CN104245961B - 用于微生物检测的方法和*** - Google Patents

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Abstract

公开了用于从样品分离和检测微生物的方法和***。描述了结合剂用于从样品分离目标微生物的用途。在某些实施方案中，所述方法在细菌和其它微生物的检测中使用基于核糖体和/或基于噬菌体的信号放大。例如，本发明的实施方案可实现来自单个感染细胞的至少10,000倍的总放大。

Description

用于微生物检测的方法和***
本申请要求2012年2月21日提交的美国临时专利申请61/601,231的优先权。将美国临时专利申请61/601,231的公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于微生物的检测的方法和***。
背景
在生物样品和基于食品的样品中细菌和其它微生物的检测上存在强烈的兴趣。细菌病原体可在人和家养动物中引起高发病率以及巨大经济损失。同样地，鉴于因摄入被某些微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门菌属某些种(Salmonella spp.)污染的食品而引起的威胁生命或致命的疾病的爆发，微生物的检测在食品和药物管理局(FDA)内具有高度优先权。
用于细菌检测的常规微生物测试依赖于非选择性和选择性富集培养物，随后将其涂板在选择性培养基上，进一步测试以确认怀疑的菌落。这样的方法可能需要数天。多种快速法已被研究，并被引入实践来减少所需时间。然而，这些方法具有缺点。例如，牵涉直接免疫测定或基因探针的技术通常需要富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链式反应(PCR)测试还包括扩增步骤，从而能够具有高度灵敏度和选择性，然而，可经济地接受PCR测试的样品尺寸是有限的。对于稀释的细菌悬浮液，大多数小的次级样品不含细胞，从而仍然需要富集步骤。生物富集所需时间取决于样品中靶细菌群体的生长速率、样品基质的作用以及需要的灵敏度。例如，用于产Vero毒素大肠杆菌(verotoxigenic E.coli)的磁性捕获PCR***在模型***中需要约5、7和10小时的富集培养以分别检测1000、100和1个菌落形成单位/毫升(cfu/ml)，以及在绞牛肉中需要15小时的富集培养来检测1cfu/克(g)。实际上，大多数高灵敏度方法使用过夜温育，总共花费约24小时。因培养所需时间，这些方法可花费达3天的时间，这取决于待鉴定的生物和样品来源。该延滞时间通常是不适合的，因为污染的食品、水(或其它产品)可能已进入家畜或人中。此外，耐抗生素菌的增加和生物防御考虑使得水、食品和临床样品中的细菌病原体的快速鉴定在世界上成为关键的优先事项。
因此，存在对微生物例如细菌和其它潜在病原性微生物的更快速的、简单灵敏的检测和鉴定的需要。
发明概述
在一个方面，本发明利用用于检测样品中的微生物的微生物生物学。可使用本文中描述的方法检测多种微生物。
例如，在一个实施方案中，本发明包括使用多个存在于单个微生物中的核糖体作为检测存在于样品中的低水平微生物的工具的方法和***。例如，所述方法可包括如下步骤：将微生物与样品中的其它组分分离，裂解微生物以释放存在于微生物中的核糖体；和检测核糖体或核糖体的组分，其中核糖体或核糖体的组分的检测表明微生物存在于样品中。在某些实施方案中，可使用基于珠粒的扩增免疫测定法来测定从微生物释放的核糖体和/或核糖体蛋白。在其它实施方案中，本发明可包括与炭黑纳米条形码(nanostring)组合以检测从微生物释放的核糖体和/或核糖体蛋白的侧流测定。
在其它另外的和/或可选择的方面，本发明利用可结合微生物或其组分的试剂的高度特异性作为工具以检测和分离存在于样品中的低水平的微生物(例如，单个微生物)。例如，在某些实施方案中，该方法可包括将至少一个细菌与样品的其它组分分离和利用多个亲代噬菌体感染所述至少一个细菌的步骤。该方法还可包括裂解所述至少一个细菌以释放存在于细菌中的子代噬菌体。该方法还可包括检测子代噬菌体或子代噬菌体的组分，其中噬菌体或噬菌体的组分的检测表明细菌存在于样品中。
本发明还包括利用特异性结合剂例如噬菌体和/或抗体的特异性来从样品分离微生物的方法和***。
本文中描述的其它实施方案使用利用可检测部分标记的子代噬菌体和/或细菌，以帮助检测感染的细菌。例如，子代噬菌体可包括可检测的生物分子例如萤光素酶蛋白。或者，子代噬菌体可通过包含标志生物分子例如萤光素酶蛋白的细菌的感染来定量。或者，子代噬菌体可使用与炭黑纳米条形码结合的侧流测定来定量。
在其它实施方案中，本发明包括包含用于进行本文中公开的方法的组分的***(例如，试剂盒)。
因此，本发明的实施方案依赖于用于细菌检测的放大的基于噬菌体和基于核糖体的方法。本文中使用的原理可用于检测其它微生物。由于存在于微生物中的核糖体的绝对数量或放大后存在于细胞中的感染因子的数量的快速增加，因此可比检测微生物本身更容易地检测核糖体和/或这样的子代感染因子。这样，本发明的实施方案可实现从单个感染细胞的至少10,000倍的总体放大。
附图概述
可通过参考下列非限定性附图来更好地理解本发明。
图1，图框A-E，描述了根据本发明一个实施方案的溶液中完整细菌细胞的基于抗体的捕获的示意图。
图2显示根据本发明的一个实施方案，使用基于抗体的捕获而捕获的细菌的平板测定。
图3，图框A和B，显示根据本发明的一个实施方案，使用生物素化的抗核糖体IgG和连接于链霉抗生物素蛋白的磁珠进行的核糖体蛋白质捕获的western印迹。
图4，图框A和B，分别显示包含多个核糖体的细胞和纯化的核糖体的电子显微照片，其中图框A显示了显示大量核糖体(电子致密点)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的薄切片的部分(约1/3)的电子显微照片，图框B显示了纯化的大肠杆菌核糖体的负染色电子显微照片。细胞直径约为1μm，核糖体直径约为20nm。
图5举例说明一个测定法，该测定法包括通过使用固定的结合剂从样品分离细菌，裂解细胞，导致多个核糖体的释放，以及根据本发明一个实施方案进行核糖体的免疫测定。
图6举例说明一个测定法，该测定法包括裂解样品中的细菌细胞，通过使用固定的结合剂分离从细胞释放的核糖体，根据本发明一个实施方案进行核糖体的夹心免疫测定。
图7，图框A和B，举例说明用于使用标准免疫测定形式(图框A)或根据本发明一个实施方案的信号的珠粒放大(图框B)检测核糖体、噬菌体或它们的组成蛋白的夹心免疫测定。
图8，图框A-F，显示根据本发明的可选择实施方案的多种核糖体蛋白检测法。
图9显示根据本发明一个实施方案的核糖体蛋白的检测的结果，其中x轴表示细菌细胞的数目，y轴表示相对于无细菌细胞的对照的信号。
图10，图框A-D描述了用于根据本发明可选择实施方案检测核糖体的侧流测定的用途，其中图框A显示侧流测试条检测的示意图和炭黑纳米条形码(CBNS)的描述；图框B显示使用侧流测定测量核糖体的示意图；以及图框C和D显示使用侧流测定和可选择的显影方法进行的核糖体的测量。
图11描述了根据本发明一个实施方案使用指示菌检测从细菌细胞分离的子代噬菌体。
图12图框A-C，显示根据本发明可选择实施方案的从目标细菌样品进行子代噬菌体检测的用途，其中图框A显示相较于标准细菌菌落形成单位(CFU)测定，使用子代噬菌体进行的一个或两个细菌细胞的检测；图框B显示也相较于标准细菌菌落形成(CFU)测定，对于本发明噬菌体检测(PFU)测定的剂量反应作用；图框C显示来自作为单个细菌细胞(即，100个噬菌体)或27个细菌细胞(即，2700个噬体)的子代的等同物的噬菌体的裂解指示菌的检测；图框D显示使用利用指示菌细胞的噬菌体测定进行的每样品1、5和7个样品细菌细胞的检测；以及图框E显示使用利用细菌指示细胞的噬菌体测定进行的每样品中大量(达到10,000个细胞)样品细菌细胞的检测。
图13描述了具有与萤光素酶融合的衣壳蛋白的指示噬菌体用于根据本发明一个实施方案检测从细菌细胞分离的子代噬菌体的用途。
图14描述了具有可溶性萤光素酶的指示噬菌体用于根据本发明一个实施方案检测从细菌细胞分离的子代噬菌体的用途。
发明详述
定义
除非在本文中另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语将具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，除非按上下文中另外要求，否则单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。通常地，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和本文中描述的杂交结合的命名法以及所述领域内的技术是本领域中公知的和通常使用的。除非另有所指，否则通常按照本领域中公知的和各种一般和更专业的参考资料中描述的常规方法进行已知的方法和技术，所述方法在本说明书全文中进行了论述。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域中通常实现的或如本文中描述的。与本文中描述的实验室方法和技术结合使用的命名法是本领域中公知的和通常使用的命名法。
除非另有所指，否则下列术语将被理解为具有下列含义：
如本文中所用，除非另有所指，否则术语"一个/一种(a)"、"一个/一种(an)"和"所指物(the)"可指一个或多个。
除非另外明确地仅意指供选方案或供选方案是相互排斥的，否则术语“或”的使用用于意指“和/或”，尽管本公开内容支持仅意指供选方案和“和/或”。如本文中所用，"另一个"可意指至少两个或更多个。
在整个本申请中，术语"约"用于表示数值包括将用于测定数值的设备、方法的固有误差变化或样品间存在的变化。
术语"固体载体"或"载体"意指提供可将生物分子结合于其上的基底的结构。例如，固体载体可以是测定孔(即，例如微量滴定板)，或固体载体可以是阵列上的特定区域或可移动载体例如珠粒。
术语"抗体"包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体和嵌合抗体，例如，通过组合诱变和噬菌体展示产生的。术语"抗体"还包括抗体的模拟物或肽模拟物。肽模拟物是基于或来源于肽和蛋白质的化合物。本发明的肽模拟物通常可通过使用非天然氨基酸、构象约束、电子等排取代等对已知肽序列进行结构修饰来获得。
术语"结合剂"是指可特异性和选择性结合第二(即，不同的)目标分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如因氢键合、范德瓦尔斯相互作用或静电或疏水相互作用所致，或其可以是共价的。术语"可溶性结合剂"是指不与固体载体结合(即，共价地或非共价地结合的)的结合剂。
如本文中所用，"分析物"是指待测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，目标分析物可与结合剂相互作用。如本文中所述，术语"分析物"可指目标蛋白质或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可以不具有生物效应。分析物可包括小分子、糖、寡糖、脂质、肽、肽模拟物、有机化合物等。
术语"可检测部分"或"可检测的生物分子"或"报告子"或"指示剂部分"是指可在定量测定中测量的分子。例如，可检测部分可包括可用于将底物转化成可被测量的产物(例如，可见产物)的酶。或者，可检测部分可以是可定量的放射性同位素。或者，可检测的部分可以是荧光基团。或者，可检测部分可以是发光分子。或者，可使用其它可检测分子。
如本文中所用，术语"等价带"包括其中抗原和抗体的浓度导致最大沉淀的沉淀素反应中的区域。因此，如果抗原或抗体过量，则沉淀不发生。
如本文中所用，"噬菌体"或"噬菌体(phage)"包括多个细菌病毒的一个或多个。在本公开内容中，术语"噬菌体"和"噬菌体(phage)"包括病毒例如分枝杆菌噬菌体(例如对于TB和paraTB)、噬真菌体(例如对于真菌)、支原体噬菌体和意指可侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其它微观活生物体并使用它们复制其自身的病毒的任何其它术语。此处，"微观的"意指最大尺寸为1毫米或更小。噬菌体是在自然界中已进化成使用细菌作为复制它们自身的装置的病毒。噬菌体通过将其自身附着至细菌并将其DNA(或RNA)注射入该细菌，诱导其复制噬菌体数百或数千次来进行该复制。这称为噬菌体扩增。
如本文中所用，"噬菌体标志物"是可与噬菌体的存在相关的任何生物或有机成分。不受限制地，这可以是噬菌体本身、掺入噬菌体结构中的蛋白质或其它分子；与噬菌体结合的蛋白质或工程化入噬菌体的基因产物；与噬菌体结合的RNA或DNA；或上述物质的任一种的任一部分。如本文中所用，"细菌标志物"是可用于鉴定细菌的存在的生物或有机成分，例如当细菌被噬菌体裂解时释放的组分，包括细胞壁组分、细菌核酸、蛋白质、酶、小分子或上述物质的任何部分。例如，在某些实施方案中，通过基因工程掺入噬菌体的结构组分(例如，与衣壳蛋白的融合)或作为可溶性蛋白的萤光素酶蛋白是噬菌体标志物。
微生物的检测
本发明提供了用于检测微生物的方法。可将每一个本发明的方法和***的实施方案用于检测和定量多种微生物，包括细菌细胞，以及包括来自食品、水、临床和商业样品的病原体。本发明的方法在短时间内提供了高度检测灵敏度而无需常规生物富集。例如，本发明的实施方案可提供样品中单个微生物(例如，细菌细胞)的检测和定量。
例如，在一个实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，其包括如下步骤：将微生物与样品中的其它组分分离；裂解微生物以释放存在于微生物中的核糖体；和检测核糖体或核糖体的组分，其中核糖体或核糖体组分的检测表明所述微生物存在于样品中。
可使用本发明的方法检测多种微生物。在一个实施方案中，微生物包括细菌或真菌或酵母的至少一种。
多种方法可用于分离微生物。在一个实施方案中，分离微生物的步骤包括将微生物结合于结合剂。例如，分离微生物的步骤可包括将微生物结合至结合于固体载体的结合剂。在一个实施方案中，结合剂可以是抗体。或者，当微生物是细菌时，结合剂可以是噬菌体并且分离细菌的步骤使用特异于所述细菌的噬菌体。
多种方法可用于检测来自微生物的核糖体。在一个实施方案中，核糖体的检测包括使用识别核糖体的一抗，和至少一种识别该一抗的二抗。或者，核糖体的检测可包括使用识别核糖体的一抗，和至少一种识别核糖体的第二一抗。在某些实施方案中，第二一抗结合于固体载体。在其它实施方案中，固体载体包括多种第二一抗。
在其它实施方案中，核糖体可使用侧流测定来检测。例如，在一个实施方案中，将核糖体暴露于(即，施加于)包含抗核糖体抗体的固体载体，随后通过将核糖体流过载体的表面来进行检测。在一个实施方案中，结合于包含抗核糖体抗体的膜的核糖体可使用至少一种炭黑纳米条形码(包括另外的抗核糖体抗体)来可视化。
本发明的其它实施方案利用感染因子的特异性和多样性(multiplicity)来检测目标微生物。在另一个实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，其包括以下步骤：将至少一个微生物与样品中的其它组分分离；用多个亲代感染因子感染所述至少一个微生物；裂解该至少一个感染的微生物以释放存在于微生物中的子代感染因子；和检测子代感染因子，或子代感染因子的组分，其中感染因子或感染因子组分的检测表明所述微生物存在于样品中。在一个实施方案中，将亲代感染因子与子代感染因子分离。在一个实施方案中，所述微生物为细菌并且感染因子为噬菌体。
例如，在一个实施方案中，本发明可包括用于检测目标微生物的方法，其包括以下步骤：将至少一个细菌与样品中的其它组分分离；用多个亲代噬菌体感染所述至少一个细菌；裂解该至少一个感染的细菌以释放存在于细菌中的子代噬菌体；和检测子代噬菌体，或子代噬菌体的组分，其中噬菌体或噬菌体组分的检测表明所述细菌存在于样品中。在一个实施方案中，将亲代噬菌体与子代噬菌体分离。
该方法可包括多种用于检测子代感染因子例如噬菌体的形式。例如，在一个实施方案中，子代感染因子可包含指示部分。在一个实施方案中，子代感染因子中的指示部分可包括融合于结构蛋白(例如，噬菌体衣壳蛋白)的萤光素酶。在一个实施方案中，子代感染因子中的指示部分可以是在感染因子(例如但不限于可溶性萤光素酶蛋白)的复制过程中表达的可检测部分，例如但不限于可溶性萤光素酶蛋白。在一个可选择的实施方案中，该方法可包括用子代感染因子感染指示微生物的步骤，其中指示微生物可包含在指示微生物裂解后释放的蛋白质。在一个实施方案中，从指示微生物释放的蛋白质包含可检测部分。例如，在一个实施方案中，释放的蛋白质是萤光素酶蛋白。在一个可选择的实施方案中，可利用炭黑纳米条形码通过侧流测定检查来自感染的样品细胞和/或指示细胞的子代感染因子。
或者，从指示微生物释放的蛋白质可包括核糖体。这样，该方法组合了通过感染因子(例如，噬菌体)感染提供的放大与通过核糖体检测提供的放大。
微生物的分离
在某些实施方案中，本发明利用可结合目标微生物的试剂的高度特异性作为检测存在于样品中的低水平微生物(例如，单个微生物)的工具。例如，在一个实施方案中，本发明包括利用感染因子的特异性从样品分离微生物的方法和***。例如，在某些实施方案中，噬菌体可用于分离细菌。
或者，本发明可使用特异于所述微生物的抗体。一旦分离(例如，通过与抗体、感染因子或其它结合剂相互作用)后，可裂解微生物以进行本文中描述的核糖体和/或子代感染因子的测定。
因此，在某些实施方案中，分离微生物的步骤包括将微生物结合于结合剂，所述结合剂识别微生物，从而用于将微生物与样品的其余组分分离。本文中描述的方法可用作检测和分离存在于样品中的低水平的微生物(例如，单个微生物)的工具。例如，可从具有1012立方微米体积的1毫升样品分离具有小于1立方微米体积的单个细菌。
在某些实施方案中，本发明包括利用抗体的特异性从样品快速且灵敏地分离单个细菌细胞的方法和***。该方法可包括将样品与多种针对完整细胞产生的抗体接触的步骤。可亲和纯化所述抗体。
另外地和/或可选择地，可对抗体进行生物素标记。该方法还可包括使抗体结合细菌。在其中用生物素标记抗体的情况下，该方法还包括将样品与多个磁性链霉抗生物素蛋白涂覆的珠粒接触，以结合细菌-抗体复合物，以及利用磁铁捕获珠粒-抗体-细菌复合物。或者，可使用纯化生物素-抗体:细菌复合物的其它方法。通过使用这样的方法，可将1毫升样品中的细菌浓缩至约1微升(～1000倍)，从而有利于利用本文中描述的方法进一步检测和/或定量。例如，分离后，可裂解细菌以进行在本文中更详细描述的核糖体的测定。
在一个可选择的实施方案中，本发明包括利用感染因子(例如，特异于微生物的病毒)的特异性从样品快速、灵敏地分离单个微生物的方法和***。因此，在另一个实施方案中，该方法可包括将样品与结合于固体载体(例如，磁珠)的多个特异性感染因子(例如，细菌细胞分离中用噬菌体)接触，从而使噬菌体-固体载体复合物能够发现细菌、结合并感染细菌。随后可捕获固体载体-噬菌体-细菌复合物，然后裂解。
因此，在某些实施方案中，可将生物素化的噬菌体用于感染样品中的细菌。可将生物素化的噬菌体固定于链霉抗生物素蛋白-涂覆的固体载体上。在其它实施方案中，可使用特异性结合感染因子(例如，结合噬菌体或结合噬菌体亚结构例如头)的抗体将感染因子(例如，噬菌体)固定于固体载体上。
随后，可通过固体载体的分离从样品除去固定的输入噬菌体(所述噬菌体中的一些噬菌体在细胞裂解后结合于细菌细胞被膜)。例如，在一个实施方案中，固体载体是磁珠，结合于珠粒的噬菌体可使用磁铁进行分离。
或者，可通过随后的纯化将生物素化的输入噬菌体与细菌和/或子代噬菌体分离开。例如，可将来自感染的裂解物通过链霉抗生物素蛋白柱；亲代(输入)生物素化噬菌体将结合柱子，而未被生物素化的子代噬菌体将存在于流通级分中。这样，输入噬菌体不干扰在感染中产生的噬菌体子代的计数。
例如，该方法可包括例如通过将样品通过细菌过滤器(例如，0.45um孔径的旋转过滤器)过滤来收集微生物(例如，细菌)的步骤。或者，可使用物理分离样品中的微生物的其它方法。该方法还可包括利用噬菌体例如以高感染复数(MOI)感染分离的细菌，并且其中噬菌体包含结合部分(例如，生物素或其它结合剂)。该方法还可包括例如通过洗涤(通过用于捕获细菌的过滤器)这样的未吸附噬菌体来除去至少大部分过量的未吸附输入噬菌体。
通过使用连接于结合剂/固体载体的噬菌体来分离细菌，本发明的方法可克服与区分用于回收(分离)细菌的噬菌体(即，结合于结合剂或固体载体的输入感染性噬菌体)与子代噬菌体(其不连接于结合剂或固体载体)相关的问题。该问题的一个先前解决方法是在靶细胞被感染后化学地破坏剩余的未被吸附的细胞外噬菌体。然而，化学处理可在它们能够产生新的噬菌体颗粒之前杀死病原体细胞。此外，每单位面积的固体载体结合高密度的输入感染性噬菌体消除了可裂解细菌而无子代颗粒产生(称为"自外裂解(lysis fromwithout)"的过程)的与极高感染复数(MOI)相关的潜在问题。
可通过本领域已知的许多方法之一将噬菌体固定在基底上。例如，可将特异于噬菌体的抗体用于将噬菌体连接于基底。或者，可使用配体例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素。还可将共价连接法用于将噬菌体连接于基底。一般而言，不应当使用对噬菌体尾部蛋白具有特异性的抗体，因为这样的抗体对尾部蛋白的结合可干扰噬菌体颗粒结合宿主细菌细胞的能力。
描述微生物分离的一个实例提供于图1，图框A-E中。因此，如图1中举例说明的，可将包含多个细菌例如细菌-X和细菌-Y(分别地22和24)的样品暴露于特异于细菌-X的抗体例如抗-细菌-X抗体20，如图1A中显示的。在一个实施方案中，将抗体与结合剂例如生物素21复合。在细菌-X 22结合抗体20后，可将复合物暴露于利用链霉抗生物素蛋白26涂覆的磁珠(图IB)。抗体上的生物素可识别磁珠上的链霉抗生物素蛋白(图1C)。或者，当一抗不被生物素化时，可将利用识别抗-细菌-X抗体的二抗涂覆的珠粒用于涂覆磁珠。或者，可使用利用识别抗-细菌抗体的蛋白A和/或蛋白G涂覆的珠粒。在这一点上，可分离结合于珠粒的细菌。在一个实施方案中，捕获效率可通过涂板结合于珠粒32的细菌和未结合的上清液级分30(图1D)，随后计数所得的菌落34(图1E)来定量。
图2描述了通过使用针对完整大肠杆菌产生的抗体从样品特异性捕获大肠杆菌而非鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurim)的示例性实验；在每一块的左下/右下方显示了菌落计数。在该实验中，利用链霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠用于分离结合于生物素化的(兔)多克隆抗体的复合大肠杆菌。已发现当特异性大肠杆菌抗体存在时大肠杆菌仅存在于珠粒级分中，并且在上清液(未结合的)级分中没有细菌被回收。相反地，当使用大肠杆菌-特异性抗体时，鼠伤寒沙门氏菌主要在上清液级分中被发现。在抗体不存在的情况下，两种类型的细菌都主要在上清液级分中被发现。
图3A和3B显示了从包含利用6M硫氰酸胍解离并稀释至0.6M硫氰酸胍的核糖体的细菌(大肠杆菌)裂解物进行的核糖体蛋白捕获的Western印迹数据。图3A显示利用生物素标记的抗核糖体抗体(IgG)和链霉抗生物素珠粒能够从溶液捕获核糖体蛋白。可看到当不添加抗核糖体抗体(IgG＝0)时，未检测到核糖体蛋白("Ribo prot")。还可看到50ng抗体能够结合来自100,000个细胞的全部核糖体蛋白。
图3B显示生物素化的抗核糖体抗体和链霉抗生物素蛋白珠粒的添加足以定量捕获存在于溶液中的所有核糖体。在本实验中，利用或不利用200ng兔生物素化抗核糖体IgG温育0.6M硫氰酸胍磷酸缓冲液中的来自大肠杆菌的裂解物。随后，可添加链霉抗生物素蛋白(SA)磁珠以捕获Ab-核糖体蛋白复合物。从珠粒级分取出未结合的上清液，使用200ng生物素化的抗体和SA磁珠对其进行再捕获("recapt")。在利用其中核糖体蛋白先前已被捕获的裂解物的再捕获实验中核糖体蛋白的不存在表明第一捕获步骤足以捕获全部核糖体蛋白。
基于核糖体的信号放大
在某些实施方案中，本发明包括利用存在于单个微生物中的多个核糖体作为检测存在于样品中的低水平微生物的工具的方法和***。在一个实施方案中，该方法用于测定细菌细胞。然而，如本文中公开的，本发明的方法可用于测量其它类型的包含核糖体的微生物，例如但不限于真菌、支原体、原生动物、酵母和其它微观活生物体。因此，在本发明的某些实施方案中，核糖体释放、鉴定和定量被用于放大天然、商业或临床样品中的病原体细胞信号。
核糖体是由两个亚单位组成的致密核糖核蛋白颗粒，所述亚单位由包含所有氨基酸和核糖体RNA(rRNA)的蛋白质组成。来自细菌、古细菌和真核细胞的核糖体具有不同的结构、蛋白质和rRNA序列。可根据它们的沉降速率描述核糖体。细菌核糖体通常以约70S沉降，而真核细胞核糖体通常以约80S沉降。细菌70S核糖体具有两个以约50S和30S沉降的亚单位，而80S真核细胞核糖体亚单位以约60S和40S沉降。
图4A显示枯草芽孢杆菌的薄切片的电子显微照片，该照片显示了大量核糖体(电子致密点)。显示的细胞直径为约1μm，核糖体直径为约-0.02μm(20nm)。仅显示了约1/3的细胞长度。例如，细菌细胞例如大肠杆菌通常包含约20,000个核糖体/细胞，这占据约1/3至1/4的细菌蛋白质质量。因此，细胞裂解后释放的细菌核糖体的检测可提供约为单个可培养细菌细胞的信号约20,000倍的天然放大。通过培养和标准富集法产生完整细菌细胞的相同放大可能需要7小时或更长的温育时间，这取决于具体细菌的生长速率。
大肠杆菌的纯化的核糖体的负染色电子显微照片示于图4B中。虽然细菌的核糖体翻译装置是高度保守的，但在完整核糖体或分离的核糖体蛋白的表位中可存在足够的差异来区分革兰氏阴性与***，例如，大肠杆菌抗核糖体抗体不识别和捕获表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)核糖体蛋白。可以例如通过吸收血清来利用不同物种的完整核糖体上的表位的微小差异。
对于完整核糖体的测定，通常可用酶-去垢剂混合物裂解浓缩的细胞来释放核糖体。在一个实施方案中，可通过添加核糖体特异性生物素化的抗体，随后利用磁性链霉抗生物素蛋白涂覆的珠粒(如本文中描述的)捕获核糖体:抗体复合物来分离核糖体。核糖体的存在表明特异于细胞浓缩中所用抗体的细菌的存在，核糖体的不存在表明特异于细胞浓缩中所用抗体的细菌的不存在。
例如，在一个实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，其包括步骤：将微生物与样品中的其它组分分离；裂解微生物以释放存在于微生物中的核糖体；和检测核糖体或核糖体组分，其中核糖体或核糖体组分的检测表明所述微生物存在于样品中。在某些实施方案中，分离微生物的步骤可包括将微生物结合于结合剂，所述结合剂识别微生物，这样被用于从样品的剩余物分离微生物。例如，在某些实施方案中，分离微生物的步骤可包括将微生物结合于结合剂(例如，抗体或噬菌体)，所述结合剂结合于固体载体或包含识别结合于固体载体的第二试剂(例如，链霉抗生物素蛋白或第二抗体)的结合剂(例如，生物素)。例如，可将识别来自目标微生物的核糖体蛋白的亲和纯化多克隆或单克隆抗体用于检测核糖体和核糖体蛋白。
在其它另外的和/或可选择的实施方案中，通过完整核糖体的检测提供的信号可通过核糖体蛋白(通过完整核糖体的解离获得的)的检测来进一步放大，例如，大肠杆菌的每一个核糖体包含55种不同的蛋白，34种蛋白在50S亚单位中，21种蛋白在30S亚单位中。例如，可裂解从本文中描述的样品分离的细胞，随后通过添加离液剂(例如，硫氰酸胍)在单个步骤中将其中的核糖体解离成单个蛋白质分子。约1/3的核糖体质量为蛋白质，约2/3的核糖体质量为核糖体RNA(rRNA)。因此，在单个细菌细胞中组成20,000个核糖体中的每一个核糖体的55种核糖体蛋白的检测可提供单个可培养细胞的信号约100万倍的假定信号放大。此外，每一个核糖体的55种不同的蛋白质分子具有多个可结合特异性抗体的表位(有限长度的氨基酸序列和可变组成，数目依赖于蛋白质质量)。相反地，完整核糖体的表面上展示更少的蛋白质表位；大多数表位被包埋在内部或特异性结合于rRNA，从而不能接触它们的特异性抗体。因此，特异于来自目标微生物的核糖体蛋白的多克隆或单克隆抗体可用于分离、检测和定量核糖体或来自解离核糖体的核糖体蛋白。
本发明的实施方案利用针对纯化的核糖体(例如，大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和表皮葡萄球菌)产生的多克隆兔和豚鼠抗血清。或者，可使用针对来自其它微生物的核糖体蛋白的抗体。
例如，如图5中举例说明的，在一个实施方案中，本发明的方法可包括通过使用具有特异于微生物的结合剂或噬菌体108的基底106，从样品104回收并浓缩微生物102(例如，细菌)的步骤。在一个实施方案中，结合剂108被固定在固体载体106(例如，聚苯乙烯、二氧化硅或其它载体例如晶片、测试条(dipsticks)、滤器或珠粒)上，或是游离的，随后被固定在固体载体上。随后可从样品取出固定的微生物(例如，通过抽吸、倾析或磁力)。随后可在固体载体上原位裂解微生物和/或将其释放入小的体积(例如，微量滴定孔)112以进行进一步分析。例如，在一个实施方案中，可通过添加小体积的化学药品与酶的混合物裂解浓缩的微生物细胞，以将核糖体114直接释放至固体载体上和/或释放入更小的体积112例如微量滴定孔。
在一个另外和/或可选择的实施方案中，核糖体蛋白可使用抗核糖体抗体116来检测(例如，图5)。如在本领域中已知的，抗核糖体一抗可被直接标记(例如，利用荧光生物分子)118，或一抗对核糖体的结合可利用二抗来检测。
在本发明的方法和***的其它一些实施方案中，以及图6中举例说明的，样品104中的微生物细胞102可通过添加化学品与酶的混合物来原位裂解(例如，在样品中)，以释放核糖体114。随后可通过使用具有特异性结合核糖体的固定的结合剂122(例如，抗体或其它结合剂)的基底106而从样品回收核糖体并浓缩其。随后可利用离液剂将浓缩的核糖体离解成亚单位126，稀释试剂或除去其，例如使用利用可检测部分119标记的抗体117鉴定单个蛋白质126。例如，可通过方法例如但不限于旋转浓缩器的使用或除去解离剂来回收核糖体蛋白亚单位并浓缩其，和如本文中描述的鉴定蛋白质亚单位。
在可选择的实施方案中，可通过标准免疫测定或通过珠粒-抗体免疫测定放大法，例如本文中描述的所述方法，或通过在本领域中是已知的其它灵敏的生物化学、免疫化学、免疫荧光或生物物理法来鉴定核糖体和/或核糖体蛋白。因此，ELISA、RIA或免疫荧光测定可用于检测和定量核糖体蛋白。
或者，不除去解离剂，可在反相蛋白质微阵列(RPPMA)法中将核糖体蛋白亚单位沉积在适当的结合基底上。在一个实施方案中，可封闭基底以阻止其它大分子的结合，通过连接至报道分子来鉴定蛋白质亚单位。例如，在反相微阵列法中，可将变性的蛋白质直接排列在硝酸纤维素涂覆的载玻片上，利用一抗探测，随后利用二抗-报道分子复合物例如生物素化的二抗-Qdot复合物显影(参见，例如，Geho等人,2007,Fluorescence-based analysisof cellular protein lysate arrays using quantum dots,229-237,in"Quantum Dots,Applications in Biology",Methods in Molecular Biology:374,Bruchez和Hotz,eds.,Humana Press)。
在另一个另外和/或可选择的实施方案中，以及如本文中更详细论述的，可通过利用等价带上的最佳浓度核糖体或核糖体蛋白凝集利用抗核糖体抗体涂覆的大珠粒(例如，15μm的珠粒)来检测(直接或在50-100X的放大倍数下)完整核糖体或核糖体蛋白分子。完整核糖体表面上的rRNA序列可提供可排斥抗体的高度负变化的视野。在一个实施方案中，这样的电荷可利用小的碱性分子例如BAC(苄基二甲基烷基氯化铵)来中和。在本实施方案中，可将核糖体分散于微量滴定孔中而非定位于固体载体。
噬菌体蛋白和/或核糖体蛋白的放大免疫检测
在某些方面，本发明利用已被偶联于固体载体以进一步放大信号的生物分子的高度特异性作为工具来检测存在于样品中的低水平的分析物(例如，目标蛋白质)。在某些实施方案中，对于其中待鉴定的蛋白质直接或通过捕获抗体结合于钝化表面的免疫化学(例如，ELISA或RIA)或免疫荧光测定，可实现约10,000倍的信号放大。
因此，在某些实施方案中，本发明包括用于检测目标分析物的方法，所述方法包括向目标分析物中添加检测载体，所述检测载体包括包含识别目标分析物并与其结合的多个结合剂分子的固体载体；和检测存在于检测载体上的众多结合剂分子的至少一些结合剂分子。在某些实施方案中，该方法还可包括添加捕获载体，所述捕获载体包含至少一种识别目标分析物并与其结合的捕获载体结合剂以将目标分析物固定在捕获载体上。在一个实施方案中，在与检测载体相互作用之前将目标分析物结合于捕获载体。或者，可在与检测载体相互作用后，将目标分析物结合于捕获载体。在某些实施方案中，该方法还可包括添加可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子的至少一些并与其结合的结合剂。在一个实施方案中，可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子的至少一些并与其结合的结合剂是可溶性结合剂。
在一个实施方案中，捕获固体载体可以是测定孔(即，例如微量滴定板)。或者，捕获固体载体可以是阵列上的位点，或可移动载体，例如珠粒。在一个实施方案中，检测载体是移动载体例如珠粒。在某些实施方案中，目标分析物可以存在于溶液中。或者，目标分析物可以是微生物和/或组织内部的蛋白质，从而在固定后，细胞中的大分子充当捕获载体。例如，在一个实施方案中，免疫测定放大法可用于蛋白质的原位检测。
在一个实施方案中，向包含目标分析物的样品中添加过量的包含特异性识别目标分析物的结合剂多个分子的检测载体。同样地，在一个实施方案中，检测载体包含多个分子的可检测部分。或者，当结合剂用于识别检测载体上的众多结合剂分子例如二抗时，可溶性结合剂可包含可检测部分。
多种结合剂可用于本发明的方法。例如，连接于检测载体的众多结合剂分子可以是识别目标分析物的抗体或抗体片段。
此外和/或可选择地，连接捕获载体的结合剂可以是识别目标分析物的抗体或抗体片段。此外和/或可选择地，可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子(例如，二抗)的至少一些并与其结合的结合剂可以是抗体或抗体片段。或者，捕获或检测载体的任一种上的结合剂或可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子的至少一些并与其结合的结合剂可包含结合非蛋白质靶的蛋白(即，例如特异性结合小分子目标分析物的蛋白，或结合蛋白的受体)。
在一个实施方案中，可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子(例如，二抗)的至少一些并与其结合的结合剂不识别用于将目标分析物结合于捕获固体载体的捕获结合剂。
包含识别目标分析物的许多结合剂的检测载体的使用提供了信号的放大。在可选择的实施方案中，检测载体包含超过1,000个，或超过10,000个，或超过100,000个，或超过500,000个，或超过1,000,000个特异于目标分析物的结合剂分子。因此，在可选择的实施方案中，本发明的方法提供了为在标准非放大免疫测定(所述测定不包括包含众多检测结合剂的检测载体)中看到的信号的1,000至1,000,000,000倍，或1,000至100,000,000倍，或5,000至10,000,000倍，或10,000至1,000,000倍，或10,000倍变化至500,000倍，或50,000至500,000倍的放大。或者，可实现在这些范围内的范围。
检测载体和/或捕获载体的使用可包括多种形式。
例如，在一些实施方案中，可首先将目标分析物结合于捕获载体，随后让其与检测载体相互作用。因此，该方法可包括将众多可特异性结合目标蛋白的结合剂连接于捕获载体的步骤。该方法还可包括将目标分析物添加至捕获载体。随后，该方法可包括添加检测载体，所述检测载体包含特异于结合于捕获载体的目标分析物的多个检测结合剂，以便所述多个检测结合剂的检测提供信号的放大。
同样地，在某些实施方案中，该方法可包括添加可特异性识别众多检测结合剂并与其结合的结合剂。在一个实施方案中，可特异性识别众多检测结合剂并与其结合的结合剂是可溶性结合剂。第三结合剂可包含可检测部分。因此，在一些实施方案中，进行所述方法的步骤产生由捕获载体:捕获结合剂:目标分析物:检测结合剂:检测载体:可溶性结合剂:可检测部分组成的复合物。
例如，在几个实施方案中，通过使用包括由本文中描述的检测载体提供的基于珠粒的放大的测定来测定来自微生物的核糖体蛋白和/或来自感染因子的蛋白(例如，噬菌体蛋白)。
因此，图7A举例说明非放大间接"夹心"免疫测定***，其中核糖体、核糖体蛋白或子代噬菌体(或来自待测定的微生物的其它目标蛋白)被固定在固体载体上，随后通过抗体进行检测。例如，如图7A中举例说明的，可将通过细菌细胞(包括核糖体)的裂解和解离，通过利用离液剂(例如，硫氰酸胍)的处理，或通过噬菌体子代的解离产生的核糖体或子代噬菌体蛋白分子206固定在利用定向抗核糖体或抗噬菌体一抗208(例如，兔)涂覆的固体表面214上。在一个实施方案中，固体表面可用蛋白A/G涂覆，随后进行钝化(即，被涂覆以减少非特异性结合)。或者，可将抗体共价结合于固体表面，随后钝化表面。如图7A中显示的，固定的抗体208可特异性识别核糖体、核糖体蛋白或目标噬菌体蛋白206，而其它蛋白或生物分子202、204不被结合。目标核糖体、核糖体蛋白或噬菌体蛋白206随后可通过添加也识别所述目标核糖体、核糖体蛋白或噬菌体蛋白的第二一抗211来检测。例如，固定的抗体208可以是兔抗核糖体抗体，而第二一抗211可以是豚鼠抗核糖体抗体。随后可利用二抗(例如，抗-豚鼠抗体)212检测第二一抗。在一个实施方案中，二抗212用可检测部分210标记。例如，二抗可用荧光部分(例如，)或酶(例如，辣根过氧化物酶)标记。
图7B描述了可用于检测核糖体、核糖体蛋白或子代噬菌体蛋白(或其它目标蛋白)的基于珠粒的“夹心”放大免疫测定。在一个实施方案中，将核糖体、核糖体蛋白或子代噬菌体蛋白或其它目的蛋白固定在固体载体上，随后利用抗体进行检测。例如，可将通过细菌细胞的裂解和解离产生的目标蛋白分子206固定在利用定向抗核糖体或抗噬菌体一抗208(例如，兔)包被的固体表面214上。在某些实施方案中，固体表面可用蛋白A/G涂覆，随后进行钝化(即，被涂覆以减少非特异性结合)。或者，可将抗体共价结合于固体表面，随后钝化表面。与非放大测定类似，固定的抗体208可特异性识别目标核糖体、核糖体蛋白或噬菌体蛋白206，而其它蛋白或生物分子202、204不被结合。
随后可添加利用数百个或数千个或数万个或数十万个也识别目标核糖、核糖体蛋白或噬菌体蛋白206的第二一抗211涂覆的珠粒。例如，固定的抗体可以是兔抗核糖体抗体，而第二一抗可以是豚鼠抗核糖体抗体。这样，目标分析物206将包含众多识别目标分析物206的放大第二一抗211的珠粒连接于固体载体214。最后，添加识别第二一抗211的二抗(例如，抗-豚鼠抗体)212。在一个实施方案中，利用可检测部分210标记二抗212。例如，利用荧光部分(例如，)或酶(例如，辣根过氧化物酶)标记第三抗体。因此,可以从单个蛋白质分子产生信号的极大放大。
因此，在用于检测样品中微生物的可选择的实施方案(其中核糖体或子代噬菌体颗粒解离成它们的组成蛋白质亚单位提供了额外放大(因为大肠杆菌的每一个核糖体包含55个蛋白质，并且噬菌体颗粒例如T4可包含数千个蛋白质分子))中，高增益放大免疫测定法可包括以下步骤：将微生物与样品中的其它组分分离，和在单个步骤中通过使用离液剂(例如，6M硫氰酸胍)解离微生物的大分子组分(包括其中的核糖体)(或将噬菌体子代解离成蛋白质组分)。该方法还可包括去除或稀释解离剂。该方法还可包括结合生物素化的多克隆核糖体特异性(或噬菌体特异性)一抗(例如，兔中产生的)和通过磁性链霉抗生物素蛋白涂覆的“捕获”珠粒捕获蛋白质-抗体复合物。随后，该方法可包括利用多个(例如数万个)在另一个物种(例如，豚鼠)中产生的核糖体特异性(或噬菌体特异性)一抗涂覆的“检测”珠粒的结合。在这一点上，该方法可包括结合多个缀合于可检测部分(报道分子)例如辣根过氧化物酶、的二抗(例如，山羊抗-豚鼠)的步骤或炭黑纳米条形码；和通过产生荧光或其它信号的测定。
在一个实施方案中，高增益放大的决定因素是可容纳特异于目标分析物的大量抗体(例如，核糖体特异性抗体)的结合的检测珠粒的巨大表面积。被106个核糖体蛋白亚单位(一个细菌细胞中核糖体的解离获得的核糖体蛋白亚单位的近似数目)占据的面积很小，该面积必须满足对珠粒的可及性。在一个实施方案中，l06个lμm珠粒的二维汇合阵列将占据约1mm2。对于可移动捕获载体(例如，珠粒)，可结合的具有特定尺寸的检测载体的数目可受到位阻效应限制。可通过ELISA、RIA或免疫荧光测定单个蛋白质分子对被105个一抗涂覆的珠粒的结合和随后标记二抗的结合，从而提供高增益放大。
在另一个实施方案中，可通过离心至具有适当孔径(通常地，对于细菌为0.45μm以及对于核糖体为0.02μm)的旋转过滤器的表面上来浓缩样品中的细胞(或通过本文中描述的方法从样品中的细胞释放的核糖体)。随后可在本文中描述的小体积缓冲液(例如，～20μl)中裂解浓缩的细胞以释放核糖体。可将核糖体(例如，来自单个细菌细胞的约20,000个)从过滤器表面转移至微量滴定板的孔。在这一点上，可通过添加～3,000个大的聚苯乙烯珠粒(通常地直径为15至20μm)后网格的形成来鉴定核糖体或核糖体蛋白，所述珠粒被偶联于可识别核糖体或核糖体蛋白上的多个表位的多克隆抗体。每一个大的珠粒可结合～107个抗体，如果用蛋白G或另一种复合于抗体的蛋白预涂覆珠粒，则抗体被定向用于最佳抗原结合。因核糖体或核糖体蛋白桥连固定在分开的珠粒上的抗核糖体抗体所致的网格形成(珠粒凝集)可以很快，并且取决于使用的珠粒的尺寸和数目，其可直接看到而无需放大，或可通过光学显微镜在50-100x的放大倍数下看到。核糖体蛋白的系列稀释物的使用可鉴定等价带，在所述等价带中珠粒结合的抗体和蛋白分子的浓度对于珠粒凝集是最佳的。与已知数目的核糖体或核糖体蛋白聚集(凝集)的珠粒-蛋白G-抗体复合物可用作阳性对照，无核糖体或核糖体蛋白的缓冲液中未聚集的珠粒-蛋白G-抗体复合物可用作阴性对照。
图8举例说明了可用于检测来自微生物的目标分析物的免疫测定的若干可选择实施方案。在某些实施方案中，所述测定提供了基于珠粒的放大。
如图8A中显示的，方法la和lb分别提供了针对核糖体和/或噬菌体蛋白的未放大的和放大的免疫测定的示例性实施方案。在这些测定中，添加特异于目标分析物206(例如，核糖体或噬菌体蛋白)的游离生物素化一抗分子230(例如，兔)以结合溶液中的靶分子。该生物素化的抗体分子230可特异性识别目标分析物206，而其它蛋白质或生物分子202、204不被结合。在这一点上，可添加磁性链霉抗生物素蛋白涂覆的"捕获"珠粒240(例如，直径约1微米)以定量结合生物素化的抗体-蛋白质复合物。在一个实施方案中，该方法可包括通过添加生物素和牛血清白蛋白(BSA)来封闭珠粒-蛋白质复合物。
在这一点上，在放大测定(方法1b)中，添加利用数百至数千、至数万、至数十万或更多分子的在不同物种(例如豚鼠)中产生的第二抗核糖体一抗211涂覆的"检测"珠粒233，以结合核糖体蛋白分子上的开放的未被占据的表位。可使用识别第二一抗211的二抗分子(例如，抗豚鼠抗体)212检测第二一抗分子211的量。在一个实施方案中，利用可检测部分210标记二抗分子212。例如，二抗可用荧光部分(例如，)或酶(例如，辣根过氧化物酶)标记。因此，归因于检测珠粒上大量第二一抗分子的存在，信号的极大放大可源自单个蛋白质分子。相反地和为了比较，在方法la中举例说明了利用捕获珠粒而非放大检测珠粒进行的间接免疫荧光夹心测定。
图8B(方法2)举例说明了方法la的未放大测定的可选择形式，但其中在添加链霉抗生物素珠粒240之前，同时添加第二一抗分子211和第一一抗分子230。
图8C(方法3)举例说明了方法lb的放大测定的可选择形式，但其中在添加识别第一一抗分子230的链霉抗生物素捕获珠粒240之前，添加第一一抗分子230和利用在不同物种(例如，豚鼠)中产生的第二抗核糖体一抗分子211涂覆的检测珠粒233。在一个实施方案中，这可促进目标分析物206与检测载体珠粒233和第一一抗分子230之间的复合物形成。
图8D(方法4)举例说明了方法lb的放大测定的可选择形式，但其中利用众多在不同物种(例如，豚鼠)中产生的第二抗核糖体一抗分子211涂覆的检测珠粒233包含众多分子的可检测部分210作为检测珠粒223的部分(例如，通过共价连接或涂覆在表面上)而不是结合于第二抗核糖体一抗分子211。可检测部分210可包含荧光部分(例如，)或酶(例如，辣根过氧化物酶)。在一个实施方案中，如果检测载体包含众多可检测部分，则该方法可允许使用更少的检测结合剂(例如，第二抗核糖体一抗211)。例如检测载体233上可检测部分210:检测结合剂211的比率可以为1:1，或5:1，或10:1，或100:1，或500:1，或1000:1，10,000:1或更大。可检测部分可包含荧光部分(例如，)或酶(例如，辣根过氧化物酶)。
图8E(方法5)举例说明方法4的测定的可选择形式，但其中在添加识别第一一抗分子230的链霉抗生物素珠粒240之前，添加利用在不同物种(例如，豚鼠)中产生的第二抗核糖体一抗分子211和可检测部分210涂覆的检测珠粒233。在一个实施方案中，这可促进目标分析物206与检测载体珠粒233和第一一抗分子230之间的复合物形成。
图8F(方法6)举例说明方法3的可选择形式，但其中在添加第一一抗分子230和识别第一一抗分子230的链霉抗生物素珠粒240之前，添加利用在不同物种(例如，豚鼠)中产生的第二抗核糖体一抗分子211涂覆的检测珠粒233。在一个实施方案中，这可促进目标分析物206与检测载体珠粒233之间的复合物形成。
图9显示利用方法6的结果，所述结果显示来自500或2,000个大肠杆菌细胞的等同物的核糖体的检测。X轴表示细菌细胞的数目，y轴表示相对于不具有细菌细胞的对照的信号。
重要的是二抗和/或第二检测一抗不结合捕获载体抗体，因为这样的结合可导致本底。因此，在某些实施方案中，检测的步骤包括添加识别检测珠粒上的检测一抗试剂的二抗，但其中二抗不识别用于将目标蛋白结合于捕获载体的捕获结合剂(例如，第一一抗)。
在某些实施方案中，捕获和/或检测固体载体可用钝化剂处理。例如，在某些实施方案中，可将目标分析物捕获在钝化的表面(即，经处理而减少了非特异性结合的表面)上。一种这样的钝化剂是BSA。此外和/或可选择地，当使用的结合剂是抗体时，可用蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或另一种以高亲和力与结合剂抗体结合的试剂涂覆捕获和/或检测固体载体。这些蛋白结合抗体的Fc结构域，从而可定向识别目标蛋白的抗体的结合。
检测和/或捕获载体可以是聚苯乙烯珠粒或由相似或其它材料制造的珠粒，以便珠粒可用蛋白质涂覆，但不与测定中的其它组分反应。在某些实施方案中，珠粒足够大以便众多抗体分子可被连接于珠粒。例如，珠粒的尺寸范围在直径上可为0.1至50，或0.2至40，或0.3至30，或1至20，或1至15或约1至3μm。珠粒的尺寸可取决于待进行的测定的尺寸。对于在微量滴定孔中进行的测定，可使用约1微米(μm)的珠粒。
在可选择的实施方案中，检测载体可包含众多检测结合剂。例如，在可选择的实施方案中，检测载体上的结合剂数量可以是超过100个，或超过500个，或超过1,000个，或超过5,000个，或超过10,000个，或超过20,000个，或超过50,000个，或超过100,000个，或超过500,000个，或超过1,000,000个分子的检测结合剂。例如，在一个实施方案中，检测载体可包含利用数万或数十万个抗体分子涂覆的珠粒。在可选择的实施方案中，对于直径约为15μm的检测载体珠粒，可存在约10,000至10,000,000个，或约50,000至1,000,000个，或约100,000至500,000个结合剂分子(例如，一抗)。对于具有不同尺寸的检测载体珠粒，可使用对应的表面覆盖度。因此，在可选择的实施方案中，本发明的方法提供了为在标准非放大免疫测定中看到的信号的1,000至1,000,000,000倍，或1,000至100,000,000倍，或5,000至10,000,000倍，或10,000至1,000,000倍，或10,000至500,000倍，或50,000至500,000倍的放大，所述标准非放大免疫测定不包括包含众多检测结合剂的检测载体。或者，可实现在这些范围内的范围。
在某些实施方案中，检测载体珠粒足够大从而众多结合剂分子可连接于珠粒。例如，珠粒的尺寸范围在直径上可以为约0.1至50，或0.2至40，或0.5至30，或1至20，或1至15或约1至3μm。当待连接于珠粒的结合剂是抗体时，可使用商购可得的利用蛋白G、蛋白A或蛋白A/G预涂覆的珠粒，因为这些蛋白结合抗体的Fc结构域，确定抗体方向以便Fab结构域自由而结合抗原的表位。
如上所述，可添加与酶或荧光物质(或其它荧光标记物)复合的结合剂(例如，识别检测载体上的第二一抗的二抗)以结合检测载体上用作检测结合剂的大量抗体。免疫化学(例如，ELISA)测定或适当的发射成像***中荧光物质的激发和显影可用于定量蛋白质。在一个实施方案中，由该方法提供的大信号放大因子的关键因素是可容纳检测结合剂结合的检测载体的巨大表面积。例如，对于抗体，可将约>10,000个和>100,000个分子分别用于涂覆1μm和2.8μm的珠粒。
通过测流测定(LFA)检测核糖体
在一个实施方案中，可使用侧流测定(LFA)或免疫层析测定来检测核糖体。这样的测定可以是快速的并且易于进行，可在1小时内产生可视结果。在一个实施方案中，测定可包括使用炭黑纳米条形码(CBNS)的超灵敏侧流测定，其用作抗体-载体和结果读出器(Lonnberg等人.,J.Immunol.Methods,339:236-244(2008))。
例如，在某些实施方案中，侧流测定可包括允许分子以单一方向流动的固体载体。在一个实施方案中，固体载体可包含具有比宽度更长的长度的测试条(图10A)。测试条可由膜(例如，硝酸纤维素膜或其它类型的吸收基底)和与膜接触的吸收垫组成(图10A)。在一个实施方案中，膜可包含具有来自第一物种(例如，兔)的识别目标分析物(例如，核糖体、核糖体蛋白、噬菌体蛋白)的抗核糖体抗体的测试线，和具有识别来自第一物种的抗体的二抗(例如，山羊抗-兔抗体)的对照线。图10A中还显示了利用抗核糖体抗体302涂覆的炭黑纳米条形码300。
在一个实施方案中，可通过将样品施用于膜的底部("点样区")(图10B)，使样品通过毛细管作用流动穿过图10A中显示的膜的表面来进行测定。因此,样品中存在的目标分析物可与测试线上的固定抗体(例如，对于核糖体分析物为抗核糖体抗体)相互作用并结合所述抗体，而样品中的其余材料将继续进入吸收垫。随后可用利用也识别目标分析物(例如，兔抗核糖体抗体)的抗体(CBNS-Ab)预涂覆的炭黑纳米条形码温育测试条。在一个实施方案中，LFA测试条具有来自全血清IgG的抗体，而CBNS-Ab上的IgG利用目标抗原来亲和纯化。使CBNS-Ab复合物流过硝酸纤维素表面。这样，CBNS-Ab复合物可与结合于测试线的核糖体相互作用。该相互作用可被可视化为灰色至黑色的线(图10B)。任何未结合的CBNS-Ab可沿测试条继续向上并结合于抗-兔对照线，这也导致灰色/黑色的线(图10B)。如果样品不包含核糖体蛋白，则在测试线的位置上无线形成，但在对照线的位置上将形成线。
图10C和10D显示使用这样的测流测定，利用用兔抗核糖体抗体涂覆的炭黑纳米条形码对来自大肠杆菌的核糖体进行的检测。因此，图10C显示使用利用兔抗核糖体抗体涂覆的CBNS进行的10ng核糖体的检测，以及核糖体在样品中的存在(在测试线位置上观察到一条线)。对照中的线表明CBNS-Ab沿着测试条向上迁移。
在某些实施方案中，CBNS-LFA***的灵敏度可通过减少测试线的面积以将CBNS浓缩至更小的区域中以增加线的强度来增加。在另一个实施方案中，将结合已定位在测试线上的CBNS-Ab的CBNS二抗复合物可用于进一步增强信号的强度。第三方法可将酶例如辣根过氧化物酶(HRP)整合入一抗-CBNS复合物或二抗-CBNS复合物，以便可将HRP底物直接添加至测试条，以通过将底物转化成有色产物来增强线的强度。此外和/或可选择地，可将CBNS上生物素化的抗体与结合于CBNS的可溶性链霉抗生物素蛋白-HRP(SA-HRP)或SA-HRP结合用作增强信号的工具。图10D显示了这样的实验，该实验使用CBNS-生物素化的抗核糖体抗体，并且通过CBNS-生物素化的抗核糖体抗体(顶部图框)的可视化以及通过添加与缀合于辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白复合的CBNS(SA-HRP-CBNS)，随后添加比色辣根过氧化物酶底物(下图框)发展而来。可看到通过使用该方法，有可能检测到少至5ng的核糖体。
通过感染因子提供的放大
在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中的微生物的快速灵敏的方法，所述方法包括：将样品与游离的或结合至结合于固体载体的结合剂的感染因子接触，其中感染因子对于所述微生物是特异性的，从而可从样品分离所述微生物。例如，在某些实施方案中，目标微生物是细菌，感染因子是一种或多种噬菌体。或者，对于其它类型的微生物，可使用其它感染因子。
如上文中所述，噬菌体是附着于特定细菌并注射它们的遗传物质的病毒。噬菌体因而使用细菌的机器将它们自已在短时间内复制100或数百次。一些噬菌体是裂解的，意指它们使宿主细菌破裂，复制的噬菌体(子代)被释放至环境中以搜寻出其它细菌并感染它们。
此外，大多数噬菌体对于特定细菌是特异性的，因为特定噬菌体的复制仅在特定细菌中发生。因此，扩增的噬菌体的存在表明了所述噬菌体特异性的细菌的存在。此外，由于噬菌体可感染细菌并在短至1小时或更短时间内产生子代噬菌体，因此检测时间相较于可培养细胞的检测被显著缩短。
噬菌体是否已感染细菌可通过测定来确定，所述测定可鉴定噬菌体子代或噬菌体标志物、或在被亲代噬菌体或子代噬菌体感染后被检测的细菌标志物的存在。在一个实施方案中，测定不仅可鉴定噬菌体、噬菌体标志物和/或细菌标志物，而且还可确定噬菌体、噬菌体标志物或细菌标志物的量或浓度。
例如，在一个实施方案中，本发明提供了用于细菌病原体的快速检测和定量的超灵敏的基于噬菌体的测定。在一个实施方案中，本发明可包括用于检测细菌的方法，包括步骤：将至少一个细菌与样品中的其它组分分离，和利用噬菌体感染所述至少一个细菌。该方法还可包括除去大部分未被吸附的输入噬菌体的步骤。该方法还可包括步骤：温育感染的细胞以促进噬菌体复制和细胞裂来释放子代噬菌体，和检测子代噬菌体，或解离的子代噬菌体的组分，其中噬菌体或噬菌体组分(即，噬菌体标志物)的检测表明细菌存在于样品中。该方法还可包括在检测子代噬菌体之前除去剩余的输入噬菌体。
本文中描述的其它实施方案利用用可检测部分标记的子代噬菌体和/或细菌来帮助检测感染的细菌。例如，子代噬菌体可包含编码可检测生物分子例如萤光素酶蛋白的基因。在一个可选择的实施方案中，子代噬菌体可通过感染包含标志生物分子例如萤光素酶蛋白的指示菌(例如，可使用包含编码这样的标志生物分子的质粒的细菌)来定量。
指示菌用于测定(通过检测裂解的指示细胞的子代噬菌体)样品细胞的用途描述于图11中。因此，在该测定中，将用于感染目标细菌样品的亲代噬菌体与子代噬菌体分离，随后将子代噬菌体用于感染经工程化表达生物分子的指示菌，所述生物分子在细菌裂解后提供可检测信号。例如，可通过用编码萤光素酶蛋白的质粒转染来工程化细菌。
例如，在这些实验中，生长指示细胞401(例如，表达萤光素酶蛋白的细菌)的培养物。同时，将至少部分的包含待定量细菌的样品400进行旋转过滤，以除去培养基，添加适当复数的生物素化噬菌体406(例如，T4噬菌体)(可通过离心洗涤除去过量噬菌体406)，使其温育足够长的时间以感染细菌和随后裂解细菌以释放子代噬菌体。随后可例如通过离心收集所得的裂解物411，将包含子代噬菌体和生物素化的亲代噬菌体的滤液410转移至包含链霉抗生物素蛋白414的载体412(例如，链霉抗生物素蛋白柱)以将剩余的生物素化亲代噬菌体与未被生物素化的子代噬菌体416分离。随后，将产生可检测部分403的指示细胞401(即，表达萤光素酶蛋白的细菌)添加至子代噬菌体416，使子代噬菌体感染细菌。可将感染的指示细胞温育足以产生另外的噬菌体和裂解发生的时间。随后可使用照度计418或其它适当的检测法(例如，对于荧光蛋白为荧光计)定量从感染的指示菌释放的可检测部分403(例如，萤光素酶)的水平。
来自使用该测定的示例性实验的数据示于图12A-E中。
图12A-C显示来自图11中描述的方法的第一和第二半部分的单独数据。图12D和12E显示来自完整测定的数据。
图12A显示少至1-2个大肠杆菌细胞可通过噬斑测定提供可测量的子代噬菌体的噬斑形成单位(PFU)浓度(即，约300-460PFU)。y轴上靠近0PFU的点(达到约60PFU)可能归因于按随机机率无细胞沉积在过滤器上，因为每样品平均有一个细胞可能实际上具有0个细胞。
图12B显示：噬菌体测试显示对输入样品细胞的剂量依赖性反应，子代噬菌体产量增加，样品中的细胞越多。图12A和12B是针对从标准过夜集落形成单位(CFU)测定的细胞浓度绘制的曲线，从而以可在8小时内可视化的噬斑测定的固有更快速度显示相似的灵敏度。
图12C显示通过使用该方法的第二半部分，使用图11中概述的指数细胞的裂解进行的作为单个细胞(即，100个噬菌体)或27个细胞(即，2700个噬菌体)的等同物的噬菌体检测。这显示，当组合时，完全噬菌体测定应当能够检测每样品少至1个细胞。
图12D显示相较于标准CFU测定(虚线表示本底水平)，对于1、5和7个样品细胞(例如，大肠杆菌)的检测。图12E显示使用完全噬菌体测定(线表示本底水平)进行的每样品100至10,000个细菌细胞(用显微镜测定的)的成功检测。因此，对于无样品稀释物，显示了从1至10,000个细胞的灵敏度。除了这是一种快得多的测定(在大致3小时内进行的)以外，这还比标准过夜CFU测定更灵敏1或2个数量级，其中在Petri培养皿上超过500-700CFU不能被可靠地计数。
同样地，在一些实施方案中，测定可包括检测从指示菌释放的核糖体。在该形式中，该测定从而可利用由子代噬菌体提供的放大，以及由存在于单个细菌细胞中的大量核糖体提供的放大。
使用指示噬菌体的策略示于图13中。在该方法中，通过转基因将噬菌体衣壳蛋白与萤光素酶融合，以便链霉抗生物素蛋白柱上的与生物素化的亲代输入噬菌体分离的子代颗粒包含萤光素酶(或其它检测部分)并且可被直接定量。
如图13中举例说明的，在该方法中，将至少部分包含待定量的细菌502的样品500旋转过滤以除去培养基，添加适当量的具有与萤光素酶融合的衣壳蛋白(指示噬菌体)的生物素化噬菌体504(例如，T4噬菌体)(可通过离心洗涤除去过量噬菌体504)，使其余亲代噬菌体温育足够长的时间以感染细菌511和裂解所述细菌以释放子代噬菌体。随后可例如通过离心收集所得的裂解物510，将包含子代噬菌体和亲代噬菌体的滤液转移至包含链霉抗生物素蛋白414(例如，链霉抗生物素蛋白柱)的载体412以将生物素化的亲代噬菌体与未被生物素化的子代噬菌体516分离。随后可使用照度计418定量在指示子代噬菌体516上作为与Soc衣壳蛋白的融合蛋白存在和起作用的萤光素酶的水平。例如，每细胞约100-200个子代噬菌体(每一个噬菌体包含约900个萤光素酶-衣壳蛋白拷贝)产生约200,000个萤光素酶拷贝。
使用产生可溶性萤光素酶的指示噬菌体的策略示于图14中。在该方法中，噬菌体(例如，T4噬菌体)经工程化在复制期间表达可溶性萤光素酶而不是衣壳蛋白-萤光素酶融合蛋白。萤光素酶的表达由病毒衣壳蛋白启动子(例如，T4噬菌体中的Soc启动子)驱动，产生高表达。亲代噬菌体将不含萤光素酶，这样在测定中检测到的任何萤光素酶必须来自从细菌细胞释放的子代噬菌体的复制。因此，不需要分离出亲代噬菌体和子代噬菌体。
在这些实验中，将至少部分的包含待定量细菌602的样品600进行旋转过滤以除去培养基，添加适当量的表达萤光素酶而非Soc衣壳蛋白604的生物素化T4噬菌体。随后可以例如通过离心收集来自感染细菌611的滤液中的亲代604和子代噬菌体616，使用照度计418定量萤光素酶的水平。
因此，在某些实施方案中，本发明利用由感染因子提供的高度特异性和由感染因子的复制提供的放大作为工具来检测存在于样品中的低水平的微生物。例如，在一个实施方案中，本发明包括利用噬菌体的特异性从样品分离细菌和/或利用由子代噬菌体提供的放大来检测样品中的细菌的方法和***。例如，对来自每一个感染细胞的200个子代噬菌体的蛋白质组分(例如，大肠杆菌的裂解噬菌体T4具有约2500个蛋白质亚单位)的鉴定可实现比依赖于单个可培养细胞的分离和鉴定的方法更大的放大。
因此，本发明的实施方案包括使用超灵敏的基于噬菌体的测定快速检测和定量细菌病原体。例如，该方法可包括如下步骤：在细菌过滤器(例如，0.45μm的孔径)上从样品浓缩细菌；用生物素化的噬菌体感染细菌；通过过滤器洗涤未被吸附的输入噬菌体；温育感染的细胞以进行噬菌体复制和细胞裂解；和通过使用链霉抗生物素蛋白纯化(例如，旋转柱或其它固体载体)从裂解物除出剩余的输入生物素化噬菌体。
未被吸附的输入噬菌体的高效取出对于定量噬菌体子代可以是不可或缺的。不能除去或选择性灭活未被吸附的输入噬菌体可妨碍子代颗粒的定量，这在基于噬菌体的细菌检测法中一直是个主要障碍。样品中的子代噬菌体可通过涂板和噬菌体计数(PFU测定)，或通过使用指示细菌或指示噬菌体或本文中描述的高增益放大免疫测定来定量。子代噬菌体的存在表明特异于噬菌体的细菌细胞存在于样品中，子代噬菌体的不存在表明特异于噬菌体的细菌细胞不存在于样品中。
在另一个实施方案中，该方法可包括将样品与结合于固体载体的感染因子或其它结合剂接触(例如，结合于链霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠的生物素化噬菌体)，其中噬菌体特异于细菌细胞；在对于固定在固体载体上的噬菌体感染细菌细胞有效的条件下温育样品；分离感染的细胞-噬菌体-固体载体复合物；温育以进行噬菌体复制和细胞裂解，这导致不结合于固体载体的子代噬菌体的释放，从而可与用于感染细菌的输入固定化噬菌体相区别；除去附着了过量输入噬菌体的固体载体和噬菌体-细胞包膜复合物；将裂解物通过链霉抗生物素蛋白旋转柱以消除任何剩余的输入生物素化噬菌体；和通过本文中描述的方法定量子代噬菌体。再次地，子代噬菌体的存在表明特异于噬菌体的细菌细胞存在于样品中，子代噬菌体的不存在表明特异于噬菌体的细菌细胞不存在于样品中。
为了检测给定的细菌细胞，可选择能够感染细菌细胞，在细菌细胞内复制并裂解细菌细胞的噬菌体。对于任何给定的细菌细胞，可以例如从ATCC(约500种噬菌体)获得或通过从具有宿主细胞的天然来源分离来获得众多种噬菌体。噬菌体还应当显示对于细菌细胞的特异性。当噬菌体感染给定的细菌细胞并且不感染其它种或株的细菌细胞时，其对于该细菌细胞是特异性的。为了检测特定细菌细胞，还可优选地选择提供最佳或最大裂解量的噬菌体。
当噬菌体用于分离细菌和/或放大细菌的检测时，可由本发明检测的细菌细胞的范围仅受限于特异于该细菌细胞的噬菌体的可获得性，并且可由本领域技术人员来实现变大。例如，可从ATCC获得的噬菌体类型列表由它们以细菌和噬菌体的目录公布，并且可在地址为atcc.org的万维网上获得。其它这样的保藏库也在它们的的目录中公布了等同物的资料，这可用于鉴定用于本发明方法的可能的噬菌体试剂。
细菌的噬菌体感染、噬菌体在细菌中的繁殖或扩增以及细菌裂解的整个过程的总反应时间可花费数十分钟至数小时之间的任何时间，这取决于所述噬菌体和细菌以及环境条件。一旦细菌被裂解，子代噬菌体以及细菌的所有内容物被释放入环境。子代噬菌体可感染存在的的其它细菌，重复周期以产生更多噬菌体和更多细菌碎片。这样，噬菌体的数目将指数增加直至基本上不再有细菌被感染。
噬菌体除了能够在短时期内产生大量子代外，还具有显示特异性的能力。此外，噬菌体复制意味着活的宿主细胞。在最佳感染和宿主生长培养基条件下，给定的噬菌体/细菌组合产生恒定数目的噬菌体子代。一般而言，裂解性感染周期在约半小时至1小时内从单个感染的细胞产生100或更多个子代噬菌体颗粒。在测定内，可能必需包括在相同培养基中，利用已知数目的噬菌体感染已知数目的结合于基底的靶细胞进行的对照比较标准。
其它检测测定
从微生物分离的子代噬菌体和/或核糖体的存在还可通过本领域公知的其它方法来测定。例如，子代噬菌体可通过常规噬斑测定法或通过自动化技术，包括例如细胞分选术例如荧光激活细胞分选术(FACS)来检测。
子代噬菌体还可通过直接可视化来检测(Anderson等人,US2004/0137430,将其公开内容通过引用并入本文)。这样的直接可视化可利用光学或荧光显微镜检查。可使用的染色或酶包括但不限于荧光探针Alexa Fluor(可获自Life Technologies/MolecularProbes,Grand Island,NY)、Cy3、异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶或本领域已知的任何其它标记物。或者，可使用激光***来检测标记的噬菌体。其它检测法包括腺苷酸激酶的检测，参见Murphy等人.,pp.320-322ofBioluminescence and Chemiluminesence in Medicine and Disease,ClinicalChemistry and Microbiology，和使用基于二项式的细菌冰核化检测方法的检测，参见Irwin等人.,Journal of AOAC International 83:1087-95(2000)。或者，对于一些实施方案，子代噬菌体还可通过利用生物发光，检测克隆入噬菌体基组(如图12和13中概述的)的或整合在指示菌中(如图11中指示的)的萤光素酶基因的表达的方法来检测。参见，例如，Loessner等人,Applied and Environmental Microbiology 62(4):1133-1140(1996)。
同样地，由Life Technologies/Molecular Probes制造的量子点(在本文中也称为")纳米晶体可在本发明的方法中用于检测免疫复合物，例如用于检测从细菌细胞释放的核糖体蛋白或噬菌体蛋白。是显示许多优于常规荧光染料的有利特征的纳米级晶体。与荧光染料不同，纳米晶体光漂白慢得多并且荧光亮得多。由于不同尺寸的阵列是可获得的，因此纳米晶体覆盖更广的光谱(即，不同尺寸发射不同颜色)，从而允许用于检测相同样品中不同的生物体。纳米晶体是利用相同的均一缀合化学法(uniform conjugational chemistry)制造的，从而在多种测定环境下提供一致行为。目前，纳米晶体可以以若干种不同的缀合物形式获得，包括链霉抗生物素蛋白、蛋白A和生物素。在本发明的一些实施方案中，链霉抗生物素蛋白缀合物可用于通过-链霉抗生物素蛋白-生物素-抗体复合物使子代噬菌体或核糖体或它们的组成蛋白发荧光，或可将直接缀合于抗体。链霉抗生物素蛋白缀合物极其明亮，提供了优良的光稳定性，并且具有单个激发源。
样品
本发明的方法和***的每一个实施方案可允许快速检测和定量样品中的微生物。例如，最优选地可在约2小时或更短的时间内进行根据本发明的某些方法。
通过本发明的方法和***检测的微生物包括在商业、医学或兽医学上受到关注的病原体。这样的病原体包括革兰氏阴性细菌、***、支原体和病毒(仅病毒的蛋白质，因为病毒不具有核糖体)。可通过本发明的方法检测已鉴定到特异于特定微生物的结合剂的任何微生物。本领域技术人员将理解，除必需的特异性结合剂/微生物对的可获得性外，对于本方法的应用没有限制。
可通过本发明检测的细菌细胞包括但不限于为食品或水传播的病原体的细菌细胞。可通过本发明检测的细菌细胞包括但不限于沙门菌属的所有种、大肠杆菌的所有种，包括但不限于大肠杆菌O157/H7，李斯特菌属(Listeria)的所有种，包括但不限于单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)以及弯曲杆菌属(Campylobacter)的所有种：可通过本发明检测的细菌细胞包括但不限于为具有医学或兽医学重要性的病原体的细菌细胞。这样的病原体包括但不限于芽孢杆菌属某些种(Bacillus spp.)、百日咳博特氏菌(Bordetellapertussis)、空肠弯曲菌(Camplyobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、产气荚膜杆菌(Clostridium perfringens)、肠杆菌属某些种(Enterobacter spp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和链球菌属某些种(Streptococcus spp)。
样品可以是环境或食品或水样品以及医学或兽医学样品。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭子。样品可包括环境材料，例如水样品，或来自空气样品的过滤器或来自旋风集成器的气溶胶样品。样品可以是肉、家禽、加工食品、奶、乳酪或其它乳制品。医学或兽医学样品包括但不限于血液、痰、脑脊髓液以及粪便样品和不同类型的拭子。
样品可直接用于本发明的检测方法，无需制备或稀释。例如，可直接测定液体样品，包括但不限于奶和果汁。可将样品稀释于或悬浮于溶液中，所述溶液可包括但不限于缓冲溶液或细菌培养基。可通过在液体中切碎、混合或浸离固体而将作为固体或半固体的样品悬浮于液体中。应当将样品保持在促进噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH范围内。样品还应当包含适当浓度的二价和单价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和K+。优选地，在维持样品中包含的任何病原体细胞的活力的温度下维持样品。
优选地在整个检测测定中，将样品维持在保持存在于样品中的任何病原体细胞的活力的温度下。在其中噬菌体附着于细菌细胞的步骤中，优选在促进噬菌体附着的温度下维持样品。在其中噬菌体在感染的细菌细胞内复制或裂解这样的感染细胞的步骤中，优选在促进噬菌体复制和宿主裂解的温度下维持样品。这样的温度为至少约25摄氏度(℃)，更优选不超过约45摄氏度，最优选约37摄氏度。还优选地，在噬菌体附着、复制和细胞裂解过程中，将样品经历温和混合或摇动。在其它实施方案中，可在感染后抑制噬菌体装配，以便噬菌体蛋白的亚单位积累而不被装配，从而可提供子代噬菌体的额外放大。
测定可包括各种适当的对照样品。例如，可将不包含噬菌体的对照样品或包含噬菌体但无细菌的对照样品作为本底水平的对照来测定。
基底
待用于本方法的基底包括但不限于平面聚苯乙烯或磁珠(Spherotech,Libertyville,IL；Life Technologies/Invitrogen,Grand Island,NY；Polyscience,Niles,FL；Thermo Scientific Pierce,Waltham MA；EMD Millipore,Billerica,MA；NewEngland Biolabs,Ipswich,MA)，和平面或磁性二氧化硅珠粒(AmsBio,Lake Forest,CA)、胶乳涂层、膜滤器、纤维滤器、不溶解纤维(free fiber)或多孔固体基底。使用磁珠的方法可见于例如Dynabeads Protein G Prod.No.10003D的包装说明书中，Kala等人,Analytical Biochemistry 254:263-266(1997)和Dutton,Genetic Engineering News,第22卷(13),July 2002中。
一系列各种尺寸的颗粒，特别地磁性和聚苯乙烯珠粒是商购可得的。对于某些实施方案，优选的一组颗粒具有约1微米(即，1微米)的平均粒径。对于某些实施方案，特别地在凝集测定中，优选的一组颗粒具有不超过20微米(即，微米)的平均粒径(即，颗粒的最大尺度)。
对于某些实施方案，例如微生物、核糖体、噬菌体或它们的组分的回收，颗粒(例如，珠粒)浓度优选为至少108/毫升。对于某些实施方案，颗粒(例如，珠粒)浓度优选不大于109/毫升。
对于某些实施方案，例如由核糖体、噬菌体或它们的组分进行的颗粒凝集，颗粒(例如，珠粒)的数目优选为10至20μl中至少300个颗粒和不超过3,000个颗粒(例如，珠粒)。在牵涉附着于珠粒的微生物或病毒的可视化的实施方案中，该颗粒数目(例如，珠粒)允许在二维阵列中进行光学显微镜评价而无堆叠。
示例性商购可得的平面或磁珠包括利用蛋白G、蛋白A、蛋白A/G、环氧树脂或链霉抗生物素蛋白(全都可从Invitrogen,Grand Island,NY或从Spherotech,Libertyville,I11获得)涂覆的聚苯乙烯珠粒。MagSi，具有相同涂层的磁性二氧化硅珠粒，可获自AmsBio,Lake Forest,CA。
用于微生物检测的***
本发明的实施方案还包括用于进行本发明的方法的***(例如，试剂盒)。
例如，在一个实施方案中，本发明包括包含用于检测目标微生物的组分的试剂盒，所述组分包括：用于将微生物与样品中的其它组分分离的组分；用于裂解微生物以释放存在于微生物中的核糖体的组分；和用于检测核糖体或核糖体的组分的组分，其中核糖体或核糖体的组分的检测表明所述微生物存在于样品中。
可使用本发明的试剂盒检测多种微生物。在一个实施方案中，微生物包括细菌或真菌或酵母中的至少一种。
在一个实施方案中，分离微生物的组分包含识别微生物并与其结合的结合剂。可将结合剂结合于固体载体。在一个实施方案中，结合剂可以是抗体。或者，当微生物为细菌时，结合剂可以为特异于所述细菌的噬菌体。
在一个实施方案中，试剂盒可包含识别核糖体的一抗，和至少一种识别一抗的二抗。或者，试剂盒可包含识别核糖体的一抗，和至少一种识别核糖体的第二一抗。在某些实施方案中，将第二一抗结合于固体载体。在其它实施方案中，固体载体包含多种第二一抗。
在其它实施方案中，可使用侧流测定检测核糖体。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包含含有抗核糖体抗体的固体载体。在一个实施方案中，试剂盒可包含至少一种含有另外的抗核糖体抗体的炭黑纳米条形码。
在另一个实施方案中，本发明包括试剂盒，所述试剂盒包含用于检测目标微生物的组分，其包括：用于将至少一种微生物与样品中的其它组分分离的组分；用于利用多种亲代感染因子感染所述至少一种微生物的组分；用于裂解所述至少一种感染的微生物以释放存在于该微生物中的子代感染因子的组分；和用于检测子代感染因子或子代感染因子的组分的组分，其中感染因子或感染因子的组分的检测表明所述微生物存在于样品中。在一个实施方案中，微生物是细菌，并且感染因子是噬菌体。
试剂盒可包含多种用于检测子代感染因子的组分。例如，在一个实施方案中，子代感染因子(例如，噬菌体)可包含指示部分。在一个实施方案中，子代感染因子中的指示部分可包含融合于结构蛋白(例如，噬菌体衣壳蛋白)的萤光素酶。在实施方案中，子代感染因子(例如，噬菌体)中的指示部分可以是在复制过程中表达的可检测部分，例如可溶性萤光素酶蛋白。在一个可选择的实施方案中，试剂盒可包括指示微生物(例如细菌)，其包含当被子代感染因子感染时在指示微生物裂解后释放的蛋白质。在一个实施方案中，从指示微生物释放的蛋白质可包含可检测部分。例如，在一个实施方案中，释放的蛋白质是萤光素酶蛋白。在一个可选择的实施方案中，试剂盒可包含组分，以便来自感染的样品细胞和/或指示细胞的子代感染因子可利用炭黑纳米条形码通过侧流测定来检测。或者，从指示微生物释放的蛋白可包括核糖体。这样，试剂盒组合了通过噬菌体感染提供的放大与通过核糖体检测提供的放大。
用于从样品分离微生物的试剂盒
本发明的试剂盒可包含用于从样品分离细菌的试剂。
例如，在某些实施方案中，试剂盒可包含特异于目标微生物的抗体。在某些实施方案中，抗体可包括可被第二结合剂识别的第一结合剂，以便可通过结合剂的相互作用分离微生物。例如，在某些实施方案中，试剂盒可包括识别目标微生物的生物素化抗体和链霉抗生物素蛋白涂覆的珠粒。
在可选择的实施方案中，试剂盒可包含可连接于固定的结合剂(例如但不限于链霉抗生物素蛋白、生物素、特异性结合噬菌体特或噬菌体亚结构例如头部的抗体)的特定噬菌体。在一个实施方案中，连接于噬菌体的试剂用于将噬菌体连接于固体载体。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包含特异于目标细菌的生物素化噬菌体。这样，生物素化的噬菌体可结合于链霉抗生物素蛋白磁性珠粒。在可选择的实施方案中，可将噬菌体、噬菌体、分枝杆菌噬菌体(例如对于TB和paraTB)、噬真菌体(例如对于真菌)、支原体噬菌体以及可侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其它微观活生物体的任何其它病毒偶联于固体载体，以用于分离目标微生物。作为实例，详尽研究的大肠杆菌的噬菌体包括Tl、T2、T3、T4、T5、T7和λ；可在ATCC保藏库中获得的其它大肠杆菌噬菌体包括phiX174、S 13、Ox6、MS2、phiVl、fd、PR772和ZIK1。
用于微生物的基于核糖体的检测的试剂盒
在某些实施方案中，试剂盒可包含用于检测来自目标微生物的核糖体和/或核糖体蛋白的试剂。例如，在一个实施方案中，试剂盒可包含在兔、小鼠、豚鼠等中例如针对大肠杆菌或沙门菌属某些种或哺乳动物细胞的纯化核糖体产生的多克隆抗血清。
用于检测核糖体蛋白的LFA试剂盒可包括在测试线和对照线上含有适当抗体的样品测试条。这样的试剂盒还可包含结合于特异于目标分析物的抗体的炭黑纳米条形码。试剂盒还可包括电泳缓冲液和/或稀释样品所需的任何试剂或其它试剂。另外的试剂可包括用作对照的材料和用于进一步信号放大的试剂。例如，试剂盒可包括第二CBNS-Ab(即，识别针对目标分析物的一抗的二抗)。试剂盒还包括酶促检测试剂例如辣根过氧化物酶(HRP)和/或HRP底物。本发明的试剂盒中还可包括用于运行测定的适当尺寸的贮液池。
用于微生物的基于噬菌体的检测的试剂盒
对于基于噬菌体的检测技术，任何商购可得的噬菌体可用于产生用于本发明的试剂盒的试剂。例如，ATCC在其细菌和噬菌体目录中公布了一系列可从ATCC获得的噬菌体类型，并且可在地址为atcc.org的万维网上或其它已知的保藏库获得。
可通过许多本领域已知的方法之一将噬菌体固定在基底上。例如，特异于噬菌体的抗体可用于将噬菌体连接于基底。蛋白A、蛋白G或配体例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和生物素可用于将抗体连接于基底。共价连接法还可用于将噬菌体连接于基底。一般而言，不应当使用对噬菌体尾部蛋白质具有特异性的抗体，因为这样的抗体对尾部蛋白质的结合会干扰噬菌体颗粒结合宿主细菌细胞的能力。
本发明的试剂盒可包含含有检测部分的细菌。这样的细菌称为"指示细菌"，其可由也对与待检测样品细菌相同的噬菌体易感的细菌菌株组成。例如，野生型大肠杆菌菌株B(ATCC)可被修饰来从DNA质粒表达萤光素酶，或一些其它检测部分。质粒可被从头构建或基于商购可得的构建体例如萤光素酶质粒pGL.4.10(萤火虫萤光素酶)(Promega,MadisonWI)和pGL.4.70(海肾萤光素酶)来构建。可包括驱动检测部分(例如萤光素酶)的表达的组成型或病毒启动子的添加，连同本领域已知的其它共同DNA序列(抗生素抗性基因和复制起点)。
此外和/或可选择地，本发明的试剂盒可包含"指示噬菌体"。指示噬菌体可由噬菌体组成，它们的基因组经修饰而包含用于表达共同检测部分例如萤光素酶、绿色荧光蛋白或辣根过氧化物酶的基因。这些基因可被整合入融合蛋白中的高拷贝数蛋白，例如T4中的Soc-萤光素酶融合蛋白，或作为未被整合入噬菌体结构、但在噬菌体感染细菌后表达的可溶性蛋白。
试剂盒还可包含用于浓缩待被噬菌体感染的细菌和/或为细菌提供底物、随后洗涤的过滤器，例如0.45μm旋转过滤器(Millipore,Billerica,MA)。试剂盒还可包含链霉抗生物素蛋白亲和柱，以用于分离生物素化的亲代噬菌体与子代噬菌体(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)。试剂盒还可包含与检测部分例如D-萤光素或萤光素酶测定基底(Promega,Madison,WI)(对于萤火虫萤光素酶)或腔肠荧光素(对于海肾萤光素酶)一起使用的底物。
同样地，用于检测噬菌体蛋白的LFA试剂盒可包括在测试和对照线上包含适当抗体的样品测试条。这样的试剂盒还可包含结合于特异于目标分析物的抗体的炭黑纳米条形码。试剂盒还可包含电泳缓冲液和/或稀释样品所需的任何试剂或其它试剂。另外的试剂可包括用作对照的材料和用于进一步信号放大的试剂。例如，试剂盒可包括第二CBNS-Ab(即，识别针对目标分析物的一抗的二抗)。试剂盒还可包括酶促检测试剂例如辣根过氧化物酶(HRP)和/或HRP底物。用于运行测定的适当尺寸的贮液池也可被包含在本发明的试剂盒中。
免疫测定试剂盒
在可选择的实施方案中，试剂盒可包含用于基于珠粒的免疫测定的试剂。
在一个实施方案中，本发明可包括用于测定目标分析物的试剂盒，其包含检测载体，所述检测载体包含含有众多可识别目标分析物并与其结合的结合剂分子的固体载体。在一个实施方案中，试剂盒可包含捕获载体，所述捕获载体包含至少一种识别目标分析物并与其结合的捕获载体结合剂。在一些实施方案中，试剂盒还可包含可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子并与其结合的结合剂。在一个实施方案中，可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子并与其结合的结合剂是可溶性结合剂。
检测和/或捕获载体可包括多种形式。在一个实施方案中，捕获固体载体可以是测定孔(即，例如微量滴定板)。或者，捕获固体载体可以是阵列上的位点，或可移动载体例如珠粒。在一个实施方案中，检测载体是可移动载体例如珠粒。
众多种结合剂可用于本发明的试剂盒。例如，众多种连接于检测载体的结合剂可以是识别目标分析物的抗体或抗体片段。此外和/或可选择地，连接于捕获载体的结合剂可以是识别目标分析物的抗体或抗体片段。此外和/或另外地，可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子并与其结合的结合剂可以是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子并与其结合的结合剂可以是不识别用于将目标分析物结合于捕获固体载体的捕获结合剂。或者，捕获或检测载体的任一种上的结合剂或可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子并与其结合的结合剂可包括结合非蛋白质靶的蛋白(即，例如特异性结合目标小分子分析物的蛋白，或结合蛋白的受体)。
检测载体可包含众多可检测部分。此外和/或可选择地，可特异性识别检测载体上的众多结合剂分子并与其结合的结合剂可包含可检测部分。
包含众多识别目标分析物的结合剂的检测载体的使用提供了信号的放大。在可选择的实施方案中，检测载体包含超过1,000个，或超过10,000个，或超过100,000个，或超过500,000个，或超过1,000,000个特异于目标分析物的结合剂。因此，在可选择的实施方案中，本发明的试剂盒提供了为在标准非放大免疫测定(所述测定不包括包含众多检测结合剂的检测载体)中看到的信号的1,000至1,000,000,000倍，或1,000至100,000,000倍，或5,000至10,000,000倍，或10,000至1,000,000倍，或10,000倍变化至500,000倍，或50,000至500,000倍的放大。或者可实现这些范围内的范围。
因此，在某些实施方案中，试剂盒可包含用于基于珠粒的免疫测定的试剂。因此，在一个实施方案中，检测载体可包含利用识别目标蛋白的抗体涂覆的珠粒。在某些实施方案中，珠粒可以是利用蛋白G、蛋白A或蛋白A/G涂覆的聚苯乙烯珠粒，具有各种尺寸的所述珠粒是商购可得的(例如，Invitrogen,Carlsbad CA)。可以是有用的其它珠粒包括利用这些相同蛋白涂覆的磁性二氧化硅珠粒(来自AmsBio,Lake Forest,CA的MagSi珠粒)。
因此，在一个实施方案中，试剂盒可包含利用识别核糖体蛋白的抗体涂覆的珠粒。或者，试剂盒可包含利用识别噬菌体蛋白的抗体涂覆的珠粒。珠粒可以是聚苯乙烯、二氧化硅、玻璃或其它材料、平面或经衍生用于连接特定化学基团。
用于本发明的试剂盒的基底包括但不限于聚苯乙烯珠粒(Spherotech,Libertyville,I11.)、磁珠(Invitrogen；AmsBio)、胶乳涂层、膜滤器、纤维滤器、不溶解纤维或多孔固体载体。
使用磁珠的方法可见于例如Dynabeads Protein G Prod.No.10003D的包装说明书中，Kala等人,Analytical Biochemistry254:263-266(1997)和Dutton,GeneticEngineering News,第22卷,Number 13,July 2002中。
宽范围尺寸的颗粒，特别地磁性和聚苯乙烯珠粒是商购可得的。对于某些实施方案，优选的一组颗粒具有约1微米(即，微米)的平均粒径(即，颗粒的最大尺度)。对于某些实施方案，优选的一组颗粒具有不超过10微米(即，微米)的平均粒径(即，颗粒的最大尺度)。示例性商购可得的珠粒是蛋白G-、蛋白A-和蛋白A/G-涂覆的聚苯乙烯珠粒和链霉抗生物素蛋白涂覆的聚苯乙烯珠粒，其可从Invitrogen,Carlsbad,CA或Spherotech,Libertyville,I11获得。聚苯乙烯和磁性珠粒的其它提供商包括Thermo Scientific Pierce,Millipore,Polyscience和New England Biolabs。AmsBio,Lake Forest,IL是磁性二氧化硅珠粒的提供商，具有所有上文中给定的蛋白质涂层的所述磁性二氧化硅珠粒都是可获得的。LifeTechnologies/Invitrogen还提供共价地结合抗体的环氧树脂表面磁珠。
珠粒上抗体分子的数目可变化。在可选择的实施方案中，对于直径约15μm的珠粒可存在约10,000至10,000,000个或约50,000至1,000,000个，或约100,000至500,000个抗体。对于不同尺寸的珠粒，可使用对应的表面覆盖度。
在某些实施方案中，珠粒足够大从而可将众多抗核糖体抗体连接于珠粒。例如，珠粒的尺寸范围在直径上可为约0.1至50，或0.2至40，或0.5至30，或1至20，或1至15或约1至3μm。为了将目标抗体复合于珠粒，可用蛋白G、蛋白A、蛋白A/G或复合于目标抗体的另一种蛋白预涂覆珠粒。这样的珠粒通常是商购可得的。用于基于珠粒的免疫测定的试剂盒还可包含用于目标蛋白的另外的一抗，其中这样的抗体来自第二物种。这些抗体用于本文中描述的夹心测定中，因为它们结合二抗-报道分子复合物，并且第二复合物不结合固体表面上的第一物种抗体(这可导致假阳性反应)。然而，第二物种抗体还可用于涂覆固体表面和/或微量滴定孔，如本文中描述的。
试剂盒还可包含可用于检测一抗的二抗，其中这样的抗体可以是来自第二物种的抗球蛋白抗体。这些抗体可用可检测标志物或可与可检测标志物复合的结合剂来标记。例如，在某些实施方案中，本发明的试剂盒可包含结合于荧光基团的二抗。在一个实施方案中，荧光基团可包含。例如，在一个实施方案中，可将链霉抗生物素蛋白-结合于识别例如抗核糖体一抗的生物素化二抗。
实施例
本发明的实施方案还可通过下列非限定性实例来表征。
实施例1：纯化的核糖体分离
大肠杆菌获自ATCC(#11303)并于37℃在LB培养基(Difco:10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl/L)中培养过夜。将菌落置于5mL LB培养基中，于37℃温育过夜。第二天，将培养物以1:100稀释于新鲜LB中，使细胞生长至Klett 68的浓度(600nm处的OD＝0.8)(Summerson光电比色计上的20个Klett单位＝分光光度计上540nm处的0.1OD),所述浓度对应于生长约3.5小时后约4x 108个细胞/mL。随后将细胞在Beckman Coulter XL 80K Type19转子(Cat.No.325632)中以5,000rpm沉淀15分钟。将沉淀重悬浮于l mL TMS(50mM Tris-HCl,pH 7.8,l0mMMgCl2,l00mM NaCl)和1/10体积的10X Bugbuster(Novagen,PN70921-3)、0.5mg/ml溶菌酶(Sigma L6876)和10μg/mL高质量DNA酶I(不含RNA酶)(USB 14365)中。将裂解物在Beckman Coulter Allegra64R F2402转子中于1.5mL微量离心管中以16,000rpm澄清10min。将上清液转移至新微量离心管，重复澄清步骤。在Beckman Coulter SW40Ti转子中，将核糖体于TMS中在4℃以35,000rpm离心3小时进行沉淀，将沉淀重悬浮于0.5ml TMS。将悬浮液澄清，随后加载至TMS(BioComp GradientMaster,BioComp,New Brunswick,CA)中的10-30％(w/v)蔗糖梯度上，在Beckman Coulter SW40Ti转子中于4℃以35,000rpm离心3小时。通过在3mL注射器上使用21G x 1"针取出所得的核糖体条带。如上所述，将核糖体再次沉淀，随后将沉淀重悬浮于PBS或TMS中。通过SDS-PAGE表征核糖体蛋白，利用EM负染色确认颗粒的纯度。
实施例2：在兔中进行多克隆抗体的产生
将如实施例1中所述分离的纯化的核糖体与适当的佐剂组合。在幼兔(2.5-3.0kg；10-16周龄)的皮肤下注射核糖体和佐剂。利用19规针从兔耳中央动脉收集血液，让血液凝固并在37℃收缩过夜。随后将凝固的血液冷藏24小时，然后倾倒出血清，通过以2500rpm离心20分钟澄清血清。按照下列方案注射兔子和放血：
第-4天：放血前
第0天：使用CFA(完全弗氏佐剂)通过真皮内(ID)途径免疫
第7天：使用IFA(不完全弗氏佐剂)通过真皮内(ID)途径加强注射
第14天：使用IFA通过皮下(SC)途径加强注射
第28天：使用IFA通过皮下(SC)途径加强注射
第38天：测试放血
第40天：将免疫前放血和测试放血运至NGI
第45天：最终放血(批准的)
第47天：将最终放血运至NGI
第49天：项目结束(批准的)
实施例3：使用细胞特异性抗体和磁性微粒从溶液捕获细菌
为了证明从溶液中捕获完整的活细菌细胞，产生针对不同细菌种(例如，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)的表面表位的兔多克隆抗体。
将大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的培养物生长在液体培养基中，随后收获，用磷酸盐缓冲液(1.1mM KH2P04,5.6mM Na2HPO4,154mM NaCl,pH 7.4)洗涤。随后将洗涤的细胞稀释至5-20个细胞/ml的浓度。将由Rockland Immunochemicals Inc.,Gilbertsville,PA产生的约250ng生物素化多克隆抗大肠杆菌抗体(等同于约1x 1012个抗体分子)添加至细胞悬浮液，使其温育45min。还进行其中不将抗体添加至细胞悬浮液的对照实验。
抗体温育后，将4x 108个链霉抗生物素蛋白涂覆的磁性微粒(Solulink,Inc.,SanDiego,CA)添加至混合物，并再温育15min。随后使用磁力座收集细胞-抗体-珠粒复合物，除去未结合的级分(上清液)，用磷酸盐缓冲液(1.1mM KH2PO4,5.6mM Na2HPO4,154mM NaCl,pH7.4)轻轻地洗涤珠粒。随后将上清液("sup")和珠粒("bead")级分涂布在Luria-Bertani(LB)琼脂板上，在37℃温育过夜。在过夜培养后，观察板的菌落形成。图2描述了示例性实验；菌落计数示于每块板的左/右下方。
图3A和3B显示使用生物素化的抗核糖体IgG和连接于链霉抗生物素蛋白的磁珠进行的核糖体蛋白捕获。图3A显示抗核糖体抗体和链霉抗生物素蛋白珠粒是必需的，并且能够定量地从溶液捕获核糖体。在图3A显示的实验中，用不同量的生物素化兔抗核糖体IgG(由Rockland Immunochemicals Inc.,Gilbertsville,PA产生的)温育0.6M硫氰酸胍/磷酸盐缓冲盐水和Tween-20(1.1mM KH2PO4,5.6mM Na2HPO4,154mM NaCl,0.01％Tween-20,pH7.4)中的来自100,000个细胞的裂解物1小时。还包括一个无裂解物的对照。随后，将3.3x107至1x 108个链霉抗生物素蛋白(SA)磁性Dynabead(Life Technologies,Carlsbad CA)添加至每一个反应，以便抗体对珠粒的比率是恒定的，为6000个抗体分子/珠粒颗粒。将约5x107个SA珠粒添加至"无抗体"对照。
使用磁力座收集珠粒，随后通过添加含有β-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠样品缓冲液并且煮沸来使其变性。随后使用磁力座收集洗脱液，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后经历使用兔抗核糖体抗体和抗-兔辣根过氧化物酶(HRP)二抗的Western印迹分析。可看到当未添加抗核糖体抗体时，未检测到核糖体蛋白。还可看到，50ng抗体能够结合来自100,000个细胞的所有核糖体蛋白。
在图3A中，Ponceau行提供内部对照以显示样品被加载在所有孔中，因为Ponceau是用于显现存在于Western印迹膜上的蛋白质的总蛋白染色。SA行显示在变性/煮沸步骤中从SA Dynabead取出的链霉抗生物素蛋白。可看到大致等量的珠粒被用于每一个核糖体捕获步骤中。
图3B显示生物素、抗核糖体抗体和链霉抗生物素蛋白珠粒的添加足以捕获存在于溶液中的所有核糖体蛋白。在本实验中，用或不用200ng生物素化的兔抗核糖体IgG温育0.6M硫氰酸胍/磷酸盐缓冲盐水和Tween-20中的来自270,000个细胞的裂解物。随后，添加1x 108个SA磁珠以捕获Ab-核糖体蛋白复合物(每珠粒8000个抗体分子)。从珠粒级分取出未结合的上清液，使用200ng生物素、抗体和1x 108个SA磁性珠粒进行再捕获("recapt")。使收集的珠粒变性，随后经历使用兔抗核糖体抗体和抗-兔辣根过氧化物酶(HRP)二抗的Western印迹分析。在利用其中核糖体蛋白先前已被捕获的裂解物的再捕获实验中核糖体蛋白的不存在表明第一捕获步骤足以捕获所有核糖体蛋白。
实施例4：使用珠粒放大的不同形式捕获核糖体
进行实验以比较图8、图框A-C和F(即，方法la、lb、2、3和6)中描述的各种测定形式。基本上，通过在6M(10,000个细胞/μl)硫氰酸胍中裂解细菌细胞来制备大肠杆菌裂解物(500,000个细胞)。随后通过稀释入磷酸盐缓冲液(例如，90,000个细胞至450μl中的稀释)将硫氰酸胍浓度降至0.12或0.6M。随后使用图8中显示的核糖体捕获方法之一捕获核糖体(表1)。
*实验1和2
使用图框8F中描述的方法进行另外的实验。该方法利用珠粒-Ab2(羧基珠粒和兔抗核糖体抗体)至裂解物的添加。这允许核糖体结合珠粒，与其中将'捕获'抗体固定在表面上的常规夹心ELISA相似。随后将Abl-生物素(豚鼠)直接添加至混合物而无任何洗涤步骤。使用链霉抗生物素蛋白(SA)珠粒捕获珠粒-Ab2-核糖体-Abl复合物，使用针对Ab2的二抗检测所述复合物。发现当使用兔Ab-羧基珠粒(Ab2-珠粒)和生物素、豚鼠抗体(Abl)时，该方法有效。
因此，在本实验中，用约1.3x 108个羧基珠粒(0.1μm)和兔抗核糖体抗体(抗-riboAb)温育来自2,500、5,000、10,000,或20,000个细胞的裂解物。随后添加10ng(4x 1010个IgG分子)生物素化的豚鼠抗-ribo抗体，进行进一步温育。利用约4x 107个CI SA Dynabead捕获珠粒-Ab-ribo蛋白-Ab复合物。利用10ng利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-兔抗体进行检测。将1/5的样品加载至微量滴定板以在照度计中利用Sirius HRP底物进行检测。可看到少至500个细胞的信号被检测到。
实施例5：侧流测定
与Medtox(A LabCorp公司)合作开发LFA测试条。该测试条由硝酸纤维素膜和与硝酸纤维素膜接触的吸收垫组成。硝酸纤维素膜包含具有兔抗核糖体抗体的测试线和具有山羊抗-兔抗体的对照线。测试条的方案示于图10A中。
通过将样品(0-10ng核糖体蛋白)施用至测试条的底部("点样区")并让样品通过毛细管作用流过硝酸纤维素膜表面来进行测定。存在于样品中的核糖体结合测试线上的固定的抗核糖体抗体，而样品中的材料的其余部分继续进入吸收垫。随后用利用兔抗核糖体抗体(CBNS-Ab)预涂覆的炭黑纳米条形码(CBNS)温育测试条，使CBNS-Ab复合物通过毛细管作用以与样品相同的方向移动穿过硝酸纤维素表面。基本上，通过用包含5-25mM NaCl的CBNS溶液温育抗体溶液来进行至CBNS上的抗体涂覆盖。抗体对CBNS的结合是非特异性的。在1小时的温育后，洗涤CBNS-Ab复合物，用牛血清白蛋白进行钝化。与结合于测试线的核糖体相互作用的CBNS-Ab复合物导致灰色至黑色的线，而任何未结合的CBNS-Ab继续向上通过测试条，并结合于抗-兔对照线，这在测试条的该位置上导致灰色/黑色线。如果样品不包含核糖体蛋白，则在测试线上无线形成，但将在对照线上形成线。
示例性实验示于图10C和10D。图框C中显示的实验显示单个兔抗核糖体抗体CBNS用于检测核糖体的用途。在本实验中，将纯化的大肠杆菌核糖体(10或100ng)于LFA电泳缓冲液(25mM三(羟甲基)甲基甘氨酸,5％麦芽糖醇,2％糖精钠,0.025％聚乙烯吡咯烷酮,0.05％聚乙烯醇),0.5％Tetronic 1307,0.5％Tetronic 904和0.005％叠氮化钠,pH8.0)中在LFA试纸条上运行。当所有样品已进入测试条后，将具有兔抗核糖体抗体的CBNS加载至测试条上。随后对测试条成像，使用ImageJ软件(NIH)定量线强度。
图框D中显示的实验使用两种不同的CBNS复合物。一种具有生物素抗核糖体抗体(CBNS-Ab)，第二复合物具有链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(CBNS-SA-HRP)。在本实验中，将纯化的大肠杆菌核糖体(5ng)于LFA电泳缓冲液中在LFA测试条上运行。当所有样品已进入测试条后，将具有生物素化的兔抗核糖体抗体的CBNS加载至测试条(CNBS-Ab(图10D上部4个测试条)上。对于一半的样品，将具有SA-HRP的第二CBNS加载至测试条。该第二CBNS上的SA部分能够结合存在于第一CBNS上的兔抗体上的生物素部分。这导致增加量的总CBNS位于测试线上。随后，将HRP底物(TMB)直接添加至硝酸纤维素表面，在室温温育5分钟，以允许有色TMB产物(图10D，下方4个测试条；+TMB(HRP底物)显色。随后对测试条成像，使用ImageJ软件(NIH)定量线强度。
实施例6:生物素化的T4噬菌体的制备
将约2.4x 1010个噬斑形成单位(PFU)的T4噬菌体稀释入50μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)。如果噬菌体存在于含Tris的缓冲液例如TMS中，则必需例如使用Zeba旋转柱(ThermoScientific Pierce,Waltham,MA)进行缓冲液转移。
为了制备生物素试剂，将4mg的Pierce NHS-生物素试剂添加至1ml水(4μg/μl)。随后将试剂进一步稀释至49.4ng/μl的浓度(例如，添加2μl至160.1μl PBS)。随后将约500ng生物素试剂(10μl)添加至装有约2.4x 1010PFU噬菌体的管中，让其在4摄氏度(℃)温育2小时。随后使用Zeba柱对生物素化的噬菌体进行脱盐。为了使噬菌体脱盐，用300μl PBS以1500g洗涤柱子3次，每次1分钟。随后，将PBS添加至噬菌体以使总体积达到100μl，将噬菌体(100μl)添加至Zeba柱，以1500g离心2min。随后使用噬斑测定滴定噬菌体，保存于4℃。
实施例7：基于噬菌体的细胞捕获和使用指示噬菌体或指示细菌的检测
a.指示细菌
指示细菌用于测定子代噬菌体的用途描述于图11中。因此，在该测定中，将用于感染目标细菌样品的亲代噬菌体与子代噬菌体分离，随事将子代噬菌体用于感染经工程化表达生物分子的指示细菌，所述生物分子在细菌裂解后提供可检测的信号。例如，细菌可被工程化来表达萤光素酶蛋白。
在这些实验中，使用最初获自ATCC的野生型大肠杆菌产生指示细胞，用萤光素酶质粒进行转化。萤光素酶质粒基于pGL.4.10(萤火虫荧光素酶)和pGL.470(海肾萤光素酶)(Promega,Madison,WI)。对用于指示细菌的质粒的修饰包括将组成型细菌启动子(σ70)***在萤光素酶基因的上游。在220rpm摇动的条件下，将该培养物(例如，表达萤光素酶蛋白的细菌)在37℃于具有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中进行温育。同时，将约500μl的样品细菌(即，待定量的细菌)于2ml圆底收集管中加载至MilliporeUltrafree MC-HV旋转过滤器上，以>300g离心1分钟(在微量离心机中达到8000rpm)，以除去培养基，添加LB液体培养基中的40μl生物素化T4噬菌体(即，约2.7x106PFU)。随后通过施用约500μl LB液体培养基，使用2ml收集管以>300g离心1分钟来洗涤感染的细菌4次。将包含感染细菌的过滤器从2ml收集管转移至新的1.5ml管，在添加约200μl LB液体培养基后，将感染细菌在37℃温育1小时。随后通过离心(8000rpm，进行2分钟)收集感染的细菌，将包含子代噬菌体和任何剩余的生物素化亲代噬菌体的滤液转移至链霉抗生物素蛋白柱(例如，GEHealthcareStreptavidin HP SpinTrapcolumns)。随后使柱子在室温翻滚旋转温育20分钟。在该点上，将来自包含子代噬菌体的柱子的洗脱物转移至新的管中，通过以150g离心1分钟收集子代噬菌体。通过常规噬斑测定(PFU测定)从该裂解物检测子代噬菌体，或将子代噬菌体经历利用指示细胞的检测，如下文中描述的。
随后将指示细胞(即，表达萤光素酶的细菌)于LB液体培养基中稀释至约106个细胞/ml，将10μl指示细胞添加至子代噬菌体管。通过吸附离心(例如，8000rpm，进行30分钟)使噬菌体感染细菌。随后重悬浮感染的指示细胞，在220rpm摇动的条件下于37℃温育1小时。在该点上，使用过滤/离心(8,000rpm，进行2分钟)分离感染的指示细胞，将10μl上清液转移至96孔板的孔中。随后使用照度计和利用50μ1萤光素酶测定底物的Promega萤光素酶测定定量萤光素酶的水平。
来自使用该测定的实验的数据示于图12A-E。图12A和12B显示相较于标准过夜CFU测定而言，使用噬菌体测定的高于本底的可测量和可比较的信号。图12A显示少至1-2个大肠杆菌细胞提供了可通过噬斑测定检测的可测量PFU(即，约300-460PFU)的子代噬菌体。图12B比较标准菌落形成单位(CFU)测定与本发明的噬菌体测定的灵敏度。可看到，噬菌体测定不仅可快得多地进行，还提供了与CFU测定相同的灵敏度，并且显示了剂量依赖性反应，随着样品细胞增加，子代噬菌体亦增加。尽管这仅包括完全噬菌体测定的前半部分，但利用噬斑测定相较于标准过夜CFU测定可获得相同的日结果。
图12C显示使用指示细胞、来自单个细胞(即，100个噬菌体)或27个细胞(即，2700个噬菌体)的子代的等同物的噬菌体检测(例如完全噬菌体测定的后半部分)，指示剂高度灵敏。
图12D显示相较于标准CFU测定而言1、5和7个样品细胞(例如，大肠杆菌)的检测(虚线表示本底水平)。
图12E显示使用完全噬菌体测定进行的每样品100至10,000个细菌细胞(用显微镜测定的)的成功检测(线表示本底水平)。因此显示了从1至10,000个细胞的灵敏度而无样品的稀释。除了作为一种快得多的测定、在约3小时内进行以外，这还比标准过夜CFU测定灵敏1或2个数量级，其中后一情形下超过500-700CFU不能在陪替培养皿上得到可靠计数。
图12D显示5和200个样品细胞(即，大肠杆菌)的等同物，图12E显示使用图11的子代噬菌体进行的1、5和10个细菌细胞/ml的检测。图12D显示相较于标准CFU测定而言1、5和7个样品细胞(即，大肠杆菌)的检测(红线表示本底)。
图12E显示使用完全噬菌体测定进行的每样品100至10,000个细菌细胞(通过显微镜测定的)的成功检测(线表示本底)。因此显示了从1至10,000个细胞的灵敏度而无样品的稀释。其中除了作为一种快得多的测定、在约3小时内进行以外，这还比标准过夜CFU测定灵敏1或2个数量级，其中后一情形下超过500-700CFU不能在陪替培养皿上得到可靠计数。
b.指示噬菌体
使用指示噬菌体的策略示于图13中。在该方法中，将噬菌体衣壳蛋白与萤光素酶融合，以便未被生物素化的子代噬菌体可与被生物素化的亲代噬菌体分离，并被直接定量。
为了进行测定，将约500μl的样品细菌(即，待定量的细菌)于2ml圆底收集管中加载至MilliporeUltrafree MC-HV旋转过滤器上，以>300g离心1分钟(于微量滴定管中达到8000rpm)，以除去培养基，添加于LB液体培养基中的40μl生物素化T4噬菌体(即，约2.7x106PFU)。随后通过使用约500μl的LB液体培养基，随后使用2ml收集管以>300g离心1分钟，进行4次来洗涤感染的细菌，随后可将包含感染细菌的过滤柱转移至新管，在添加约200μl LB液体培养基后，使感染的细菌在37℃温育1小时。随后通过离心(8000rpm，进行2分钟)收集感染的细菌，可将包含子代噬菌体和生物素化亲代噬菌体的滤液转移至链霉抗生物素蛋白柱(例如，GE Healthcare链霉抗生物素蛋白HP SpinTrapcolumns)。随后让柱子在翻滚旋转的条件下于室温温育20分钟。在该点上，将来自包含子代噬菌体的柱子的洗脱物转移至新的管中，通过以150g离心1分钟来收集子代噬菌体。随后，将10μl的流通物转移至96孔板的孔中，使用照度计和利用50μ1萤光素酶测定试剂的Promega萤光素酶测定定量萤光素酶的水平。
c.指示噬菌体的可溶性萤光素酶
使用具有可溶性萤光素酶的指示噬菌体的策略示于图14中。在该方法中，噬菌体表达萤光素酶而非Soc衣壳蛋白。萤光素酶的表达由Soc启动子驱动，从而产生高表达。在该情况下，无需分离出亲代噬菌体和子代噬菌体，因为亲代噬菌体不含萤光素酶(噬菌体原液纯化的副产品)。仅样品中的细菌的生产性感染将产生可检测的萤光素酶。
为了进行测定，将约500μl的样品细菌(即，待定量的细菌)于加载至2ml圆底收集管中的MilliporeUltrafree MC-HV旋转过滤器上，以>300g离心1分钟(在微量离心机中达到8000rpm)以除去培养基。随后将旋转过滤器转移至新管，添加LB中的约40μ1生物素化T4噬菌体(即，约2.7x106PFU)，在添加约200μl LB液体培养基后，使感染的细菌在37℃温育1小时。随后通过离心(8000rpm，进行2分钟)收集感染的细菌，将10μl流通液转移至96孔板的孔中，可使用照度计和利用50μl萤光素酶测定底物的Promega萤光素酶测定定量萤光素酶的水平。
本发明不限于显示的和描述的具体内容，对于本领域技术人员来说很显然的变化包括在由权利要求定义的本发明内。虽然已举例说明和描述了本发明的优选实施方案，但应理解可在其中进行各种变化而不背离本发明的精神和范围。将本申请中提及的所有印刷的专利和出版物通过引用整体并入本文。

Claims (4)

1.一种用于检测样品中目标细菌的方法，其中所述样品是环境或食品或水样品，所述方法包括步骤：
将至少一个细菌与样品中的其它组分分离；
用被基因工程化加工而在复制期间表达可溶性蛋白质的众多亲代噬菌体感染所述至少一个细菌，其中所述可溶性蛋白质是荧光素酶蛋白，其表达是被病毒衣壳蛋白启动子驱动的，并且所述可溶性蛋白质不是融合蛋白，也不被整合到噬菌体结构中；
孵育所述至少一个感染的细菌直至其被裂解而释放存在于所述细菌中的子代噬菌体；和
检测所述子代噬菌体复制期间表达的所述可溶性蛋白质，
其中所述可溶性蛋白质的检测表明所述细菌存在于所述样品中，
其中所述方法在未富集样品中的细菌的情况下进行，并且
所述方法检测样品中少至单个细菌。
2.权利要求1的方法，其中所述方法是在未经培养以富集样品中的细菌的情况下进行的。
3.权利要求1的方法，其中将所述亲代噬菌体与子代噬菌体分离。
4.一种包含用于检测目标细菌的组分的试剂盒，其包含：
用于将至少一个目标细菌与样品中的其它组分分离的组分；
用于利用被基因工程化加工而在复制期间表达可溶性蛋白质的众多亲代噬菌体感染所述至少一个目标细菌的组分，其中所述可溶性蛋白质是荧光素酶蛋白，其表达是被病毒衣壳蛋白启动子驱动的，并且所述可溶性蛋白质不是融合蛋白，也不被整合到噬菌体结构中；
用于裂解所述至少一个感染的细菌以释放存在于所述细菌中的子代噬菌体的组分；和
用于检测所述可溶性蛋白质的组分，其中所述可溶性蛋白质的检测表明所述细菌存在于所述样品中。
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