CN104208717A - 缀合抗体的双乳化核壳纳米结构 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种缀合抗体的双乳化核壳纳米结构。在油相壳包覆水相核而成的双乳化核壳纳米结构的表面引进连接基，以与抗体相接，形成缀合抗体的双乳化核壳纳米结构。

Description

缀合抗体的双乳化核壳纳米结构
技术领域
本发明涉及一种缀合抗体的纳米结构，且特别是涉及一种缀合抗体的双乳化核-壳纳米结构。
背景技术
目前已有一些由有机材料制得的核壳纳米结构被应用为药物的载体携带药物。这些有机的核壳纳米结构例如是由双脂肪层所构成的微脂体(liposome)或由两性高分子所构成的微胞(micelle)，但是这些有机的核壳纳米结构通常存在结构不稳定或工艺繁杂且不易控制等问题。
发明内容
本发明的一方面提供一种缀合抗体的双乳化核壳纳米结构，其包括水相核、油相壳与抗体。所述双乳化核壳纳米结构的直径约为50-400nm。
上述油相壳包围该水相核，该油相壳的组成包含高分子与多个疏水性磁纳米粒子，但不包含其他表面活性剂。上述高分子可为连接聚乙烯醇或是聚乙烯醇与连接高分子的组合，且不含其它高分子与其它表面活性剂。该连接聚乙烯醇与该连接高分子具有连接基(linking group)。上述抗体通过耦合剂键结于该连接基上。
依据本发明一实施例，其中该连接基包括羧基、硫醇基、醛基、胺基或羟基。
依据本发明另一实施例，其中该连接聚乙烯醇为羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚乙烯醇或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物。
依据本发明又一实施例，其中该连接高分子为聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或硫醇化聚甲基丙烯酸。
依据本发明再一实施例，其中该些疏水性磁纳米粒子为表面有疏水性官能基修饰的Fe2O3、Fe3O4、CoFe2O4或MnFe2O4微粒。
依据本发明又一实施例，其中该抗体包括乳癌抗体Trastuzumab、大肠癌抗体Cetuximab、表皮生长因子受体的抗体Panitumumab或抑制血管新生的抗体Bevacizumab。
依据本发明又一实施例，其中该油相壳包含疏水性药物。
依据本发明又一实施例，其中该水相核包含亲水性药物。
本发明的另一方面提供上述双乳化核壳纳米结构的制备方法，此制备方法分为单乳化法与双乳化法。
上述单乳化制备法包括下述制备步骤。先分别制备包括该连接聚乙烯醇，但不包含其它高分子与其它表面活性剂的水溶液与包括疏水性磁纳米粒子的有机溶液。接着，混合搅拌该水溶液与该有机溶液，以形成乳液，并于该乳液中形成多个双乳化核壳纳米结构。去除有机溶液所用的有机溶剂后，分别制备包括双乳化核壳纳米结构的第一分散液与包括与耦合剂相接的该抗体的第二分散液。混合搅拌第一分散液与第二分散液，使连接聚乙烯醇的连接基缀合上与该耦合剂相接的该抗体。
依照本发明一实施例，上述亲水性药物可加入至该水溶液中。
依照本发明另一实施例，上述疏水性药物可加入至该有机溶液中。
上述双乳化制备法包括下述制备步骤。先制备包括聚乙烯醇，但不包含其它高分子与其它表面活性剂的第一水溶液，再制备包括疏水性磁纳米粒子的有机溶液。混合搅拌第一水溶液与该有机溶液，以形成油包水乳液。然后，制备包括连接高分子与该聚乙烯醇，但不包含其它高分子与其它表面活性剂的第二水溶液。混合搅拌该油包水乳液与第二水溶液，以形成水包油乳液，并于该水包油乳液中形成多个双乳化核壳纳米结构。去除有机溶液所用的有机溶剂后，分别制备包括双乳化核壳纳米结构的第一分散液与包括与耦合剂相接的该抗体的第二分散液。混合搅拌第一分散液与第二分散液，使连接高分子的连接基缀合上与该耦合剂相接的该抗体。
依照本发明一实施例，上述亲水性药物可加入至第一水溶液中。
依照本发明另一实施例，上述疏水性药物可加入至该有机溶液中。
上述发明内容旨在提供本公开内容的简化概要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方面。
附图说明
为使本发明的下述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，提供附图如下：
图1A绘示依照本发明一方面的一种双乳化核壳纳米结构剖面结构示意图。
图1B绘示利用双乳化核壳纳米结构来同时作为亲水性药物以及疏水性药物载体的剖面结构示意图。
图2A绘示以单乳化法制备表面有连接基的双乳化核壳纳米结构的流程示意图。
图2B绘示以双乳化法制备表面有连接基的双乳化核壳纳米结构的流程示意图。
图2C绘示表面有连接基的双乳化核壳纳米结构与抗体反应的流程示意图。
图3示出使用不同分子量PVA所合成的载体的扫描式电子显微镜(SEM)影像。
图4A-4B分别为缀合乳癌抗体前与缀合乳癌抗体后的载体的扫描式电子显微镜(SEM)影像。
图5A为包覆紫杉醇(PTX)且于合成时添加不等量的TPMAA的载体在pH4下的释放行为。
图5B为包覆小红莓(Dox)且于合成时添加不等量的TPMAA的载体在pH4下的释放行为。
图5C为同时包覆亲水性小红莓与疏水性紫衫醇双药并于pH7以及pH4下的载体的药物释放行为。
图6A与图6B为含PVA/TPMAA混合物(TPMAA的添加量为1wt％)的缀合抗体载体分别在pH7与pH4下的穿透电子显微镜(TEM)影像。
图7A示出使用流式细胞仪检测缀合乳癌抗体Trastuzumab的载体与SKBR3细胞共培养后所测得的荧光量。
图7B示出使用流式细胞仪检测缀合IgG的载体与SKBR3细胞共培养后所测得的荧光量。
图8为SKBR3细胞、未被包埋的小红莓、缀合IgG且包埋小红莓的载体、缀合乳癌抗体Trastuzumab且包埋小红莓的载体分别与SKBR3细胞共培养后的共轭聚焦显微镜的观察结果。
图9为不同样品与SKBR3细胞共培养后的细胞存活率。
图10A-10B分别为裸鼠实验的第1天与第3天的非侵入式活体影像。
图11为以不同样品治疗裸鼠肿瘤后，在不同时间观察所得的肿瘤体积变化图。
图12为含有PVA/PAA混合物并以EDC/Sulfo-NHS缀合乳癌抗体Trastuzumab后的双乳化核壳纳米结构的外观SEM影像。
图13A-13C分别为分子量25,000、47,000与78,000的含有TPVA载体外观的SEM影像。
具体实施方式
为了使本公开内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来实现相同或均等的功能与步骤顺序。
表面缀合抗体的双乳化核壳纳米结构
参照图1A，其绘示依照本发明一方面的一种双乳化核壳纳米结构剖面结构示意图。在图1A中，双乳化核壳纳米结构100由油相壳110包围水相核125而成，而油相壳110的组成包含高分子115与疏水性磁纳米粒子120。在油相壳110的表面具有连接基(linking group)130以及与其经由耦合剂(coupling agent；未示出于图1A中)相接的抗体135。双乳化核壳纳米结构100的直径约为50-400nm。
上述高分子115至少含有聚乙烯醇(polyvinyl alcohol；PVA)，或是至少含有聚乙烯醇经改性后而具有连接基130的连接聚乙烯醇。当高分子115中只含有聚乙烯醇时，还需要混合另一种具有连接基130的连接高分子。若使用连接聚乙烯醇，则不需额外混合其它高分子。需强调的是，油相壳110中不含有任何其它的表面活性剂。
上述聚乙烯醇或连接聚乙烯醇本身可令自己的亲水官能基旋转，使其朝向水相核125内以及油相壳110外的水溶液，所以能在没有任何表面活性剂的情况下，同时稳定油相壳110内外两个油水界面，形成双乳化核壳纳米结构100。
上述连接基130例如可为羧基(-COOH)、硫醇基(-SH)、醛基、胺基或羟基。举例来说，当高分子115含有连接聚乙烯醇时，连接聚乙烯醇可为羧甲基化聚乙烯醇(carboxymethylated polyvinyl alcohol；CMPVA)、硫醇化聚乙烯醇(thiolated polyvinyl alcohol；TPVA)或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物，而不需要混合其它高分子。
当高分子115含有分子量16,000-61,000的聚乙烯醇时，连接高分子可以选用聚丙烯酸(polyacrylic acid；PAA)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid；PMAA)、或硫醇化聚甲基丙烯酸(thiolated polymethacrylic acid；TPMAA)。使聚乙烯醇与连接高分子混合后，形成油相壳110内的高分子115。
上述聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚甲基丙烯酸与硫醇化聚乙烯醇的化学结构式列在下表一中。
表一：例示的连接高分子
上述抗体135可为任何所需的抗体，其选择视其欲结合的抗原而定。例如，抗体135可为抗乳癌(breast cancer)的抗体Trastuzumab(商品名为Herclon或Herceptin)，其所识别的抗原为由致癌基因ERBB2所表达的HER2接受器。其它用来治疗癌症的抗体例子还有抗大肠癌(colorectal cancer)的抗体Cetuximab、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)的抗体Panitumumab或抑制血管新生(angiogenesis inhibitor)的抗体Bevacizumab等。
上述疏水性磁纳米粒子120的材料例如可为表面有疏水性官能基修饰的Fe2O3、Fe3O4、CoFe2O4或MnFe2O4纳米粒子，上述疏水性官能基例如可为长链烷基或长链烯基，例如可为油酸或油胺之类的分子。
疏水性磁纳米粒子120具有稳定油相壳110结构的功能，使其不易坍塌。此外，除了可作为核磁共振显影(magnetic resonance imaging；MRI)的显影剂的外，还可在外加高频磁场(high frequency magnetic field；HFMF)下，利用磁流体过热(magnetic fluid hyperthermia；MFH)现象来进行局部加热，破坏油相壳110的结构。
由于缀合抗体的双乳化核壳纳米结构100具有油相壳110与水相核125的结构，两者可以用来分别容纳疏水性药物与亲水性药物。因此，上述双乳化核壳纳米结构100可应用来作为疏水性药物、亲水性药物或其任意组合的载体，并利用控制外加交流磁场的强度与开关来控制活性药物的释放速率。
参照图1B，其绘示利用双乳化核壳纳米结构来同时作为亲水性药物以及疏水性药物载体的剖面结构示意图。在图1B中，亲水性药物145容纳在双乳化核壳纳米结构100的水相核125中，疏水性药物140容纳在双乳化核壳纳米结构100的油相壳110中。举例来说，亲水性药物145例如可为小红莓(Doxorubicinl；DOXO)或顺铂(cisplatin)，疏水性药物140例如可为紫杉醇(Paclitaxel；PTX)、欧洲紫杉醇(Docetaxel；Dtxl)、喜树碱(Camptothecin；CPT)或姜黄素(Cururmine)。
表面缀合双乳化核壳纳米结构的制备方法
表面缀合有抗体的双乳化核壳纳米结构的制备方法是先以单乳化法或双乳化法来制备表面有连接基的双乳化核壳纳米结构。之后，再与抗体反应，形成表面缀合有抗体的双乳化核壳纳米结构。
图2A绘示以单乳化法制备表面有连接基的双乳化核壳纳米结构的流程示意图。在图2A中，先分别制备含有连接聚乙烯醇的水溶液(步骤202a)与含有疏水性磁纳米粒子的有机溶液(步骤202b)。然后，取多量的水溶液与少量的有机溶液，将两者混合搅拌后(步骤212)，形成含有双乳化核壳纳米结构的乳液(步骤222)。接着，去除乳液中的有机溶剂(步骤230)，得到双乳化核壳纳米结构(步骤235)。
在上述步骤202a的水溶液中，可选择再添加至少一种亲水性药物。在上述步骤202b的有机溶液中，可选择再添加至少一种的疏水性药物。
当有机溶液只含有疏水性磁纳米粒子时，所用的有机溶剂较佳为符合下述特性者：可有效地溶解或分散疏水性磁纳米粒子、与水不互溶及沸点较低。当有机溶液也含有疏水性药物时，除了上述特性外，所用有机溶剂较佳为还可同时有效地溶解或分散疏水性药物。
上述选用沸点较低的有机溶剂是因为可在不需过度加热的情况下，轻易地去除有机溶剂，以免对双乳化核壳纳米结构的外形造成不可控制的不良影响。例如可选择沸点在90℃以下的有机溶剂，如三氯甲烷、二氯甲烷、三氯乙烷或乙腈。
在上述步骤212中，混合搅拌方法例如可为超声震荡法。在上述的步骤230中，去除有机溶剂的方法，例如可为室温挥发法或减压蒸馏法。
图2B绘示以双乳化法制备表面有连接基的双乳化核壳纳米结构的流程示意图。在图2A中，先分别制备含有聚乙烯醇的第一水溶液(步骤205a)与含有疏水性磁纳米粒子的有机溶液(步骤205b)。取少量的第一水溶液与多量的有机溶液，使两者进行第一混合搅拌后(步骤210)，形成油包水的乳液(步骤215a)。此为第一阶段的乳化步骤。
在上述步骤205a的第一水溶液中，可选择再添加至少一种亲水性药物。在上述步骤205b的有机溶液中，可选择再添加至少一种疏水性药物。步骤205b的有机溶液的选择方法如同图2A中步骤202b中所述，因此不再赘述。
接着，制备含有连接高分子的第二水溶液(步骤215b)。使油包水乳液与第二水溶液进行第二混合搅拌步骤后(步骤220)，形成含有表面有连接基的双乳化核壳纳米结构的水包油乳液(步骤225)。此为第二阶段的乳化步骤。
上述步骤210的第一混合搅拌方法与步骤220的第二混合搅拌方法，例如可为超声震荡法。在上述的步骤230中，去除有机溶剂的方法，例如可为室温挥发法或减压蒸馏法。
图2C绘示表面有连接基的双乳化核壳纳米结构与抗体-耦合剂缀合物反应的流程示意图。在图2C中，先制备表面有连接基的双乳化核壳纳米结构的分散液(步骤240a)。接着，制备与耦合剂相接的抗体的分散液(步骤240b)，抗体通常是利用其自由一级胺基与耦合剂相接。
上述与抗体相接的耦合剂例如可为列在下表二中的各种耦合剂，其选择视上述连接基而定，以利于使耦合剂与连接基形成化学键结。例如当连接基为硫醇基时，耦合剂可以选用下表二中的SMCC或SPDP。而当连接基为羧基时，耦合剂可以选用下表二中的EDC与Sulfo-NHS一起作为耦合剂。
表二：常见的一些耦合剂
在上述步骤240a中制备表面有连接基的双乳化核壳纳米结构的分散液与步骤240b中制备与耦合剂相接的抗体的分散液所用的溶剂，是以所选耦合剂来决定的。例如，若选用SMCC为耦合剂，则可选用3mL的PBS缓冲液作为分散液的溶剂，其含有0.1M的磷酸钠与0.15M的NaCl，pH值为7.4。若选用EDC与Sulfo-NHS为耦合剂时，则可选用MES缓冲液作为分散液的溶剂，其含有0.1M的2-[吗啉代]乙磺酸[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；MES]以及0.5M NaCl，pH值为6.0。
然后使上述两种分散液混合后，一起反应(步骤245)，制备出缀合抗体的双乳化核壳纳米结构。接着，以离心方法移除未键结的自由抗体分子(步骤250)，得到缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(步骤255)。
在下面的实施例中，为了简化文字叙述起见，将「双乳化核壳纳米结构」简称为「载体」。
实施例一：制备包覆有油酸的Fe3O4纳米微粒
在此实施例中，制备粒径为约5nm的包覆有油酸(Oleic acid)的Fe3O4纳米微粒(以下简称为IO-OA纳米微粒)，其例示的制备方法简述如下。此外，制备方法的参考文献为Sun,S.H.；Zeng,H.；Robinson,D.B.；Raoux,S.；Rice,P.M.；Wang,S.X.；Li,G.X.Journal of the American Chemical Society,2004,126(1),273-279。
于三颈瓶中加入0.708克Fe(acac)3、2.58克的1,2-十六烷二醇(1,2-Hexadecanediol)、0.565克油酸、0.535克油胺(Oleylamine)、20mL芐醚(Benzyl Ether)。将上述混合物在冷却水回流及氮气环境下经过三步骤加热(第一段为100℃，持温30分钟；第二段为200℃，持温60分钟；第三段为285℃，持温30分钟后，冷却至室温)，形成IO-OA纳米微粒。接着，使IO-OA纳米微粒分散在乙醇中，再以6000rpm离心，去除上面的溶液，重多次后，使IO-OA纳米微粒保存于乙醇中。
实施例二：制备硫醇化聚甲基丙烯酸
在此实施例中，制备硫醇化聚甲基丙烯酸(thiolated polymethacrylic acid；TPMAA)，其例示的制备方法简述如下，并亦请同时参考下面的合成方案一。
合成方案一
取250mg的30wt％的PMAA水溶液，依序加入5mL的pH8的PBS缓冲液、75mg催化剂EDC与40mg催化剂Sulfo-NHS。混合搅拌15分钟后，加入5毫克的半胱胺(Cysteamine)，并混合搅拌至隔日，使半胱胺的一级胺基与PMAA的羧基反应形成酰胺键结，得到产物TPMAA。接着，利用透析法去除催化剂EDC和Sulfo-NHS后，利用冷冻干燥设备去除水分，得到TPMAA结晶。
实施例三：制备聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物
在此实施例中，制备聚乙烯醇(PVA)-硫醇化聚甲基丙烯酸(TPMAA)的共聚物，其例示的制备方法简述如下。
将上述所得的TPMAA与PVA混合，加入浓硫酸，反应成PVA-TPMAA共聚物以及副产物水。接着，以饱和碳酸钠溶液分离PVA-TPMAA共聚物以及反应物TPMAA和PVA，得到PVA-TPMAA共聚物的产物。
实施例四：制备硫醇化聚乙烯醇
在此实施例中，制备硫醇化聚乙烯醇(thiolated polyvinyl alcohol；TPVA)，其例示制备方法简述如下，并同时参考下面的合成方案二。制备方法的参考文献为Gupta B,Anjum S and Ikram S.Preparation of thiolated polyvinyl alcoholhydrogels.Journal of Applied Polymer Science.2013；129:815-21。
合成方案二
将PVA溶解于去离子水中，形成2wt％的PVA水溶液。将20-99％(v/v)的乙硫醇酸水溶液和0.1-1wt％的硫酸水溶液缓慢倒入PVA水溶液中，在油浴环境下加热，以进行酯化反应。接着，再将甲醇缓缓倒入上述PVA酯化反应的溶液中，使其产生沉淀。收集此沉淀产物并重复以甲醇纯化数次，得到粉体。然后，将粉体进行冷冻干燥，得到白色结晶粉体TPVA。
实施例五：制备羧甲基化聚乙烯醇
在此实施例中，制备羧甲基化聚乙烯醇(carboxymethylated polyvinylalcohol；CMPVA)，其例示制备方法简述如下，并同时参考下面的合成方案三。制备方法的参考文献为Yu C.and Li B.Preparation and characterization ofcarboxymethyl polyvinyl alcohol–graphite nanosheet composites.PolymerComposites.2008；29:998-1005。
合成方案三
首先，将PVA配制成2wt％的水溶液后，加入氢氧化钠活化PVA的羟基。再将氯乙酸(ClCH2COOH)溶于乙醇，以氢氧化钠中和，形成氯乙酸钠(ClCH2COONa)的乙醇溶液。使上述二溶液混合反应形成CMPVA的钠盐，五小时后，添加适量盐酸以调整酸碱值至pH为6。接着，加入过量酒精使CMPVA析出，并重复以酒精纯化产物数次。
实施例六：含PVA/TPMAA混合物的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，利用图2B的双乳化法制备含有PVA/TPMAA混合物的缀合抗体的载体，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与顺铂(Cisplatin)以及疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)与喜树碱(Camptothecin；CPT)为例，两者皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有PVA/TPMAA混合物的载体壳层表面缀合上抗体。
先分别配制亲水性药物/PVA水溶液、IO-OA纳米微粒/疏水性药物的CHCl3溶液以及PVA/TPMAA水溶液。在亲水性药物/PVA水溶液中，PVA的浓度为20mg/mL，亲水性药物(小红莓或顺铂)的浓度为8mg/mL。在IO-OA纳米微粒/疏水性药物的CHCl3溶液中，IO-OA纳米微粒的浓度为20mg/mL，当疏水性药物为紫杉醇时，紫杉醇浓度为30mg/mL，当疏水性药物为喜树碱时，喜树碱浓度为5mg/mL。在PVA/TPMAA水溶液中，PVA的浓度为20mg/mL，TPMAA的浓度为2mg/mL。上述PVA的平均分子量分别为16,000、25,000、31,000及47,000。TPMAA的改性比例约为37％。
取0.2mL的亲水性药物/PVA水溶液与0.5mL的IO-OA纳米微粒/疏水性药物氯仿溶液，将两者混合，利用20kHz超声震荡器将混合液乳化。当乳化完成，再加入1.5mL的PVA/TPMAA的水溶液，再次以超声震荡器乳化，得到含PVA/TPMAA混合物的载体。最后置于开放空间中，等待CHCl3挥发完全。CHCl3挥发时的温度高低会影响载体的形貌。再将含PVA/TPMAA混合物的载体分散于3mL的PBS缓冲液(含0.1M磷酸钠与0.15M的NaCl)中。
当以上述做法只包覆单一药物时，上述四种测试药物的包覆率及载体大小如下表三所示。由下表三可知，疏水性药物的包覆率通常大于亲水性药物的包覆率，因此包覆疏水性药物的载体尺寸也通常较大。此外，以目前的实验数据看来，亲水性药物的包覆率在75％以上，显示以双乳化法来合成包覆药物的载体的包覆效率相当好。
表三：单一亲水性药物或疏水性药物的包覆率
取1毫克乳癌抗体Trastuzumab与4.8毫克的耦合剂SMCC分别各自溶于2mL与5mL的PBS缓冲液(含0.1M磷酸钠与0.15M的NaCl)中，然后将两者混合，于4℃下反应2小时，得到缀合有SMCC的乳癌抗体Trastuzumab。利用透析离心管于8000rpm下，去除未反应的耦合剂SMCC，并将缀合有SMCC的乳癌抗体Trastuzumab重新分散于1mL的PBS缓冲液(含0.1M磷酸钠与0.15M的NaCl)中。
混合含有上述载体与缀合有SMCC的乳癌抗体Trastuzumab的PBS分散液，于4℃下反应2小时。再离心，以去除未反应的乳癌抗体Trastuzumab分子，并将产物重新分散于4mL的去离子水中。
上述耦合剂SMCC成为TPMAA的-SH连接基以及乳癌抗体Trastuzumab上的-NH2官能基的缀合桥梁，使乳癌抗体Trastuzumab透过SMCC与TPMAA的-SH连接基键结，接在载体壳层的外侧。
图3示出使用不同分子量PVA所合成出的空载体的扫描式电子显微镜(SEM)图。在图3中，含有分子量为16k、25k、31k及47k的PVA的空载体(即不含DOXO与PTX)的平均直径分别为140、130、130、125nm。显示PVA的分子量越大，空载体的平均直径有减少的趋势。
图4A-4B分别为缀合乳癌抗体前与缀合乳癌抗体后的载体的扫描式电子显微镜(SEM)影像，其中所用的PVA的分子量为16k。图4A示出混合TPMAA与PVA后合成的载体在经由去离子水清洗并重新分散后，利用真空干燥后所摄得的影像仍维持中空的球体结构。图4B示出同一批载体在缀合乳癌抗体后的形貌因为经历了表面改性，因此形态有些转变。
实施例七：溶液酸碱值对含PVA/TPMAA混合物的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)释放药物的影响
在此实施例中，测试溶液酸碱值对缀合抗体的载体释放药物的影响。在此所用载体的壳层为分子量16k的PVA与TPMAA的混合物。所用药物包括亲水性药物小红莓(Dox)与疏水性药物紫杉醇(PTX)。
TPMAA是将高分子PMAA修饰后带有硫醇官能机的高分子，而PMAA为一种酸碱敏感性的高分子，其支链上的羧基和烷基为PMAA在不同酸碱环境下展现不同外型的主要因素。当其在中性环境下时，高分子链呈现舒展的结构；然而，当环境转变为酸性时，PMAA将会转变成扎实的疏水卷曲结构。利用这种特性，将PMAA上的羧基部分取代为硫醇键，希望修饰成为TPMAA仍保有酸碱敏感性的特质，且同时可以利用改性后的硫醇键来缀合具有标靶作用的乳癌抗体Trastuzumab分子。为了探讨这种酸碱敏感性的特质，将合成后同时包覆有双药的载体分别置于中性pH7以及酸性pH4的环境之中，以观察其药物释放的变化。
图5A为包覆紫杉醇(PTX)且于合成时添加不等量的TPMAA的载体在pH4下的释放行为。图5B为包覆小红莓(Dox)且于合成时添加不等量的TPMAA的载体在pH4下的释放行为。TPMAA的改性比例约为37％。由图5A-5B可知，在pH4的酸性环境中，当增加TPMAA在合成时的添加量时，小红莓以及紫杉醇的释放量将明显的增加，显示TPMAA在酸性环境下有加速药物自载体内向外释放的的能力。
图5C为同时包覆亲水性小红莓与疏水性紫衫醇双药并于pH7以及pH4下的载体的药物释放行为，制备载体时TPMAA的添加量为1wt％，TPMAA的改性比例约为37％。由图5C可知，载体在pH4酸性环境中的释放药物量远大于在pH7中性环境下的药物释放量。而在pH4酸性环境中，油溶性的紫杉醇的释放率比水溶性小红莓的释放率还大。
图6A与图6B为含PVA/TPMAA混合物(TPMAA的添加量为1wt％)的缀合抗体载体分别在pH7与pH4下的穿透电子显微镜(TEM)影像。图6A示出在中性环境下的载体，球状的壳层结构相当明显。图6B示出在酸性环境下的载体，壳层遭受挤压而变形。
这样的药物释放特性，与上述TPMAA在酸性环境下会收缩并转变成疏水性的性质相符合。当遭遇到环境有大量的氢离子时，位于载体的壳层处的与PVA混合交缠并与PVA互相形成氢键的TPMAA将会开始收缩，使得载体变形而挤压壳层。因此在酸性环境下，处于壳层处的油相药物的释放量会较水相药物的释放量多。
实施例八：缀合乳癌抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)对HER2过度表达细胞的识别效果
在此实施例中，验证缀合乳癌抗体的载体对HER2过度表达的细胞是否具有标定的作用。在此所选用HER2过度表达的细胞株为SKBR3。所用的载体的壳层为分子量16k的PVA与TPMAA的混合物，其中TPMAA的添加量为1wt％，TPMAA的改性比例约为37％。
首先，将含有亲水性药物小红莓的载体分别缀合乳癌抗体Trastuzumab与对SKBR3细胞株不具有专一性的IgG。接着，使上述两者与SKBR3细胞株共培养30分钟。由于小红莓具有荧光性质(激发光波长488nm，放光波长580nm)，所以可利用流式细胞仪(flow cytometer)来检测经由抗体-抗原作用而贴附在细胞表面的荧光强度。
图7A示出使用流式细胞仪检测缀合乳癌抗体Trastuzumab的载体(以符号T代表)与SKBR3细胞共培养后所测得的荧光量。图7B示出使用流式细胞仪检测缀合IgG的载体(以符号IgG代表)与SKBR3细胞共培养后所测得的荧光量。上述两图的对照组为没有缀合任何抗体，但有包埋小红莓的载体。流式细胞仪的光激发波段为480nm，发光检测波段为580nm。
图7A示出当缀合乳癌抗体的载体的添加量越多时，越多的细胞带有越强的荧光，显示缀合有乳癌抗体Trastuzumab的载体对于SKBR3细胞株有明显的标靶作用。但是，图7B示出不论缀合IgG的载体的添加量为多少，带有不同荧光强度的细胞数目皆差不多，显示缀合IgG的载体对于SKBR3细胞株没有任何的标靶作用。
为了更加确定这个结果，将缀合乳癌抗体Trastuzumab且包埋小红莓的载体与缀合IgG且包埋小红莓的载体与SKBR3细胞共培养30分钟后，以染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole；DAPI)将细胞核染色，在共轭聚焦显微镜下观察具有荧光特性的小红莓与细胞的位置分布图。此外，还加入单纯的SKBR3细胞以及未被包埋的小红莓，也以共轭聚焦显微镜来进行观察。所得结果显示在图8上。
在图8中，每栏上方所标示的「细胞」、「Dox」、「IgG-Dox」与「T-Dox」分别代表SKBR3细胞、未被包埋的小红莓、缀合IgG且包埋小红莓的载体、缀合乳癌抗体Trastuzumab且包埋小红莓的载体等样品。第一列与第二列右方标示的「细胞核」与「Dox」分别代表细胞核与小红莓所在位置的影像图，而第三列的「影像重叠」则代表将第一列与第二列的影像重叠后所得的影像图。
图8的结果示出对SKBR3细胞具有专一性标定功用的乳癌抗体Trastuzumab载体，其细胞核与小红莓的影像有多个重叠处，显示缀合乳癌抗体Trastuzumab载体可以清楚地识别出SKBR3细胞。但是，其它样品几乎只有细胞核的影像，而没有小红莓的影像与其重叠。这表示，其它样品几乎都没有附着在SKBR3细胞表面，也就是无法识别出SKBR3细胞。
实施例九：缀合乳癌抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)对HER2过度表达细胞的毒杀效果
在此实施例中，将探讨包覆药物的缀合乳癌抗体的载体对于HER2过度表达细胞的毒杀效果。在此所用的载体的壳层为分子量16k的PVA与TPMAA的混合物，其中TPMAA的含量为1wt％。
因此，将上述载体分别以未经任何处理(对照组)、包覆紫杉醇(PTX)、包覆小红莓(Dox)、缀合乳癌抗体Trastuzumab(T)、包覆紫杉醇后缀合乳癌抗体Trastuzumab(T-PTX)、包覆双重药物(PTX-Dox)以及包覆双重药物后缀合乳癌抗体Trastuzumab(T-PTX-Dox)各种不同方式处理后，加入至细胞培养液中，再加入至培养皿中，与培养皿内的SKBR3细胞株在37℃下，共培养24小时。接着，以MTT法检测，以确定细胞毒杀效果。所得结果显示在图9以及下表四中。
表四：各样品对SKBR3细胞毒杀的效果。
*计算方式为(实验组载体所得的细胞存活率/未缀合抗体且未包药的载体所得的细胞存活率)x100％
由上述结果可知，对照组的载体对于细胞的存活率没有太大的影响，代表其安全性足够。但是，缀合抗体后，存活率下降至75％左右。比较包覆小红莓的缀合乳癌抗体前后的两者数据，其存活率亦从35％左右下降至29％左右，显示缀合抗体后，存活率下降至未接抗体前的82％。比较包覆紫衫醇的缀合乳癌抗体前后的两者数据，其存活率亦从56％左右下降至27％左右，显示缀合抗体后，存活率下降至未接抗体前的47.7％。再比较同时包覆小红莓与紫衫醇的缀合抗体前后的数据，可知缀合抗体后的存活率为缀合抗体前的存活率的59.1％。由这些比较可知，不论是何种形式的载体，在缀合乳癌抗体Trastuzumab后，对于HER2过度表达的SKBR3细胞的毒杀效果，都有增强作用的功效。
实施例十：缀合乳癌抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)的动物实验
在此实施例中，使用患有肿瘤的裸鼠来进行缀合乳癌抗体的载体的动物实验。在此所用载体的壳层为分子量16k的PVA与TPMAA的混合物，其中TPMAA的添加量为1wt％，且TPMAA的改性比例约为37％。壳层表面缀合有生物染剂Cyanine5.5(缩写为Cy5.5)。
首先，先观测载体在生物体内的分布情形。在实验过程中，以非侵入式活体影像***(non invasion in vivo imaging system；IVIS)的探测器来观测载体在裸鼠体内的分布状况。为了观察外加磁场对带有IO-OA纳米微粒的载体分布的影响，裸鼠左侧的肿瘤黏贴磁力为3700G的磁铁，右侧肿瘤则没有贴附任何磁铁。注射载体后的第1天与第3天的观测结果显示在图10A-10B中。
在图10A的第1天的影像中，可以观察到裸鼠左右两侧肿瘤110a、120a皆累积了大量的载体。但是到了第3天，由图10B的影像可知，裸鼠左侧肿瘤110b的载体的累积量远多于右侧肿瘤120b的载体的累积量，约为两倍左右。由此可看出外加磁场的确可以影响磁敏感载体在生物体内的分布状况。
接着，以裸鼠的异位肿瘤模型来检验各种载体的治疗效果。在实验过程中，先分别在第1、5、9、13天对患有肿瘤的裸鼠以静脉注射方式注入各种欲测试的载体，进行治疗。再以IVIS的探测器来观测注射后的第1-30天的肿瘤尺寸。所得结果显示在图11中。
在图11中的各实验组，静脉注射的内容物分别有盐水、没有包埋药物与缀合抗体的载体(在图中记做空载体)、包覆紫杉醇的载体(PTX)、包覆小红莓的载体(Dox)、包覆紫杉醇后缀合乳癌抗体的载体(T-PTX)、包覆小红莓与紫杉醇后缀合乳癌抗体的载体且没有外加磁场(T-PTX-DOX No MT)、包覆小红莓与紫杉醇后缀合乳癌抗体的载体(T-PTX-DOX)。在上述各组实验中，裸鼠的肿瘤处皆贴附有2000G的磁铁，只有其中一组实验(T-PTX-Dox No MT)的裸鼠在肿瘤处没有贴附磁铁。
由图11的结果可知，在裸鼠的肿瘤处贴附磁铁，且注射了包覆小红莓与紫杉醇后缀合乳癌抗体的载体(T-PTX-DOX)的实验组，其治疗效果最佳，到注射药物后的第30天，肿瘤的尺寸才增长为原来的约1.96倍而已。但是，注射盐水者的肿瘤，到了第30天，已经为原来的约17.6倍。
实施例十一：含PVA/PVA-TPMAA共聚物的混合物的缀合抗体双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，利用图2B的双乳化法制备含有PVA/PVA-TPMAA共聚物的混合物的双乳化核壳纳米结构，药物分子则以亲水性的小红莓(Dox)与疏水性紫杉醇(PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有PVA/PVA-TPMAA共聚物的载体壳层表面缀合上抗体。
含有PVA/PVA-TPMAA共聚物的混合物的载体制备方法与实施例六的含有PVA/TPMAA混合物的载体的制备方法类似。唯一不同处为在要进行第二次乳化步骤时，将PVA/TPMAA水溶液替换成2wt％的PVA-TPMAA共聚物的水溶液，且PVA-TPMAA共聚物中TPMAA的改性比例为37％。最后将所得缀合乳癌抗体Trastuzumab的含PVA/PVA-TPMAA共聚物的混合物的载体分散于去离子水中。
首先，先探讨PVA-TPMAA共聚物中TPMAA含量对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。所得结果如下表五所示。由表五数据可知，当TPMAA的含量越多时，抗体缀合率就越高，因为抗体的缀合需要TPMAA的硫醇基。而且，由于抗体的缀合率越高，使得载体的粒径也越大。至于疏水性紫衫醇与亲水性小红莓的包覆率，则与TPMAA含量多少的关系不大，显示药物包覆率不太会受到抗体缀合的影响，可能是在进行抗体缀合反应之前，药物就已经包埋在载体内的原因。
表五：PVA-TPMAA共聚物的TPMAA含量对抗体缀合率、载体粒径及药物包覆率的影响
再来，探讨在制备载体过程中，有机溶剂氯仿的挥发温度与挥发时间对载体粒径以及药物包覆率的影响。在此，PVA-TPMAA共聚物的PVA/TPMAA单体的摩尔数比例为4：1。所得结果列在下表六中。由表六的数据可知，在55℃以下，有机溶剂氯仿的挥发温度与挥发时间对载体粒径以及药物包覆率的影响并不明显。
表六：有机溶剂氯仿的挥发温度与挥发时间对载体粒径以及药物包覆率的影响。
接着，探讨制备载体过程中，乳化时间对于所得载体的粒径以及药物包覆率的影响。在此，PVA-TPMAA共聚物的PVA/TPMAA单体的摩尔数比例为4：1。所得结果列在下表七中。由表七的数据可知，第一次与第二次乳化时间的长短对载体粒径以及药物包覆率的影响并不明显。
表七：乳化时间对于所得载体的粒径以及药物包覆率的影响。
再来，探讨PVA分子量以及PVA-TPMAA共聚物中TPMAA含量对双乳化法所得产物外型的影响。所得结果列在下表八中。由表八的数据可知，当PVA分子量由25,000增加至61,000时，随着PVA-TPMAA共聚物中TPMAA的含量增加，具有核壳结构的载体粒径也跟着增加。其中，使用分子量47,000的PVA来进行制备所得的产物，还约有半数具有核壳结构。使用分子量61,000的PVA来进行制备时，只剩下少数产物具有核壳结构。使用分子量78,000的PVA来进行合成时，就没有观察到任何具有核壳结构的产物了。显示当PVA的分子量太大时，将不利于具有核壳结构的产物生成。
表八：PVA分子量以及PVA-TPMAA共聚物中TPMAA的含量对双乳化法所得产物外型的影响。
实施例十二：含PVA/TPVA混合物的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，利用图2B的双乳化法制备含有PVA/TPVA的混合物的双乳化核壳纳米结构，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有PVA/TPVA混合物的载体壳层表面缀合上抗体。
含有PVA/TPVA混合物的载体制备方法与实施例七的含有PVA/TPMAA混合物的载体的制备方法类似。唯一不同处为在要进行第二次乳化步骤时，将PVA/TPMAA水溶液替换成2wt％的TPVA的水溶液，且TPVA的改性比例约为30％。最后将所得缀合乳癌抗体Trastuzumab的含PVA/TPVA混合物的载体分散于去离子水中。
首先，先探讨TPVA含量对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。所得结果如下表九所示。由表九数据可知，当TPVA的含量越多时，抗体缀合率就越高，因为抗体的缀合需要TPVA的硫醇基。而且，由于抗体的缀合率越高，使得载体的粒径也越大。至于疏水性紫衫醇与亲水性小红莓的包覆率，则与TPVA含量多少的关系不大，显示药物包覆率不太会受到抗体缀合的影响，可能是在进行抗体缀合反应之前，药物就已经包埋在载体内的原因。
表九：TPVA含量对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。
接着，探讨制备载体过程中，乳化时间对于所得载体的粒径以及药物包覆率的影响。在此，TPVA的含量为30mol％，在此所用的PVA的分子量为16,000。所得结果列在下表十中。由表十的数据可知，第一次与第二次乳化时间的长短对载体粒径以及药物包覆率的影响并不明显。
表十：乳化时间对于所得载体的粒径以及药物包覆率的影响。
再来，探讨PVA分子量以及TPVA含量对双乳化法所得产物外型的影响。所得结果列在下表十一中。由表十一的数据可知，当PVA分子量由25,000增加至61,000时，随着TPVA含量增加，具有核壳结构的载体粒径也跟着增加。其中，使用分子量47,000的PVA来进行制备所得的产物，还约有半数具有核壳结构。使用分子量61,000的PVA来进行制备时，只剩下少数产物具有核壳结构，而且还掺杂粒径较小的实心球体的产物。使用分子量78,000的PVA来进行合成时，就没有观察到任何具有核壳结构的产物了。显示当PVA的分子量太大时，将不利于具有核壳结构的产物生成。
表十一：PVA分子量以及TPVA含量对双乳化法所得产物外型的影响。
实施例十三：含PVA/PAA混合物的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，利用图2B的双乳化法制备含有PVA/PAA混合物的载体，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有PVA/PAA混合物的载体壳层表面缀合上抗体。
含有PVA/PAA混合物的载体制备方法与实施例六的含有PVA/TPMAA混合物的载体的制备方法类似。第一个不同处为在要进行第二次乳化步骤时，将PVA/TPMAA混合物的水溶液替换成PVA/PAA混合物的水溶液。在PVA/PAA混合物的水溶液中，PVA的浓度为20mg/mL，而PAA的浓度为2mg/mL。第二个不同处为乳癌抗体Trastuzumab所使用的耦合剂从SMCC替换成EDC/sulfo-NHS，以连接PAA的羧基与乳癌抗体Trastuzumab上的-NH2基。在此所用的PVA的分子量为16,000。
在使乳癌抗体Trastuzumab与耦合剂反应过程中，先配制0.1M的MES缓冲液，其含有0.1M的MES与0.5M的NaCl，pH值为6.0。然后在3mL的MES缓冲液中，依序添加载体、50μg的EDC和60μg的Sulfo-NHS，于室温下混合搅拌使其反应15分钟。接着，加入1μL的2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)至上述的MES缓冲液中，中止EDC的活化反应。然后，再加入高浓度的PBS，将前述MES缓冲液的酸碱值调整至大于7后，加入500μg的乳癌抗体Trastuzumab。在室温下反应两小时，完成缀合反应，使乳癌抗体Trastuzumab缀合至载体上。
将所得的缀合有乳癌抗体Trastuzumab的载体加入去离子水，再以7000rpm离心后，移除未反应的试剂。重复上述步骤数次后，使所得的缀合有乳癌抗体Trastuzumab的载体再分散于溶剂中，例如食盐水。
图12为含有PVA/PAA混合物并以EDC/Sulfo-NHS缀合乳癌抗体Trastuzumab后的载体结构的外观SEM影像。从图12可知，缀合了乳癌抗体Trastuzumab的载体外型会由一般常见的球体转变为不规则的形状，推测其因是抗体键结于载体的表面，使得载体不再是球体形状。但是，仍可通过其边界的黑白对比看出其仍具有中空的结构。而且所得缀合乳癌抗体的含有PVA/PAA混合物载体可均匀地分散在溶液中而没有沉淀。因此，缀合乳癌抗体的含有PVA/PAA混合物载体基本上与实验例七缀合乳癌抗体的含PVA/TPMAA混合物载体类似。
实施例十四：含PVA/PMAA混合物的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，利用图2B的双乳化法制备含有PVA/PMAA的混合物的载体，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有PVA/PMAA混合物的载体表面缀合上抗体。
含有PVA/PMAA混合物的载体制备方法与实施例十三的含有PVA/PAA混合物的载体的制备方法类似。唯一不同处为在要进行第二次乳化步骤时，将PVA/PAA混合物的水溶液替换成PVA/PMAA混合物的水溶液。在此所用的PVA的分子量为16,000。
所得缀合乳癌抗体的含有PVA/PMAA混合物载体，在SEM下外型也是由球体转变成不规则形状，但是仍然保有中空结构。此外，缀合乳癌抗体的含有PVA/PMAA混合物载体也可均匀地分散在溶液中而没有沉淀。因此，缀合乳癌抗体的含有PVA/PMAA混合物载体与实验例七缀合乳癌抗体的含PVA/TPMAA混合物载体类似。
实施例十五：含PVA/CMPVA混合物的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，利用图2B的双乳化法制备含有PVA/CMPVA的混合物的载体，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有PVA/CMPVA混合物的载体表面缀合上抗体。
含有PVA/CMPVA混合物的载体制备方法与实施例十三的含有PVA/PAA混合物的载体的制备方法类似。唯一不同处为在要进行第二次乳化步骤时，将PVA/PAA混合物的水溶液替换成PVA/CMPVA混合物的水溶液。在此所用的PVA的分子量为16,000，CMPVA的改性比例为30％。
首先，先探讨CMPVA含量对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。所得结果如下表十二所示。由表十二数据可知，当CMPVA的含量越多时，抗体缀合率就越高，因为抗体的缀合需要CMPVA的羧基。而且，由于抗体的缀合率越高，使得载体的粒径也越大。
至于疏水性紫衫醇与亲水性小红莓的包覆率，则与CMPVA含量多少的关系不大，显示药物包覆率不太会受到抗体缀合的影响，可能是在进行抗体缀合反应之前，药物就已经包埋在载体内的原因。但是，与含PVA/TPVA混合物的载体相比(请同时参考表九与表十二)，由于CMPVA的羧基易解离出质子而带有负电荷，因此使得带正电荷的小红莓包覆率提升了5-10％。
表十二：CMPVA含量对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。
接着，探讨制备载体过程中，乳化时间对于所得载体的粒径以及药物包覆率的影响。在此，CMPVA的含量为30mol％，在此所用的PVA的分子量为16,000。所得结果列在下表十三中。由表十三的数据可知，第一次与第二次乳化时间的长短对载体粒径以及药物包覆率的影响并不明显。
表十三：乳化时间对于所得载体的粒径以及药物包覆率的影响。
再来，探讨PVA分子量以及CMPVA含量对双乳化法所得产物外型的影响。所得结果列在下表十四中。由表十四的数据可知，当PVA分子量由25,000增加至61,000时，随着CMPVA含量增加，具有核壳结构的载体粒径也跟着增加。其中，使用分子量61,000的PVA来进行制备时，只剩下少数产物具有核壳结构。使用分子量78,000的PVA来进行合成时，就没有观察到任何具有核壳结构的产物了。显示当PVA的分子量太大时，将不利于具有核壳结构的产物生成。
表十四：PVA分子量以及CMPVA含量对双乳化法所得产物外型的影响。
实施例十六：含PVA-TPMAA共聚物的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，以图2A的单乳化法制备含有PVA-TPMAA共聚物的载体，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有PVA-TPMAA共聚物的载体缀合上抗体。
先分别配制PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液与IO-OA纳米粒子/PTX的CHCl3有机溶液。在PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液中，PVA-TPMAA共聚物的浓度为20mg/mL，Dox的浓度为8mg/mL。在IO-OA纳米粒子/PTX的CHCl3有机溶液中，IO-OA纳米粒子的浓度为20mg/mL，PTX的浓度为30mg/mL。
取2.5mL的PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液与1mL的IO-OA纳米微粒/PTX的CHCl3有机溶液，将两者混合，PVA-TPMAA共聚物中TPMAA的改性比例为37％。利用20kHz超声震荡器使混合液乳化，而后置于开放空间中，等待CHCl3挥发完全。CHCl3挥发时的温度高低会影响载体的形貌。再将含PVA-TPMAA共聚物的载体于离心后重新分散于3mL的PBS缓冲液(含0.1M磷酸钠与0.15M的NaCl)中。
接着，以实施例七中的缀合乳癌抗体的方法，将抗乳癌体Trastuzumab缀合至含PVA-TPMAA共聚物的载体的表面上。
接着，探讨在含PVA-TPMAA共聚物的载体中，TPMAA含量对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响，所得结果如下表十五所示。由表十五的数据可知，当共聚物中TPMAA的含量越多时，抗体缀合率会因为缀合所需硫醇基的增加而跟着增加。另外，载体的粒径也因为分子量较大的TPMAA的量的提升和抗体的缀合率越高，使得载体的粒径也越大。至于疏水性紫衫醇与亲水性小红莓的包覆率，则与TPMAA含量多少的关系不大，显示药物包覆率不太会受到抗体缀合的影响。这可能是在进行抗体缀合反应之前，药物就已经包埋在载体内的原因。
表十五：PVA-TPMAA共聚物的TPMAA含量对抗体缀合率、载体粒径及药物包覆率的影响
实施例十七：含TPVA的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，以图2A的单乳化法制备含有TPVA的载体，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有TPVA的载体壳层表面缀合上抗体。
缀合抗体的含有TPVA载体的制备方法与实施例十六的含有PVA-TPMAA共聚物载体的方法类似，唯一不同处为PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液换成TPVA/Dox水溶液。在TPVA/Dox水溶液中，TPVA的浓度为20mg/mL，Dox的浓度为8mg/mL。
图13A-13C分别为分子量25,000、47,000与78,000的含有TPVA载体外观的SEM影像。由图13A-13C可知，随着分子量的提升，载体团聚的情况逐渐明显。其可能因为TPVA分子量增加，使得载体的疏水性上升的原因。尤其当分子量来到78k时，TPVA分子量已经过高，因而无法形成空心的载体。
接着，由于TPVA系由PVA改性而来，因此探讨在含TPVA的载体中，TPVA改性比例对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。以分子量16,000的PVA改性而得的TPVA为例，所得结果如下表十六所示。由表十六的数据可知，当TPVA的改性比例越高时，抗体缀合率会因为缀合所需硫醇基的增加而跟着增加。另外，载体的粒径也因为抗体的缀合率越高，使得载体的粒径也越大。至于疏水性紫衫醇与亲水性小红莓的包覆率，则与TPVA含量多少的关系不大，显示药物包覆率不太会受到抗体缀合的影响。这可能是在进行抗体缀合反应之前，药物就已经包埋在载体内的原因。
表十六：TPVA含量对抗体缀合率、载体粒径及药物包覆率的影响
实施例十八：含CMPVA的缀合抗体的双乳化核壳纳米结构(载体)
在此实施例中，以图2A的单乳化法制备含有CMPVA的载体，药物分子则以亲水性的小红莓(Doxorubicin；Dox)与疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)为例，两种皆为常见的癌症化疗药物。然后再以图2C的方法，在含有CMPVA的载体缀合上抗体。
前半段含有CMPVA载体的制备方法与实施例十六的含有PVA-TPMAA共聚物载体的方法类似，唯一不同处为PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液换成CMPVA/Dox水溶液。在CMPVA/Dox水溶液中，CMPVA的浓度为20mg/mL，Dox的浓度为8mg/mL。后半段缀合抗体的部分，则与实施例十三的含有PVA/PAA混合物的载体类似，选择EDC/sulfo-NHS为耦合剂，以连接CMPVA的羧基与乳癌抗体Trastuzumab上的-NH2基。
接着，探讨在含CMPVA的载体中，CMPVA含量对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。以分子量16,000的PVA改性而得的为例，所得结果如下表十七所示。由表十七的数据可知，当PVA的改性比例越高时，抗体缀合率会因为缀合所需羧基的增加而跟着增加。另外，载体的粒径也因为抗体的缀合率越高，使得载体的粒径也越大。
至于疏水性紫衫醇与亲水性小红莓的包覆率，则与CMPVA含量多少的关系不大，显示药物包覆率不太会受到抗体缀合的影响。这可能是在进行抗体缀合反应之前，药物就已经包埋在载体内的原因。但是，与实施例十五的缀合抗体的含PVA/CMPVA混合物的载体相比，由于单乳化法只使用单一CMPVA，因此在载体的内外表面上都会分布有羧基。又，由于羧基容易解离出质子而带负电，因此可增加水相核内的小红莓包覆量，使小红莓的包覆率提升了1-5％。
表十七：CMPVA改性比例对所得载体的抗体缀合率、载体粒径与药物包覆率的影响。
由上述可知，可以使用单乳化法直接使连接聚乙烯醇形成双乳化核壳纳米结构，令所得的双乳化核壳纳米结构的壳层内外表面展现连接基。也可以使用双乳化法在原先的水溶性高分子中掺入连接高分子，在所得的双乳化核壳纳米结构的壳层外表面展现连接基。再利用此连接基与所需的抗体结合，则可使抗体缀合在双乳化核壳纳米结构的壳层外表面。因此，包覆药物与疏水性磁纳米粒子的双乳化核壳纳米结构不但可以识别特定细胞，进行标靶治疗，而且还可以进一步利用外加磁场来增加治疗标靶处的药物累积量与其治疗效果。
虽然本发明已以实施方式揭露如上，然而其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种的修改与改变，因此本发明的保护范围以所附权利要求书所界定为准。

Claims (14)

1.一种缀合抗体的双乳化核壳纳米结构，其直径为50-400nm且包括：
水相核；
油相壳，其包围该水相核，该油相壳的组成包含一高分子与多个疏水性磁纳米粒子，但不包含其它高分子与其它表面活性剂，其中该高分子为连接聚乙烯醇或是聚乙烯醇与连接高分子的组合，且该连接聚乙烯醇与该连接高分子具有连接基；以及
至少一抗体，其通过耦合剂键结于该连接基上。
2.根据权利要求1所述的双乳化核壳奈米结构，其中该架桥基包括羧基、硫醇基、醛基、胺基或羟基。
3.根据权利要求1所述的双乳化核壳纳米结构，其中该连接聚乙烯醇为羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚乙烯醇或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物。
4.根据权利要求1所述的双乳化核壳纳米结构，其中该连接高分子为聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、或硫醇化聚甲基丙烯酸。
5.根据权利要求1所述的双乳化核壳纳米结构，其中所述疏水性磁纳米粒子为表面有疏水性官能基修饰的Fe2O3、Fe3O4、CoFe2O4或MnFe2O4微粒。
6.根据权利要求1所述的双乳化核壳纳米结构，其中该抗体包括乳癌抗体Trastuzumab、大肠癌抗体Cetuximab、表皮生长因子受体的抗体Panitumumab或抑制血管新生的抗体Bevacizumab。
7.根据权利要求1所述的双乳化核壳纳米结构，其中该油相壳包含疏水性药物。
8.根据权利要求1所述的双乳化核壳纳米结构，其中该水相核包含亲水性药物。
9.根据权利要求1-6任一项所述的双乳化核壳纳米结构的制备方法，包括：
制备一水溶液，其包括该连接聚乙烯醇，但不包含其它高分子与其它表面活性剂；
制备一有机溶液，其包括该些疏水性磁纳米粒子；
混合搅拌该水溶液与该有机溶液，以形成乳液，并于该乳液中形成多个双乳化核壳纳米结构；
去除该有机溶液所用的有机溶剂，以得到该些双乳化核壳纳米结构；
制备第一分散液，其包括该些双乳化核壳纳米结构；
制备第二分散液，其包括与该耦合剂相接的该抗体；以及
混合搅拌第一分散液与第二分散液，使该连接聚乙烯醇的连接基缀合上与该耦合剂相接的该抗体。
10.根据权利要求9所述的双乳化核壳纳米结构的制备方法，其中于制备该水溶液时，包括加入亲水性药物。
11.根据权利要求9所述的双乳化核壳纳米结构的制备方法，其中于制备该有机溶液时，包括加入疏水性药物。
12.根据权利要求1-6任一项所述的双乳化核壳纳米结构的制备方法，包括：
制备包括该聚乙烯醇，但不包含其它高分子与其它表面活性剂的第一水溶液；
制备包括该些疏水性磁纳米粒子的有机溶液；
混合搅拌该第一水溶液与该有机溶液，以形成油包水乳液；
制备包括该连接高分子与该聚乙烯醇，但不包含其它高分子与其它表面活性剂的第二水溶液；
混合搅拌该油包水乳液与该第二水溶液，以形成水包油乳液，并于该水包油乳液中形成多个双乳化核壳纳米结构；
去除该有机溶液所用的有机溶剂，以得到该些双乳化核壳纳米结构；
制备包括该些双乳化核壳纳米结构的第一分散液，其；
制备包括与该耦合剂相接的该抗体的第二分散液；以及
混合搅拌第一分散液与第二分散液，使该连接高分子的连接基缀合上与该耦合剂相接的该抗体。
13.根据权利要求12所述的双乳化核壳纳米结构的制备方法，其中于制备该第一水溶液时，包括加入亲水性药物。
14.根据权利要求12所述的双乳化核壳纳米结构的制备方法，其中于制备该有机溶液时，包括加入疏水性药物。
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