc), erg6Δ::KlURA3-TEF1p-sDrDHCR24(cc) /NTS-tHMG1-TRP1 |
this study |
효모 형질 전환 (LiAc/PEG 방식)
상기 제조된 벡터 혹은 카세트 들을 이용하여 형질전환을 수행하기 위하여, YPD (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-글루코오즈(Glucose) 2%(w/v) 액체배지에서 전배양한 균주를 500 mL 배플 플라스크(baffled flask)에 초기 OD 600 값을 0.2로 맞추어 50 mL을 30 ℃ 진탕 배양기에서 180 rpm으로 배양하였다. 6~7 시간 후 OD 600 값이 1.0이 될 때까지 배양한 후 4 ℃, 4,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 상층액은 제거하고 LiAc/TE 완충용액 (0.01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M LiAc, pH 7.5) 1 mL을 넣고 피펫팅(pipetting)으로 현탁한 다음 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 다시 LiAc/TE 완충 용액 500 μL에 현탁하여 컴피턴트 세포(competent cell)을 제조하였다. 100 μL씩 5개로 나누어 분주하고 각 튜브(tube)에 재조합 벡터 혹은 카세트 2 μL, 연어 정자(salmon sperm) DNA 10 μL, PEG/LiAc 완충용액 (50% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 0.01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M LiAc, pH 7.5) 600 μL를 혼합한 후, 3~4번 정도 조심스럽게 피펫팅(pipetting)해 주었다. 30℃에서 30분간 방치시킨 후 DMSO 70 μL를 첨가하여 피펫팅(pipetting) 해준 후, 42℃에서 15 분간 열처리를 하였다. 얼음에서 3분간 방치한 후 13,000 rpm으로 1분간 원심 분리하여 얻은 침전물을 멸균된 증류수로 현탁하고 특정 아미노산(LEU or TRP or HIS) 또는 염기(URA)가 결손된 SC 합성 기반의 선택 배지 SC-LEU, SC-URA, SC-LUE-URA-TRP, SC-LUE-URA-TRP-HIS(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose, 0.77 g/L drop-out amino acid mixture supplemented without leucine, tryptophan, histidine, or uracil in combination)에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 후 형질전환체를 얻었다(Hill J et. al. 1991).
실시예 1:
ERG5
,
ERG6
결손과
DHCR24
,
DHCR7
동시 삽입을 통한 스테롤 생산 균주 제작
우선 ERG5, ERG6 결손을 위해 상동재조합(homologous recombination)이 일어날 N 단편과 C 단편을 표 1에 표시된 erg5 dN fw, erg5 dN rv, erg5 dC fw, erg5 dC rv, erg6 dN fw, erg6 dN rv, erg6 dC fw, erg6 dC rv 프라이머를 이용하여 각각 N, C 2개의 PCR 단편을 얻은 후 그 단편들을 가지고 융합 중합효소연쇄반응(Fusion-PCR)을 수행하여 pT-ERG5dNC, pT-ERG6dNC를 얻었다. 효모용 코돈 어댑테이션 인덱스 (Codon Adaptation Index) 방식으로 코돈 최적화된 제브라피쉬 유래의 DHCR24와 DHCR7 유전자가 클로닝되어 있는 pMKRQ-DrDHCR24, pMKRQ-DrDHCR7에서 PCR을 통해 DHCR7, DHCR24 DNA 절편을 회수하고 또한 PCR을 통해 얻은 411 bp TEF1 프로모터(promoter)와 314 bp GAL7 터미네이터(terminator)와 같이 연결(ligation)하여 pT-DHCR24, pT-DHCR7 벡터를 제작 후 이 벡터에서 TEF1p-DHCR7-GAL7t, TEF1p-DHCR24-GAL7t 단편을 가져와 pT-ERG5dNC, pT-ERG6dNC 벡터의 N, C 단편 가운데 BamHI/XbaI 위치로 삽입하고 KlURA3, KlLEU2를 pUG73, pUG72 벡터에서 가져와 NotI 위치로 삽입함으로써 최종 벡터 pT-erg5::DHCR24-LEU2, pT-erg6::DHCR7-URA3, pT-erg6::DHCR24-LEU2, pT-erg5::DHCR7-URA3를 얻었다(도 4A, B, C, D). 최종 벡터를 SphI/MluI 처리하여 erg5::DHCR24-LEU2, erg6::DHCR7-URA3, erg6::DHCR24-LEU2, erg5::DHCR7-URA3 카세트를 회수한 후 CENPK 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-LEU, SC-URA, SC-LEU-URA 배지에서 선별하여 erg5::D24, erg6::D7, erg6::D24, erg5::D7, erg5::24/erg6::D7, erg6::D24/erg5::D7 재조합 균주를 제작하였다(도 2, 1단계, 표 3).
실시예 2:
DHCR24
다중 삽입 카세트 제작 및 재조합 효모 선별
콜레스테롤 생합성 유전자 다중삽입을 위해서 본 연구팀에서 개발된 rDNA-NTS 기반 다중삽입 카세트 시스템(Moon et al., 2016)을 이용하여 NTS-DHCR24-86TRP1 카세트를 제작하였다. pT-NTS-86TRP1 벡터에 pT-erg6::DHCR24-LEU2에서 가져온 TEF1p-DHCR24-GALt7 단편을 BamHI 위치에 삽입하여 제작된 pT-NTS-DHCR24-86TRP1(도 4E)를 SphI/NsiI 처리하여 NTS-DHCR24-86TRP1 카세트를 회수한 후 erg5::D24/erg6::D7 (#19, 기탁번호 KCTC 13889BP), erg6::D24/erg5::D7 (#S1, 기탁번호 KCTC 13888BP) 재조합 균주에 도입시킨 후 SC-LEU-URA-TRP 배지에서 선별하여 NTSD24/#19 및 NTSD24/#S1 재조합 균주를 제작하였다(도 2, 2단계).
실시예 3:
DHCR24
/
DHCR7
다중 삽입 제작 및 재조합 효모 선별
DCHR24와 DHCR7 발현 카세트가 함께 들어있는 pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 벡터(도 4f) 제작은 ACT1p fw 와 ACT1p rv 프리이머로 837 bp 크기의 ScACT1 프로모터와 DHCR7 fw2와 DHCR7 rv2 프라이머로 1458 bp 크기의 DHCR7 유전자, CYC1t fw 와 CYC1t rv 프리이머로 252 bp 크기의 CYC1 터미네이터 부위를 각각 증폭하고 이를 융합(fusion) PCR을 통해 하나의 단편으로 만든 후 기존 pT-NTS-DHCR24-86TRP1 벡터에 KpnI 자리로 삽입하여 제작하였다. 이렇게 제작된 pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1를 SphI/NsiI 처리하여 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 회수한 후 erg5::D24/erg6::D7 (#19) 재조합 균주에 형질전환 수행 후 SC-LEU-URA-TRP 배지에서 선별하여 NTSD24D7/#19 재조합 균주 (기탁번호 KCTC 13884BP)를 제작하였다(도 2, 3단계, 오른쪽 패널).
또한, pT-NTS-86TRP1-DHCR24-DHCR7 벡터를 BamHI 처리하여 DHCR24을 제거함으로써 pT-NTS-86TRP1-DHCR7 벡터를 제작하였다. 이후 pT-NTS-86TRP1-DHCR7 벡터에 SmaI/NotI을 처리하여 86TRP1을 제거한 후 프라이머 101HIS3 fw, 101HIS3 rv를 이용하여 PCR로 얻은 101 bp 크기의 프로모터를 가진 HIS3 단편를 삽입하여 pT-NTS-101HIS3-DHCR7를 제작하였다 (도 12a). SpeI/XbaI을 처리하여 NTS-101HIS3-DHCR7 카세트를 얻은 후 NTSD24/#S1 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-HIS 배지에서 선별하여 NTSD7/NTSD24/#S1 균주 (기탁번호 KCTC 13885BP)를 얻었다. 제작된 균주 NTSD7/NTSD24/#S1 유전체 내 도입된 카세트 수를 확인하고자, 해당 균주를 qPCR을 통해 도입 카피 수를 분석한 결과 DHCR7의 유전자는 약 4개 DHCR24의 유전자는 약 2개의 카세트가 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 12b).
실시예 4: 에피좀 플라스미드(Episomal plasmid) 기반
DHCR24
/
DHCR7
발현 벡터 제작
2 마이크로 이스트 에피좀 플라스미드(micro yeast episomal plasmids)를 이용한 Y2pH-DHCR7-DHCR24 벡터(도 4g)는 Y2pH 벡터에 pT-NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1에서 가져온 DHCR24-DHCR7를 BamHI/XhoI 위치에 삽입하여 제작하였고, erg6::D24/erg5::D7 (#S1) 재조합 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환을 수행 후 SC-LEU-URA-HIS 배지에서 선별하여 2uD24D7/#S1 재조합 균주를 얻었다(도 2, 3단계, 왼쪽 패널).
실시예 5:
ERG27
-
ERG2
융합 유전자(fusion gene),
ERG3
과발현 균주 제작
ERG2, ERG3 발현을 위하여 Y2pH-ERG3-ERG2 벡터(도 4f) 제작은 TDH3p fw와 TDH3p rv 프라이머로 714 bp 크기의 ScTDH3 프로모터와 ERG3 fw와 ERG3 rv 프라이머로 1098 bp 크기의 ScERG3 유전자, TEF1t fw와 TEF1t rv 프라이머로 367 bp 크기의 ScTEF1 터미네이터 부위를 각각 증폭하고 이를 융합(fusion) PCR을 통해 하나의 단편으로 만들고, TEF2p fw와 TEF2p rv 프라이머로 836 bp 크기의 ScTEF2 프로모터와 ERG2 fw 와 REF2 rv 프라이머로 666 bp 크기의 ScERG2 유전자, TDH3t fw와 TDH3t rv 프라이머로 484 bp 크기의 ScTDH3 터미네이터 부위를 각각 증폭하고 이를 융합 PCR을 통해 하나의 단편으로 만든 후 기존 Y2pH 벡터에 BamHI/XhoI 자리로 삽입하여 제작하였다. Y2pH-ERG3-ERG27-2 융합 벡터(도 4g) 제작은 ERG27과 ERG2를 ERG27-2 fw1와 ERG27-2 rv1를 이용하여 PCR 생성물(product) 1과 ERG27-2 fw2와 ERG27-2 rv2를 이용하여 얻은 PCR 생성물(product) 2를 융합 PCR을 통해 얻은 후 Y2pH-ERG3-ERG2 벡터에 SphI 사이트를 이용하여 ERG2 대신 삽입시켜 제작하였다. 제작된 Y2pH-ERG3-ERG2, Y2pH-ERG3-ERG27-2 융합 벡터를 NTSD24D7/#19 균주에 형질전환시킨 후 SC-LEU-URA-TRP-HIS 배지에서 선별하여 E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19 재조합 균주를 제작하였다.
실시예 6:
UPC2-1
도입 균주 제작
본 연구팀에서 480 bp 크기의 UPC2 프로모터(promoter)와 YCp(yeast centromere plasmids)를 이용하여 제작한 YCpH-np-UPC2를 2uD24D7/#19 균주에 형질전환시킨 후 SC-LEU-URA-TRP-HIS 배지에서 선별하여 UPC2-1/NTSD24D7/#19 재조합 균주를 제작하였다(도 2, 4단계 왼쪽 패널).
실시예 7: erg6::D7/UPC2-1/
NTS
D24D7 균주 제작
앞서 제작된 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 CEN.PK 야생형 균주에 형질전환 시킨 후 SC-TRP 배지에서 선별하여 NTSD24D7/WT 재조합 균주를 얻었다. 그 후 상기 제작한 Y2pH-ERG3-ERG2, Y2pH-ERG3-ERG27-2, YCpH-np-UPC2를 도입하여 E3E2/NTSD24D7/WT, E3E27-2/NTSD24D7/WT, UPC2-1/NTSD24D7/WT 균주를 제작하였다. 이들 중 UPC2-1/NTSD24D7/WT 균주를 선택하여 erg6::DHCR7-URA3 카세트를 활용하여 ERG6 유전자를 결손시켜 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 균주를 제작하였다(도 3).
실시예 8: 스테롤 에스터(Sterol ester)화 주요 유전자
ARE2
결손 균주 제작
상동재조합을 이용한 ARE2 결손을 위해 N 단편과 C 단편을 ARE2 dN fw, ARE2 dN fw, ARE2 dC fw, ARE2 dC fw 프라이머를 이용하여 각각 PCR로 얻은 후 그 단편들을 가지고 융합 PCR을 수행하여 pT-ARE2dNC를 얻었다. 이후 두 단편 사이의 XhoI/EcoRV 사이트에 ScHIS3를 삽입하여 최종벡터 pT-ARE2dNC-HIS를 얻었고 SphI/MluI 처리를 통해 ARE2dNC-HIS 카세트를 얻은 후 NTSD24D7/#19 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환을 수행한 후 SC-LEU-URA-TRP-HIS 배지에서 선별하여 are2Δ/NTSD24D7/#19 재조합 균주를 제작하였다.
실시예 9: 코돈 컨텍스트(Codon context) 방식으로 코돈 최적화한 cc
DHCR24
, cc
DHCR7
을 이용한
ERG5
,
ERG6
결손과 DHCR24/DHCR7 동시 삽입 제작 및 재조합 효모 선별
기존에 제작된 pT-ERG5dNC-DrDHCR7, pT-ERG5dNC-DrDHCR24, pT-ERG6dNC-DrDHCR7, pT-ERG6dNC-DrDHCR7 벡터를 PstI/SalI 처리하여 백본(backbone)으로 준비하고 코돈 컨텍스트(Codon context) 방식으로 ccDHCR24, ccDHCR7를 유전자 합성한 pMKRQ-sDrDHCR7(cc), pMKRQ-sDrDHCR24(cc)벡터에서 프라이머 ccD7 fw, ccD7 rv, ccD24 fw, ccD24 rv 를 이용하여 PCR로 얻은 ccDHCR24, ccDHCR7 단편을 KpnI/SalI 처리하여 얻은 인서트(insert)를 리게이션(ligation)하여 벡터 pT-ERG5dNC-ccDHCR7, pT-ERG5dNC-ccDHCR24, pT-ERG6dNC-ccDHCR7, pT-ERG6dNC-ccDHCR24를 얻었다. 이후 KlURA3, KlLEU2를 pUG73, pUG72 벡터에서 가져와 NotI 위치로 삽입함으로써 최종 벡터 pT-erg5::ccDHCR24-LEU2, pT-erg6::ccDHCR7-URA3, pT-erg6::ccDHCR24-LEU2, pT-erg5::ccDHCR7-URA3를 얻었다(도 13a~d). 최종 벡터를 SphI/MluI 처리하여 erg5::ccDHCR24-LEU2, erg6::ccDHCR7-URA3, erg6::ccDHCR24-LEU2, erg5::ccDHCR7-URA3 카세트를 회수한 후 CEN.PK 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-LEU, SC-URA, SC-LEU-URA 배지에서 선별하여 erg5::ccD24, erg6::ccD7, erg6::ccD24, erg5::ccD7, erg5::ccD24/erg6::ccD7(=#cc19, 기탁번호 KCTC 13886BP), erg6::ccD24/erg5::ccD7(=#ccS1, 기탁번호 KCTC 13882BP) 재조합 균주를 제작하였다(표 3).
실시예 10:
tHMG1
다중 삽입에 의한 재조합 #cc19, #ccS1 균주의 콜레스테롤 생산량 증대
다중 삽입이 가능한 pT-NTS-86TRP1-tHMG1 벡터는 표 1에 기술된 프라이머 tHMG1-fw와 tHMG1-rv를 이용하여 증폭한 N-말단 552 amino acid가 제거된 HMG1 유전자를 pT-NTS-86TRP1의 EcoRI/SalI에 삽입하여 pT-NTS-86TRP1-tHMG1 벡터를 제작하였다(도 14a). 제작된 pT-NTS-86TRP1-tHMG1 벡터를 SpeI/NsiI 처리하여 NTS-86TRP1-tHMG1 카세트를 얻은 후 erg5::ccD24/erg6::ccD7(=#cc19), erg6::ccD24/erg5::ccD7(=#ccS1) 균주에 LiAc/PEG 방식으로 형질전환하고, SC-TRP 배지에서 선별하여 tHMG1/erg5::ccD24/erg6::ccD7(=tHMG1/#cc19, 기탁번호 KCTC 13887BP), tHMG1/erg6::ccD24/erg5::ccD7(=tHMG1/#ccS1, 기탁번호 KCTC 13883BP) 재조합 균주를 제작하였다(표 3). 제작된 균주 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1 유전체 내 도입된 카세트 수를 확인하고자, 해당 균주를 qPCR을 통해 도입 카피 수를 분석한 결과 약 3~4개의 카세트가 도입된 것을 확인할 수 있었다(도 14b).
<실험예>
qPCR을 이용한 삽입 카피 수 분석
제작된 재조합 균주의 삽입된 타겟 유전자 발현 카세트 카피 수를 확인하기 위해 염색체(chromosome) DNA를 회수한 후 이 염색체 DNA를 템플릿(template)로 하여 qPCR을 수행하였다.
대사 부산물 및 잔존 탄소원 분석
최종 배양 후 상층액 내에 축적된 대사 부산물(예: Ethanol, acetate)과 배양 시 첨가한 탄소원인 글루코오스(glucose) 잔존량을 측정하였다. 분석에 사용한 시료는 본 배양 최종 배양액을 이용하였으며, 이를 원심분리(12,000 rpm, 10 분)하여 상층액을 분석하였다. 분석은 바이오 프로세스 애널라이저(Bio process analyzer)를 이용하였으며, 해당 장비의 에탄올(ethanol), 아세테이트(acetate), 글루코오스(glucose) 측정 전용 키트(Roche/COWIE)를 이용하여 분석하였다.
HPLC-UV/VIs 기반 콜레스테롤 및 전구체 분석
HPLC 분석은 SC 배지 [Synthetic Complete medium (0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose, 0.77 g/L drop-out amino acid mixture supplemented with all required amino acids)]에 균주 1~2 콜로니(colony) 접종하여 종배양 수행한 후 OD600=0.3~0.5 되게 초기 접종 후 SC 배지 또는 YPD 배지에서 배양하였다. 총 스테롤(Total sterol) 추출을 위해서는 3일 내지 6일 배양 (28℃, 220 rpm) 샘플 10 mL 회수 후, 0.05 g/wet weight pellet에 1 mL KOH/EtOH (3:2) (KOH final concentration 4.5 M) 혼합액에 현탁 후 85 ℃에서 1시간 배양 후 0.5 mL 헵탄(heptane)(sigma)을 첨가한 후 비드비터(beadbeator) (6,000 rpm, 15 초, 3번 반복)을 이용하여 혼합하였다. 혼합된 샘플을 원심분리(12,000 rpm, 10 분, 25℃)로 상등액 0.5 mL 헵탄(heptane) 층을 회수한 (12,000 rpm, 10 분, 25℃) 후 건조하고 아세톤(acetone) 200 μL 첨가하여 녹여낸 샘플에 대해 HPLC 분석을 수행하였다. 유리 스테롤(Free sterol) 추출을 위해서는 0.5 mL 클로로포름(chloroform):MeOH(2:1) 혼합물(mixture)을 펠렛(pellet)과 첨가 후 비드비터 (6,000 rpm, 15 초, 3번 반복)을 이용하여 혼합하였다. 혼합된 샘플을 원심분리(12,000 rpm, 10 분, 25℃)로 유기용매 층을 회수한 후 건조하고 건조 펠릿(pellet)에 250 μL 헥산(hexane)을 첨가 하여 녹여낸 후 다시 건조하였다. 완벽히 건조 후 아세톤(acetone) 200 μL 첨가하여 녹여낸 샘플에 대해 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 분석 시 컬럼은 Cosmosil C18-PAQ (4.6 mm*250 mm)을 사용하였고 유량(flow rate)은 1 mL/min, 분석 용매는 90% 아세토니트릴(Acetonitrile), 분석 시간 50 분(min) 이었다. 콜레스테롤 및 전구체에 해당되는 피크(peak)는 UV/Vis 감지기를 사용하여 파장 203 nm에서 분석하였다.
HPLC-CAD 기반 콜레스테롤 및 전구체 생산성 분석
제작한 균주에서 콜레스테롤 및 전구체 생산성 확인을 위한 HPLC-CAD 분석을 위한 세포 배양은 상기 HPLC 기반 분석 내용과 동일하다. 콜레스테롤 및 전구체 추출을 위해서는 3일 내지 6일 배양(28℃, 220 rpm)한 샘플 50 mL을 회수한 후, 20 mL의 재현탁(resuspension) 용액(15% KOH (w/v), 0.125% 피롤갈롤(pyrogallol, w/v), 71% MeOH (v/v))에 재현탁하였다. 이를 85℃에서 2시간 반응한 후 상온에서 식히고, 석유 에테르(petroleum ether) 5 mL을 첨가한 후 5분간 볼텍싱(vortexing)하여 혼합하였다. 혼합된 샘플을 원심분리(3,000 g, 5 분)하고, 상층액을 회수하였다. 석유 에테르를 첨가하여 추출하는 과정은 이후 2회 반복하며, 3 mL로 진행하여 상층액은 모두 회수하였다. 회수한 상층액은 회전진공농축기(rotational vacuum concentrator)를 이용하여 건조하고, 건조한 시료에 1 mL의 메탄올(methanol)을 첨가하여 녹여낸 샘플에 대해 HPLC-CAD 분석을 수행하였다. HPLC-CAD 분석 시 컬럼은 캅셀팩(Capcellpak) (C18, 4.6 mm x 250 mm, 5μm)을 사용하였고, 이동상으로는 메탄올을 사용하였으며 유량 및 조건은 아래 표와 같다. 분석시간은 45 분(min)이었다.
상기 분석법을 통해 표준품 7종(Zymosterol, Ergosterol, Lathosterol, 7-dehydrocholesterol, 7-dehydrodesmosterol, Desmosterol, Cholesterol)을 분석한 결과(도 9 참조), 에르고스테롤과 데스모스테롤의 HPLC peak 머무름 시간이 각각 30.7분과 30.4분으로 겹치나, 야생형 효모 균주에서는 에르고스테롤만 생산되며, 콜레스테롤 및 전구체를 생산할 수 있도록 제작한 재조합 효모 균주의 경우에는 데스모스테롤만 생산되므로 해당 분석법을 통해 최종 생산성 분석을 수행하였다.
실험예 1:
erg5
,
erg6
결손 및
DHCR24
,
DHCR7
발현을 통해 제작한 스테롤 생산 균주에 대한 HPLC 분석
HPLC-UV/Vis 분석 결과 erg5::D24/erg6::D7, erg6::D24/erg5::D7 균주에서 콜레스테롤 피크(cholesterol peak)를 확인할 수 있었으며 erg5::D24/erg6::D7 (#19) 균주가 3.1 ppm, erg6::D24/erg5::D7 (#S1) 균주가 7.5 ppm 콜레스테롤 생산량을 보였다(표 4). 그러나 콜레스테롤 전구체인 지모스테롤(zymosterol), 디하이드로데스모스테롤(dehydrodesmosterol), 데스모스테롤(desmosterol)의 함량이 매우 높았다(도 5).
실험예 2:
DHCR24
다중 삽입을 통해 제조한 스테롤 생산 균주에 대한 HLPC 분석
생산된 콜레스테롤 생산량 증가를 위해 본 연구팀에서 개발된 rDNA-NTS 기반 다중삽입 카세트 시스템을 이용하여 NTS-DHCR24-86TRP1 카세트를 추가 도입시킨 균주의 HPLC 분석 결과 #19 균주에 비해 NTSD24/#19 재조합 균주에서 약 2.4배 높은 7.4 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 6, 표 4). 또한 #S1 균주에 비해 NTSD24/#S1 재조합 균주에서 약 1.5배 높은 11.5 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 6, 표 4).
실험예 3:
DHCR24
,
DHCR7
다중 삽입을 통한 제조한 재조합 균주에 대한 qPCR 및 HPLC 분석
DHCR24, DHCR7 두 유전자 발현 카세트가 함께 들어가 있는 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 다중삽입하여 얻은 NTSD24D7/#19 재조합 균주의 삽입된 카세트 수를 qPCR로 분석한 결과 3~4개 까지 삽입된 균주를 얻을 수 있었다(도 7a). HPLC 분석 결과 erg5::D24/erg6::D7(#19) 균주에 비해 NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 (NTSD24D7/#19)재조합 균주에서 약 2.9배 높은 9.0 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 7b). 또한 HPLC 분석 결과 2uD24D7/#S1 재조합 균주도 #S1 균주에 비해 약 1.5배 높은 11.1 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 7c, 표 4).
실험예 4:
ERG27-ERG2
융합 유전자(fusion gene),
ERG3
및
UPC2-1
과발현을 통해 제조한 재조합 균주에 대한
HPLC 분석
제작된 NTSD24D7/#19 재조합 균주의 더 나은 콜레스테롤 생산 효율 증가를 위해 지모스테롤에서 콜레스테롤 생산에 관여하는 ERG27, ERG2, ERG3 유전자의 추가 발현한 균주의 HPLC 분석 결과 NTSD24D7/#19와 비교하여 E3E2/NTSD24D7/#19, E3E27-2/NTSD24D7/#19, UPC2-1/NTSD24D7/#19 재조합 균주들에서 콜레스테롤 생산량 차이가 크지 않았다(표 4. 도 8). 그러나 ERG3,ERG27-2 또는 UPC2-1이 도입된 재조합 균주들의 경우 콜레스테롤 전구체 생산량은 현저히 증가된 추세를 보였다.
실험예 5: HPLC-CAD 기반 재조합 균주의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 분석
HPLC-CAD 기반 분석법을 통해 콜레스테롤 및 전구체 생산성 분석하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 야생형 균주에 대비 재조합 균주 #19(erg5::D24/erg6::D7)는 7-디하이드로데스모스테롤, 지모스테롤, 데스모스테롤, 7-디하이드로콜레스테롤 및 콜레스테롤을 높은 수율로 생산하는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 방법으로 제조한 재조합 균주의 콜레스테롤(cholesterol) 및 콜레스테롤 전구체의 생산량을 표 4에 정리하였다.
[표 4]
HPLC-CAD 기반 재조합 균주의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 비교 분석
(E: Ergosterol, Z: Zymosteorl, 7-dc: 7-dehydrocholesterol, 7-dm: 7-dehydrodesmosterol, D: Desmosterol, C: Cholesterol)
실험예 6: 스테롤 에스터(Sterol ester)화 주요 유전자
ARE2
결손 재조합 균주에 대한 HPLC-UV/Vis 분석
효모에서 세포내 과잉된 스테롤(sterol)의 저장을 위해 에스터(ester)화 및 지질액적(lipid droplet) 보관에 관여하는 ARE1, ARE2 유전자(Hohmann H-P et. al. 2017) 중 호기성 성장에서 주요 기능을 담당하는 ARE2의 결손을 상동재조합에 의한 유전자 파쇄기법으로 NTSD24D7/#19 균주에 시도하였다(도 10a). 유리 콜레스테롤(Free cholesterol) 형태가 유지되는 추출법으로 준비한 샘플의 경우 야생형 균주 배경에서 콜레스테롤의 양은 큰 변화가 없는 반면 전구체 중 디하이드로데스모스테롤의 양이 크게 감소됨이 관찰되었다(도 10b). 이는 디하이드로데스모스테롤의 경우 대부분 에스터(ester)화된 상태로 존재하지만, 콜레스테롤은 대부분 유리된(free) 형태로 존재함을 시사한다. 제작된 are2Δ/NTSD24D7/#19 균주의 HPLC 분석 결과, 콜레스테롤 양은 큰 차이가 없었고 다량 축적되고 있던 디하이드로데스모스테롤의 양이 다소 감소하였다. 이러한 결과는 NTSD24D7/#19 균주에서 생산되는 콜레스테롤은 대부분 유리 스테롤(free sterol) 상태로 추정된다.
실험예 7: 야생형 균주 대상 스테롤 생산 재조합 효모
S. cerevisiae
분석
앞서 시도된 전략 중에서 다중삽입 카세트 시스템을 이용한 염색체(chromosome) 내의 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트의 삽입 수 증가를 위한 방법으로 야생형 균주에 먼저 NTS-DHCR24-DHCR7-86TRP1 카세트를 다중 삽입 시킨 후 ERG6 결손을 시도하는 전략을 가지고 첫 단계로 제작된 NTSD24D7/WT 재조합 균주의 삽입된 카세트 수를 qPCR로 분석한 결과 4~10개 까지 삽입된 여러 후보 균주를 얻을 수 있었다(도 11a). 이후 HPLC-UV/Vis 분석에서 7개 삽입된 후보군(NTSD24D7/WT #8)에서 에르고스테롤(ergosterol) 피크(peak)가 크게 감소한 반면 캄페스테롤(campesterol)로 추정되는 피크(peak)의 가장 증가된 값을 보였다(도 11b). 따라서 이후 실험에서는 7개 삽입된 후보군(NTSD24D7/WT #8)을 사용하여 E3E2/NTSD24D7/WT, E3E27-2/NTSD24D7/WT 균주를 제작하였으나, HPLC-UV/Vis 분석결과 NTSD24D7/WT 균주와 큰 차이를 볼 수 없었다. 한편, UPC2-1/NTSD24D7/WT 재조합 균주의 경우 전체적인 에르고스테롤 생합성 경로(ergosterol pathway) 활성화 때문인지 오히려 에르고스테롤 생산이 증가 되었다(도 11c). 다음으로 제작된 erg6::D7/UPC2-1/NTSD24D7 균주에 대해 HPLC-UV/Vis 분석 결과, 콜레스테롤 생산량이 기존 제작한 가장 높은 콜레스테롤 생산량을 보이는 NTSD24D7/erg5::D24/erg6::D7 (NTSD24D7/#19) 재조합 균주에 비해 더 우수하지는 않았다(도 11d).
실험예 8: 스테롤 생산 재조합 균주 #S1 및 #19의 생장량 및 부산물 축적량 분석
제작한 균주의 대사 부산물 축적량 확인 결과, #19(erg5::D24/erg6::D7) 균주에서는 최종 배양 후 에탄올과 아세테이트와 같은 부산물이 축적되는 반면, #S1(erg6::D24/erg5::D7) 균주의 경우는 아세테이트의 축적은 소량 있지만 주요 대사 부산물인 에탄올의 축적은 확인되지 않았으므로 야생형과 동일한 양상을 확인할 수 있었다. 또한 세포 생장량 분석 결과, #19(erg5::D24/erg6::D7) 균주의 OD600 값의 경우 약 14.8로 확인되었는 바, 야생형 균주(WT) 및 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 균주 각각의 OD600 값인 약 46.5, 약 57.3 대비 생장이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(표 5).
[표 5]
재조합 균주 #S1 및 #19의 생장량 및 부산물 축적량 비교분석
실험예 9: SC 또는 YPD 배지에서 #S1 유래 균주와
DHCR
유전자 코돈 최적화 균주들의 콜레스테롤 및 콜레스테롤 전구체 생산량 분석
세포 생장량 및 부산물 축적량 분석 결과는 #19(erg5::D24/erg6::D7) 균주에 비해 성장이 좋고 부산물 축적이 거의 없는 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 균주가 산업적 균주로 더 적합함을 제시하고 있다. 이에 따라서 #S1 유래의 재조합 균주들의 콜레스테롤 및 전구체 생산량을 SC 배지와 YPD 배지에서 배양하여 HPLC-CAD 기반 LC 크로마토그램을 이용하여 상세 비교 분석을 수행하였다(표 6). YPD 배지에서 배양 시에는 SC 배지를 이용할 때보다 세포 성장이 높아 총 콜레스테롤 생산량은 높은 반면, SC 배지에서 배양된 경우가 균체 당 생산된 콜레스테롤 양은 높은 것을 확인할 수 있었다.
[표 6]
HPLC-CAD 기반 HPLC 크로마토그램을 이용한 SC 또는 YPD 배지에서 배양한 #S1(erg6::D24/erg5::D7) 유래 재조합 균주들의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 분석
(E: Ergosterol, Z: Zymosteorl, 7-dc: 7-dehydrocholesterol, 7-dm: 7-dehydrodesmosterol, D: Desmosterol, C: Cholesterol)
또한 NTSD7/NTSD24/#S1 재조합 균주에 대한 HPLC 분석 결과 #S1 균주에 비해 약 1.7배 높은 9.3 ppm의 콜레스테롤(cholesterol) 생성 피크를 확인할 수 있었다(도 12c, 표 7). 또한 erg5::ccD24/erg6::ccD7(=#cc19), erg6::ccD24/erg5::ccD7(=#ccS1)에 대해 HPLC분석 결과, 30.1, 29.4 ppm의 콜레스테롤과 6.1, 6.0 ppm의 지모스테롤을 생산하는 것으로 확인되었고, 이는 #S1 균주 대비 콜레스테롤 생산량이 약 5배 이상 증대된 결과이다 (도 13e, 표7).
[표 7]
HPLC-CAD 기반 HPLC 크로마토그램을 이용한 재조합 균주들의 콜레스테롤 및 전구체 생산량 분석
(7-dm: 7-dehydrodesmosterol, 7-dc: 7-dehydrocholesterol, Z: Zymosteorl, D: Desmosterol, E: Ergosterol, L: Lathosterol, C: Cholesterol, D7/D24/S1: NTSD7/NTSD24/#S1)
또한 HPLC 분석 결과 tHMG1/#cc19, tHMG1/#ccS1 균주가 #cc19, #ccS1 균주에 비해 스쿠알렌 (squalene), 옥시도스쿠알렌 (oxidosqualene), 라노스테롤 (lanosterol), 지모스테롤 (zymosterol) 모두 축적되는 패턴을 보였으며, 콜레스테롤의 경우 #cc19, #ccS1 균주에 비해 HPLC 크로마토그램 피크 면적 (peak area) 비교 시 약 1.3~1.5배 정도 생산량이 증가하는 경향을 보였다(도 14c).
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<400> 5
cttcgaagaa tatactaaaa aatgagcagg caagataaac gaaggcaaag 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 6
tattgagcac gtgagtatac gtgattaagc acacaaaggc agcttggagt 50
<210> 7
<211> 1617
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 7
atgagttctg tcgcagaaaa tataatacaa catgccactc ataattctac gctacaccaa 60
ttggctaaag accagccctc tgtaggcgtc actactgcct tcagtatcct ggatacactt 120
aagtctatgt catatttgaa aatatttgct actttaatct gtattctttt ggtttgggac 180
caagttgcat atcaaatcaa gaaaggttcc atcgcaggtc caaagtttaa gttctggccc 240
atcatcggtc catttttgga atccttagat ccaaagtttg aagaatataa ggctaagtgg 300
gcatccggtc cactttcatg tgtttctatt ttccataaat ttgttgttat cgcatctact 360
agagacttgg caagaaagat cttgcaatct tccaaattcg tcaaaccttg cgttgtcgat 420
gttgctgtga agatcttaag accttgcaat tgggtttttt tggacggtaa agctcatact 480
gattacagaa aatcattaaa cggtcttttc actaaacaag ctttggctca atacttacct 540
tcattggaac aaatcatgga taagtacatg gataagtttg ttcgtttatc taaggagaat 600
aactacgagc cccaggtctt tttccatgaa atgagagaaa ttctttgcgc cttatcattg 660
aactctttct gtggtaacta tattaccgaa gatcaagtca gaaagattgc tgatgattac 720
tatttggtta cagcagcatt ggaattagtc aacttcccaa ttattatccc ttacactaaa 780
acatggtatg gtaagaaaac tgcagacatg gccatgaaga ttttcgaaaa ctgtgctcaa 840
atggctaagg atcatattgc tgcaggtggt aagccagttt gtgttatgga tgcttggtgt 900
aagttgatgc acgatgcaaa gaatagtaac gatgatgatt ctagaatcta ccacagagag 960
tttactaaca aggaaatctc cgaagctgtt ttcactttct tatttgcttc tcaagatgcc 1020
tcttcttctt tagcttgttg gttgttccaa attgttgctg accgtccaga tgtcttagct 1080
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gatttgattg agaaaatgaa gtacaccaat atggtcataa aagaaacttt gcgttacaga 1200
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tatgtcatga ttaccttcgc cgctttgttg ggtaaatttg cactatatac tgatttccat 1500
catacagtga ctccattaag tgaaaaaatc aaggttttcg ctacaatttt cccaaaagat 1560
gatttgttac tgactttcaa aaagagagac ccaattactg gagaagtctt cgaataa 1617
<210> 8
<211> 1152
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 8
atgagtgaaa cagaattgag aaaaagacag gcccaattca ctagggagtt acatggtgat 60
gatattggta aaaagacagg tttgagtgca ttgatgtcga agaacaactc tgcccaaaag 120
gaagccgttc agaagtactt gagaaattgg gatggtagaa ccgataaaga tgccgaagaa 180
cgtcgtcttg aggattataa tgaagccaca cattcctact ataacgtcgt tacagatttc 240
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tacgctaaaa aatacaattt gagtgaccaa atggactttg taaagggtga tttcatgaaa 540
atggatttcg aagaaaacac tttcgacaaa gtttatgcaa ttgaggccac atgtcacgct 600
ccaaaattag aaggtgtata cagcgaaatc tacaaggttt tgaaaccggg tggtaccttt 660
gctgtttacg aatgggtaat gactgataaa tatgacgaaa acaatcctga acatagaaag 720
atcgcttatg aaattgaact aggtgatggt atcccaaaga tgttccatgt cgacgtggct 780
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gatgatgaaa tcccttggta ttacccatta actggtgagt ggaagtacgt tcaaaactta 900
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atgcttttcg tcgctaggaa gccagaaaac gccgaaaccc cctcccaaac ttcccaagaa 1140
gcaactcaat aa 1152
<210> 9
<211> 1437
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR7 DNA sequences
<400> 9
atgatggcct ccgatagagt tagaaagaga cataagggtt ctgctaatgg tgctcaaacc 60
gttgaaaaag aaccatctaa agaaccagct caatggggta gagcttggga agttgattgg 120
ttttctttgt ccggtgttat cttgttgttg tgttttgctc cattcttggt ttctttcttc 180
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ggtgatgcta ctttgttcac tatttggaat agagccccat cttttacttg ggctgctgct 300
aaaatctatg ctatttgggt tactttccaa gtcgtcttgt atatgtgtgt tccagatttc 360
ttgcacaaga ttttgccagg ttatgttggt ggtgttcaag atggtgctag aactccagct 420
ggtttgatta acaagtacga agtcaacggt ttacaatgct ggttgattac tcatgttttg 480
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attccattat tgtggtgcac caacattttg ggttatgctg tttctacttt cgccttcatt 600
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ttctttaatg gtagaccagg tatcgttgct tggaccttga ttaacttgtc ttacgctgct 780
aagcaacaag aattatacgg ttacgttacc aactccatga tcttggttaa cgttttacaa 840
gccgtttacg tcgttgattt cttttggaat gaagcctggt acttgaaaac catcgatatc 900
tgccatgatc atttcggttg gtatttgggt tggggtgatt gtgtttggtt gccattcttg 960
tataccttac aaggcttgta cttggtctac aacccaatcc aattgtctac tccacatgct 1020
gctggtgttt tgattttggg tttggttggt tactacatct tcagagttac caaccaccaa 1080
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attgaatgct cttaccaatc tgctgatggt gccattcata agtctaagtt gatgacttct 1200
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<210> 10
<211> 1551
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR24 DNA sequences
<400> 10
atggaccctt tgttgtattt gggtggtttg gctgttttgt tcttgatttg gattaaggtc 60
aagggtttgg aatacgtcat catccatcaa agatggatct tcgtttgctt gttcttgttg 120
ccattgtccg ttgttttcga tgtttactac catttgagag cctggatcat tttcaagatg 180
tgttctgctc caaagcaaca cgatcaaaga gttagagata tccaaagaca agttagagaa 240
tggcgtaagg acggtggtaa aaagtatatg tgtactggta gaccaggttg gttgactgtt 300
tctttgagag tcggtaagta caaaaagacc cacaagaaca ttatgatcaa catgatggac 360
atcttggaag ttgacaccaa gagaaaggtt gttagagttg aaccattggc taacatgggt 420
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ggtttgttcc aacatatttg cgttgccttc gaattggttt tggctgatgg ttctttggtt 600
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ttgggttttt tggttgctgc cgaaattaga attattccag cacaaaagtg ggtcaagttg 720
cattatgaac cagttagagg tttggatgct atctgtaaga agttcgctga agaatccgcc 780
aacaaagaaa atcaattcgt tgaaggttta caatactcca gagatgaagc cgttattatg 840
actggtgtta tgactgatca tgccgaacca gataagacta actgtattgg ttactactac 900
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tatatcccat tgagacatta ttaccacaga cacaccagat ccattttctg ggaattgcaa 1020
gatattatcc cattcggtaa caaccctttg ttcagatatg ttttcggttg gatggttcca 1080
ccaaagatca gtttgttgaa attgactcaa ggtgaaacca tcagaaagtt gtacgaacaa 1140
catcacgttg tccaagatat gttggttcca atgaaggata ttaaggccgc cattcaaaga 1200
ttccatgaag atattcatgt ctacccattg tggttgtgtc cattcttgtt accaaatcaa 1260
ccaggtatgg ttcatccaaa gggtgacgaa gatgaattat acgttgatat tggtgcttac 1320
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gttagagatg ttcacggttt ccaaatgttg tacgctgatg tttacatgga aagaaaagaa 1440
ttctgggaaa tgttcgacgg tacattatac cacaagttga gagaagaatt gggttgcaaa 1500
gatgctttcc cagaagtttt cgacaaaatc tgtaaatccg ccagacacta a 1551
<210> 11
<211> 1098
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 11
atggatttgg tcttagaagt cgctgaccat tatgtcttag acgacttgta cgctaaagtt 60
ctgcccgctt cgttggcagc taatattcct gtcaagtggc agaaattgct agggttgaac 120
agtgggttca gcaattctac gattttgcag gagactttga actccaagaa tgccgtcaaa 180
gaatgtagaa ggttctacgg gcaggtgcca ttcctgtttg atatgtcgac gacgtctttt 240
gcatcgctat tgcctcgttc cagcatcttg agagaattcc tctcactatg ggttattgtt 300
acgatctttg gtttactact ttacttattc acggctagtc tcagctacgt gtttgtgttt 360
gacaagtcga ttttcaacca tcctcgttac ttgaaaaacc aaatggcaat ggaaatcaag 420
ttggcagtca gtgctatccc atggatgtcg atgttgaccg ttccatggtt tgttatggaa 480
ttgaacggcc attctaaact atacatgaag attgattatg aaaaccacgg tgtaaggaag 540
ctcattatcg agtacttcac tttcatcttt ttcactgatt gcggtgtgta tttagcgcac 600
agatggttgc attggccaag ggtctaccgt gctctgcaca agcctcatca caagtggctg 660
gtctgcacac ctttcgcatc tcattctttc catcctgtag acgggttttt gcaatccatc 720
tcgtaccaca tctacccatt gattctgcca ttacacaagg tttcttattt gattctgttc 780
acttttgtta acttttggac tgttatgatt catgacggtc aatacctatc aaacaatcct 840
gccgtcaacg gtactgcctg ccacacggtt caccatctat atttcaacta caactacggt 900
caattcacca ctctgtggga cagactaggg ggttcttacc gtagaccaga tgactcattg 960
tttgatccta agttaagaga tgctaaggag acctgggacg ctcaagttaa ggaagttgaa 1020
catttcatca aggaggtcga aggtgatgat aatgatagaa tctatgaaaa cgacccaaat 1080
accaagaaga acaactga 1098
<210> 12
<211> 669
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 12
atgaagtttt tcccactcct tttgttgatt ggtgttgtag gctacattat gaacgtattg 60
ttcactacct ggttgccaac caattacatg ttcgatccaa aaactttgaa cgaaatatgt 120
aactcggtga ttagcaaaca caacgcagca gaaggtttat ccactgaaga cctgttacag 180
gatgtcagag acgcacttgc ctctcattac ggggacgaat acatcaacag gtacgtcaaa 240
gaagaatggg tcttcaacaa tgctggtggt gcgatgggcc aaatgatcat cctacacgct 300
tccgtatccg agtacttaat tctattcgga accgctgttg gtactgaagg gcacacaggt 360
gttcactttg ctgacgacta ttttaccatc ttacatggta cgcaaatcgc agcattgcca 420
tatgccactg aagccgaagt ttacactcct ggtatgactc atcacttgaa gaagggatac 480
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ccatgtatgt tgccattcgg gtttttggac actttctcca gtactcttga tttatacact 600
ctatatagaa ctgtctacct gactgccagg gacatgggta agaacttgtt gcaaaacaaa 660
aagttctaa 669
<210> 13
<211> 1044
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 13
atgaacagga aagtagctat cgtaacgggt actaatagta atcttggtct gaacattgtg 60
ttccgtctga ttgaaactga ggacaccaat gtcagattga ccattgtggt gacttctaga 120
acgcttcctc gagtgcagga ggtgattaac cagattaaag atttttacaa caaatcaggc 180
cgtgtagagg atttggaaat agactttgat tatctgttgg tggacttcac caacatggtg 240
agtgtcttga acgcatatta cgacatcaac aaaaagtaca gggcgataaa ctaccttttc 300
gtgaatgctg cgcaaggtat ctttgacggt atagattgga tcggagcggt caaggaggtt 360
ttcaccaatc cattggaggc agtgacaaat ccgacataca agatacaact ggtgggcgtc 420
aagtctaaag atgacatggg gcttattttc caggccaatg tgtttggtcc gtactacttt 480
atcagtaaaa ttctgcctca attgaccagg ggaaaggctt atattgtttg gatttcgagt 540
attatgtccg atcctaagta tctttcgttg aacgatattg aactactaaa gacaaatgcc 600
tcttatgagg gctccaagcg tttagttgat ttactgcatt tggccaccta caaagacttg 660
aaaaagctgg gcataaatca gtatgtagtt caaccgggca tatttacaag ccattccttc 720
tccgaatatt tgaatttttt cacctatttc ggcatgctat gcttgttcta tttggccagg 780
ctgttggggt ctccatggca caatattgat ggttataaag ctgccaatgc cccagtatac 840
gtaactagat tggccaatcc aaactttgag aaacaagacg taaaatacgg ttctgctacc 900
tctagggatg gtatgccata tatcaagacg caggaaatag accctactgg aatgtctgat 960
gtcttcgctt atatacagaa gaagaaactg gaatgggacg agaaactgaa agatcaaatt 1020
gttgaaacta gaacccccat ttaa 1044
<210> 14
<211> 1929
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 14
atggacaaga agaaggatct actggagaac gaacaatttc tccgcatcca aaagctcaac 60
gctgccgatg cgggcaaaag acaatctata acagtggacg acgagggcga actatatggg 120
ttagacacct ccggcaactc accagccaat gaacacacag ctaccacaat tacacagaat 180
cacagcgtgg tggcctcaaa cggagacgtc gcattcatcc caggaactgc taccgaaggc 240
aatacagaga ttgtaactga agaagtgatt gagaccgatg ataacatgtt caagacccat 300
gtgaagactt taagctccaa agagaaggca cggtataggc aagggtcctc taactttata 360
tcgtatttcg atgatatgtc atttgaacac aggcccagta tattagatgg gtcagttaac 420
gagcccttca agaccaaatt cgtgggacct actttagaaa aggagatcag aagaagggag 480
aaagagctaa tggccatgcg caaaaattta caccaccgca agtcctcccc agatgctgtc 540
gactcagtag ggaaaaatga tggcgccgcc ccaactactg ttccaactgc cgccacctca 600
gaaacggtgg tcaccgttga aaccaccata atttcatcca atttctccgg gttgtacgtg 660
gcgttttgga tggctattgc atttggtgct gtcaaggctt taatagacta ttattaccag 720
cataatggta gcttcaagga ttcggagatc ttgaaattta tgactacgaa tttgttcact 780
gtggcatccg tagatctttt gatgtatttg agcacttatt ttgtcgttgg aatacaatac 840
ttatgcaagt ggggggtctt gaaatggggc actaccggct ggatcttcac ctcaatttac 900
gagtttttgt ttgttatctt ctacatgtat ttaacagaaa acatcctaaa actacactgg 960
ctgtccaaga tcttcctttt tttgcattct ttagttttat tgatgaaaat gcattctttc 1020
gccttctaca atggctatct atggggtata aaggaagaac tacaattttc caaaagcgct 1080
cttgccaaat acaaggattc tataaatgat ccaaaagtta ttggtgctct tgagaaaagc 1140
tgtgagtttt gtagttttga attgagctct cagtctttaa gcgaccaaac tcaaaaattc 1200
cccaacaata tcagtgcaaa aagctttttt tggttcacca tgtttccaac cctaatttac 1260
caaattgaat atccaagaac taaggaaatc agatggagct acgtattaga aaagatctgc 1320
gccatcttcg gtaccatttt cttaatgatg atagatgctc aaatcttgat gtatcctgta 1380
gcaatgagag cattggctgt gcgcaattct gaatggactg gtatattgga tagattattg 1440
aaatgggttg gattgctcgt tgatatcgtc ccagggttta tcgtgatgta catcttggac 1500
ttctatttga tttgggatgc cattttgaac tgtgtggctg aattgacaag atttggcgac 1560
agatatttct acggtgactg gtggaattgt gttagttggg cagacttcag tagaatttgg 1620
aacatcccag tgcataagtt tttgttaaga catgtttacc atagttcaat gagttcattc 1680
aaattgaaca agagtcaagc aactttgatg acctttttct taagttccgt cgttcatgaa 1740
ttagcaatgt acgttatctt caagaaattg aggttttact tgttcttctt ccaaatgctg 1800
caaatgccat tagtagcttt aacaaatact aaattcatga ggaacagaac cataatcgga 1860
aatgttattt tctggctcgg tatctgcatg ggaccaagtg tcatgtgtac gttgtacttg 1920
acattctaa 1929
<210> 15
<211> 1635
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 15
atgaacagga aagtagctat cgtaacgggt actaatagta atcttggtct gaacattgtg 60
ttccgtctga ttgaaactga ggacaccaat gtcagattga ccattgtggt gacttctaga 120
acgcttcctc gagtgcagga ggtgattaac cagattaaag atttttacaa caaatcaggc 180
cgtgtagagg atttggaaat agactttgat tatctgttgg tggacttcac caacatggtg 240
agtgtcttga acgcatatta cgacatcaac aaaaagtaca gggcgataaa ctaccttttc 300
gtgaatgctg cgcaaggtat ctttgacggt atagattgga tcggagcggt caaggaggtt 360
ttcaccaatc cattggaggc agtgacaaat ccgacataca agatacaact ggtgggcgtc 420
aagtctaaag atgacatggg gcttattttc caggccaatg tgtttggtcc gtactacttt 480
atcagtaaaa ttctgcctca attgaccagg ggaaaggctt atattgtttg gatttcgagt 540
attatgtccg atcctaagta tctttcgttg aacgatattg aactactaaa gacaaatgcc 600
tcttatgagg gctccaagcg tttagttgat ttactgcatt tggccaccta caaagacttg 660
aaaaagctgg gcataaatca gtatgtagtt caaccgggca tatttacaag ccattccttc 720
tccgaatatt tgaatttttt cacctatttc ggcatgctat gcttgttcta tttggccagg 780
ctgttggggt ctccatggca caatattgat ggttataaag ctgccaatgc cccagtatac 840
gtaactagat tggccaatcc aaactttgag aaacaagacg taaaatacgg ttctgctacc 900
tctagggatg gtatgccata tatcaagacg caggaaatag accctactgg aatgtctgat 960
gtcttcgctt atatacagaa gaagaaactg gaatgggacg agaaactgaa agatcaaatt 1020
gttgaaacta gaacccccat tccaaccaat tacatgttcg atccaaaaac tttgaacgaa 1080
atatgtaact cggtgattag caaacacaac gcagcagaag gtttatccac tgaagacctg 1140
ttacaggatg tcagagacgc acttgcctct cattacgggg acgaatacat caacaggtac 1200
gtcaaagaag aatgggtctt caacaatgct ggtggtgcga tgggccaaat gatcatccta 1260
cacgcttccg tatccgagta cttaattcta ttcggaaccg ctgttggtac tgaagggcac 1320
acaggtgttc actttgctga cgactatttt accatcttac atggtacgca aatcgcagca 1380
ttgccatatg ccactgaagc cgaagtttac actcctggta tgactcatca cttgaagaag 1440
ggatacgcca agcaatacag catgccaggt ggttcctttg cccttgaatt ggctcaaggc 1500
tggattccat gtatgttgcc attcgggttt ttggacactt tctccagtac tcttgattta 1560
tacactctat atagaactgt ctacctgact gccagggaca tgggtaagaa cttgttgcaa 1620
aacaaaaagt tctaa 1635
<210> 16
<211> 2739
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 16
atgagcgaag tcggtataca gaatcacaag aaagcggtga caaaacccag aagaagagaa 60
aaagtcatcg agctaattga agtggacggc aaaaaggtga gtacgacttc aaccggtaaa 120
cgtaaattcc ataacaaatc aaagaatggg tgcgataact gtaaaagaag aagagttaag 180
tgtgatgaag ggaagccagc ctgtaggaag tgcacaaata tgaagttgga atgtcagtat 240
acaccaatcc atttaaggaa aggtagagga gcaacagtag tgaagtatgt cacgagaaag 300
gcagacggta gcgtggagtc tgattcatcg gtagatttac ctcctacgat caagaaggag 360
cagacaccgt tcaatgatat ccaatcagcg gtaaaagctt caggctcatc caatgattcc 420
tttccatcaa gcgcctctac aactaagagt gagagcgagg aaaagtcatc ggcccctata 480
gaggacaaaa acaatatgac tcctctaagt atgggcctcc agggtaccat caataagaaa 540
gatatgatga ataacttttt ctctcaaaat ggcactattg gttttggttc tcctgaaaga 600
ttgaattcag gtatcgatgg cttactatta ccgccattgc cttctggaaa tatgggtgcg 660
ttccaacttc agcaacagca gcaagtgcag cagcaatctc aaccacagac ccaagcgcag 720
caagcaagtg gaactccaaa cgagagatat ggttcattcg atcttgcggg tagtcctgca 780
ttgcaatcca cgggaatgag cttatcaaat agtctaagcg ggatgttact atgtaacagg 840
attccttccg gccaaaacta cactcaacaa caattacaat atcaattaca ccagcagctg 900
caattgcaac agcatcagca agttcagctg cagcagtatc aacaattacg tcaggaacaa 960
caccaacaag ttcagcaaca acaacaggaa caactccagc aataccaaca acattttttg 1020
caacagcagc aacaagtact gcttcagcaa gagcaacaac ctaacgatga ggaaggtggc 1080
gttcaggaag aaaacagcaa aaaggtaaag gaagggcctt tacaatcaca aacaagcgaa 1140
actactttaa acagcgatgc tgctacatta caagctgatg cattatctca gttaagtaag 1200
atggggctaa gcctaaagtc gttaagtacc tttccaacag ctggtattgg tggtgtttcc 1260
tatgactttc aggaactgtt aggtattaag tttccaataa ataacggcaa ttcaagagct 1320
actaaggcca gcaacgcaga ggaagctttg gccaatatgc aagagcatca tgaacgtgca 1380
gctgcttctg taaaggagaa tgatggtcag ctctctgata cgaagagtcc agcgccatcg 1440
aataacgccc aagggggaag tgctagtatt atggaacctc aggcggctga tgcggtttcg 1500
acaatggcgc ctatatcaat gattgaaaga aacatgaaca gaaacagcaa catttctcca 1560
tcaacgccct ctgcagtgtt gaatgatagg caagagatgc aagattctat aagttctcta 1620
ggaaatctga caaaagcagc cttggagaac aacgaaccaa cgataagttt acaaacatca 1680
cagacagaga atgaagacga tgcatcgcgg caagacatga cctcaaaaat taataacgaa 1740
gctgaccgaa gttctgtttc tgctggtacc agtaacatcg ctaagctttt agatctttct 1800
accaaaggca atctgaacct gatagacatg aaactgtttc atcattattg cacaaaggtc 1860
tggcctacga ttacagcggc caaagtttct gggcctgaaa tatggaggga ctacataccg 1920
gagttagcat ttgactatcc atttttaatg cacgctttgt tggcattcag tgccacccat 1980
ctttcgagga ctgaaactgg actggagcaa tacgtttcat ctcaccgcct agacgctctg 2040
agattattaa gagaagctgt tttagaaata tctgagaata acaccgatgc gctagttgcc 2100
agcgccctga tactaatcat ggactcgtta gcaaatgcta gtggtaacgg cactgtagga 2160
aaccaaagtt tgaatagcat gtcaccaagc gcttggatct ttcatgtcaa aggtgctgca 2220
acaattttaa ccgctgtgtg gcctttgagt gaaagatcta aatttcataa cattatatct 2280
gttgatctta gcgatttagg cgatgtcatt aaccctgatg ttggaacaat tactgaattg 2340
gtatgttttg atgaaagtat tgccgatttg tatcctgtcg gcttagattc gccatatttg 2400
ataacactag cttatttaga taaattgcac cgtgaaaaaa accagggtga ttttattctg 2460
cgggtattta catttccagc attgctagac aagacattcc tggcattact gatgacaggt 2520
gatttaggtg caatgagaat tatgagatca tattataaac tacttcgagg atttgccaca 2580
gaggtcaagg ataaagtctg gtttctcgaa ggagtcacgc aggtgctgcc tcaagatgtt 2640
gacgaataca gtggaggtgg tgatatgcat atgatgctag atttcctcgg tggcggatta 2700
ccatcgatga caacaacaaa tttctctgat ttttcgtta 2739
<210> 17
<211> 1437
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ccDHCR7
<400> 17
atgatggcct ctgacagagt cagaaagaga cataagggtt ccgctaacgg tgctcaaact 60
gttgaaaagg aaccatccaa agaacctgct caatggggca gagcttggga agttgactgg 120
ttctccttat ctggtgttat tctattgtta tgtttcgctc catttttagt ttcttttttc 180
attatggctt gtgaccaata ccaatgttct atttctcatc cattattgga tttatacaac 240
ggcgatgcta ctttatttac catctggaac agagccccat ctttcacttg ggctgccgct 300
aaaatttatg ctatttgggt tactttccaa gttgtcttat atatgtgtgt tccagatttt 360
ttgcacaaga ttttgcctgg ttatgttggt ggtgttcaag atggtgctag aaccccagct 420
ggtttaatca acaagtacga agtcaacggt ttgcaatgtt ggttgattac tcacgtttta 480
tgggttttga acgcccaaca tttccactgg ttctctccaa ctatcatcat tgacaactgg 540
attccattgc tatggtgtac caacatctta ggttacgccg tttccacttt tgctttcatc 600
aaggcttatt tattcccaac caatccagaa gattgtaaat ttactggtaa tatgttttac 660
aattacatga tgggtatcga attcaaccca agaattggta aatggtttga tttcaagttg 720
ttcttcaatg gtagaccagg tattgttgca tggactttga ttaacttgtc ctacgctgct 780
aagcaacaag aattgtacgg ttatgtcact aactctatga ttttggttaa cgttttacaa 840
gctgtttacg ttgttgattt cttttggaat gaagcttggt atttgaagac cattgatatt 900
tgtcacgatc attttggttg gtacttgggc tggggtgact gtgtttggtt accattcttg 960
tatactctac aaggtctata cttagtctac aacccaattc aattgtctac tccacatgcc 1020
gccggtgtct tgatcttggg tttggtcggt tactacatct tcagagttac aaaccaccaa 1080
aaggacttgt ttagaagaac tgaaggtaac tgttccattt ggggtaagaa gccaacattt 1140
attgaatgtt cttatcaatc tgctgacggt gccattcata aatctaaatt aatgacctcc 1200
ggtttctggg gtgttgccag acacatgaac tacaccggtg atttgatggg ttctttggct 1260
tactgtttgg cctgtggtgg taaccatttg ttgccatact tctacattat ttacatgact 1320
attttattag ttcatcgttg tattagagat gaacacagat gttccaacaa atatggtaag 1380
gattgggaaa gatacactgc tgctgtctct tacagattgc taccaaacat tttctaa 1437
<210> 18
<211> 1551
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ccDHCR24
<400> 18
atggacccat tgctatactt aggtggtttg gccgtcttat ttttgatttg gatcaaggtc 60
aagggtttag aatacgttat cattcaccaa agatggattt ttgtttgttt gtttttacta 120
ccattgtctg tcgtcttcga tgtctactac catttgagag cttggattat cttcaagatg 180
tgttccgctc caaagcaaca cgatcaaaga gtcagagata tccaacgtca agttagagaa 240
tggagaaagg atggtggtaa gaagtacatg tgtaccggta gaccaggctg gttgaccgtt 300
tctttgcgtg tcggtaaata caaaaagact cacaagaaca ttatgattaa tatgatggat 360
attttggaag ttgacaccaa gagaaaagtt gtccgtgttg aacctttggc gaacatgggt 420
caagtcactg ctttgttgaa ctccatcggt tggactttgc ctgttttgcc agagttagat 480
gatttaactg ttggtggctt ggtcatgggt actggtattg aatcctcctc tcacatttat 540
ggtctatttc aacatatttg tgttgcattt gaattagtct tggctgacgg ttctctagtc 600
agatgtactg aaaaagaaaa ctctgatttg ttctacgctg tcccatggtc ttgtggtacc 660
ttggggttct tggttgctgc cgaaattaga atcatcccag ctcaaaagtg ggttaaattg 720
cattatgaac cagttagagg tttggatgcc atctgtaaga aatttgctga agaatctgct 780
aacaaggaaa atcaatttgt cgaaggttta caatactcca gagacgaagc tgttattatg 840
acaggtgtta tgactgatca tgctgaacca gataagacca actgtattgg ttactattac 900
aagccatggt tcttccgtca tgtcgagtct ttcttgaaac aaaacagagt tgccgttgaa 960
tatattcctt taagacacta ctaccacaga cacactagat ccattttctg ggaattgcaa 1020
gacattattc catttggtaa caacccatta ttcagatatg ttttcggttg gatggttcca 1080
ccaaaaattt ctttattgaa gttgactcaa ggtgaaacta tcagaaagtt atacgaacaa 1140
catcacgttg ttcaagatat gttagttcca atgaaggaca ttaaggctgc tattcaaaga 1200
ttccacgaag acatccatgt ttacccatta tggttatgtc cattcttatt accaaaccaa 1260
ccaggtatgg tccatccaaa aggtgatgaa gatgaattgt acgtcgatat tggtgcttac 1320
ggtgagccaa aggttaagca tttcgaagcc acttcttcta ccagacaatt ggaaaagttc 1380
gttcgtgacg ttcacggttt ccaaatgttg tatgctgatg tttatatgga aagaaaggaa 1440
ttttgggaaa tgtttgatgg tactttatat cataaattac gtgaagagtt gggttgtaaa 1500
gatgctttcc cagaagtctt tgacaagatt tgcaaatctg ccagacatta g 1551
<210> 19
<211> 1512
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tHMG1
<400> 19
atgccagttt taaccaataa aacagtcatt tctggatcga aagtcaaaag tttatcatct 60
gcgcaatcga gctcatcagg accttcatca tctagtgagg aagatgattc ccgcgatatt 120
gaaagcttgg ataagaaaat acgtccttta gaagaattag aagcattatt aagtagtgga 180
aatacaaaac aattgaagaa caaagaggtc gctgccttgg ttattcacgg taagttacct 240
ttgtacgctt tggagaaaaa attaggtgat actacgagag cggttgcggt acgtaggaag 300
gctctttcaa ttttggcaga agctcctgta ttagcatctg atcgtttacc atataaaaat 360
tatgactacg accgcgtatt tggcgcttgt tgtgaaaatg ttataggtta catgcctttg 420
cccgttggtg ttataggccc cttggttatc gatggtacat cttatcatat accaatggca 480
actacagagg gttgtttggt agcttctgcc atgcgtggct gtaaggcaat caatgctggc 540
ggtggtgcaa caactgtttt aactaaggat ggtatgacaa gaggcccagt agtccgtttc 600
ccaactttga aaagatctgg tgcctgtaag atatggttag actcagaaga gggacaaaac 660
gcaattaaaa aagcttttaa ctctacatca agatttgcac gtctgcaaca tattcaaact 720
tgtctagcag gagatttact cttcatgaga tttagaacaa ctactggtga cgcaatgggt 780
atgaatatga tttctaaagg tgtcgaatac tcattaaagc aaatggtaga agagtatggc 840
tgggaagata tggaggttgt ctccgtttct ggtaactact gtaccgacaa aaaaccagct 900
gccatcaact ggatcgaagg tcgtggtaag agtgtcgtcg cagaagctac tattcctggt 960
gatgttgtca gaaaagtgtt aaaaagtgat gtttccgcat tggttgagtt gaacattgct 1020
aagaatttgg ttggatctgc aatggctggg tctgttggtg gatttaacgc acatgcagct 1080
aatttagtga cagctgtttt cttggcatta ggacaagatc ctgcacaaaa tgttgaaagt 1140
tccaactgta taacattgat gaaagaagtg gacggtgatt tgagaatttc cgtatccatg 1200
ccatccatcg aagtaggtac catcggtggt ggtactgttc tagaaccaca aggtgccatg 1260
ttggacttat taggtgtaag aggcccgcat gctaccgctc ctggtaccaa cgcacgtcaa 1320
ttagcaagaa tagttgcctg tgccgtcttg gcaggtgaat tatccttatg tgctgcccta 1380
gcagccggcc atttggttca aagtcatatg acccacaaca ggaaacctgc tgaaccaaca 1440
aaacctaaca atttggacgc cactgatata aatcgtttga aagatgggtc cgtcacctgc 1500
attaaatcct aa 1512
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg5 dN fw
<400> 20
acatgcatgc cgctattgaa gagagctcat g 31
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg5 dN rv
<400> 21
gcggccgcgg gtctagaggg ggatccccag gatactgaag gcagtag 47
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg5 dC fw
<400> 22
ggatccccct ctagacccgc ggccgccatg attaccttcg ccgctttg 48
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg5 dC rv
<400> 23
cgacgcgtgc tggcagggtg agtatttg 28
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg6 dN fw
<400> 24
acgtgcatgc gctgttgccg ataacttctt c 31
<210> 25
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg6 dN rv
<400> 25
gcggccgcgg gtctagaggg ctcgaggggg gatccctcaa ttctgtttca ctcatc 56
<210> 26
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg6 dC fw
<400> 26
ggatcccccc tcgagccctc tagacccgcg gccgccctcc caaacttccc aag 53
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> erg6 dC rv
<400> 27
cgacgcgtct tgccgctgta gacaatag 28
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR7 fw
<400> 28
aactgcagat gatggcctcc gatagagtta g 31
<210> 29
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR7 rv
<400> 29
gcgtcgactt acttgtcgtc atcgtctttg tagtcaaaga tgtttggcaa taatctatag 60
g 61
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR24 fw
<400> 30
aactgcagat ggaccctttg ttgtatttgg g 31
<210> 31
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR24 rv
<400> 31
gcgtcgactt acgcatagtc aggaacatcg tatgggtagt gtctggcgga tttacag 57
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEF1p fw
<400> 32
ccgctcgaga gctcatagct tcaaaatgtt tc 32
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEF1p rv
<400> 33
gctctagagg ggaaacttaa agaaattc 28
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAL7t fw
<400> 34
acgcgtcgac ttgaacgaaa cttgaacgga g 31
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAL7t rv
<400> 35
gctctagagg ggaaacttaa agaaattc 28
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACT1p fw
<400> 36
cgaagttatt agggcggccg ctttggactc caccaacgtc 40
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACT1p rv
<400> 37
atcggaggcc atcattgtta attcagtaaa ttttcgatct tggg 44
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR7 fw2
<400> 38
tgaattaaca atgatggcct ccgatagagt tag 33
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DHCR7 rv2
<400> 39
ctttaatttg cggccttact tgtcgtcatc gtctttg 37
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYC1t fw
<400> 40
gatgacgaca agtaaggccg caaattaaag ccttc 35
<210> 41
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYC1t rv
<400> 41
acctctggcg cggcctcatg taattagtta tgtcacgc 38
<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TDH3p fw
<400> 42
cgcggatccg tagaatcatt ttgaataaaa aacacgc 37
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TDH3p rv
<400> 43
acttctaaga ccaaatccat gaattctgtt tatgtgtgtt tattcgaaac 50
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG3 fw
<400> 44
acttctaaga ccaaatccat gaattctgtt tatgtgtgtt tattcgaaac 50
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG3 rv
<400> 45
agaaaagtct tatcaatctc cgtcgactca gttgttcttc ttggtatttg 50
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEF1t fw
<400> 46
caaataccaa gaagaacaac tgagtcgacg gagattgata agacttttct 50
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEF1t rv
<400> 47
ccgctcgagg taaaaaatac gcccgtaacg atg 33
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEF2p fw
<400> 48
ccgctcgagt gccattaaag gcgaattttt g 31
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEF2p rv
<400> 49
aaggagtggg aaaaacttca tgcatgcgtt tagttaatta tagttcgttg 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG2 fw
<400> 50
caacgaacta taattaacta aacgcatgca tgaagttttt cccactcctt 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG2 rv
<400> 51
agatttaaag taaattcacg catgcttaga actttttgtt ttgcaacaag 50
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TDH3t fw
<400> 52
cttgttgcaa aacaaaaagt tctaagcatg cgtgaattta ctttaaatct 50
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TDH3t rv
<400> 53
ccgctcgagt ctagatatat gttatcttat cttgg 35
<210> 54
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG27-2 fw1
<400> 54
cgaacatgta attggttgga atgggggttc tagtttcaac aatttg 46
<210> 55
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG27-2 rv1
<400> 55
ctataattaa ctaaacgcat gcatgaacag gaaagtagct atcgtaac 48
<210> 56
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG27-2 fw2
<400> 56
aagatttaaa gtaaattcac gcatgcttag aactttttgt tttgcaacaa gttc 54
<210> 57
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERG27-2 rv2
<400> 57
gttgaaacta gaacccccat tccaaccaat tacatgttcg atcc 44
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARE2 dN fw1
<400> 58
acatgcatgc caagtcgtaa acctcgtcgg 30
<210> 59
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARE2 dN rv1
<400> 59
gatatcgcgc tcgaggttct ccagtagatc cttcttc 37
<210> 60
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARE2 dN fw2
<400> 60
ctcgagcgcg atatcggacc aagtgtcatg tgtacg 36
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARE2 dN rv2
<400> 61
ccgacgcgtg gcaaatagat tggttaaatc tgaag 35
<210> 62
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 101HIS fw
<400> 62
gctatacgaa gttattaggc ccggggattg gcattatcac ataatgaatt atac 54
<210> 63
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 101HIS rv
<400> 63
caccttgaaa ctacctctgg cgcggccgct cgagttcaag agaaaaaaaa agaaaaagca 60
aaaag 65
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ccD7 fw
<400> 64
ctaatctaag ttttctagct gcagatgatg gcctctgaca gagtc 45
<210> 65
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ccD7 rv
<400> 65
gtcactccgt tcaagtcgac ttagaaaatg tttggtagca atctgtaag 49
<210> 66
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ccD24 fw
<400> 66
ctaagttttc taactgcaga tggacccatt gctatactta ggtg 44
<210> 67
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ccD24 rv
<400> 67
caagtttcgt tcaagtcgac ctaatgtctg gcagatttgc aaatcttg 48
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tHMG1-fw
<400> 68
ggaattcatg ccagttttaa ccaataa 27
<210> 69
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tHMG1-rv
<400> 69
gcgtcgactt acgcatagtc aggaacatcg tatgggtagg atttaatgca ggtgacgg 58
Claims (16)
- ERG5 및 ERG6 유전자가 결손되고, DHCR24 및 DHCR7 유전자가 도입된 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주로서,
상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)가 4 ~ 10 으로 다중으로 도입되며,
상기 DHCR24 유전자가 ERG6 유전자 자리에 도입되고, 상기 DHCR7 유전자가 ERG5 유전자 자리에 도입되거나; 또는 DHCR24 유전자가 ERG5 유전자 자리에 도입되고 상기 DHCR7 유전자가 ERG6 유전자 자리에 도입되며; 추가적으로 도입되는 DHCR24 또는 DHCR7 유전자는 효모 균주의 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)에 도입되고,
상기 스테롤은 콜레스테롤 전구체 또는 콜레스테롤 둘 중 하나 이상을 포함하고,
상기 콜레스테롤 전구체는 지모스테롤, 디하이드로콜레스테롤, 라쏘스테롤, 디하이드로데스모스테롤 및 데스모스테롤로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하며,
상기 재조합 효모균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 재조합 효모 균주에는 ERG3, ERG2, ERG27 및 UPC2-1 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
- 청구항 1에 있어서,
상기 재조합 효모 균주에는 ERG27-ERG2 융합 단백질을 코딩하는 합성 유전자가 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
- 청구항 1에 있어서,
상기 DHCR24 유전자는 ERG6 유전자 자리에 도입되고,
상기 DHCR7 유전자는 ERG5 유전자 자리에 도입되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 재조합 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 제조되고,
상기 유전자 다중 삽입 카세트의 rDNA NTS의 N 말단 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되고, 상기 rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 재조합 효모 균주는 tHMG1 유전자가 숙주의 염색체 상으로 추가 도입된 것을 특징으로 하는 재조합 효모 균주.
- 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법에 있어서,
효모 균주의 ERG5 및 ERG6 유전자를 결손시킨 후 DHCR24 및 DHCR7 유전자를 도입하는 단계를 포함하되,
상기 DHCR24와 DHCR7 유전자 둘 중 하나 이상의 유전자의 카피수(copy number)를 4 ~ 10 로 다중으로 도입하고,
상기 DHCR24 유전자를 ERG6 유전자 자리에 도입하고 상기 DHCR7 유전자를 ERG5 유전자 자리에 도입하거나; 또는 DHCR24 유전자를 ERG5 유전자 자리에 도입하고 상기 DHCR7 유전자를 ERG6 유전자 자리에 도입하며; 추가적으로 도입하는 DHCR24 또는 DHCR7 유전자는 효모 균주의 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)에 도입하고,
상기 스테롤은 콜레스테롤 전구체 또는 콜레스테롤 둘 중 하나 이상을 포함하고,
상기 콜레스테롤 전구체는 지모스테롤, 디하이드로콜레스테롤, 라쏘스테롤, 디하이드로데스모스테롤 및 데스모스테롤로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하며,
상기 재조합 효모 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법.
- 삭제
- 청구항 12에서,
상기 DHCR24 및 DHCR7 유전자 도입은, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 리보좀 DNA 비전사 지역(ribosomal DNA nontranscribed spacer; rDNA NTS)의 N 말단 단편 유전자, 삽입 목적 유전자, 프로모터 영역을 포함하는 영양요구성 선택 표지 마커 유전자 및 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자를 순서대로 포함하는 유전자 다중 삽입 카세트를 이용하여 수행하고,
상기 유전자 다중 삽입 카세트의 rDNA NTS의 N 말단 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되고, 상기 rDNA NTS의 C 말단 단편 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 스테롤 생산능을 갖는 재조합 효모 균주의 제조방법.
- 청구항 1, 3 내지 5, 8 또는 11 중 어느 한 항의 재조합 효모 균주를 배지에 배양하여 스테롤을 생산하는 방법.
- 청구항 15에 있어서,
상기 배양은 25 ~35℃에서 2 ~ 10일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 스테롤을 생산하는 방법.
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