CN106164259A - 使用重组噬菌体快速检测微生物的方法和*** - Google Patents

使用重组噬菌体快速检测微生物的方法和*** Download PDF

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Abstract

本文中公开了用于快速检测样品中的微生物的方法和***，而没有富集培养微生物。还公开了修饰的噬菌体，其在晚期基因区中包括非天然指示基因。指示产物不是融合蛋白。感染原的特异性允许靶向特定的微生物，并且指示信号可以被扩大以优化测定灵敏度。

Description

使用重组噬菌体快速检测微生物的方法和***
相关申请
依据35USC 119(e)，本申请要求2014年2月18日提交的美国临时专利申请NO.61/940,959的优先权。将美国临时专利申请No.61/940,959的公开内容全部按引用并入本文中。
发明领域
本发明涉及使用感染原检测微生物的方法和***。
背景
对提高检测生物、食品、水和临床样品中的细菌、病毒和其他微生物的速度和灵敏度存在强烈兴趣。微生物病原体可以引起人和家畜中相当大的发病率，以及巨大的经济损失。此外，鉴于由摄入某些微生物(例如，大肠杆菌(E.coli)或沙门氏菌(Salmonella spp.)污染的食品引起的致病或毁灭性的疾病，微生物的检测对于食品药品管理局(FDA)和疾控中心(CDC)是高优先级的。
用于细菌检测的传统微生物测试依赖非选择性和选择性的富集培养，接着涂布在选择性的培养基上并进一步测试，以证实怀疑的菌落。这样的程序可能需要几天。已经研究了各种快速方法并引入实践来缩短时间需求。然而，这些方法具有缺陷。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要富集步骤，以获得适当的灵敏度。聚合酶链反应(PCR)测试还包括扩增步骤，并且因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，可以经济地接受PCR测试的样品大小受到限制。使用稀释的细菌悬浮液，大部分小的子样品将不含细胞，并且因此仍然需要纯化和/或富集步骤。
传统生物富集所需的时间受样品的靶细菌群的生长速率、样品基质的影响和所需灵敏度的控制。例如，对于分别检测模型***中1000、100和1个集落形成单位/毫升(CFU/mL)，用于产志贺毒素大肠杆菌的磁捕获PCR***可能需要约5、7和10小时的富集培养，而对于检测绞碎牛肉中的1CFU/克(g)，需要15小时的富集培养。在实践中，大部分高灵敏度方法使用过夜孵育并且总地花费大约24小时。由于培养所需的时间，根据待测定的生物体和样品来源，这些方法可能花费长达三天。这种滞后的时间通常是不合适的，因为受污染的食品、水(或其他产品)可能已经进入牲畜或人。此外，抗生素抗性细菌的增加和生物防御考虑使得全世界非常优先地考虑水、食品和临床样品中细菌病原体的快速鉴定。
因此，需要快速、简单和灵敏的微生物检测和鉴定，所述微生物如细菌、病毒和其他潜在致病的微生物。
概述
本发明的实施方案包括用于微生物检测的组合物、方法、***和试剂盒。本发明可以以各种方式来具体说明。
在一些方面中，本发明包括重组噬菌体，其包括***噬菌体的晚期基因区中的指示基因。
在一些实施方案中，本发明包括用于检测样品中的目标微生物的方法，其包括将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育的步骤，其中重组噬菌体包括***噬菌体的晚期基因区中的指示基因，使得在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因表达，形成可溶的指示蛋白产物，并且检测指示蛋白产物，其中指示剂蛋白产物的阳性检测表示目标微生物存在于样品中。
在其他实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的***，其包括用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组分，其中感染原包括指示部分，和用于检测指示部分的组分。
在再其他实施方案中，本发明包括用于与根据本发明的方法或***一起使用的非瞬时性计算机可读介质。
附图简述
通过参考一下非限制性附图可以更好地理解本发明。
图1描绘了根据本发明实施方案的指示噬菌体构建体，说明了包括萤火萤光素酶基因和T7晚期启动子的遗传构建体***噬菌体的晚期(III类)区。还描绘了在所有三个阅读框中包括防止通读的终止密码子和未翻译区(UTR)的序列。
图2显示了噬菌体JG04的基因组，JG04是T4-样噬菌体，其从污水处理厂样品分离并与T4-样噬菌体RB69共享～98％同一性。衣壳蛋白gp23和gp24在晚期基因区内，由结构基因组成，其编码病毒粒蛋白。因为这些病毒粒蛋白以非常高的水平表达，可以预期***这个区域的任何基因具有相似表达水平，只要使用晚期基因启动子和/或其他相似控制元件。
图3显示了携带三个不同萤光素酶基因的同源重组质粒构建体。将萤火萤光素酶，萤光素酶，和Oplophorus萤光素酶基因每个***pUC57.AmpR质粒主链中。在每个构建体中，gp23衣壳蛋白基因的片段接着是T4晚期启动子，各自的萤光素酶基因和gp23-24未翻译区。Oplophorus构建体另外包括未翻译区下游的gp24基因的片段。
图4描绘了使用一些列按序感染和吸收步骤，使用如图3中所示那些的质粒构建体，从JG04噬菌体的修饰分离重组噬菌体，以鉴定表达指示基因的重组噬菌体。
图5描绘了使用编码可溶性萤光素酶的指示噬菌体，以通过检测细菌细胞感染过程中从子代噬菌体复制产生的萤光素酶来检测细菌细胞。
图6证明了使用具有旋转柱的指示噬菌体检测靶细菌的灵敏度。X-轴上表示每个测定中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号显示于Y-轴上，作为相对背景(BG)信号(即，无细胞)的相对鲁米那单位(relativeluminal unit)(RLU)(RLU/BG)。
图7证明了根据本发明的实施方案，使用具有旋转柱的指示噬菌体，在一定范围的滴定度内，检测靶细菌。X-轴上表示每个测定中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为相对背景(BG)信号(即，无细胞)的相对鲁米那单位(RLU)(RLU/BG)显示于Y-轴上。
图8证明了根据本发明的实施方案，使用指示噬菌体和96-孔滤板检测靶向细菌的灵敏度。X-轴上表示每个测定中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为相对背景(BG)信号(即，无细胞)的相对鲁米那单位(RLU)(RLU/BG)显示于Y-轴上。
图9证明了根据本发明的实施方案，使用指示噬菌体和96-孔滤板，在一定范围的滴定度内，检测靶细菌。X-轴上表示每个测定中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为相对背景(BG)信号(即，无细胞)的相对鲁米那单位(RLU)(RLU/BG)显示于Y-轴上。萤光素酶活性的检测持续延长的时间段。在此，阅读◇表示0时间(即，基线对照)；Δ15分钟(min)后；和□30分钟后。
图10描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测靶细菌的滤板测试，其中在滤板上孵育细菌和重组噬菌体，并且在子代噬菌体产生后，直接检测指示剂蛋白，没有除去培养基。
图11显示了使用噬菌体来检测具有已知细胞数量的样品中的大肠杆菌O157:H7细胞的滤板测试的结果。X-轴上表示每个测试中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为相对背景(BG)信号(即，无细胞)的相对鲁米那单位(RLU)(RLU/BG)显示于Y-轴上。
图12描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测靶细菌的“无浓缩测定”。
图13显示了来自使用JG04-OpLuc噬菌体的无浓缩测试的结果，以检测具有低数量范围的已知细胞数量的样品中的大肠杆菌O157:H7细胞。X-轴上表示每个测试中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为与背景(X)信号(即，无细胞)相比的相对鲁米那单位(RLU)显示于Y-轴上。
图14显示了来自使用JG04-OpLuc噬菌体的无浓缩测试的结果，以检测具有低至高数量范围的已知细胞数量的样品中的大肠杆菌O157:H7细胞。X-轴上表示每个测试中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为相对鲁米那单位(RLU)显示于Y-轴上。
图15显示了来自使用JG04-OpLuc噬菌体的无浓缩测试的结果，以检测具有已知细胞数量的蔬菜洗涤样品中的大肠杆菌O157:H7细胞。X-轴上表示每个测试中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为相对鲁米那单位(RLU)显示于Y-轴上。
图16证明了根据本发明的实施方案，使用亲和性纯化的、表面特异性的抗体，大肠杆菌O157:H7的特异性和定量捕获。
图17描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体，检测靶细菌的HybridImmuno-Phage(HIP)测定，其中在与具有指示基因的重组感染原一起孵育前，使用目标微生物的抗体将微生物捕获在测定孔表面上。
图18显示来自HIP测试的结果，使用噬菌体，以检测具有已知细胞数量的样品中的大肠杆菌O157:H7细胞，以对数标度。X-轴上表示每个测试中大致的大肠杆菌O157:H7细胞的数量。感染细菌时产生的可溶性萤光素酶提供的信号作为相对鲁米那单位(RLU)显示于Y-轴上。
发明详述
本文中公开的是证明了令人惊讶的检测测定样品(例如，生物、血液、水和临床样品)中的目标微生物的灵敏度的组合物、方法和***。在没有使用任何富集培养或在一些实施方案中使用最小孵育时间(在该过程中，微生物可能潜在地繁殖)进行的测定中，可以使用遗传修饰的感染原，在短于之前认为可能的时间周期中实现检测。还令人惊讶的是，使用高感染复数(MOI)或高浓度的噬菌斑形成单位(PFU)用于与测试样品一起孵育的成功。这样的高噬菌体浓度(PFU/mL)之前据说对于微生物检测测定是有害的，因为据说它们引起“自外溶菌作用”。
本发明的组合物、方法、***和试剂盒可以包括用于检测此类微生物的感染原。在某些实施方案中，本发明包括组合物，所述组合物包括具有***噬菌体的晚期基因区中的指示基因的重组噬菌体。在某些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性的指示蛋白产物。在某些实施方案中，指示基因可以***噬菌体的晚期基因(即，III类)区中。噬菌体可以源自T7、T4、JG04或另一种天然噬菌体。
在一些方面中，本发明包括检测目标微生物的方法。该方法可以使用用于检测目标微生物的感染原。例如，在某些实施方案中，目标微生物是细菌，而感染原是噬菌体。因此，在某些实施方案中，该方法可以包括检测样品中的目标微生物，通过将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育。在某些实施方案中，重组噬菌体包括指示基因。在某些实施方案中，指示基因可以***噬菌体的晚期基因区中，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。该方法可以包括检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表示目标微生物存在于样品中。
在某些实施方案中，本发明可以包括一种***。该***可以含有至少一些本发明的组合物。此外，该***可以包括至少一些用于进行所述方法的组分。在某些实施方案中，将所述***配制成试剂盒。在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的***，其包括：用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组分，其中感染原包括指示部分；和用于检测指示部分的组分。在再其他实施方案中，本发明包括用于与所述方法或***一起使用的软件。
因此，本发明的一些方法通过使用基于感染原的方法解决了对扩大表示细菌存在的可检测信号的需求。在某些实施方案中，检测少至单个细菌。本文中应用的原理可以应用于检测各种微生物。由于微生物表面上用于感染原的无数结合位点，在感染过程中产生一百或更多感染原子代的能力和编码的指示部分的高水平表达的可能，感染原或指示部分可以比微生物自身更快速地检测到。以这种方式，本发明的实施方案可以从甚至单个感染的细菌实现巨大的信号扩增。
本发明的各个方面利用可以结合特定微生物，如感染原的结合组分的结合剂的高特异性，作为检测和/或定量样品中的特定微生物的方式。在一些实施方案中，本发明利用感染原(如噬菌体)的高特异性。
在一些实施方案中，通过与目标微生物特异性的结合剂相关的指示部分来实现检测。例如，感染原可以包括指示部分。在一些实施方案中，指示剂可以由感染原(如噬菌体)编码，并且噬菌体被定名为指示噬菌体。
本文中公开和描述的本发明的一些实施方案利用以下发现：单个微生物能够结合特定的识别剂，如噬菌体。噬菌体感染和复制后，可以通过噬菌体复制过程中表达的指示部分检测子代噬菌体。这个原则基于微生物表面受体的特异性识别，允许从一或几个细胞扩大指示信号。例如，通过将甚至单个微生物细胞暴露于多个噬菌体，此后在复制过程中允许噬菌体的扩增和编码的指示基因产物的高水平表达，指示信号扩大，使得可以检测到单个微生物。
本发明的方法和***的实施方案可以应用于检测和定量各种环境中的各种微生物(例如，细菌、真菌、酵母)，包括但不限于来自食品、水、临床和商业样品的病原体的检测。本发明的方法可以快速地提供高检测灵敏度和特异性，并且不需要传统的生物富集(例如，富集培养)，这是令人惊讶的方面，因为所有可利用的方法都需要培养。在一些实施方案中，检测在噬菌体或病毒的1-2个复制周期内是可能的，这与常规智慧相反，因为常规智慧不利用噬菌体的天然能力来扩大自身和萤光素酶信号。
定义
除非本文中另外限定，否则结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非内容另外需要，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。通常，结合本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名以及本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交的教导是本领域公知和常用的那些。通常根据本领域公知的以及按照本发明整个说明书中讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所述的常规方法进行已知的方法和技术，除非另外指出。根据制造商的说明进行酶反应和纯化技术，如本领域通常完成的或如本文中所述的。结合本文中所述的实验室程序和技术使用的命名是本领域公知和常用的那些。
以下术语，除非另外指出，应当理解为具有以下含义：
如本文中使用的，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”可以指一个或多个，除非另外明确指出。
术语“或”的使用用来表示“和/或”，除非明确指出是指只是替换方案或替换方案是互相排他的，尽管公开内容支持表示只是替换方案和“和/或”的限定。如本文中使用的，“另一个”可以表示至少第二个或更多。
在整个本申请中，术语“约”用于表示数值包括该设备的固有误差变化、该方法用于测定该数值或样品间存在的变化。
术语“固体支持物”或“支持物”表示提供其上可以结合生物分子的基质和/或表面的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即，如微滴定平板或多孔平板)，或固体支持物可以是滤器、阵列或可移动支持物，如珠粒或膜上的位置(例如，滤板或侧流条)。
术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体和嵌合抗体，例如，通过组合诱变和噬菌体展示产生的。术语“抗体”还包括抗体的模拟物或肽模拟物。肽模拟物是基于或源自肽和蛋白质的化合物。本发明的肽模拟物通常可以使用非天然氨基酸、构象限制、等构置换等，通过已知肽序列的结构修饰而获得。在一些实施方案中，抗体片段可以替代抗体来起作用。如本文中使用的“表面特异性抗体”结合特定微生物外表面上暴露的分子。
如本文中使用的，术语“游离抗体”是指在溶液中并且可以通过液体自由移动的抗体；即，它们最初不结合固体支持物或者被限制。
如本文中使用的，“亲和性纯化的”或“亲和性纯化”是指一系列用于制备和处理抗体，使得它们呈现出最佳的特异性和灵敏性，包括与不需要表位的最小交叉反应性的步骤。例如，从抗血清除去不需要的脂质和蛋白质可以首先通过盐沉淀步骤来实现。更多阳性选择(也称为“亲和性纯化”)和/或阴性选择(也称为“反向纯化”)可以通过将剩余的抗体通过包括设计来截留具有特定表位亲和性的表面抗原的支持物(例如，琼脂糖柱)来实现。在一些实施例中，其中起始抗血清是多克隆的，这些选择步骤后截留的纯化抗体能够识别目标微生物表面上的许多不同表位，但它们不识别其他微生物的表面表位。
术语“结合剂”是指可以特异性和选择性地结合第二个(即，不同的)目标分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如，作为氢键合、范德华相互作用或静电或疏水性相互作用的结果，或可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物相连(即，共价或非共价结合)的结合剂。
如本文中使用的，“分析物”是指待测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，目标分析物可以与结合剂相互作用。如本文中所述的，术语“分析物”可以指目标蛋白或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或，分析物可以不具有生物效应。分析物可以包括小分子、糖、寡糖、脂质、肽、肽模拟物、有机化合物等。
术语“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报道子”或“指示部分”是指可以在定量测定中测量的分子。例如，指示部分可以包括可以用于将底物转化成可以测量的产物的酶。指示部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶)。或，指示部分可以是可以定量的放射性同位素。或，指示部分可以是荧光团。或，可以使用其他可检测分子。
如本文中使用的，“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括多种细菌病毒中的一种或多种。在本公开内容中，术语“噬菌体(bacteriophage)”和“噬菌体(phage)”包括如分枝杆菌噬菌体(如，用于TB或paraTB)、真菌噬菌体(如，用于真菌)、支原体噬菌体这样的病毒，以及是指可以入侵活的细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他用显微镜可见的活生物体并且使用它们来自我复制的病毒的任何其他术语。在此，“显微镜可见的”表示最大尺寸为一毫米或更小。噬菌体是已经自然进化以使用细菌作为自我复制方式的病毒。噬菌体通过使自身连接至细菌并将其DNA(或RNA)注入该细菌中，并诱导其复制噬菌体上百乃至上千次，来进行这个过程。将这成为噬菌体扩增。
如本文中使用的，“晚期基因区”是指在病毒生命周期晚期转录的病毒基因组的区域。晚期基因区通常包括最大量表达的基因(例如，装配至噬菌体颗粒中的结构蛋白)。晚期基因与III类基因是同义的，并且包括具有结构和装配功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在T7中转录，例如，从传染后8分钟脂质裂解，I类(例如，RNA聚合酶)是早期从4-8分钟，而II类是早期从6-15分钟，因此在II和III的时间上存在重叠。晚期启动子是天然位于这样的晚期基因区并且在该区域中有活性的启动子。
如本文中使用的，“富集培养”是指传统培养，如在有利于微生物繁殖的培养基中的孵育，并且不应当与词语“富集”的其他可能的使用混淆，如通过除去样品的液体组分以浓缩其中所含微生物的富集，或不包括微生物繁殖的传统促进的其他富集形式。在本文所述方法的一些实施方案中，可以使用非常短时间段的富集培养，但不是必需的并且如果完全使用，时间段比传统富集培养短得多。
如本文中使用的，“重组”是指通常在实验室进行的遗传(即，核酸)修饰，以将不会另外被发现的遗传物质集合。该术语可以与本文中的术语“修饰”互换使用。
样品
本发明方法和***各自的实施方案可以允许样品中的微生物的快速检测和定量。例如，最优选，可以在约两小时或更短时间内进行根据本发明的方法。
通过本发明的方法和***检测的微生物包括商业、医疗或兽医关注的病原体。这样的病原体包括革兰氏阴性细菌、***、支原体和病毒。可以通过本发明的方法检测已经对其鉴定出对特定微生物具有特异性的感染原的任何微生物。本领域技术人员将认识到除了需要的特异性感染原/微生物对的可利用性，对本发明方法的应用没有限制。
通过本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，是食品或水传播的病原体的细菌细胞。通过本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，沙门氏菌属的所有种，大肠杆菌的所有菌株，包括但不限于大肠杆菌O157:H7，李斯特氏菌属(Listeria)的所有种，包括但不限于单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)，以及弯曲杆菌属(Campylobacter)的所有种。通过本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，是医疗或兽医重要的病原体的细菌细胞。这样的病原体包括但不限于芽孢杆菌属数种(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠杆菌属数种(Enterobacter spp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、索氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和链球菌属数种(Streptococcusspp.)。
样品可以是环境或食品或水样品以及医疗或兽医样品。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭样。样品可以包括环境材料，如水样，或来自旋风收集器的空气样品或气溶胶样品的滤器。样品可以是肉、家禽、加工食品、奶、奶酪，或其他乳制品。医疗或兽医样品包括但不限于血液、痰液、脊髓液和粪便样品以及不同类型的拭样。
样品可以直接用于本发明的检测方法中，不用制备、浓缩或稀释。例如，液体样品，包括但不限于，奶和汁液，可以直接测试。样品可以被稀释或悬浮于溶液中，其可以包括，但不限于，缓冲液或细菌培养基。可以通过将固体在液体中切碎、混合或浸软，将固体或半固体样品悬浮于液体中。样品应当维持在促进噬菌体连接宿主细菌细胞的pH范围内。样品还应当含有合适浓度的二价和单价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和K+。优选，将样品维持在保持样品内含有的任何病原体细胞的生活力的温度下。
优选在检测测定中，将样品维持在保持样品中存在的任何病原体细胞的生活力的温度下。在其中噬菌体连接细菌细胞的步骤期间，优选将样品维持在促进噬菌体连接的温度下。在其中噬菌体在受感染细菌细胞内复制或裂解这样的受感染细胞的步骤期间，优选将样品维持在促进噬菌体复制和宿主裂解的温度下。这样的温度至少约25摄氏度(℃)，更优选不高于约45摄氏度。最优选约37摄氏度。还优选将样品在噬菌体连接、复制和细胞溶解过程中温和地混合或振荡。
测定可以包括各种合适的对照样品。例如，不含噬菌体的对照样品或含有噬菌体但不含细菌的对照样品可以作为用于背景信号水平的对照来进行测定。
指示感染原
如本文中更详细描述的，本发明的组合物、方法、***和试剂盒可以包括用于检测这些微生物中的感染原。在某些实施方案中，本发明可以包括组合物，所述组合物包括具有***噬菌体的晚期基因区中的指示基因的重组噬菌体。如以下更详细描述的，在感染原的某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，指示基因可以***噬菌体的晚期基因区中。在重组噬菌体中，晚期基因区可以是III类基因区。
在一些实施方案中，指示噬菌体源自T7、T4或另一种噬菌体。指示噬菌体还可以源自T7-样、T4-样、JG04、JG04-样或任何其他与T7、T7-样、T4、T4-样、JG04、JG04-样噬菌体具有至少99，98，97，96，95，94，93，92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82，81，80，79，78，77，76，75，74，73，72，71或70％同源性的基因组的噬菌体。在一些实施方案中，指示噬菌体源自从环境分离的天然噬菌体，如按照实施例中所述的JG04噬菌体、T4-样噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失并且因此与许多商业可购得的噬菌体(例如，415)相比，保留更多与野生型感染原的相似性。这样天然衍生的噬菌体与商业可购得的噬菌体相比，对环境中发现的细菌更具有特异性，并且因此，遗传上与环境中发现的噬菌体截然不同。
此外，认为非必需的噬菌体基因可能具有未被认识的功能。例如，明显非必需的基因可能在升高释放量中具有重要功能，同时在装配中具有精细切割、拟合或整理功能。因此，缺失基因以***指示剂可能是有害的。大部分噬菌体可以包装比其天然基因组大几个百分比的DNA。鉴于这种考虑，对于修饰噬菌体，尤其是具有较小基因组的噬菌体，较小的指示基因可能是更合适的选择。OpLuc和蛋白只有约20kDa(大约500-600bp来编码)，而Fluc为约62kDa(大约1,700bp来编码)。比较而言，T7的基因组大约为40kbp，而T4基因组为约170kbp。
在一些指示噬菌体实施方案中，指示基因可以***未翻译区中，以避免功能基因的破坏，留下完整的野生型噬菌体基因，当感染非实验室菌株细菌时，这可以导致更高的适合度。另外，所有三个阅读框的终止密码子可以通过降低通读来提高表达，也称为泄露表达。这种策略还可以消除以低水平形成融合蛋白的可能性，其将呈现为不能与噬菌体分离的背景信号(例如，萤光素酶)。
指示基因可以表达各种生物分子。指示基因是表达可检测产物或产生可检测产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可以使用各种类型的萤光素酶。在可替换的实施方案中，并且如本文中更详细描述的，萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火萤光素酶或工程化的萤光素酶。
因此，在一些实施方案中，本发明包括修饰的噬菌体，其包括在晚期(III类)基因区中的非噬菌体指示基因。在一些实施方案中，非天然指示基因处于晚期启动子的控制下。使用病毒晚期基因启动子确保报道基因(萤光素酶)不仅高水平表达，如病毒衣壳蛋白那样，而且没有关闭(shut down)，如内源性细菌基因乃至早期病毒基因那样。
在一些实施方案中，晚期启动子是T4-或T7-样启动子，或另一个与没有遗传修饰的天然噬菌体中发现的相似的噬菌体启动子。晚期基因区可以是III类基因区，并且噬菌体可以源自T7、T4、T4-样、JG04或另一个与T7、T4或T4-样噬菌体具有至少90％同源性的基因组的天然噬菌体。在优选实施方案中，指示基因没有编码融合蛋白。
感染原的遗传修饰可以包括小片段的核酸、实质性部分的基因或完整基因的***、缺失或置换。在一些实施方案中，***或置换的核酸包括非天然序列。非天然指示基因可以***噬菌体基因组中，使得其处于噬菌体启动子的控制下。在一些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。即，在一些实施方案中，可以配置遗传修饰，使得指示蛋白产物不包括天然噬菌体的多肽。在一些实施方案中，指示蛋白产物是可溶性的。在一些实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，包括将测试样品与这样的修饰噬菌体一起孵育的步骤。
在一些实施方案中，非天然指示基因不邻近编码结构噬菌体蛋白的基因，并且因此不产生融合蛋白。在一些实施方案中，宿主细菌感染后子代噬菌体中指示基因的表达形成可溶性蛋白产物。
与使用检测部分与衣壳蛋白的融合体(即，融合蛋白)的***不同，本发明的一些实施方案表达可溶性萤光素酶。这可以很大程度上提高测定的灵敏度(低至单个细菌)，并将测定简单化，对于一些实施方案，允许测定在短于1小时内完成，与由于使用产生可检测融合蛋白的构建体需要的其他纯化步骤的几个小时相对。此外，由于例如可能改变酶活性位点的构象或接近底物的蛋白折叠限制，融合蛋白活性可能比可溶性蛋白低。
此外，通过限定的融合蛋白限制了连接至噬菌体中的蛋白亚基上的部分的数量。例如，使用设计来作为用于融合蛋白平台的商业上可购得的***将形成约415个融合部分的拷贝，对应于约415个的每个T7噬菌体颗粒中基因10B衣壳蛋白的拷贝。在没有这个限制的情况下，感染细菌可望表达比适合于噬菌体上的更多拷贝的检测部分(例如，萤光素酶)。另外，大的融合蛋白，如衣壳-萤光素酶融合体，可能抑制噬菌体颗粒的装配，因此产生较少的噬菌体子代。因此，可溶性的、非融合指示基因产物可能是优选的。
在一些实施方案中，指示噬菌体编码可检测酶。指示剂可以发射光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶是商业上可购得的，如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作指示部分。在一些实施方案中，萤火萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，是指示部分。其他工程化萤光素酶或产生可检测信号的其他酶也可以是合适的指示部分。
此外，使用可溶性检测部分消除了从受感染样品细胞的裂解物分离污染亲本噬菌体的需要。使用融合蛋白***，用于感染样品细胞的任何噬菌体将具有连接的检测部分，并且与也含有检测部分的子代噬菌体是不可区分的。因为样品细菌的检测依赖于新形成的(重头合成的)检测部分的检测，使用融合构建体需要另外的步骤从新形成的(子代噬菌体)部分分离老的(亲本)部分。这可以在噬菌体生命周期完成前，通过洗涤受感染的细胞多次来完成，在感染后通过物理或化学方式灭活过量的亲本噬菌体，和/或用结合部分(如生物素)化学修饰亲本噬菌体，其随后可以被结合并分离(如通过抗生物素蛋白链菌素覆盖的琼脂糖珠粒)。然而，即使在分离时使用所有这些尝试，当使用高感染复数(MOI)来确保少量样品细胞的感染时，通常还是保留了亲本噬菌体，形成可能阻碍从受感染细胞子代噬菌体检测信号的背景信号。
相反，在本发明的一些实施方案中使用表达的可溶性检测部分，就不需要从最终裂解物纯化亲本噬菌体，因为亲本噬菌体将不具有任何连接的检测部分。因此，感染后存在的任何检测部分必须重新形成，表示受感染细菌的存在。为了利用这种益处，亲本噬菌体的产生和制备可以包括从细菌培养物中产生亲本噬菌体的过程中产生的任何游离检测部分纯化噬菌体。根据本发明的噬菌体的一些实施方案，可以使用标准噬菌体纯化技术来纯化，如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、大小排阻色谱和渗析或衍生技术(如Amicon条带浓缩器-Millipore，Inc.)。本文中的实施例描述了使用氯化铯等密度超离心作为本发明的重组噬菌体制备的一部分，使得从细菌储液中的噬菌体繁殖时产生的污染萤光素酶蛋白分离亲本噬菌体颗粒。以这种方式，本发明的重组噬菌体基本上不含细菌生产过程中产生的任何萤光素酶。当用测试样品孵育重组噬菌体时，噬菌体储液中存在的残留萤光素酶的去除可以实质性地降低看到的背景信号。
在修饰的噬菌体的一些实施方案中，晚期启动子(III类启动子，例如，来自T7或T4)对相同天然噬菌体(例如，分别为T7或T4)的RNA聚合酶具有高亲和性，所述天然噬菌体转录用于装配至噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因。这些蛋白是由噬菌体形成的最大量蛋白，因为每个噬菌体颗粒包含数打或数百个这些分子的拷贝。使用病毒晚期启动子可以确保萤光素酶检测部分的最佳高水平表达。使用源自衍生指示噬菌体的初始野生型噬菌体的晚期病毒启动子(例如，具有基于T4-或T7-***的T4或T7晚期启动子)、衍生指示噬菌体的初始野生型噬菌体特异性的晚期病毒启动子(例如，具有基于T4-或T7-***的T4或T7晚期启动子)或在衍生指示噬菌体的初始野生型噬菌体下有活性的晚期病毒启动子(例如，具有基于T4-或T7-***的T4或T7晚期启动子)，可以进一步确保检测部分的最佳表达。在一些情况下，使用标准细菌(非病毒/非噬菌体)启动子可能对表达是有害的，因为这些启动子在噬菌体感染过程中常常下调(为了噬菌体将用于噬菌体蛋白产生的细菌来源列为优先)。因此，在一些实施方案中，噬菌体优选工程化来编码和高水平表达可溶性(游离)指示部分，其没有将表达限于噬菌体结构组分的亚基的数量。
使用本发明修饰噬菌体的实施方案可以允许特定细菌菌株的快速检测，总的测定时间快至45分钟-1.5小时。根据测试中的噬菌体的菌株和待检测细菌的菌株，所需时间量可能更短或更长一些。
图1描绘了本发明的重组噬菌体(指示噬菌体415-Luc)的基因组结构的图示。对于图1中描绘的实施方案，检测部分由晚期(III类)基因区110内***的萤火萤光素酶基因100编码，其在病毒生命周期的晚期表达。晚期基因通常以高于其他噬菌体基因的水平表达，因为它们编码结构蛋白。因此，在图1所绘的重组噬菌体的实施方案中，将指示基因(即，萤火萤光素酶)***晚期基因区中，就在基因10B(主衣壳蛋白)后，并且是包括萤火萤光素酶基因100的构建体。图1中所绘的构建体设计成在全部3个阅读框中包括终止密码子120，以确保萤光素酶不掺入基因10B产物中。此外，如图1所描绘的，构建体可以包括共有T7晚期启动子130来驱动萤光素酶基因的转录和表达。构建体还可以包括从几个T7UTR140合成的复合未翻译区。这种构建体确保产生可溶性萤火萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示***中固有的衣壳蛋白的数量。
如本文中所述，在某些实施方案中，可以优选利用已经从环境中分离的感染原，用于生产本发明的感染原。以这种方式，可以产生天然衍生的微生物特异性的感染原。
例如，图2显示了噬菌体JG04的基因组，JG04是与T4-样噬菌体(RB69)具有约98％序列同源性的天然噬菌体。在本文的实施例中特别描述了从污水处理厂样品分离JG04噬菌体。如实施例中讨论的，衣壳蛋白，gp23(220)和gp24(230)在晚期基因区(210)内，由结构基因组成，其编码病毒粒蛋白。因为这些病毒粒蛋白以非常高的水平表达，预期***这个区域中的任何基因具有相似的表达水平，只要使用晚期基因启动子和/或其他相似控制元件。图2中描绘的噬菌体构建体具有SEQ ID NO:3中所示的序列。
本发明的组成可以包括各种感染原和/或指示基因。例如，图3显示了携带三个不同萤光素酶基因的三个同源重组质粒构建体。制得了三个构建体并与JG04一起用于重组中，以产生本发明的重组噬菌体。因此，图3中的上构建体显示了具有用于萤火萤光素酶同源重组***JG04的萤火萤光素酶构建体的重组质粒：同源重组质粒pUC57.HR.Fluc，对应于SEQ ID NO.5。图3中的中间构建体显示了用于萤光素酶同源重组***JG04的重组质粒：同源重组质粒pUC57.HR.对应于SEQ ID NO.6；以及图3中的下构建体显示了用于Oplophorus萤光素酶同源重组***JG04中的重组质粒：同源重组质粒pUC19.HR.OpLuc.KanR，对应于SEQ ID NO.7。
在一些实施方案中，根据本发明的指示基因包括遗传工程化来包括图3中显示的三个构建体中的任一个的JG04。即，包括SEQ ID NO.3的序列的指示噬菌体，进一步包括在SEQ ID NO.3的核苷酸116,555和119,830之间***的对应于SEQ ID NO.5的核苷酸402-2,973(或其一部分)的其他序列；或SEQ ID NO.6的核苷酸402-1,922(或其一部分)，在本文中的实施例6和11中也称为指示噬菌体；或SEQ ID NO.7的核苷酸2,241-4,729(或其一部分)，在本文中的实施例7-9中也称为JG04-OpLuc指示噬菌体。例如，其一部分可以只包括萤光素酶部分(即，SEQ ID NO.5的核苷酸943-2,595；或SEQ ID NO.6的核苷酸943-1.542；或SEQ ID NO.7的核苷酸2,784-3,296)。其一部分可以进一步包括T4晚期启动子(即，SEQ ID NO.5或NO.6的核苷酸908-936，或SEQ ID NO.7的核苷酸2,749-2,777)。在另一个实施方案中，这样的指示噬菌体包括在根据本发明的***或试剂盒中。本文中所述的方法也利用这样的指示噬菌体。
图4描绘了使用图3中显示的和实施例6中描述的质粒构建体，从JG04噬菌体的修饰分离重组噬菌体。
在第一个步骤402中，用噬菌体感染用同源重组质粒转化的细菌，形成具有大约20,000个野生型432:1个重组噬菌体434比例的亲本和重组噬菌体混合物的子代噬菌体。将所得到的重组噬菌体混合物稀释404至96孔平板406中，以获得平均每个平板3个重组转导单位(TU)，其对应于每孔约625个大部分野生型噬菌体的传染单位(IU)。测定96-孔平板的萤光素酶活性，以与含有野生型噬菌体的孔440相比，鉴定含有重组噬菌体的孔436。加入408细菌438；例如，每个孔可以含有约50μL混浊的大肠杆菌O157:H7。这允许噬菌体复制并产生萤光素酶442。在410所示的37℃下孵育2小时后，可以针对萤光素酶442的存在筛选孔。任何阳性孔很可能已经用单个重组噬菌体接种，并且在这个阶段，混合物可以含有大约600个野生型噬菌体:1个重组体的比例，高于初始20,000:1比例的富集。在一个实施方案中，可溶性萤光素酶和噬菌体以大约625个野生型:1个重组的比例存在。来自这个富集培养物412的子代可以接受另外的有限稀释测定414，以证实比例并测定重组噬菌体转导单位的实际浓度。例如，可以从第一个纯化储液等分414约3个重组TU/96-孔平板416，形成大约～20个大部分野生型噬菌体/孔的接种的第二个稀释测试平板420。任何阳性的萤光素酶孔很可能已经接种单个重组连同～20个野生型噬菌体。可以针对萤光素酶442的存在分析这些孔。
添加细菌并孵育(例如，37℃2小时)418后，可溶性萤光素酶和噬菌体以大约20个野生型:1个重组体存在420。最后，可以进行噬菌斑测定422，以筛选表达萤光素酶446的重组体。可以单独挑选少量单独的(例如，n＝48)噬菌斑，并针对萤光素酶活性436，在第三个多孔平板上筛选426。在一个实施方案中，这种方法应当确保约3个重组体在待筛选的噬菌斑混合物中。可以从平板取出一个噬菌斑至96-孔平板的每个孔中424，并且进行萤光素酶测试426，以确定哪个孔含有呈现出萤光素酶442活性的噬菌体。证明萤光素酶活性的孔428表示纯的重组噬菌体434，而没有萤光素酶活性的孔430表示纯的野生型噬菌体432。
然后可以将单独的噬菌斑悬浮于缓冲液或培养基中(例如，100μL TMS)，并且将等份试样(例如，约5μL)加入含有混浊的大肠杆菌O157:H7培养物的孔中，并在孵育后测定(例如，在37℃下约45分钟至1小时)。预期阳性孔含有纯的重组噬菌体培养物。仍然，在某些实施方案中，包括另一轮的噬菌斑纯化是优选的。
因此，如图4举例说明的，通过合适的重组质粒与JG04的同源重组产生的重组噬菌体可以从构成0.005％总噬菌体的混合物分离。分离后，可以进行大规模生产，以获得适用于大肠杆菌O157:H7检测测定中的高滴定度储液。例如，如本文中的实施例中更详细描述的，氯化铯等密度梯度离心可以用于从污染荧光素蛋白分离噬菌体颗粒，以降低背景。
以这种方式，并且如以下实施例中更详细描述的，可以产生具有***源自环境的噬菌体中的目标萤光素酶基因(例如，萤火虫、Oplophorus或工程化萤光素酶，如)的重组噬菌体。
使用感染原检测微生物的方法
如本文中所述的，在某些实施方案中，本发明可以包括使用感染原检测微生物的方法。可以以各种方式来具体说明本发明的方法。
因此，本发明的方法利用识别并结合特定目标微生物的结合剂的高特异性，作为扩大信号的手段并由此检测样品中存在的低水平微生物(例如，单个微生物)。例如，感染原(例如，噬菌体)特异性地识别特定微生物的表面受体并因此特异性地感染那些微生物。因此，这些感染原可以是用于靶向目标微生物的合适结合剂。本发明的一些实施方案利用感染原的结合特异性和高水平的遗传表达能力，用于快速且灵敏地靶向感染并促进目标微生物的检测。
因此，在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中的目标微生物的方法，包括步骤：用感染目标微生物的感染原孵育样品，其中感染原包括指示基因，使得目标微生物感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表示样品中存在目标微生物。
可以使用各种感染原。在可替换的实施方案中，可以入侵活的细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他用显微镜可见的活生物体的噬菌体、噬菌体、分枝杆菌噬菌体(如用于TB和paraTB)、真菌噬菌体(如用于真菌)、支原体噬菌体和任何其他病毒。例如，在一个实施方案中，其中目标微生物是细菌，则感染原可以包括噬菌体。如本文中讨论的，这样的噬菌体可以在细菌内部复制，以产生上百个子代细菌。***噬菌体中的指示基因的检测可以用作样品中细菌的测量。例如，充分研究的大肠杆菌的噬菌体包括T1、T2、T3、T4、T5、T7和λ；ATCC保藏中心可获得的其他大肠杆菌噬菌体，例如，包括phiX174、S13、Ox6、MS2、phiV1、fd、PR772和ZIK1。或者，可以从各种环境来源分离天然噬菌体。可以基于其中预期发现目标微生物的位置来选择用于噬菌体分离的来源。因此，在一些实施方案中，指示噬菌体包括指示部分，并且可以通过扩大的指示部分产生的信号来检测单个大肠杆菌细胞的感染。因此，该方法可以包括检测噬菌体复制过程中产生的指示部分，其中指示剂的检测表示样品中存在靶细菌。
在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中的靶细菌的方法，包括步骤：将样品与感染靶细菌的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包括***噬菌体晚期基因区中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表示样品中存在靶细菌。在一个实施方案中，并且如本文中详细描述的，检测的指示部分的量对应于样品中存在的靶细菌的量。
在一个实施方案中，晚期基因区是III类基因区。如本文中更详细描述的，指示基因***晚期III类基因区中可以确保指示基因在细菌中复制时以高数量表达。
如以上针对本发明的组合物所述的，噬菌体源自T7、T4、T4-样、JG04的噬菌体或具有与T7、T4或其他T4-样噬菌体至少90％同源性的基因组的另一种天然噬菌体。
此外，在某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。因此，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。
可以使用各种指示部分。在某些实施方案中，指示基因可以编码萤光素酶。例如，萤光素酶可以是Oplophorus萤光素酶、萤火萤光素酶或工程化萤光素酶中的一种。
如本文中更详细描述的，本发明的方法和***可以利用各种感染复数(MOI)。在某些实施方案中，MOI高于标准测试。这样相对高的MOI可以允许感染以非常低的量存在于样品的微生物。例如，在某些实施方案中，用于孵育步骤的噬菌体浓度高于1×107PFU/mL。
在某些实施方案中，重组感染原可以纯化，使得不含感染原储液生产时产生的任何残余指示剂蛋白。因此，在某些实施方案中，并且如本文中更详细描述的，在与样品一起孵育前，可以使用氯化铯等密度梯度离心纯化重组噬菌体。感染原是噬菌体时，这种纯化可以具有除去不具有DNA的噬菌体(即，空噬菌体)的附加益处。
如以下进一步描述的，在某些实施方案中，该方法可以使用由此浓缩目标微生物或从大量样品中捕获目标微生物的步骤。因此，在某些实施方案中，该方法可以包括在孵育步骤前从固体支持物上的样品捕获微生物的步骤。
在一些实施方案中，该方法可以包括将固体支持物(例如，磁珠或滤器基质)上捕获的微生物与多种特异性感染原(例如，指示噬菌体)接触并允许噬菌体结合并感染细菌。在其他实施方案中，微生物的捕获对于检测不是必需的。可以使用各种固体支持物。在某些实施方案中，固体支持物可以包括多孔平板、滤器、珠粒或侧流带、滤带、滤盘或滤纸，或设计用于培养细胞的薄膜(例如，3M的PetriFilm)。其他固体支持物也可能是合适的。
可以通过使用结合剂从样品纯化目标微生物。例如，在某些实施方案中，捕获步骤进一步包括用捕获抗体结合微生物。抗体可以结合固体支持物来使用。例如，在某些实施方案中，捕获抗体促进微生物与固体支持物的结合。
本发明的方法可以包括各种步骤来提高灵敏度。例如，如本文中更详细讨论的，所述方法可以在添加噬菌体之后但在孵育之前包括洗涤捕获并受感染的微生物的步骤，以除去污染噬菌体制备物的过量亲本噬菌体和/或萤光素酶或其他报道蛋白。
与现有技术已知的测试相反，可以不需要培养样品而完成目标微生物的检测，培养微生物是作为提高微生物群的一种方式。因此，在某些实施方案中，在比使用富集培养将微生物数量提高到原来的4-倍或10-倍所需的时间段短的时间内完成目标微生物的检测。例如，在某些实施方案中，检测需要的总时间短于6.0小时，5.0小时，4.0小时，3.0小时，2.5小时，2.0小时，1.5小时，1.0小时，45分钟，或短于30分钟。
此外，与本领域已知的测试相反，本发明的方法可以检测单独的微生物。因此，在某些实施方案中，所述方法可以检测样品中存在的≤10个微生物细胞(即，1，2，3，4，5，6，7，8，9个微生物)。
因此，本发明的各个方面提供了通过指示部分检测测定样品中的微生物的方法。在一些实施方案中，在目标微生物是细菌的情况下，指示部分可以与感染原(如指示噬菌体)相关。指示部分可以与底物反应来发射可检测信号或可以发射固有信号(例如，荧光蛋白)。在一些实施方案中，检测灵敏度可以揭示测试样品中少如50，20，10，9，8，7，6，5，4，3或2个目标微生物细胞的存在。在一些实施方案中，甚至单个目标微生物的细胞也可以产生可检测的信号。
在一些实施方案中，与感染原相关的指示部分可以在感染原复制过程中或之后检测到。适宜用作指示部分的许多不同类型的可检测生物分子是本领域已知的，并且许多是商业上可购得的。在一些实施方案中，指示噬菌体包括酶，其用作指示部分。在一些实施方案中，将指示噬菌体的基因组进行修饰，以编码可溶性蛋白。在一些实施方案中，指示噬菌体编码可检测酶。指示剂可以发射光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶是商业上可购得的，如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作指示部分。在一些实施方案中，萤火萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，是指示部分。其他工程化的萤光素酶或产生可检测信号的其他酶也是合适的指示部分。
检测指示剂可以包括检测光的发射。在一些实施方案中，可以使用光度计来检测指示剂(例如，萤光素酶)。然而，也可以使用其他仪器或设备。例如，分光光度计、CCD相机或CMOS相机可以检测颜色变化和其他光发射。
在一些实施方案中，指示噬菌体被遗传工程化以含有用于酶(如萤光素酶)的基因，其只在噬菌体特异性地识别并感染的细菌感染时才产生。在一些实施方案中，指示部分在病毒生命周期的晚期表达。在一些实施方案中，如本文中所述的，指示剂是可溶性蛋白(例如，可溶性萤光素酶)并且没有与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。
在本发明方法的各种实施方案中，可以不需要从样品的任何微生物纯化来检测微生物。例如，在某些实施方案中，含有一个或几个目标微生物的样品可以直接施加于测定容器，如旋转柱、微滴定孔或滤器，并且在该测定容器中进行测定。本文中公开了此类测定的各种实施方案。
例如，将包含细菌的等份测试样品施加于旋转柱并且用重组噬菌体感染和任选的洗涤以除去任何过量噬菌体后，检测的可溶性指示剂的含量将与受感染的细菌产生的噬菌体含量成比例。实施例4描述了这样的测试。
或者，可以将等份的测试样品直接分配在多孔平板的孔中，加入指示噬菌体，并且在足以感染的时间段后，添加裂解缓冲液以及指示部分的底物(例如，用于萤光素酶指示剂的萤光素酶底物)并进行指示信号的检测。实施例5-6描述了在滤板上进行的方法的实施方案。本文中的实施例7-9描述了称为“无浓缩测定”的测定变化形式。
例如，在许多实施方案中，使用多孔平板来进行测定。平板的选择(或其中可以进行检测的任何其他溶液)可能影响检测步骤。例如，一些平板可以包括有色或白色背景，这可能影响光发射的检测。一般而言，白色平板具有更高的灵敏度，但也产生较高的背景信号。其他颜色的平板可能产生较低的背景信号，但也具有略低的灵敏度。另外，针对背景信号的一个原因是光从一个孔泄露至另一个邻近的孔。存在一些具有白色孔但平板的剩余部分是黑色的平板。这允许孔内部的高信号，而且防止孔至孔的光泄露，并且因此可以降低背景。因此，平板或其他测定容器的选择可能影响该测定的灵敏度和背景信号。
因此，在一些利用指示噬菌体的实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，包括步骤：捕获至少一个样品微生物；将至少一个微生物与多个指示噬菌体一起孵育；允许感染和复制的时间，以产生子代噬菌体并表达可溶性指示部分；和检测子代噬菌体，或优选指示剂，其中指示剂的检测证明样品中存在微生物。
例如，在一些实施方案中，可以通过结合平板的表面，或通过噬菌体滤器(例如，0.45μm孔径旋转滤器或平板滤器)过滤样品，来捕获测试样品微生物。在一个实施方案中，在最小体积中将感染原(例如，指示噬菌体)直接添加至滤器上的捕获样品中。在一个实施方案中，随后将滤器或平板表面上捕获的微生物洗涤一次或多次，以除去过量未结合的感染原。在一个实施方案中，添加培养基(例如，Luria-Bertani，在本文中也称为LB肉汤)，持续更多孵育时间，以允许噬菌体复制和编码指示部分的基因的高水平表达。然而，该测定的实施方案的令人惊讶的方面在于孵育步骤只需要足够用于单个噬菌体生命周期的时间长度。之前认为使用噬菌体的扩大率需要更多时间，使得噬菌体可以复制几个周期。根据本发明的一些实施方案，单个复制的指示噬菌体足以促进灵敏且快速的检测。
当细菌裂解时，可溶性指示剂(例如，萤光素酶)释放至周围液体中，其随后可以被测量和定量。在一个实施方案中，随后将溶液通过滤器旋转，并且通过添加针对指示剂酶的底物(例如，萤光素酶底物)，收集用于测试的滤液。因此可以从捕获固体支持物除去滤液，并在新的容器中(例如，在光度计中)分析，或可以直接在滤器上测量指示信号。
在各种不同的实施方案中，纯化的亲本指示噬菌体不包括可检测指示剂自身，因为在用于与测试样品一起孵育前，亲本噬菌体可以被纯化。晚期(III类)基因的表达发生在病毒生命周期的晚期。在本发明的一些实施方案中，亲本噬菌体可以纯化，以排除任何现有的指示剂蛋白(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，在宿主细菌感染后子代噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。因此，在许多实施方案中，不需要在检测步骤中从子代噬菌体分离出亲本。在一个实施方案中，微生物是细菌，并且指示噬菌体是噬菌体。在一个实施方案中，指示部分是可溶性萤光素酶，其在宿主微生物裂解时释放出来。
因此，在可替换的实施方案中，指示剂底物可以与保持结合滤器或结合平板表面的样品部分一起孵育。因此，在一些实施方案中，固体支持物是96-孔滤器平板(或常规96-孔平板)，并且通过将平板直接放入光度计中来检测底物反应。
例如，在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括步骤：用能够在感染时表达萤光素酶的多个亲本指示噬菌体感染96-孔滤板上捕获的细胞；洗掉过量噬菌体，添加LB肉汤并允许噬菌体复制和裂解特定大肠杆菌靶的时间(例如，30-90分钟)；和通过加入萤光素酶底物并直接在96-孔平板中测量萤光素酶活性来检测指示剂萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表示样品中存在大肠杆菌O157:H7。
在另一个实施方案中，本发明可以包括用于检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括步骤：用感染时能够表达萤光素酶的多个亲本指示噬菌体感染96-孔平板中的液体溶液或悬浮液中的细胞；允许噬菌体复制并裂解特定大肠杆菌靶的时间(例如，30-90分钟)；和通过加入萤光素酶底物并直接在96-孔平板中测量萤光素酶活性来检测指示剂萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表示样品中存在大肠杆菌O157:H7。在这样的实施方案中，不需要捕获步骤。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是可消费的测试样品，如蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩LB肉汤或营养肉汤强化的蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是在LB肉汤中稀释的细菌。
在一些实施方案中，微生物的裂解可以在检测步骤之前、之中或之后发生。实验表明在一些实施方案中，添加萤光素酶底物时，受感染的未裂解的细胞是可检测的。据推测，萤光素酶可能脱离细胞和/或萤光素酶底物可能进入细胞，而没有完全的细胞溶解。因此，对于利用旋转滤器***的实施方案，其中在光度计中只分析释放至裂解物中的萤光素酶(而不是萤光素酶仍然在完整的细菌内部)，需要裂解来用于检测。然而，对于利用滤板或96-孔平板和溶液或悬浮液中的样品的实施方案，其中充满完整和裂解细胞的初始平板在光度计中直接测定，对于检测，不需要裂解。
在一些实施方案中，指示部分(例如，萤光素酶)与底物的反应可能持续30分钟或更长，并且对于优化灵敏度，在不同时间点的检测可能是理想的。例如，在使用96-孔滤板作为固体支持物和萤光素酶作为指示剂的实施方案中，可以在初始以及以10-或15-分钟间隔获取光度计读数，直至反应完成。
令人惊讶地，对于感染测试样品利用高浓度的噬菌体(即，高MOI)成功地实现了在非常短的时间周期中非常少量的目标微生物的检测。在一些实施方案中，将噬菌体与测试样品一起孵育只需要足够用于单个噬菌体生命周期的时间长度。在一些实施方案中，用于此孵育步骤的噬菌体浓度高于7×106，8×106，9×106，1.0×107，1.1×107，1.2×107，1.3×107，1.4×107，1.5×107，1.6×107，1.7×107，1.8×107，1.9×107，2.0×107，3.0×107，4.0×107，5.0×107，6.0×107，7.0×107，8.0×107，9.0×107或10.0×108PFU/mL。
使用这样的高浓度噬菌体的成功是令人惊讶的，因为大量的噬菌体之前与“自外溶菌作用”相关，其杀灭靶细胞并由此防止从早期噬菌体测试产生有用的信号。可能是本文中所述的制备的噬菌体储液的清除有助于减轻这个问题(例如，通过氯化铯等密梯度超离心的清除)，因为除了除去任何与噬菌体相关的污染萤光素酶，这种清除也可能除去了菌蜕粒子(具有丢失的DNA的颗粒)。这种菌蜕粒子可以通过“自外溶菌作用”裂解细菌细胞，过早地杀灭细胞并由此防止指示信号的产生。电子显微镜证明了粗制JG04裂解物(即，在氯化铯清除之前)具有高于50％的菌蜕。这些菌蜕粒子可以通过刺穿细胞膜的许多噬菌体颗粒的作用引起微生物过早的死亡。因此，菌蜕粒子可能引起之前的问题，其中报道了高PFU浓度是有害的。此外，非常干净的噬菌体制备允许没有洗涤步骤而进行测试，这使得无浓缩测定是可能的。
旋转柱测定
图5显示了根据本发明的实施方案，使用产生可溶性萤光素酶的指示噬菌体的策略。在这种方法中，噬菌体(例如，T7、T4或JG04噬菌体)可以被工程化，以在噬菌体复制过程中表达可溶性萤光素酶。萤光素酶的表达通过病毒衣壳启动子来驱动(例如，噬菌体T7或T4晚期启动子)，产生高表达。亲本噬菌体将不含萤光素酶，因此测试中检测的萤光素酶必须来自细菌细胞感染过程中子代噬菌体的复制。因此，通常不需要从子代噬菌体分离出亲本噬菌体。
在这些实验中，将至少部分包含待定量大肠杆菌细菌502的样品500放入旋转柱滤器中并离心除去LB肉汤，并且加入合适多重性的遗传工程化来表达可溶性萤光素酶503的T7噬菌体504。可以将感染的细胞孵育足以发生子代噬菌体复制和细胞溶解的时间(例如，37℃下30-90分钟)。然后可以收集(例如，通过离心)裂解物中的亲本504和子代噬菌体516加游离萤光素酶503，并且使用光度计518定量滤液中的萤光素酶水平。或者，可以使用高通量方法，其中将细菌样品施加于96-孔滤板中，并且进行以上所列的所有操作后，可以直接在初始96-孔滤板中测试萤光素酶，而没有最终的离心步骤。
来自本发明实施方案的实例实验的数据显示于图6-9中。结果证明本发明的可替换实施方案利用指示噬菌体通过指示噬菌体感染细菌产生的可溶性萤光素酶的检测来测试样品细菌。将作为相对光单位(RLU)校准的指示剂检测水平相对于从标准过夜菌落形成单位(CFU)测定所确定的细胞浓度进行作图，并表示为“细胞/测定”，因此证明相似的灵敏度。提高萤光素酶信号对应于提高输入样品细胞，证明剂量依赖性响应。
如图6中所示，本发明的方法可以证明使用指示噬菌体和旋转柱滤器，对于靶细菌的检测的高灵敏度。在这个测定中，通过离心在旋转滤器上收集测试样品，并与包括可溶性萤光素酶的基因的指示噬菌体一起孵育(例如，如图1中所示)。孵育足以感染的时间(例如，室温下10分钟)后，可以洗涤滤器并旋转以除去过量输入噬菌体。可以加入培养基(例如，LB肉汤)并孵育(例如，在37℃下30分钟)，以允许子代噬菌体的复制和细菌的裂解。可以再次旋转滤器，以除去滤液，其可以转移至光度计平板，并进行萤光素酶测试(例如，使用光度计，使用萤光素酶测定试剂的注射，Promega，Inc.)。可以根据平行CFU测定中的菌落数量校正细胞计数。
如图6中所示，在初始样品中可以检测到大约1,700个细菌细胞，并且进一步的连续稀释测定可以证明检测降至平均1.7个细胞，对应于1或2个细胞的实际检测。这表明少如1至3个大肠杆菌细胞的感染可以通过萤光素酶活性提供可测量的信号。这也表明甚至单个细胞相对于背景的存在或不存在的统计学显著性(p值＝0.018)。
图7证明了使用较宽范围的细胞数量的连续稀释，对于图5的测试描述的相同方法的非常大的检测范围。这表明检测范围可以从平均1.4个细胞至1.4千万个细胞。
滤板测定
如上所述，在某些实施方案中，可以在为滴定测定平板的孔中直接进行测定。例如，图8证明了使用指示噬菌体，用96-孔滤板用于捕获和检测。该方法与以上针对图5所述的相同，除了整个测试在96-孔滤板中进行，包括萤光素酶反应。与旋转滤器方法相比，这个实施方案减少了操作和材料。减少的操作和96-孔滤板的使用顺从高通量测定情况，并且根据本发明的实施方案，适用于与液体操作机器人一起使用。图8显示了在这个实施方案中，96-孔滤器平板可以用于检测单个大肠杆菌细胞(测定平均0.5个细胞，证实约一半的孔接收了单个细胞)、5.4和54个细胞。
图9证明了在某些实施方案中，使用96-孔***，对于相同的测定，可以获得非常大的细胞浓度检测范围，从平均少于1个细胞/测定(单个细胞)至至少1.4千万个细胞/测定。添加萤光素酶底物后不同时间点的多次读数可以证明各种各样的灵敏度。使用15分钟读数获得了对于检测<10个细胞的灵敏度，并且在30分钟读数可以获得降至单个细胞水平的灵敏度。因此，如果不需要检测数十个细胞或更少的细胞，可以节约时间。注意到两个实验中响应提高数量的输入样品细胞，信号提高，再次证明了剂量依赖性响应。
图10描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测靶细菌的滤板测定。利用这种测定的实际实验描述于实施例6中。简而言之，可以将包括靶细菌1018的样品1016加入多孔滤板1004的孔1002中并旋转1006，以通过从样品除去液体来浓缩样品。将遗传修饰的噬菌体1020加入孔中并与添加的另外的培养基一起孵育，持续足够的时间，以用于吸收1008，接着是靶细菌的感染和噬菌体生命周期的进展1010(例如，～45分钟)。最后，加入萤光素酶底物并与任何存在的萤光素酶反应1024。在光度计1014中测量所得到的发射，所述光度计检测萤光素酶活性1026。图11显示了来自图10所绘滤板测定的结果，使用噬菌体来检测具有已知细胞数的样品中的大肠杆菌O157:H7细胞。Student’s t-检验表明每个测试0个细胞和1个细胞之间0.034的p值，证明统计学显著性。
在某些实施方案中，可以进行测定而没有浓缩捕获表面上或附近的细菌。图12说明了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测靶细菌的“无浓缩测定”。将等份的指示噬菌体1214分配至多孔平板1204的单独孔1202中，然后加入含有细菌1212的测试样品等份试样并孵育1206(例如，37℃下45分钟)，持续足以使噬菌体复制并产生可溶性指示剂1216(例如，萤光素酶)的时间。然后可以测定1210含有可溶性指示剂和噬菌体的平板孔1208，以测量平板上的指示剂活性1218(例如，萤光素酶测定)。利用这种方法的真正实验描述于实施例7-9中。在这个实施方案中，测试样品没有浓缩(例如，通过离心)，而只是与指示噬菌体一起直接孵育一段时间，并随后测定萤光素酶活性。
图13显示了来自图12中所绘的无浓缩测定类型测定的结果，使用JG04-OpLuc噬菌体检测具有低数量范围的已知细胞数的样品(即，大量稀释的细胞样品)中的大肠杆菌O157:H7。如实施例7中所述，这个实验证明了每个测定0个细胞和1个细胞的信号之间可以看到统计学显著差异(通过ANOVA检验，p值＝0.0024)，证明了检测单个细胞的能力。因此，该测定是令人惊讶地灵敏的。具有每孔少于1个细胞的样品似乎显示出高于背景信号的成比例的孔数。
图14显示了来自无浓缩测定的结果，使用JG04-OpLuc噬菌体检测具有非常低至非常高数量范围的已知细胞数的样品(即，含有少于1个细胞/测定至上百万个细胞的样品)中的大肠杆菌O157:H7。如实施例8中所述，这个实验证明了来自每个测定0个细胞和1.1个细胞的信号之间的统计学显著差异(p值＝0.000702，Student’s t-检验)，证明了检测单个细胞的能力。每个测定更多个细菌细胞表明信号以剂量依赖性方式递增，高达至少106个细菌细胞/测定，令人惊讶地证明了非常宽的检测范围。
图15显示了来自无浓缩测定的结果，如实施例9中所述的，使用JG04-OpLuc噬菌体检测具有已知细胞数量的蔬菜洗涤样品中的大肠杆菌O157:H7。
为了制备蔬菜洗涤液，将蔬菜叶(例如，菠菜或生菜)称重并加入干净的塑料袋中。每克(g)蔬菜加入一mL LB(+/-0.01-0.05％Tween20)。将叶子和溶液手动混合几分钟。然后从塑料袋中提取液体并用作“蔬菜洗涤液”。使用这种方法，发现在单片菠菜叶(1-2g)上存在～1百万个细菌。
测试是定量的，因为检测的信号与样品中的目标微生物的量成比例。例如，在图15中所绘的实验中，将已知数量的大肠杆菌O157:H7细胞加入蔬菜洗涤液样品中，以刺激植物被致病细菌污染。使用蔬菜洗涤液样品的实验证明了来自每个测定0个细胞和3个细胞的信号之间的显著差异，证明了检测蔬菜洗涤液中个位数细胞数量的能力。每个测定使用更多细菌细胞显示出信号以剂量依赖性方式递增。蔬菜洗涤液含有约106个非靶细菌/mL，对应于这个测定中每个样品至少105个非靶细菌(包括0个大肠杆菌O157:H7对照)。分辨来自105个非靶细菌的少如3个靶细菌细胞的能力是令人惊讶的，并再次证明了测试的特异性。
暴露于感染原前的微生物捕获
在一些实施方案中，本发明包括不需要捕获微生物步骤的方法和***。其他实施方案允许从样品物理分离细菌细胞。本文中所述的方法可以用作促进样品中存在的低水平微生物(例如，单个微生物)检测的手段。捕获步骤可以基于特定的结合剂，如识别目标微生物的抗体，或可以基于针对微生物的其他特征的选择，如大小分级。
在一些实施方案中，基于分子特异性(例如，大小)以外的其他物理特征来捕获微生物。在一些实施方案中，本发明利用微生物的物理大小将其捕获在固体支持物上。在一些实施方案中，固体支持物是滤器。例如，将样品通过细菌滤器(例如，0.45μm孔径旋转滤器)过滤允许较小的物质通过，而保留完整的细菌。或者，可以使用板滤来捕获微生物，或可以使用各种其他滤器设备(例如，96-孔滤板)。
例如，所述方法可以包括收集固体支持物上的微生物的步骤，如例如，将样品通过细菌滤器过滤。基于大小捕获后，可以使用任何特异性靶向目标微生物的结合剂。例如，可以用捕获的微生物孵育感染原，以特异性地靶向和鉴定目标微生物。可以使用分离样品中的微生物的其他方法。在一些实施方案中，检测步骤可以在这样的捕获步骤之前、同时或之后进行。
在一些实施方案中，可以使用对目标微生物具有高特异性的结合剂，作为促进样品中存在的低水平微生物(例如，单个微生物)的特异性捕获的手段。在一些实施方案中，待测试的大体积液体样品可能需要在进一步测试前有效地浓缩。
例如，单个细菌，其可能具有约一立方微米的体积，可以从具有1012立方微米体积的一微升样品中分离出来。在这样的实施方案中，捕获步骤可以包括将样品接触多个(过量)的亲和性纯化捕获抗体或抗体片段。
一些实施方案利用相对特定目标微生物的表面上发现的抗原分子产生的亲和性纯化的和/或反向纯化的表面特异性抗体或抗体片段。这样的抗体或抗体片段可以特异性地鉴定用于捕获或检测目的或两者的微生物。证明对各种细菌或其他微生物上的表面抗原特异性识别的抗体可以从各种来源商业购得，如Kirkegaard&Perry Laboratories，Inc.(KPL)或Abcam。
在本发明的一些实施方案中，识别特定微生物(例如，大肠杆菌O157:H7)的微生物表面抗原的亲和性纯化和/或反向纯化的表面特异性抗体不识别其他相似的微生物(例如，大肠杆菌B)。在一些实施方案中，对例如大肠杆菌B或大肠杆菌O157:H7特异性的抗体不识别鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的细胞。这表示另一种令人惊讶的发现，因为许多细菌具有例如表面脂多糖(革兰氏阴性细菌)或脂磷壁酸(***)分子，之前认为是高度相似的，尤其是在密切相关的种之间。
本文中公开的用于基于抗体的捕获的方法适用于其没有与其他微生物交叉反应的表面特异性抗体是可利用的任何靶细菌或其他微生物(例如，致病微生物)。
例如，在一些实施方案中，本发明的捕获步骤可以使用微生物特异性的捕获抗体或抗体片段，以促进微生物的捕获。在一些实施方案中，捕获抗体可以与结合连接固体支持物(例如，珠粒或平板表面)的另一种结合剂的化学部分缀合。例如，在一些实施方案中，捕获抗体可以生物素化，以促进与结合固体支持物的抗生物素蛋白链菌素结合。在一些实施方案中，固体支持物包括磁珠。在其他实施方案中，固体支持物包括平板表面或多孔平板(例如，ELISA平板)的表面。例如，ELISA平板可以覆盖特异性识别目标微生物的抗体。
在某些实施方案中，可以通过微生物与随后结合固体支持物的游离捕获抗体或抗体片段的结合，将微生物从样品的其他成分中分离出来。在一些实施方案中，捕获抗体或抗体片段包括结合第二种试剂(例如，抗生物素蛋白链菌素)的结合剂(例如，生物素)，所述第二种试剂结合固体支持物。
在一些实施方案中，例如，如果用生物素标记捕获抗体，该方法可以进一步包括使样品与多个磁性抗生物素蛋白链菌素覆盖的珠粒接触，以结合细菌-抗体复合物，并且用磁铁捕获珠粒-抗体-细菌复合物，以分离细菌。或，可以使用纯化生物素-抗体:细菌复合物的其他方法。使用这样的实施方案，一毫升样品中的细菌可以浓缩至一微升(～1000倍)，有利于通过本文中所述的方法进一步检测和/或定量。
因此，在一些实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，其中捕获步骤包括从样品中的其他组分中特异性地分离微生物。
或者，在一些实施方案中，捕获步骤可以基于目标微生物的其他特征，如大小。在利用基于大小捕获的实施方案中，固体支持物可以是旋转柱滤器。在一些实施方案中，固体支持物包括96-孔滤板。或，用于捕获的固体支持物可以是阵列或移动支持物(如珠粒)上的一个位置。
因此，在一些实施方案中，可以使用上述方法，在检测之前，从大的体积中捕获并分离目标微生物。例如，可以使用捕获抗体或抗体片段的属性来特异性地分离微生物。在一些实施方案中，捕获抗体是生物素化的，使得其有利于随后细胞-抗体复合物与磁性抗生物素蛋白链菌素珠粒的结合。或，捕获抗体可以与另一种蛋白质或其他分子缀合，其有利于珠粒或另一种固体支持物上的捕获。这样的实施方案可以提供提高的灵敏度，特别是在初始样品体积大的情况下。因此，所述方法可以包括连接多个可以特异性地结合目标微生物上的表面抗原的结合剂的步骤，其由此有利于结合捕获固体支持物。
或者，可以使用结合抗细菌抗体的另一个化学部分来覆盖磁珠。例如，可以使用识别或结合抗细菌抗体的二抗覆盖的珠粒。然后可以分离结合珠粒的细菌。在一个实施方案中，可以通过将结合的细菌涂覆在珠粒和未结合的上清液级分并计数所得到的菌落(CFU)来定量捕获的效率。在其他实施方案中，测量通过与底物(即，用于指示部分的底物试剂)反应产生的信号，用于检测。
在一些实施方案中，使用固体支持物上的特异性捕获证明了抗体的特异性。本发明的一种方法包括通过使用具有微生物特异性的结合剂的基质从样品获得和浓缩微生物(例如，细菌)的步骤。在一个实施方案中，将结合剂固定于固体支持物上(例如，磁珠)，或是游离的并随后固定于固体支持物上。然后从样品取出固定的微生物(例如，通过分离、滗析、磁力或其他合适的分离技术)并通过各种技术来检测。
图16描绘了通过使用相对完整大肠杆菌O157:H7产生的抗体从样品特异性捕获大肠杆菌O157:H7而不是大肠杆菌B或鼠伤寒沙门氏菌的实例实施方案。因此，在某些实施方案中，用抗生物素蛋白链菌素覆盖的磁珠可以用于分离用生物素化的多克隆抗体(KPL)预先孵育的大肠杆菌O157:H7，所述抗体亲和性纯化和反向纯化，以最小化与其他微生物物种的交叉反应性。在某些实施方案中，使用特异性的大肠杆菌O157:H7抗体时，捕获级分(即，珠粒级分)中只存在大肠杆菌O157:H7，并且在上清液(未结合)级分中将没有收集到细菌。在某些实施方案中，使用大肠杆菌O157:H7特异性抗体时，在上清液级分中只发现了大肠杆菌B和鼠伤寒沙门氏菌，说明这些抗体的显著特异性。在不存在抗体的情况下，在上清液级分中发现了所有三种类型的细菌。
杂合免疫噬菌体(HIP)测定
在某些实施方案中，本发明的方法结合使用了结合剂(例如，抗体)，以除了用感染原检测以外从样品纯化和/或浓缩目标微生物。例如，在某些实施方案中，本发明包括用于检测样品中的目标微生物的方法，包括步骤：使用目标微生物特异性的捕获抗体从之前的支持物上的样品捕获微生物；将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包括***噬菌体晚期基因区中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物；并检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表示样品中存在目标微生物。
例如，图17描绘了根据本发明的实施方案，使用修饰的噬菌体检测靶细菌的杂合免疫噬菌体(HIP)测试。首先将样品施加于覆盖了细菌特异性抗体1702的微滴定平板孔中。然后将平板离心以促进细菌与捕获抗体1704的结合。足够时间以允许完全细菌捕获后，将含有细菌特异性的-噬菌体的溶液加入每个样品1706中。与噬菌体一起孵育导致单个或多个噬菌体结合和连接捕获的细菌1708。最后，孵育样品，以促进噬菌体复制和萤光素酶表达，其导致细胞溶解和可溶性萤光素酶1710的释放。
图18显示了来自HIP测定的结果，如实施例11中所述的，使用噬菌体来检测具有对数规模的已知细胞数的样品中的大肠杆菌O157:H7。HIP测定能够用大约2×106个PFU噬菌体检测LB培养基中的100和1,000个大肠杆菌O157:H7。超过无细胞样品的平均信号范围从100个细胞样品的大约50倍至1,000个细胞样品的超过1,000倍。
在一些实施方案中，本文中所述方法的孵育步骤包括高于7×106，8×106，9×106，1.0×107，1.1×107，1.2×107，1.3×107，1.4×107，1.5×107，1.6×107，1.7×107，1.8×107，1.9×107，2.0×107，3.0×107，4.0×107，5.0×107，6.0×107，7.0×107，8,0×107，9.0×107或1.0×108PFU/mL的最终噬菌体浓度。之前认为这种高噬菌体浓度对于这样的测定是有害的，并且因此产生令人惊讶的结果。在一些实施方案中，本发明的方法需要少于3小时、少于2.5小时、少于2小时、少于1.5小时或少于1小时，用于检测目标微生物。在一些实施方案中，所述方法可以检测少如100，50，20，10，9，8，7，6，5，4，3或2个目标微生物细胞。这些是比之前认为可能的更短时间周期。在一些实施方案中，甚至单个微生物细胞也是可检测的。在其他实施方案中，本发明包括***(例如，计算机***、自动化***或试剂盒)，其包括用于进行本文中公开的方法和/或使用本文中修饰的感染原的组成部分。
本发明的***和试剂盒
在一些实施方案中，本发明包括***(例如，自动化***或试剂盒)，其包括用于进行本文中公开的方法的组成部分。鉴于进行所述方法需要少量的试剂和材料，本文中所述的一些实施方案特别适用于自动化或试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒的每个组成部分可以包括可以从第一个位点传送至第二个位点的自包含单元。
在一些实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的***或试剂盒。在某些实施方案中，所述***或试剂盒包括将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分和用于检测指示部分的组成部分，其中感染原包括指示部分。在本发明的***和试剂盒的一些实施方案中，感染原是感染目标微生物的重组噬菌体，并且重组噬菌体包含***噬菌体的晚期基因区中的指示基因作为指示部分，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性的指示蛋白产物。一些***进一步包括用于捕获固体支持物上的目标微生物的组成部分。
在某些实施方案中，***和/或试剂盒可以进一步包括用于洗涤捕获的微生物样品的组成部分。另外地或替换地，***和/或试剂盒可以进一步包括用于测定指示部分的量的组成部分，其中检测的指示部分的的量对应于样品中的微生物的量。例如，在某些实施方案中，***或试剂盒可以包括用于测量萤光素酶活性的光度计或其他设备。
在一些***和/或试剂盒中，相同的组成部分可以用于多个步骤。在一些***和/或试剂盒中，步骤是自动化的或通过使用者经由计算机输入来控制和/或其中液体操作机器人进行至少一个步骤。
因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的***，该***包括：用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分，其中感染原包括指示部分；用于从固体支持物上的样品捕获微生物的组成部分；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染原的组成部分；和用于检测指示部分的组成部分。在一些实施方案中，相同组成部分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤。一些实施方案另外包括用于测定样品中的目标微生物的量的组成部分，其中检测的指示部分的量对应于样品中的微生物的量。这样的***可以包括与以上针对快速检测微生物方法描述的那些类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌，并且感染原是噬菌体。在计算机化的***中，***可以全自动化、半自动化或由使用者通过计算机指引(或其一些组合)。
在一些实施方案中，***可以包括用于从样品中的其他组分分离出目标微生物的组成部分。
在一个实施方案中，本发明包括一种包括用于检测目标微生物的组成部分的***，其包括：用于从样品中的的其他组分分离出目标微生物的组成部分；用于用多个亲本感染原感染至少一个微生物的组成部分；用于裂解至少一个受感染微生物以释放微生物中存在的子代感染原的组成部分；和用于检测子代感染原或子代感染原组分的组成部分，其中感染原或感染原组分的检测表示样品中存在微生物。
***可以包括用于检测子代感染原的各种组成部分。例如，在一个实施方案中，子代感染原(例如，噬菌体)可以包括指示部分。在一个实施方案中，子代感染原(例如，噬菌体)中的指示部分可以是在复制过程中表达的可检测部分，如可溶性萤光素酶蛋白。
在其他实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的试剂盒，该***包括：用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分，其中感染原包括指示部分；用于从固体支持物上的样品捕获微生物的组成部分；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染原的组成部分；和用于检测指示部分的组成部分。在一些实施方案中，相同的组成部分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤。一些实施方案另外包括扩用于测定样品中的目标微生物量的组成部分，其中检测的指示部分的量对应于样品中的微生物量。这样的试剂盒可以包括与以上针对快速检测微生物的方法描述的那些类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌，并且感染原是噬菌体。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于从样品中的其他组分中分离目标微生物的组成部分。
在一个实施方案中，本发明包括包括用于检测目标微生物的组成部分的试剂盒，其包括：用于从样品中的其他组分中分离出至少一个微生物的组成部分；用于用多个亲本感染原感染至少一个微生物的组成部分；用于裂解至少一个受感染的微生物以释放微生物中存在的子代感染原的组成部分；和用于检测子代感染原或子代感染原的组分的组成部分，其中感染原或感染原的组分的检测，表示样品中存在微生物。
试剂盒可以包括用于检测子代感染原的各种组成部分。例如，在一个实施方案中，子代感染原(例如，噬菌体)可以包括指示部分。在一个实施方案中，子代感染原(例如，噬菌体)中的指示部分可以是在复制过程中表达的可检测部分，如可溶性萤光素酶蛋白。
本发明的这些***和试剂盒包括各种组成部分。如本文中使用的，术语“组成部分”宽泛限定，并且包括适用于进行所述方法的任何合适的装置或装置的集合。组成部分不需要以任何特定方式相对于彼此完整地连接或安置。本发明包括相对于彼此任何合适的组成部分的排列。例如，组成部分不需要在同一个房间中。但在一些实施方案中，组成部分在成套机组中彼此连接。在一些实施方案中，相同的组成部分可以进行多个功能。
计算机***和计算可读介质
本发明或其任何组成部分中所述的***可以以计算机***的形式来具体说明。计算机***的典型实例包括通用计算机、程序化微处理器、微控制器、外周集成电路元件和能够执行组成本发明技术方法的步骤的其他设备或设备的排列。
计算机***可以包括计算机、输入装置、显示单元和/或互联网。计算机可以进一步包括微处理器。微处理器可以连接通讯总线。计算机还可以包括存储器。存储器可以包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机***可以进一步包括存储设备。存储设备可以是硬盘驱动器或可移动存储设备，如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备还可以是用于将计算机程序或其他指令加载至计算机***中的其他相似装置。计算机***还可以包括通讯单元。通讯单元允许计算机通过I/O界面连接其他数据库和互联网。通讯单元允许将数据转移至其他数据库，以及从其他数据库接收数据。通讯单元可以包括调制解调器、以太网卡或能够使计算机***连接数据库和网络的任何相似设备，如LAN、MAN、WAN和互联网。计算机***因此有利于从使用者通过输入设备输入，通过I/O界面进入***。
计算设备通常将包括提供用于一般管理和计算设备操作的可执行程序指令的操作***，并且通常将包括存储指令的计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)，当通过服务器的处理器执行时，所述指令允许计算设备进行其预定的功能。用于计算设备的操作***和一般功能性的合适指令是已知的或商业可购得的，并且容易由本领域普通技术人员来执行，特别是根据本文中的公开内容。
计算机***执行一套存储在一个或多个存储元件中的指令，以处理输入数据。存储元件还可以按照需要容纳数据或其他信号。存储元件可以是处理器中存在的信息源或物理存储元件的形式。
环境可以包括如上讨论的各种数据存储以及其他存储器和存储介质。这些可以停留在各种位置，如一个或多个计算机本地(和/或存在于内部)的存储介质或通过网络远程来自任一个或全部计算机。在特定组的实施方案中，信息可以存在于本领域技术人员熟悉的存储区网络(“SAN”)。相似地，用于进行归属于计算机、服务器或其他网络设备的功能的任何所需文件可以本地和/或远程存储，按照需要。在***包括计算设备的情况下，每个这样的设备可以包括可以通过总线电耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入设备(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)和至少一个输出设备(例如，显示设备、打印机或扬声器)。这样的***还可以包括一个或多个存储设备，如盘驱动器、光存储设备和固态存储设备，如随机存取存储器(“RAM”)或只读存储器(“ROM”)，以及可移动介质设备、存储卡、闪卡等。
这样的设备还可以包括如上所述的计算机可读存储介质阅读器、通讯设备(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通讯设备等)和工作存储器。计算机可读存储介质阅读器可以连接计算机可读存储介质或配置成接收计算机可读存储介质，所述存储介质表示远程、本地、固定的和/或可移动的存储设备以及用于临时和/或更多永久含有、存储、传输和接收计算机可读信息的存储介质。***和各种设备通常还将包括各种软件应用、模块、服务器或位于至少一个工作存储设备内的其他元件，包括操作***和应用程序，如客户应用或Web浏览器。应当认识到可替换的实施方案可以具有来自上述的各种变化。例如，还可以使用定制硬件和/或硬件、软件(包括便携式软件，如applet)或两者中可以执行特定元件。此外，可以使用与其他计算设备(如网络输入/输出设备)的连接。
用于包含编码或编码的一部分的非瞬态存储介质和计算机可读介质可以包括本领域已知或使用的任何合适介质，包括存储介质和通讯介质，如但不限于在任何方法或技术中执行的易变和非易变、可移动和不可移动的用于信息(如，计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的存储和/或传送的介质，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其他光学存储、磁盒、磁带、磁盘存储或其他磁存储设备，或任何其他可以用于存储所需信息并可以由***设备存取的介质。基于本文中提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将认识到用于实施各种实施方案的其他方式和/或方法。
计算机可读介质可以包括，但不限于，能够给处理器提供计算机可读指令的电、光、磁或其他存储设备。其他实例包括，但不限于，软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(“CAM”)、DDR、闪存，如NAND闪存或NOR闪存、ASIC、配置的处理器、光存储、磁带或其他磁存储，或从其计算处理器可以阅读指令的任何其他介质。在一个实施方案中，计算设备可以包括单种类型的计算机可读介质，如随机存取存储区(RAM)。在其他实施方案中，计算设备可以包括两种或更多种类型的计算机可读介质，如随机存取存储器(RAM)、盘驱动器和快速缓冲存储区。计算设备可以联通一个或多个外部计算机可读介质，如外部硬盘驱动器或外部DVD驱动器。
如以上讨论的，所述实施方案包括配置成执行计算机可读程序指令和/或存取存储器中储存的信息的处理器。指令可以包括由汇编者和/或解释器从以任何合适的计算机编程语言书写的代码产生的处理器特异性的指令，所述编程语言包括，例如，C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(Adobe Systems，MountainView，Calif.)。在一个实施方案中，计算设备包括单个处理器。在其他实施方案中，设备包括两个或更多个处理器。这样的处理器可以包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。这样的处理器可以进一步包括可编程的电子设备，如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑设备(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、电可编程只读存储器(EPROM或EEPROM)，或其他相似的设备。
计算设备包括网络界面。在一些实施方案中，网络界面配置成通过有线或无线通讯链接来通讯。例如，网络界面可以允许通过以太网、IEEE802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外等通过网络通讯。作为另一个实例，网络界面允许通过如CDMA、GSM、UMTS或其他蜂窝通信网络这样的网络来通讯。在一些实施方案中，网络界面允许与另一个设备点对点连接，如通过通用串行总线(USB)、1394FireWire、串联或并联，或相似界面。合适的计算设备的一些实施方案可以包括两个或更多个网络界面，用于通过一个或多个网络通讯。在一些实施方案中，除了网络界面以外或替代网络界面，计算设备可以包括数据存储。
合适的计算设备的一些实施方案可以包括各种外部或内部设备或与各种外部或内部设备联通，所述设备如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、扬声器、一个或多个麦克风，或任何其他输入或输出设备。例如，计算设备可以与各种使用者界面设备和显示器联通。显示器可以使用任何合适的技术，包括，但不限于，LCD、LED、CRT等。
用于通过计算机***执行的指令组可以包括命令处理器执行特定任务(如组成本发明技术的方法的步骤)的各种要求。指令组可以是软件程序的形式。此外，软件可以是分开的程序的集合、具有较大程序的程序模块或程序模块的一部分的形式，如在本文中的技术中。软件还可以包括面向目标变成形式的模块编程。通过处理器的输入数据的处理可以是响应使用者要求、之前处理的结果或由另一个处理器形成的要求。
尽管已经关于某些实施方案公开了本发明，但所述实施方案的多种修改、变化和改变都是可能的，而没有脱离所附权利要求中限定的本发明的范围和精神。因此，认为本发明不限于所述的实施方案，而是具有由以下权利要求的语言限定的完整范围及其等价体。
本文中所述技术的一些实施方案可以根据以下编号段落中的任何一个来限定：
(1)重组噬菌体，包括***噬菌体晚期基因区中的指示基因，和任选其中晚期基因是III类基因区，和任选其中指示基因的转录由噬菌体III类或“晚期”启动子来控制。
(2)段落1的重组噬菌体，其中噬菌体源自T7、T4、T4-样、JG04的噬菌体或具有与T7、JG04、T4或其他T4-样噬菌体具有至少90％同源性的基因组的另一种天然噬菌体；和/或其中检测的指示部分的量对应于样品中存在的目标微生物的量。
(3)段落1-2中任一个的噬菌体，其中指示基因不编码融合蛋白和/或其中指示基因邻近主要衣壳基因，和任选其中宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。
(4)段落1-3中任一个的噬菌体，其中指示基因编码萤光素酶，和任选其中萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火萤光素酶或工程化萤光素酶中的一种。
(5)一种检测样品中的目标微生物的方法，包括步骤：将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包括***噬菌体晚期基因区中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表示样品中存在目标微生物。
(6)段落5的方法，其中晚期基因区是III类基因区，和任选其中指示基因的转录受噬菌体III类启动子的控制。
(7)段落5或6的方法，其中噬菌体源自T7、T4、T4-样、JG04或具有与T7、T4或其他T4-样噬菌体具有至少90％同源性的基因组的另一种天然噬菌体；和/或其中检测的指示部分的量对应于样品中存在的目标微生物的量。
(8)段落5-7中任一个的方法，其中指示基因不编码融合蛋白和/或其中指示基因邻近主要衣壳基因，和任选其中宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。
(9)段落5-8中任一个的方法，其中指示基因编码萤光素酶，和热选其中萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火萤光素酶或工程化萤光素酶中的一种。
(10)段落5-9中任一个的方法，其中用于孵育步骤的噬菌体浓度高于1×107PFU/mL，和任选其中在与样品一起孵育之前使用氯化铯等密度梯度离心来纯化重组噬菌体。
(11)段落5-10中任一个的方法，进一步包括在孵育步骤前从固体支持物上的样品捕获微生物的步骤；和任选其中固体支持物包括多孔平板或滤器；和任选其中捕获步骤进一步包括用捕获抗体结合微生物；和任选其中捕获抗体有利于微生物与固体支持物的结合；和任选其中该方法进一步包括在添加噬菌体后而在孵育前，用于洗涤捕获和感染的微生物的步骤，以除去过量的噬菌体和/或污染报道蛋白，如萤光素酶。
(12)段落5-11任一个的方法，其中在短于使用富集培养将微生物的数量提高至原来的4-倍或10-倍所需的时间段的时间中完成目标微生物的检测；和任选其中该方法可以检测样品中≤10微生物细胞，和任选其中用于检测所需的总时间少于2小时。
(13)一种用于快速检测样品中的目标微生物的***，包括：用于用目标微生物特异性的感染原孵育样品的组成部分，其中感染原包括指示部分；和用于检测指示部分的组成部分；和任选进一步包括用于测定样品中的目标微生物的量的组成部分，其中检测的指示部分的量对应于样品中微生物的量；和任选进一步包括用于捕获固体支持物上的目标微生物的组成部分，和/或进一步包括用于洗涤捕获的微生物样品的组成部分，和任选其中相同的组分可以用于多个步骤。
(14)段落13的***，其中感染原是感染目标微生物的重组噬菌体，其中重组噬菌体包括***噬菌体晚期基因区中的指示基因，作为指示部分，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示剂的表达形成可溶性指示蛋白产物；和任选其中步骤是自动化的或通过使用者经由计算机输入来控制和/或其中液体操作机器人进行至少一个步骤；或其中***包括试剂盒。
(15)用于与段落5-12任一个的方法和/或段落13-14任一个的***一起使用的非瞬态计算机可读介质。
实施例
以下实施例中描述的结果，除了实施例11，是没有富集培养或没有孵育样品以实现样品细胞复制而获得的。此外，在“无浓缩测定”中，指示噬菌体直接加入样品中，没有浓缩细胞，可以感染和检测少量细胞，甚至单个细菌。
实施例1.指示噬菌体的形成
使用来自Millipore，Inc.的415-1噬菌体展示***形成了指示噬菌体。简而言之，购买纯化的DNA并用DNA限制酶EcoRI和HindIII(New EnglandBiolabs)消化，并随后纯化切割的DNA。用噬菌体T7上游区，包括晚期T7启动子，合成了用于野生型萤火萤光素酶(来自常见的东方萤火虫，Photinus pyralis)的基因，以确保萤光素酶基因的高水平表达。
合成的萤光素酶基因命名为SEQ ID NO.1。通过PCR扩增这个基因，以包括用于EcoRI和HindIII的相容性限制酶识别位点，来确保新基因可以***415-1基因组中，使用以下引物：
TATCTGAATTCTAAGTAACTGATAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAAC，命名为SEQ IDNO.2，和
AATGA AAGCTTTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTTCTTGG，命名为SEQ ID NO.3。
另外，在萤光素酶起始位点的上游添加所有3个阅读框中的终止密码子，以终止噬菌体主要衣壳蛋白(基因10B产物)的产生。415-1噬菌体展示***设计形成基因10B主要衣壳蛋白的融合产物及其下游***的任何小蛋白。终止密码子的添加确保没有形成融合产物，并且允许相对大的萤光素酶基因以可溶形式表达。用EcoR1和HindIII消化PCR产物，纯化，并连接415-1。使用BioRad MicroPulser电穿孔***，将连接产物***MegaX DH10B电感受态细胞(Invitrogen)中，并且将培养物涂布在大肠杆菌上，用于噬菌斑。挑选噬菌斑，并且将噬菌体生长于大肠杆菌DH10B中并通过蔗糖密度梯度离心纯化，用作指示噬菌体，415-Luc。
图1描绘了实例指示噬菌体415-Luc的基因组结构。可检测的指示部分由III类基因区内***的萤火萤光素酶基因编码，其在病毒生命周期晚期表达并以高于其他噬菌体基因的水平表达。构建体含有终止密码子，以确保萤光素酶不掺入天然基因产物中，如衣壳蛋白基因10B，并且因此不是融合单位。因此，这个构建体允许子代噬菌体表达可溶性萤火萤光素酶，作为待检测的指示剂。
实施例2.从环境分离和纯化大肠杆菌O157:H7特异性噬菌体。
连同从邻近的Ballona湿地的水样，获得了来自Hyperion污水处理厂的样品。将样品与粉末状营养肉汤(Gibco，Inc.)混合成1×，并用来自3mL混浊培养物的大肠杆菌O157:H7(ATCC 43888)接种。将样品在37℃下振荡孵育3小时，以富集感染大肠杆菌O157:H7的噬菌体，用120μL氯仿裂解，涡旋15秒，并将1mL样品在6800g下离心2分钟。将上清液过滤(0.45μm滤器)，并为了大肠杆菌O157:H7上的噬菌斑涂布。将这个样品以各种稀释度在噬菌斑测试中涂布，以获得孔分离的噬菌斑。用一次性移液管尖端刺入单个噬菌斑，并重悬浮于100μL TMS缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl2，和100mM NaCl)。
对大肠杆菌菌株O157:H7、B和DH10B，以及沙门氏菌菌株，在覆盖琼脂上进行5μL重悬浮噬菌斑的等份试样的斑点测试。只有澄清的O157:H7的噬菌体在大肠杆菌O157:H7中扩增，裂解物通过离心澄清，并使用缓冲液交换柱，将颗粒投入TMS缓冲液中。
将八个密切相关的噬菌体分离物在大肠杆菌O157:H7上生长，纯化，并分离基因组和测序。三个基因组类型全部显示出与T4-样噬菌体RB69具有98％同源性。基于这种同源性，将晚期基因作图，并且选择噬菌体JG04用于进一步的研究。图2显示了JG04，并将JG04的基因组命名为SEQ ID NO.4。
实施例3.重组指示噬菌体的产生和纯化
基于晚期基因区的序列分析和定位，使用针对各种报道基因的***片段合成了同源重组序列，所述报道基因由不同的萤光素酶蛋白组合，如图3中所示。具体地，使用了三个构建体：萤火萤光素酶同源重组质粒，pUC57.HR.Fluc，对应于SEQ ID NO.5；同源重组质粒，pUC57.HR.对应于SEQ ID NO.6；和Oplophorus萤光素酶同源重组质粒，pUC19.HR.OpLuc.KanR，对应于SEQ ID NO.7。
使用上游T4晚期基因启动子来***萤光素酶基因，以确保病毒晚期过程中的表达。在一些情况下，还***了雷帕霉素抗性标记，以允许在雷帕霉素抗生素下选择受感染的细胞。这些区域两侧为多达500bp匹配衣壳蛋白的序列，gp23和gp24。这些合成的序列由氨苄青霉素抗性pUC57或pUC19来携带。
使用Gene Pulser II电穿孔器，将含有合成序列的质粒转化至电穿孔感受态大肠杆菌O157:H7中，赋予氨苄青霉素抗性。通过用合适的萤光素酶底物(D-萤光素，用于萤火萤光素酶，肠腔荧光素，用于Oplophorus萤光素酶，以及肠腔荧光素或用于)进行测试，以针对阳性转化来筛选菌落。将带有质粒的大肠杆菌O157:H7(所述质粒具有两侧为与噬菌体JG04同源的序列的luc)生长于含有氨苄青霉素的LB肉汤细菌中，并且将细菌培养物在含有氨苄青霉素的LB肉汤中生长至大约107个细胞/mL。然后用1MOI的噬菌体JG04感染培养物并在37℃下振荡孵育45分钟，以裂解细胞。裂解物含有大部分的野生型噬菌体与少量重组噬菌体的混合物，所述重组噬菌体由同源重组质粒对野生型噬菌体基因组的同源重组形成。
为了测定重组噬菌体与野生型噬菌体的比例，使用基于TCID50(组织培养感染剂量50％)的有限稀释测定来测定感染单位的浓度(IU/mL)，类似于病毒颗粒或噬菌噬菌斑形成单位的数量，以及测定萤光素酶转导单位(TU/mL)的数量。在这些测试中，将样品连续稀释，将每个稀释度等分至含有大肠杆菌O157:H7细菌的重复孔中。任何显示出萤光素酶活性的孔必须已经用至少一个重组噬菌体感染。基于其中发生这些情况下的每一种的最高稀释度，反算初始浓度。来自转化细胞的这些初始噬菌体混合物对于每个重组噬菌体TU通常产生20,000个野生型IU的比例。然后进行分离和扩增重组噬菌体的步骤。
如图4中所示，从混合物中分离构成0.005％总噬菌体的重组噬菌体。将噬菌体混合物稀释至96孔平板中，以获得每个平板平均3个重组TU，其分解成每个孔约625IU的大部分野生型噬菌体。每个孔含有50μL混浊的大肠杆菌O157:H7。在37℃下孵育2小时后，对孔取样并筛选萤光素酶的存在。任何阳性孔很可能已经接种单个重组噬菌体，和～600个野生型噬菌体，其是相对于初始20,000:1比例的富集。将来自这种富集培养的子代接受另一个有限稀释测定，以验证比例和测定重组噬菌体转导单位的实际浓度。
再次，从这个储液等分每个96-孔平板3个重组TU，形成每孔～20个大部分野生型噬菌体的大致接种物。任何阳性萤光素酶孔很可能已经接种单个重组噬菌体连同～20个野生型噬菌体。分析这些孔的萤光素酶活性，并且将任何阳性孔接受有限稀释测定，以测定TU与IU的比例，然后接受噬菌斑测试，以获得孔分离的噬菌斑。
在这点，预期的野生型与重组体的比例为约20:1。单独挑选了48个噬菌斑并筛选萤光素酶转导能力，确保约3个重组体在待筛选的噬菌斑的混合物中。将每个噬菌斑悬浮于100μL TMS中，并将5μL加入含有混浊的大肠杆菌O157:H7培养物的孔中，并且在37℃下孵育45分钟至1小时后，测定孔。
预期阳性孔含有纯的重组噬菌体培养物，但另一轮的噬菌斑纯化是标准程序。进行大规模生产以获得适用于大肠杆菌O157:H7检测测定中的高滴定度储液。使用氯化铯等密度梯度离心，以从污染萤光素酶蛋白中分离出噬菌体颗粒，来降低背景。
实施例4.使用旋转柱滤器通过指示噬菌体的细菌检测
图5说明了根据本发明的实施方案，使用指示噬菌体和旋转柱滤器用于细菌检测。在实例实施方案中，将大肠杆菌DH10B在37℃下在Luria-Bertani肉汤(LB)中振荡生长。将415-Luc噬菌体稀释至108PFU/40μL(2.5×109PFU/mL)。将细胞计数并稀释至3000，300，30和3个细胞/mL。与以下萤光素酶测定平行进行CFU测定，以测定每个测定的输入细胞的实际数量。
对于每个细胞稀释度，将0.1mL加入滤器中，重复三份。将滤器在600g下旋转1分钟。接着，将40μL每种噬菌体稀释液加入每个滤器中，接着在室温下孵育10分钟。通过加入400μL PBST(0.05％Tween)将滤器洗涤两次，接着在600g下离心1分钟。接着加入50μL LB，接着在37℃下孵育30分钟。将滤器在6800g下旋转2分钟。接着，将30μL滤液转移至200 96-孔光度计平板，并通过注射100μL萤光素酶测定试剂(Promega，Inc.)，在Promega光度计中进行了萤光素酶测定。根据平行CFU测定中的菌落数量来校正细胞计数。通过将每个孔的细胞除以来自零细胞对照的信号的平均来获得信号与背景的比例。图6显示了结果，证明了通过萤光素酶活性检测少如1至3个大肠杆菌细胞的高测试灵敏度。图7显示了结果，证明了使用起始细菌样品的连续稀释，相同方法的非常大的检测范围。这允许检测平均1.4个细胞至1.4千万个细胞。
实施例5.使用96-孔滤板通过指示噬菌体的细菌检测
将大肠杆菌DH10B在37℃下在LB中振荡生长。将415-Luc噬菌体在LB中稀释至4×107PFU/20μL(2×109PFU/mL)。将细胞计数并稀释至500，50和5个细胞/mL(将0.1mL加入每个孔中，获得图5中所示的～50，5和<1个细胞)。与以下萤光素酶测定平行进行了CFU测试，以确定每个测定的输入细胞的实际数量。
对于每个细胞稀释度，将0.1mL加入96-孔滤板中的多个孔中：0.5个细胞为9个孔，50个细胞、5个细胞和零细胞对照为3个孔。将96-孔滤板在1200rpm(263rcf)下旋转3分钟。接着，将20μL噬菌体稀释液加入每个滤器中并在室温下孵育10分钟，接着在37℃下孵育30分钟。使用100μL萤光素酶测定试剂(Promega，Inc.)注射，使用Promega光度计，在初始滤板中直接进行了萤光素酶测定，并在注射后立即阅读平板，并且在此后的15和30分钟再次阅读。根据平行CFU测定中的菌落数量来校正细胞计数。通过将每个孔的信号除以来自零细胞对照的信号的平均来获得信号与背景的比例。
图8显示了结果，证明使用96-孔滤板用于检测每个孔中的单个大肠杆菌细胞(测试了平均0.5个细胞，使得约一半的孔接收了单个细胞)，以及每孔5.4和54个细胞。
图9显示了结果，证明了使用96-孔滤板***非常大的细胞检测范围，从平均少于1个细胞/孔(单个细胞)至至少1.4千万个细胞/孔。
实施例6.使用指示噬菌体和低细胞浓度的滤板测定
将大肠杆菌O157:H7细胞在37℃下生长于LB中，使用220rpm振荡。将指示噬菌体制成106PFU/20μL。将细胞计数并稀释成7290、2430、810、270、90、30、10和0个细胞/mL。将每个样品等份的100μL沉积至Optiplate96-孔灰色光度计0.45μm滤板的孔中，重复两份。
如图10中所示，将平板加载于翻斗离心机中并且在2400rpm下旋转3分钟。将20μL噬菌体稀释液加入每个孔中，获得5×107PFU/mL的终浓度。将平板在室温下孵育10分钟，将200μL PBST加入每个孔中，并且将平板在2400rpm下旋转3分钟，以洗掉过量的亲本噬菌体。
接着，将50μL LB加入每个孔中，并将平板在37℃培养箱中孵育45分钟，没有振荡。将等份的10μL Promega Renilla萤光素酶裂解缓冲液加入孔中，将分析物转移至孔中，并用50μL Promega试剂注射进行了萤光素酶测定。将含有细胞的样品与0细胞对照进行比较。
如在图11中看到的，滤板结果显示出来自0个细胞和1个细胞/测试的信号之间的统计学显著差异(通过Student’s t-检验，p值＝0.034)，证明了检测单个细胞的能力。每个测定更多细菌细胞表明以剂量依赖性方式提高信号。
实施例7.具有低细胞浓度的无浓缩测定
在准备与示意图12中所示的测定相似的实验中，将大肠杆菌O157:H7在37℃下生长在LB中，使用220rpm振荡。将JG04-OpLuc指示噬菌体制成1.2×107PFU/20μL，并将20μL等份试样分配至Optiplate 96-孔灰色光度计平板的孔中。将细胞计数并稀释至10，3.3，1.1和0个细胞/mL。将等份的100μL的每个样品分配至孔中，重复两份(对于0.11和0.33个细胞/测定为12×，以及对于1个细胞/测定为5×)，获得108PFU/mL的最终噬菌体浓度。
将平板在37℃培养箱中孵育45分钟，没有振荡。最后，将10μL Renilla萤光素酶裂解缓冲液加入每个孔中，并且用50μL Renilla萤光素酶测定试剂(肠腔荧光素)注射进行了萤光素酶测定。将样品与0个细胞对照进行比较。
如图13中看到的，使用低细胞浓度的无浓缩测定结果表明来自0个细胞和1个细胞/测定的信号之间的统计学显著差异(通过ANOVA检验，p值＝0.0024)，证明了检测单个细胞的能力。因此，该测试是令人惊讶地灵敏的。具有少于1个细胞/孔的样品显示出高于背景信号的成比例的孔的数量。
实施例8.使用宽细胞浓度范围的无浓缩测定
在使用较高细胞浓度的相似实验中，将大肠杆菌O157:H7细胞在37℃下生长于LB中，使用220rpm振荡。将JG04-OpLuc指示噬菌体制成1.2×107PFU/20μL，并将20μL等份试样分配至Optiplate 96-孔灰色光度计平板的孔中。将细胞计数并稀释至108，107，106，105，104，103，102，33，11，3.7，1.2和0细胞/mL。将等份的100μL的每个样品分配至孔中，重复两份，获得108PFU/mL的最终噬菌体浓度。
将平板在37℃培养箱中孵育45分钟，没有振荡。将10μLRenilla萤光素酶裂解缓冲液加入每个孔中，并且用50μLRenilla萤光素酶测定试剂(肠腔荧光素)注射进行了萤光素酶测定。将样品与0个细胞对照进行比较。
如图14中看到的，使用非常宽范围的细胞浓度样品的无浓缩测定的实验表明来自0个细胞和1.1个细胞/测定的信号之间的统计学显著差异(通过Student’s t-检验，p值＝0.000702)，证明了检测单个细胞的能力。每个测定更多细菌细胞显示出以剂量依赖性方式提高信号，直至至少106个细菌细胞/mL，令人惊讶地证明了非常宽的检测范围。
实施例9.使用蔬菜洗涤样品的无浓缩测定
为了制备蔬菜洗涤液，将蔬菜叶(例如，菠菜或生菜)称重并加入干净的塑料袋中。每克(g)蔬菜添加一mL LB(+/-0.01-0.05％Tween20)。将叶子和溶液手动混合几分钟。然后从塑料袋中提取液体并用作“蔬菜洗涤液”。使用这种方法，通过CFU发现在单片菠菜叶(1-2g)上存在～1百万个细菌。
将大肠杆菌O157:H7细胞在37℃下生长于LB中，使用220rpm振荡。将JG04-OpLuc指示噬菌体制成1.2×107PFU/20μL，将20μL等份试样分配至Optiplate 96-孔灰色光度计平板的孔中。将细胞计数并稀释成120，60，30和0个细胞/mL的蔬菜洗涤液。将等份的100μL的每个样品分配至孔中，重复两份，获得108PFU/mL的最终噬菌体浓度。
将平板在37℃培养箱中孵育45分钟，没有振荡。将10μLRenilla萤光素酶裂解缓冲液加入每个孔中，并且用50μLRenilla萤光素酶测定试剂(肠腔荧光素)注射进行了萤光素酶测定。将样品与0个细胞对照进行比较。
如图15中看到的，使用蔬菜洗液样品的无浓缩测定的实验显示出来自0个细胞和3个细胞/测定的信号之间的显著差异，证明检测蔬菜洗涤液中个位数细胞数量的能力。每个测试使用更多细菌细胞表明以剂量依赖性方式提高信号。蔬菜洗涤液含有约106个非靶细菌/mL，对应于这个测定中约105个非靶细胞(包括0个细胞大肠杆菌O157:H7对照)。从105个非靶细胞中辨别少如3个靶细胞细菌的能力是令人惊讶的并再次证明了测试的特异性。
实施例10.使用抗体和珠粒的大肠杆菌O157:H7的特异性的和定量的捕获
图16描绘了实例实验，证明了对抗大肠杆菌O157:H7的抗体和磁抗生物素蛋白链菌素覆盖的珠粒从样品特异性地和定量地捕获了大肠杆菌O157:H7，但没有捕获样品中的大肠杆菌B或鼠伤寒沙门氏菌。为了证明从溶液捕获完整的、活的细菌细胞的特异性，大肠杆菌O157:H7的表面抗原的多克隆抗体购自KPL(亲和性-和反向-纯化，以最小化交叉反应性)。
将大肠杆菌种和鼠伤寒沙门氏菌的培养物在LB肉汤中生长，收集，并用磷酸盐缓冲液洗涤(1.1mM KH2PO4，5.6mM Na2HPO4，154mM NaCl，pH7.4)。然后将洗涤的细胞计数并稀释至5-20个细胞/mL的浓度。
将含有大肠杆菌O157:H7的样品与含有BSA和生物素缀合的抗体的溶液混合。将通过KPL产生的大约10ng生物素化的、多克隆抗大肠杆菌抗体(等于约4×1010抗体分子)加入每个细胞悬浮液中。还平行进行了对照实验，其中没有将抗体加入细胞悬浮液中。BSA浓度为～1％，并且总生物素-抗体为10ng。将混合物颠倒旋转1小时。
用抗体孵育后，将4×107个抗生物素蛋白链菌素覆盖的磁微粒(Invitrogen/LifeTechnologies)加入混合物中并再孵育30分钟。然后使用磁架收集细胞-抗体-珠粒复合物，并且除去未结合的级分(上清液)。用含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(1.1mM KH2PO4，5.6mMNa2HPO4，154mM NaCl，pH7.4，0.05％Tween-20)温和地洗涤珠粒。然后将上清液和捕获的细胞-珠粒复合物分布于LB琼脂平板上，并将平板在37℃下孵育过夜，以测定CFU。用抗O157:H7抗体捕获大肠杆菌O157:H7，而不是大肠杆菌B或鼠伤寒沙门氏菌，是特异性的和定量的。
实施例11.杂合免疫噬菌体(HIP)测定
如示意图17中所示，杂合免疫噬菌体或“HIP”测定结合了细菌特异性抗体捕获的益处与修饰的噬菌体的益处。首先将样品施加于覆盖了细菌特异性抗体的微滴定平板孔中(1702)。然后将平板离心，以促进细菌与捕获抗体的结合(1704)。足够时间以允许细菌完全捕获后，将含有细菌特异性的Luc-噬菌体的溶液加入每个样品中(1706)。用噬菌体孵育导致了单个或多个噬菌体与捕获的细菌的结合和连接(1708)。最后，将样品孵育以促进噬菌体复制和萤光素酶表达，其导致细胞溶解和可溶性萤光素酶的释放(1710)。
在HIP测定实验中，将白色96-孔ELISA平板覆盖300ng靶细菌特异性的单克隆抗体(在100μL PBS中)，在室温下持续2-3小时。用PBS(200μL×3次洗涤)洗涤孔，用5％BSA/PBS(300μL)在室温下阻断1-1.5小时，并再次用300μL PBS×1洗涤。将样品(100μL)加入孔中。
将ELISA平板在700×g下离心30分钟，然后在室温下孵育1小时。将噬菌体加入样品中(10μL LB中2-4×106PFU)，并在室温下孵育10分钟。用PBS洗涤样品(200μL×2次洗涤)。将LB培养基加入样品(100μL)中，并在37℃下孵育1.5小时。
将底物(50μL)直接加入样品中，并在光度计中测量发光。如图18中看到的，HIP测定能够使用大约2×106PFU噬菌体检测LB培养基中的100和1,000个大肠杆菌O157:H7细胞。相对于无细胞样品的平均信号以对数级别显示，并且范围从100个细胞样品大约50倍到1,000个细胞样品超过1,000倍。

Claims (44)

1.重组噬菌体，其包括***噬菌体的晚期基因区中的指示基因。
2.权利要求1的重组噬菌体，其中指示基因邻接主要衣壳基因。
3.权利要求1的重组噬菌体，其中噬菌体源自T7、T4、T4-样、JG04、JG04-样噬菌体或源自具有与T7、JG04、JG04-样、T4或其他T4-样噬菌体具有至少90％同源性的基因组的另一种天然噬菌体。
4.权利要求1的噬菌体，其中指示基因不编码融合蛋白。
5.权利要求1的噬菌体，其中指示基因的转录受噬菌体晚期启动子的控制。
6.权利要求1的噬菌体，其中在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。
7.权利要求2的噬菌体，其中指示基因编码萤光素酶。
8.权利要求7的噬菌体，其中萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火萤光素酶、Lucia萤光素酶或工程化萤光素酶中的一种。
9.用于检测样品中的目标微生物的方法，其包括步骤：
将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包括***噬菌体的晚期基因区中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物；和
检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在目标微生物。
10.权利要求9的方法，其中检测到的指示部分的量对应于样品中存在的目标微生物的量。
11.权利要求9的方法，其中指示基因邻接主要衣壳基因。
12.权利要求9的方法，其中噬菌体源自T7、T4、T4-样、JG04噬菌体或源自具有与T7、T4或其他T4-样噬菌体具有至少90％同源性的基因组的另一种天然噬菌体。
13.权利要求9的方法，其中指示基因不编码融合蛋白。
14.权利要求9的方法，其中指示基因的转录受噬菌体晚期启动子的控制。
15.权利要求9的方法，其中指示基因编码萤光素酶。
16.权利要求15的方法，其中萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火萤光素酶、Lucia萤光素酶或工程化萤光素酶中的一种。
17.权利要求9的方法，其中用于孵育步骤以感染细菌的噬菌体浓度为高于1×107噬斑形成单位/毫升体积。
18.权利要求9的方法，其中在与样品一起孵育之前使用氯化铯等密度梯度离心纯化所述重组噬菌体。
19.权利要求9的方法，进一步包括在与重组噬菌体一起孵育以感染细菌之前，用于从固体支持物上的样品捕获微生物的步骤。
20.权利要求19的方法，其中固体支持物包括多孔平板或滤器。
21.权利要求19的方法，其中捕获步骤进一步包括用捕获抗体结合微生物。
22.权利要求21的方法，其中捕获抗体促进微生物与固体支持物的结合。
23.权利要求19的方法，进一步包括在添加噬菌体后但在细胞溶解前，用于洗涤被捕获和感染的微生物的步骤，以除去过量的噬菌体和/或污染报道蛋白，如萤光素酶。
24.权利要求9的方法，其中在比使用富集培养将微生物数量提高到原来的4-倍或10-倍所需的时间段短的时间内完成目标微生物的检测。
25.权利要求9的方法，其中该方法可以检测样品中≤10个微生物细胞。
26.权利要求9的方法，其中检测所需的总时间少于2小时。
27.用于快速检测样品中的目标微生物的***，其包括：
用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分，其中感染原包括指示部分；和
用于检测指示部分的组成部分。
28.权利要求27的***，进一步包括是感染原的组成部分。
29.权利要求28的***，其中感染原是感染目标微生物的重组噬菌体，其中重组噬菌体包括***噬菌体的晚期基因区中的指示基因，作为指示部分，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。
30.权利要求28的***，进一步包括用于捕获固体支持物上的目标微生物的组成部分。
31.权利要求28的***，进一步包括用于洗涤被捕获的微生物样品的组成部分。
32.权利要求28的***，其中相同的组成部分可以用于多个步骤。
33.权利要求28的***，进一步包括用于测定样品中的目标微生物的量的组成部分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中的微生物的量。
34.权利要求28的***，其中步骤是自动化的或通过使用者经由计算机输入来控制和/或其中液体操作机器人执行至少一个步骤。
35.供权利要求28的***使用的非瞬态计算机可读介质。
36.供权利要求9的方法使用的非瞬态计算机可读介质。
37.用于快速检测样品中的目标微生物的试剂盒，其包括：
用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分，其中感染原包括指示部分；和
用于检测指示部分的组成部分。
38.权利要求37的试剂盒，其中感染原是感染目标微生物的重组噬菌体，其中重组噬菌体包括***噬菌体的晚期基因区中的指示基因作为指示部分，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。
39.权利要求37的试剂盒，进一步包括用于捕获固体支持物上的目标微生物的组成部分。
40.权利要求37的试剂盒，进一步包括用于洗涤被捕获的微生物样品的组成部分。
41.权利要求37的试剂盒，其中相同的组成部分可以用于多个步骤。
42.权利要求37的试剂盒，进一步包括用于测定样品中的目标微生物的量的组成部分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。
43.用于制备重组噬菌体的方法，其包括将指示基因***噬菌体的晚期基因区中。
44.权利要求43的方法，其中指示基因编码萤光素酶。
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