CN104237416B

CN104237416B - 同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的hplc方法

Info

Publication number: CN104237416B
Application number: CN201410510844.0A
Authority: CN
Inventors: 周军; 张琼; 孙江兵; 雷权; 曾平
Original assignee: URUMQI GENERAL HOSPITAL OF LANZHOU MILITARY REGION CPLA
Current assignee: URUMQI GENERAL HOSPITAL OF LANZHOU MILITARY REGION CPLA
Priority date: 2014-09-27
Filing date: 2014-09-27
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2034-09-27
Also published as: CN104237416A

Abstract

本发明涉及一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，该方法以微乳液作为流动相的高效液相色谱法，微乳流动相中水相的比例一般都在90%以上，与目前常规高效液相色谱法中流动相相比大大减少了有机溶剂的使用，大大降低了对身体的危害、环境的污染和分析的时间和成本。通过对微乳色谱条件的优化，在等度洗脱条件下，大花罗布麻叶中6种黄酮类成分同时得到了有效的分离，建立了一种绿色环保、准确可靠、稳定的快速检测方法。克服了现有大花罗布麻叶黄酮类成分测定中的缺陷。

Description

同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种利用HPLC同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分的方法。

背景技术

大花罗布麻(Poacynum hendersonii(Hook.F.)Woods.)是夹竹桃科白麻属植物，学名大叶白麻，药用部位是叶，主要分布在我国新疆地区，是生长在盐碱、沙荒地区及戈壁滩上的多年生宿根植物资源，其独特的生长环境使其具有十分特异的药用保健功效。新疆大花罗布麻入药已有千年历史，其部分药理作用很早就被人们发现并用于临床，据《本草纲目》、《救荒本草》记载，其罗布麻叶有清热利尿、平肝、安神等功效，临床用于治疗高血压、冠心病、颈椎病、肾炎浮肿、神经衰弱、更年期综合征等疾病，1977年正式录入《中华人民共和国药典》。现代药理学研究证明黄酮类物质为大花罗布麻叶最主要的有效成分，大花罗布麻叶中黄酮类物质主要是槲皮素-3-O-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷等6种黄酮类成分。随着大花罗布麻叶在临床上广泛应用，非常有必要对其中黄酮类成分进行含量测定及分析，这有助于大花罗布麻叶的质量控制，亦为今后对大花罗布麻的进一步研究奠定基础。目前国内外对大花罗布麻叶黄酮类成分的检测方法主要是分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)。

分光光度法测定的是大花罗布麻叶总黄酮的含量，但这只能粗略反映大花罗布麻叶中含黄酮类成分的总量，不能反映大花罗布麻叶各黄酮类成分的情况，无法用来评价大花罗布麻叶质量的真实性、优良性和稳定性。近年来，随着中药物质基础、药理活性研究的深入和现代分离技术的提高，中药质量水平有了明显的提高。在认识到中药药效是多靶点、多成分的协同作用特点后，多指标成分定量成为中药含量测定的发展趋势。而目前有关高效液相色谱法测定大花罗布麻叶黄酮成分的文献中，只有对大花罗布麻叶黄酮类物质中的个别成分进行了测定，而没有同时对槲皮素-3-O-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷等多种黄酮类成分进行测定，因而无法全面的反映大花罗布麻叶黄酮类成分，进而也就无法反映大花罗布麻叶的质量情况。同时还由于各黄酮类成分之间物理化学性质的较大差异，现有的HPLC分离方法均存在分离选择性小，分离度差和分离时间长的缺点。另外，目前的HPLC分离方法中流动相含有高比例的甲醇或乙腈，这对身体及环境也是十分有害的。因而，建立一种绿色环保高效的分析测定大花罗布麻叶中多种黄酮类成分的方法具有重要意义。

微乳液相色谱(microemulsion liquid chromatography，MELC)法是以微乳为流动相的高效液相色谱法。微乳流动相通常是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂组成，是一种透明或半透明的，低粘度的，各向同性且热力学稳定的水油混合***，粒径小于100nm。MELC法与常规HPLC法相比，具有不使用或极少使用有机溶剂、分离效率高和分离速度快的优势，可用于复杂样品的分离，复杂样品经过简单的稀释后便可以直接进样分析，无需预处理。在低紫外波长(200nm)检测方面有明显的优势。

本发明建立了一种以微乳液作为流动相的高效液相色谱法(即微乳液相色谱(MELC))对大花罗布麻叶中槲皮素-3-O-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷等6种黄酮类成分同时进行含量测定，并应用该方法分别对6批样品进行分析，进而比较不同批次大花罗布麻叶药材在化学成分组成和含量上的异同，为临床上大花罗布麻叶药材的应用提供更好的理论指导。

发明内容

本发明目的在于，提供一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，该方法以微乳液作为流动相的高效液相色谱法，微乳流动相中水相的比例一般都在90％以上，与目前常规高效液相色谱法中流动相相比大大减少了有机溶剂的使用，大大降低了对身体的危害、环境的污染和分析的时间和成本。通过对微乳色谱条件的优化，在等度洗脱条件下，大花罗布麻叶中6种黄酮类成分同时得到了有效的分离，建立了一种绿色环保、准确可靠、稳定的快速检测方法。克服了现有大花罗布麻叶黄酮类成分测定中的缺陷。

本发明所述的一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，按下列步骤进行：

a、样品溶液制备：称取真空干燥至恒重的大花罗布麻叶粉末0.5g，精密称定，过3号筛，加入40mL浓度为70％乙醇，浸泡1h，超声处理30min，放冷，滤过，准确移取续滤液2mL，置10mL容量瓶中，以浓度为70％乙醇定容，摇匀后，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得样品溶液；

b、对照品溶液制备：分别称取真空干燥至恒重的槲皮素-3-O-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷对照品适量，精密称定，加入浓度为70％乙醇超声溶解，制成2mg/ml的混合对照品溶液，作为贮备液，密封，温度4℃保存；

c、微乳流动相配制：将体积分数2.0％表面活性剂Genapol X-080，体积分数3.0％助表面活性剂正丁醇，体积分数0.6％油相乙酸乙酯，体积分数0.2％三乙胺和94.2％水溶液混合，用20mM H₃PO₄调节pH＝5.0，超声30min，经0.45μm滤膜过滤，超声30min，即得透明稳定的微乳溶液，静置过夜，备用；

d、色谱条件：色谱柱为Zorbax SB-C₁₈4.6mm×150mm，5μm柱，流速0.8mL/min，检测波长360nm，柱温30℃，流动相为2.0％Genapol X-080-3.0％正丁醇-0.6％乙酸乙酯-0.2％三乙胺-94.2％水溶液，用20mM H₃PO₄调节pH＝5.0，进样量10μL，采用外标法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按罗布麻甲素峰计算不低于8000。

本发明采用微乳液相色谱法，同时测定了大花罗布麻叶中的6中黄酮类成分的含量，结果这6种黄酮成分在15min内达到基线分离，在1-500mg/L范围内，6个黄酮成分的线性相关系数r²≥0.9996，回收率98.9-100.8％。本方法可应用于大花罗布麻叶中6种主要黄酮成分的质量分析。

本发明所述的同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，该方法的优点在于，在微乳液相色谱中，6种主要黄酮成分分离效率高(完全分离)，分离速度快(分离时间仅为常规HPLC方法的1/3)，这是由于溶质在固定相、微乳液滴和水相之间进行分配，有利于提高色谱的分离能力，与常规HPLC相比，微乳液相色谱对化合物的溶解能力较强，尤其适用于极性或溶解度差异较大的复杂样品分离，等度洗脱即可达到基线分离，且有机溶剂用量极少，分析成本低，有经济和环保方面的显著优势。

本发明所述的同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，该方法的创新点在于使用了微乳为流动相的高效液相色谱法(HPLC)，与常规HPLC法相比，具有不使用或极少使用有机溶剂、分离效率高和分离速度快的优势，可用于复杂样品的分离，复杂样品经过简单的稀释后便可以直接进样分析，无需预处理。不仅绿色环保，分析时间大大缩短。专利申请号201010120856是常规的HPLC方法，不仅流动相大量使用了甲醇和乙腈等有毒有机溶剂，而且分析时间长达70分钟以上。而本发明流动相中没有使用任何有毒有机溶剂，其中绝大部分是水(94.2％)，并且分析时间只有10分钟左右。这大大提高了分析效率。同时根据HPLC方法的原理，简单的说，就是样品溶解在流动相中，随流动相进入色谱柱，经过固定相(填料)时，会受到固定相的吸附。样品中不同组分受到的吸附不同，于是流出色谱柱的时间顺序就不同。

附图说明

图1为本发明建立MELC方法的对照品溶液高效液相色谱图；

图2为本发明建立MELC方法的样品溶液高效液相色谱图；

图3为本发明建立MELC法(A)与常规HPLC法(B)比较的高效液相色谱图。

具体实施方式

一、实验部分

仪器与试剂：

Agilent 1100高效液相色谱仪、四元梯度泵、DAD检测器、Agilent色谱工作站(Agilent公司)；FZ102植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；DGSY电热恒温水浴锅(北京长源实验设备厂)；TGL-16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)；SK5200LHC超声处理器(上海科导超声仪器有限公司)；RE-3000C旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；PHS-3C精密pH计(上海精密仪器仪表有限公司)；

槲皮素-3-O-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷对照品均购自Sigma公司(纯度大于98％)；大花罗布麻叶药材由新疆本草堂中药饮片有限公司提供，经新疆中药民族药研究所鉴定为大花罗布麻(Poacynum hedersonni(Hook.F.)Woodson)；月桂醇聚氧乙烯醚(Genapol X-080，分析纯，Sigma公司)，乙酸乙酯、庚烷、甲苯、正辛醇、正丙醇和正己烷(分析纯，Merck公司)，磷酸、三乙胺(分析纯，北京化学试剂公司)，乙腈(色谱纯，Fisher公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；

液相色谱条件：

色谱柱：Zorbax SB-C₁₈(4.6mm×150mm，5μm)柱；

流动相：2.0％Genapol X-080-3.0％正丁醇-0.6％乙酸乙酯-0.2％三乙胺-94.2％水溶液(用20mM H₃PO₄调节pH 5.0)；

流速：0.8mL/min；

检测波长：360nm；

柱温：30℃；

进样体积：10μL；

色谱分离结果见图1，由图1可知，6种黄酮类成分能良好的分离；

对照品溶液的制备：

分别称取真空干燥至恒重的槲皮素-3-O-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷对照品适量，精密称定，加入浓度为70％乙醇超声溶解，制成2mg/ml的混合对照品溶液，作为贮备液，密封4℃保存；

样品溶液制备：

称取真空干燥至恒重的大花罗布麻叶粉末(过3号筛)0.5g，精密称定，加40mL浓度为70％乙醇，浸泡1h，超声处理30min，放冷，滤过，准确移取续滤液2mL，置10mL容量瓶中，以浓度为70％乙醇定容，摇匀后，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

二、结果与讨论

色谱条件的优化

表面活性剂的选择：

考察了SDS、Brij35、Genapol X-080、TritonX-114等表面活性剂对管花肉苁蓉中6种黄酮类成分的分离效果，结果表明，在流动相中加入Genapol X-080，可使6种成分的保留因子达到合适的范围(＝2～8)，同时色谱基线平稳。当在流动相中加入SDS时，由于SDS为离子型表面活性剂，其对化学结构非常相似的亲水性化合物分离度差，6种黄酮类成分几乎分离不开；而在流动相中加入Brij35、TritonX-114等非离子型表面活性剂时，由于Brij35、TritonX-114在210nm处存在吸收，色谱基线也不稳定，会干扰测定。而非离子型表面活性剂Genapol X-080在210nm处无吸收，色谱基线稳定，故选择GenapolX-080作为最佳表面活性剂。按一定比例配制分别含0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％Genapol X-080的微乳流动相，考察Genapol X-080的含量对大花罗布麻叶中6种黄酮类成分的分离选择性的影响。结果显示：随着Genapol X-080含量的增加，大花罗布麻叶中6种黄酮类成分的保留因子明显减少，当Genapol X-080含量为2.0％时，6种黄酮类成分的保留因子达到合适的范围，分离效果最好，故选择Genapol X-080含量为2.0％。

助表面活性剂的选择：

分别选择正丁醇、正戊醇、正丙醇、异丙醇为助表面活性剂，考察其对色谱行为的影响。结果显示，以正丁醇为助表面活性剂时，6种黄酮类类成分的保留时间均减少，改变正丁醇的含量1.0-5.0％，考察其对6种黄酮类类成分分离效果的影响。结果显示：正丁醇含量在3.0％以前，随着正丁醇含量的增加，6种苯乙醇苷类成分的保留时间都随着有所缩短，当高于3.0％时，保留时间又相应延长，故确定助表面活性剂正丁醇含量为3.0％时分离效果最为理想。

油相的选择：

考察了正庚烷、甲苯、乙酸乙酯、正辛烷作为油相对分离的影响。结果表明：油相对6种黄酮类成分的洗脱能力最强的为乙酸乙酯，且乙酸乙酯作为油相时各组分分离度最好，而正辛烷、正庚烷和甲苯不能使被测成分达到基线分离，故选择乙酸乙酯为油相。改变油相乙酸乙酯的含量，可以改变物质的分离度。考察乙酸乙酯含量在0.2％-1.0％范围变化时对分离效果的影响，发现随着乙酸乙酯含量的增加，6种黄酮类成分的分离度相应提高。当乙酸乙酯的含量为0.6％时，分离效果最理想，故确定油相乙酸乙酯的含量为0.6％。

添加剂和pH值对分离的影响：

因为黄酮类成分多带有羟基，因此三乙胺浓度对黄酮类成分的保留时间有较大影响。考察三乙胺浓度为0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％时，对6种黄酮类成分分离效果的影响。结果表明：三乙胺浓度为0.3％时6种黄酮类成分的保留时间均缩短，最后选择三乙胺浓度为0.2％。在最优微乳流动相的基础上，改变pH值(用20mM H₃PO₄调节)，范围在3.0-7.0，对6种黄酮类成分的保留时间和分离度有影响，随着pH的增加，6种黄酮类成分的保留时间有所缩短，但当pH＝5.0时，6种黄酮类成分分离得最好，因此，选择pH＝5.0(用20mMH₃PO₄调节)。

柱温对分离的影响：

采用Genapol X-080-正丁醇-乙酸乙酯-三乙胺-水溶液微乳流动相，分别在温度20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的条件下考察柱温对微乳液相色谱分离选择性的影响。结果表明：随着柱温升高，各组分的保留因子减小，当柱温低于30℃时，各组分的峰宽较大，柱效较低；当柱温等于或高于30℃时，各组分的峰形较好，柱效明显提高。考虑到样品和色谱柱对温度的耐受性，最终选择柱温为30℃。

方法验证：

方法的标准曲线、检出限和定量限：

取对照品储备液，用微乳流动相稀释成一系列浓度的标准溶液，按“实验部分2中”的色谱条件进行测定，以峰面积Y对浓度X(mg/L)作行线性回归，得出6种黄酮类成分的线性回归方程、定量限(LOQ)和检出限(LOD)见表1：

表1 MELC法测定6种黄酮类成分标准品的标准曲线，定量限和检出限

成分	线性范围(mg/L)	线性方程	相关系数(r²)	检出限(mg/L)	定量限(mg/L)
						槲皮素-3-O-槐糖苷	1-500mg/L	146.8X+61.29	0.9997	0.16	0.52
罗布麻甲素	1-500mg/L	82.18X+46.73	0.9998	0.20	0.64
						槲皮素	1-500mg/L	110.12X+51.15	0.9998	0.22	0.71
金丝桃苷	1-500mg/L	70.51X+30.17	0.9997	0.18	0.68
						紫云英苷	1-500mg/L	63.68X+22.02	0.9996	0.14	0.58
三叶豆苷	1-500mg/L	28.63X+13.81	0.9997	0.13	0.53

结果(表1)显示：6个黄酮类成分在标准曲线线性范围内(1-200mg/L)呈良好的线性(r²≥0.9996)。最低检测限是信噪比为3时样品的量，将信噪比为10时样品的量作为定量限。

方法的精密度、重复性和稳定性试验：

精密度的考察为测定对照品溶液的日内、日间精密度。日内精密度是在同一天内对同一对照品溶液连续测定6次，而日间精密度则是对同一对照品溶液每天测定一次，连续6天。

表2 MELC法测定6种黄酮类成分的精密度、重复性和稳定性

结果如表2所示，日内精密度和日间精密度的相对标准偏差(RSD)分别为0.42-1.24％和0.81-2.17％，说明本实验建立的方法具有良好的重现性。

取同一大花罗布麻叶药材6份，按上述方法平行操作、分析、计算，以相对标准偏差来评价该方法的重复性。结果(表2)显示：6中黄酮类成分的相对标准偏差在1.14-2.63％的范围内，说明建立的方法重复性良好。

取大花罗布麻叶药材按照上述方法制备样品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、16h、24h、36h和48h测定，以相对标准偏差来评价稳定性。结果如表2所示，表明样品在48h内具有良好的稳定性。

方法的回收率试验：

回收率试验用来进一步评价方法的准确性。精密称取已知6种黄酮成分含量的供试品适量，加入等量的6种黄酮对照品，按所建立的色谱条件检测，通过计算测定的理论值和真实值的比率来计算回收率。

表3 MELC法测定6种黄酮类成分的回收率(n＝6)

成分	原始量(mg)	加入量(mg)	测得量(mg)	回收率(％)	RSD(％)
						槲皮素-3-O-槐糖苷	125.4	126.9	251.8	99.6	0.72
罗布麻甲素	82.5	83.4	166.1	100.3	1.13
						槲皮素	71.1	70.9	141.2	98.9	0.94
金丝桃苷	64.2	63.4	127.1	99.3	1.26
						紫云英苷	58.5	59.8	118.8	100.8	1.52
三叶豆苷	33.4	35.2	68.7	100.4	1.47

表3结果显示：该方法的回收率在98.9-100.8％范围内，相对标准偏差在0.72-1.52％的范围内，表明该方法具有良好的可靠性和准确性。

样品分析：

利用本发明所述的方法，对6批大花罗布麻叶中的6种黄酮成分进行了同时测定。结果见表4和图2，由图2可知，大花罗布麻叶中6种黄酮类成分能良好的分离，结果令人满意。

表4 6批大花罗布麻叶中6种黄酮成分的含量测定(n＝6)

与常规HPLC分离方法的比较：

同时研究了测定大花罗布麻叶中6种黄酮成分的常规HPLC方法(流动相A为0.2％磷酸水溶液，B为乙腈溶液，梯度洗脱：0-10min，A-B 70:30；10-20min，A-B 60:40；50-50min，A-B 40:60；40-60min，A-B 30:70。检测波长360nm，流速1.0mL/min，进样量10μL)，其分析时间为60min，完成一次样品分析，有机溶剂(乙腈)的消耗量约32mL；而本发明建立的MELC方法在15min内即完成对6种黄酮成分的分析，且流动相中仅有极少量有机溶剂，完成1次样品分析的消耗量约1.2mL。结果见图3。由此可见，采用MELC方法可大幅缩短检测时间，大量降低有机溶剂的消耗，降低成本，绿色环保。

三、结论:

本发明建立了一种新的分离模式(MELC)对大花罗布麻叶中6种黄酮成分含量进行测定，通过对表面活性剂种类及浓度、助表面活性剂种类及浓度、油相种类及浓度、流动相酸度、添加剂和柱温等因素的考察，获得了最佳微乳体系和色谱条件，并进行了方法学考察，对6批样品进行分析。结果表明，本发明建立的方法快速、准确，可用于对大花罗布麻叶中6种黄酮成分的质量分析与监控。

Claims

1.一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、样品溶液制备：称取真空干燥至恒重的大花罗布麻叶粉末0.5g，精密称定，过3号筛，加入 40 mL浓度为70%乙醇，浸泡 1 h，超声处理 30 min，放冷，滤过，准确移取续滤液 2mL，置 10 mL容量瓶中，以浓度为70% 乙醇定容，摇匀后，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得样品溶液；

b、对照品溶液制备：称取真空干燥至恒重的槲皮素-3-O-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷对照品适量，分别加入浓度为70%乙醇超声溶解后，转移至25 mL 容量瓶中，定容，摇匀，作为对照品贮备液，密封，温度4℃保存；

c、微乳流动相配制：将体积分数2.0 %表面活性剂Genapol X-080，体积分数3.0%助表面活性剂正丁醇，体积分数0.6%油相乙酸乙酯，体积分数0.2%三乙胺和94. 2% 水溶液混合，用20mM H₃PO₄调节pH =5.0，超声 30 min，经 0.45μm 滤膜过滤，超声 30 min，即得透明稳定的微乳溶液，静置过夜，备用；

d、色谱条件：色谱柱为Zorbax SB-C₁₈ 4.6mm×150mm，5μm柱，流速 0.8

mL/min，检测波长 360 nm，柱温30℃，流动相为2.0% Genapol X-080-3.0%正丁醇-0.6% 乙酸乙酯 -0.2% 三乙胺-94. 2% 水溶液，用20mM H₃PO₄调节pH =5.0，进样量 10μL，采用外标法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按罗布麻甲素峰计算不低于8000。