CN104204193B

CN104204193B - 间充质干细胞的培养

Info

Publication number: CN104204193B
Application number: CN201380016363.8A
Authority: CN
Inventors: 托尼·佩勒德; 雅尔·斯坦哈特
Original assignee: Gamida Cell Ltd
Current assignee: Gamida Cell Ltd
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2033-02-13
Also published as: EP2814950A1; IL234095A0; SG11201404608WA; WO2013121427A1; JP2015507921A; WO2013121426A1; US10047345B2; IN2014MN01680A; US20150064273A1; JP6348848B2; HK1202581A1; US20150004146A1; AU2013219945A1; CN104204193A; BR112014020119A2; IL234095B; AU2013219945B2; HK1199905A1; EP2814951A1; EP2814951B1

Abstract

提供了培养间充质干细胞的方法。该方法包括在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中培养MSC。还提供了使用本文中描述的方法产生的间充质干细胞群及其用途。

Description

间充质干细胞的培养

技术领域和背景技术

本发明在其一些实施方案中涉及扩增间充质干细胞和由其产生的细胞群的方法。

间充质干细胞(MSCs)是非造血细胞，其能够分化成特定类型的间充质或***，包括脂肪、骨、软骨、弹性、神经元、肝脏、胰腺，肌肉和纤维***。这些细胞进入的特定分化途径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(例如生长因子、细胞因子和/或由宿主组织建立的局部微环境条件)的各种影响。

MSC在整个成年生物体中位于不同的组织宿主中并且具有使对于这些组织为特异性的细胞类型“再生”的能力。这些组织的实例包括脂肪组织、脐带血、骨膜、滑膜、肌肉、真皮、周细胞、血、骨髓和海绵骨。

间充质干细胞的多能性特征使得这些细胞成为有吸引力的治疗手段和用于移植的候选物，并能够在细胞和基因疗法策略背景下的广泛临床应用中发挥作用。可将间充质细胞用于增强移植后的造血植入、修正骨和软骨的遗传性和获得性障碍、假肢器官装置至结缔和骨骼组织的植入以及用作基因疗法的媒介物。

在培养中，扩增的MSC表达一组关键标志物，包括CD105(内皮因子、SH2)、CD73(外－5’核苷酸酶、SH3、SH4)、CD166(ALCAM)、CD29(β1-整联蛋白)、CD44(H-CAM)和CD90(Thy-1)。与造血干细胞相反，它们缺乏CD45、CD34和CD133的表达。

MSC可通过它们在体外形成成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的能力来鉴定。然而，这些细胞在其增殖和分化能力方面是异质性的。已鉴定了至少两个形态学上不同的MSC群，其不仅在大小上还在其细胞***率和分化能力上不同。此外，来自成人骨髓的源自单细胞的MSC集落的分析显示集落经历成骨性、脂肪形成和软骨形成分化的不同能力。

在大多数情况下，未分级的骨髓衍生细胞被用作培养MSC的起始群体。该分离法依赖于成纤维细胞样细胞至塑料表面的粘附和非粘附造血细胞的去除。所产生的细胞不好界定，并且不仅产生异质性MSC群还产生成骨细胞和/或骨祖细胞、脂肪细胞、网状细胞、巨噬细胞和内皮细胞。为了更准确地界定起始群体，已使用了MSC中富集的表面标志物，例如SH2(CD105)、SH3/SH4(CD73)、SSEA-4和低亲和力神经生长因子受体(CD271)(Simmons P.J等人，(1991)Blood 78:55–62；Conconi MT等人,(2006)Int J Mol Med 18:1089–96；Gang EJ等人,(2007)Blood 109:1743–51；Liu PG,(2005)；Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi13:656–9；Quirici N等人,(2002)Exp.Hematol 30:783–91)。

另一个靶向分离间充质干细胞的均质群体的细胞表面抗原的实例是间充质前体抗原－1(STRO-1)。STRO-1抗原在约10－20％的成人BM(包括所有的CFU-F、血型糖蛋白A有核红细胞以及CD19B细胞的一小亚类)上表达，但其不在造血干细胞和祖细胞(HSC)上表达(Simmons and Torok-Storb,1991)。STRO-1被广泛地认为是早期间充质/基质前体细胞的标志物，因为其与间充质细胞集落生成、可塑性和其它祖细胞特征强烈相关(Psaltis等人,(2010),Journal of Cellular Physiology,530-540)。已显示STRO-1(STRO-1Bright)与其它表面标志物例如CD106、CD49a、CD146或STRO-3的高共表达极大地增加了BM MNC的克隆形成率(Gronthos等人,2008,Methods Molecular Biology,449:45-57)。新分离的STRO-1^Bright BM MNC还具有其它的多能干细胞所特有的标志性特征，包括体内静态、高端粒酶活性和未分化表型。此外，该细胞群缺乏造血干细胞相关(CD34)、白细胞相关(CD45)和红细胞相关(血型糖蛋白－A)的标志物。

最近，血小板衍生生长因子受体-β(PDGF-RB；CD140b)被鉴定为克隆生成MSC的分离的选择性标志物(Buhring HJ,(2007)Ann N Y Acad Sci1106:262–71)。其它的报道证明MSC在具有显著的醛脱氢酶活性的骨髓细胞中有9.5倍的富集(Gentry T et al.,(2007)Cytotherapy 9:259–74)。

即使MSC在体外相对容易繁殖，在延长的培养期间它们的增殖潜力和它们的干细胞特性连续降低。例如，已显示培养物的扩增导致过早衰老(由连续形态和功能变化表征的老化过程)。细胞变得大得多，具有不规则和扁平的形状和细胞质变得较多粒状。这些与衰老相关的效应可连续从体外培养开始而获得(PLoS ONE,May 2008|Volume 3|Issue 5|e2213)。因此，从一个供体商业化大批制造在培养物的扩增之后保持他们的特性的均质MSC仍然是个挑战。

由于MHC分子，尤其Ⅱ类MHC分子在间充质干细胞上的低表达或不表达，这些细胞可被认为是免疫赦免的，从而为这样的细胞用于治疗大量病症的同种异体移植铺设了道路。因此，扩增间充质干细胞库的改进方法已成为商业化其用途的重要因素。

在过去的几年里已经广泛研究了生长因子在增加MSC的增殖和存活中的作用，并且提出了用于增加这些细胞的扩增效率的许多因素。

例如，涉及MSC的扩增的许多方案包括在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的存在下培养(Vet Res Commun.2009Dec；33(8):811-21)。已显示b-FGF不仅包含MSC增殖潜力，而它还在整个早期促有丝***周期中保留成骨性、脂肪形成和软骨形成的分化潜力。

已显示血管内皮生长因子(VEGF)增加MSC增殖(Pons et al.,Biochem BiophysRes Commun 2008,376:419-422)。

已显示肝细胞生长因子(HGF)至MSC群的外源添加影响增殖、迁移和分化(Furgeet al.,Oncogene 2000,19:5582-5589)。

另一个提出的增加MSC扩增的生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)，已显示其为MSC的有效的促细胞***剂(Kang et al.,J Cell Biochem 2005,95:1135-1145)。

已显示表皮生长因子(EGF)和肝素结合的EGF两者促进MSC的体外扩增而不引发至任何特定谱系的分化(Kang et al.,J Cell Biochem 2005,95:1135-1145)。除了它对MSC的促有丝***的影响以外，EGF还将克隆形成单位的数目增加了25％(Tamama et al.,JBiomed Biotechnol 2010.,795385)。

其它的报道基于研究MSC中Wnt信号转导增殖的实验显示了Wnt信号转导激动剂用于扩增MSC的用途。已显示经典Wnt信号转导能将肝细胞维持在未分化但自我更新的状态。添加Wnt3a来活化经典Wnt途径同时增加了MSC的增殖和存活，并防止分化为成骨细胞谱系(Boland et al.,J Cell Biochem 2004,93:1210-1230)。

根据先前已存在的关于特定生长因子对细胞形态发生的作用的知识来最初确定将用于MSC的生长因子的选择。这通过扩增MSC和使它们分化为已知喜好的谱系的双重探索来进行。已知转化生长因子β(TGFβ)例如在体内影响来自软骨形成谱系的细胞，从而促进前软骨细胞增殖、细胞外基质的产生、软骨特异性分子沉积和间充质凝聚的起始阶段，同时抑制终末分化。当应用于MSC时，细胞显示增加的增殖和对软骨形成谱系的偏好(Bonewald eta.,J Cell Biochem 1994,55:350-357；Longobardi L,J Bone Miner Res 2006,21:626-636)。

已显示已知增强骨分化的转化生长因子β家族的另一个成员BMP-3增加MSC增殖三倍(Stewart A et al.,Cell Physiol 2010,223:658-666)。

烟酰胺(NA)(尼克酸的酰胺形式(维生素B3))是碱交换底物和具有单－和多－ADP核糖基转移酶活性的NAD(+)依赖性酶的有效抑制剂。ADP核糖基化涉及许多生物过程的改变(Corda D,Di Girolamo M.2003；22(9):1953-1958；Rankin PW,et al.,J BiolChem.1989；264:4312–4317；Banasik M.et al.,J BiolChem.1992；267:1569–1575；UedaK,Hayaishi O,Annu Rev Biochem.1985；54:73–100；Smith S.Trends Biochem Sci.2001；26:174–179；Virág L,Szabó C.Pharm.Reviews.2002；54:375-429)。

WO 07/063545公开了烟酰胺用于造血干细胞群和/或祖细胞群的扩增的用途。

WO 03/062369公开了烟酰胺、和CD38的其它抑制剂用于在离体扩增的干细胞和祖细胞的分化的用途。然而，WO 03/062369没有教导以特定的时间间隔施用烟酰胺。

美国专利申请号20050260748教导了在低钙浓度的存在下采用烟酰胺分离和扩增间充质干细胞。

其它的背景技术包括Farre et al.,Growth Factors,2007Apr；25(2):71-6。

发明内容

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了培养间充质干细胞(MSC)的方法，该方法包括在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中培养MSC群，从而培养MSC。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了扩增间充质干细胞群的方法，该方法包括在足够用于细胞增殖的时间段内培养作为种子的间充质干细胞群，其中在至少部分时间段内在没有烟酰胺的培养基中实施培养，以及在至少第二部分时间段内在包含烟酰胺和FGF4的培养基中实施培养，从而产生扩增的间充质干细胞群。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生用于至受试者的移植的细胞的方法，该方法包括：

(a)根据本文中描述的方法培养间充质干细胞，以产生培养的间充质干细胞群；

(b)将培养的间充质干细胞群与分化剂接触，从而产生用于至受试者的移植的细胞。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了产生用于移植的细胞的方法，该方法包括：

(a)根据本文中描述的方法培养间充质干细胞；

(b)将间充质干细胞与分化剂接触，从而产生用于移植的细胞。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了根据本文中描述的方法产生的分离的间充质干细胞群。

根据本文中描述的方法产生的分离的分化细胞群。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括将治疗上有效量的本文中描述的分离的细胞群移植入有此需要的受试者，从而治疗疾病或障碍。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含间充质干细胞和培养基的细胞培养物，所述培养基包含烟酰胺和FGF4。

根据本发明的一些实施方案，培养基包含DMEM。

根据本发明的一些实施方案，培养基包含血清或血小板裂解物。

根据本发明的一些实施方案，间充质干细胞衍生自选自骨髓、脂肪组织、胎盘和脐带血的组织。

根据本发明的一些实施方案，烟酰胺选自烟酰胺、烟酰胺类似物、烟酰胺代谢产物、烟酰胺类似物代谢产物及其衍生物。

根据本发明的一些实施方案，在塑料表面上实施培养。

根据本发明的一些实施方案，MSC群包含在异质细胞群中。

根据本发明的一些实施方案，至少70％的异质细胞群为MSC。

根据本发明的一些实施方案，培养基的钙浓度大于1.8mM。

根据本发明的一些实施方案，实施培养至少一个星期。

根据本发明的一些实施方案，实施培养至少3次传代。

根据本发明的一些实施方案，烟酰胺的浓度为1-20mM。

根据本发明的一些实施方案，培养基没有血小板衍生生长因子(PDGF)。

根据本发明的一些实施方案，在不诱发间充质干细胞的分化的条件下实施所述扩增。

根据本发明的一些实施方案，在不存在烟酰胺的情况下播种所述作为种子的间充质干细胞群。

根据本发明的一些实施方案，在存在烟酰胺的情况下播种所述播种的间充质干细胞群。

根据本发明的一些实施方案，没有烟酰胺的培养基没有FGF4。

根据本发明的一些实施方案，没有烟酰胺的培养基包含FGF4。

根据本发明的一些实施方案，在包含烟酰胺的培养基中实施培养，随后在没有烟酰胺的培养基中培养。

根据本发明的一些实施方案，在没有烟酰胺的培养基中实施培养，随后在包含烟酰胺的培养基中培养。

根据本发明的一些实施方案，实施在包含烟酰胺的培养基中的培养至少一天。

根据本发明的一些实施方案，实施在包含烟酰胺的培养基中的培养至少一个星期。

根据本发明的一些实施方案，实施在没有烟酰胺的培养基中的培养至少一天。

根据本发明的一些实施方案，实施在没有烟酰胺的培养基中的培养至少一个星期。

根据本发明的一些实施方案，在包含钙的培养基中实施在包含烟酰胺的培养基中的培养，其中所述钙的浓度大于1.8mM。

根据本发明的一些实施方案，在包含钙的培养基中实施在没有烟酰胺的培养基中的培养，其中所述钙的浓度大于1.8mM。

根据本发明的一些实施方案，分化剂包含生长因子。

根据本发明的一些实施方案，分化剂包含编码分化剂的多核苷酸。

根据本发明的一些实施方案，多核苷酸编码骨形态发生蛋白2(BMP2)。

根据本发明的一些实施方案，分离的间充质干细胞群是大体上均质的。

根据本发明的一些实施方案，至少40％的细胞表达VCAM1/CD106。

根据本发明的一些实施方案，至少90％的细胞具有小于20μm的直径。

根据本发明的一些实施方案，分离的间充质干细胞群比在同样的但不存在烟酰胺的条件下产生的间充质干细胞要更少地粒状。

根据本发明的一些实施方案，少于30％的细胞表达CD45，多于95％的细胞表达CD90以及多于90％的细胞表达CD105和CD44。

根据本发明的一些实施方案，疾病或障碍选自骨或软骨疾病、神经变性疾病、心脏病、肝病、癌症、神经损害、自身免疫性疾病、GvHD、伤口愈合和组织再生。

根据本发明的一些实施方案，用烟酰胺和/或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞将增加水平的生长因子和减少水平的致炎因子分泌至培养基中。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明属于的领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文中描述的那些类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，仍然将合适的方法和材料描述如下。在冲突的情况下，以包括定义的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的并且不旨在进行限制。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一个以彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的拷贝应请求和必要费用的支付后将由专利局提供。

参考所附的绘图和图像在本文中仅举例描述本发明的一些实施方案。现在详细地特别参考附图，强调所示的细节为举例并且出于本发明的实施方案的说明性讨论的目的。在这方面，获自附图的描述使本领域技术人员清楚可如何实践本发明的实施方案。

在附图中：

图1是说明碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响的棒图。

图2A-2B说明了肝素结合的EGF类生长因子(HB-EGF)对烟酰胺增加两个不同批次的间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响。

图3A-D是说明了烟酰胺(NAM)和FGF4对间充质干细胞的扩增的协同活性。采用FGF4(50ng/ml)、NAM(5mM)或FGF4+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。显示了在所示的传代下的累积细胞计数。

图4A-B是说明烟酰胺(NAM)保持采用FGF4培养的MSC的未分化状态的图表。采用FGF4(50ng/ml)、NAM(5mM)或FGF4+NAM的组合处理两个不同批次的MSC培养物。通过Cedex细胞计数器分析细胞大小。

图5A-D是说明采用NAM+FGF4的组合扩增的细胞为未分化的MSC(CD105+CD45-)的图表。采用FGF4(50ng/ml)、NAM(5mM)或FGF4+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。通过FACS分析MSC(CD105+CD45-)的百分比。

图6A-D是说明在采用NAM+PDGF-BB的MSC扩增之后获得的不一致的结果的棒图。采用PDGF-BB(50ng/ml)、NAM(5mM)或PDGF-BB+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。显示了在所示的传代处的累积细胞计数。

图7A-D是说明采用PDGF-BB或PDGF-BB+NAM的组合处理的MSC培养物与在PDGF-BB的不存在下培养的MSC相比包含除了污染培养物的MSC以外的更高分数的细胞的图表。采用PDGF-BB(50ng/ml)、NAM(5mM)或PDGF-BB+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。通过FACS分析MSC(CD105+CD45-)的百分比。

图8A-B是说明NAM与FGF4之间一致的协同效果与FGF4与PDGF-BB之间的协同或附加效国的不存在的比较的棒图。此外，NAM、FGF4和PDGF-BB的组合对MSC扩增具有不利的影响。采用PDGF-BB(50ng/ml)、FGF4(50ng/ml)和NAM(5mM)或如所示的两个或三个因子的组合处理MSC培养物。显示了在所示的传代处的累积细胞计数。

图9A-B是说明PDGF-BB支持MSC培养物中除MSC以外的细胞扩增的图表。这种影响没有被NAM和/或FGF4所缓和。采用PDGF-BB(50ng/ml)、FGF4(50ng/ml)和NAM(5mM)或如所示的两个或三个因子的组合处理MSC培养物。通过FACS分析MSC(CD105+CD45-)的百分比。

图10A-H是说明PDGF-BB支持MSC培养物中除MSC以外的细胞扩增的第34天MSC培养物的照片。这种影响没有被NAM和/或FGF4所缓和。采用PDGF-BB(50ng/ml)、FGF4(50ng/ml)和NAM(5mM)或如所示的两个或三个因子的组合处理MSC培养物。

图11是说明在第一次传代之前在播种+/-NAM的培养物中表达间充质干细胞标志物的衍生自BM的粘附细胞的百分比的棒图。在烟酰胺的存在或不存在下使用菲科(Ficoll)和“塑料粘附”方法将单核细胞与骨髓分离。在3-4天后清洗掉非粘附细胞并且每3-4天更换培养基。进行FACS分析以便获得在第一次传代之前(播种后8天)表面分子的表达水平。

图12A-C是说明在不同浓度的烟酰胺中六次传代之后脂肪组织衍生的间充质干细胞的表型表征的图。

图13是说明在+/-不同浓度的烟酰胺中处理的培养物的第一次传代之后骨髓衍生间充质干细胞的表型表征的棒图。使用菲科(Ficoll)和“塑料粘附”方法将单核细胞与骨髓分离。在3-4天后清洗掉非粘附细胞并且每3-4天更换培养基。进行FACS分析以便获得在第一次传代之后(播种后8天)表面分子的表达水平。

图14是说明不同浓度的烟酰胺(在第3次传代和在随后的每次传代添加)对第6次传代的MSC数目的影响的棒图。烟酰胺显著改进培养物中衍生自脂肪的间充质干细胞扩增。

图15是说明烟酰胺对骨髓衍生间充质干细胞扩增的影响的图。在培养起始时和在随后的每次传代添加烟酰胺。

图16是说明不同浓度的烟酰胺对脂肪衍生间充质干细胞扩增的影响的图。在第3次传代和在随后的每次传代添加烟酰胺。

图17A-B是说明在烟酰胺中培养的间充质干细胞比在同样的但不存在烟酰胺的条件下培养的间充质干细胞要扩增地更快。

图18是说明烟酰胺对在大批次中培养的间充质干细胞的累积细胞计数的影响的图。

图19是说明实施的说明烟酰胺对间充质干细胞增殖的影响的两个实验的一个的结果不依赖于使用的特定批次的血清的棒图。

图20A-C是说明在烟酰胺的存在下的培养对细胞大小和粒度的有益影响的图表和曲线图。图20C显示在烟酰胺的存在下生长的细胞较小和较少粒状的(大部分细胞在红色圆中)，这与没有采用烟酰胺生长的较大和较多粒状的细胞(黑色圆)截然相反。对于图20A，所使用的烟酰胺的浓度为5mM。

图21A-B是说明在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在相同条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞为更少粒状的图表和曲线图。

图22是说明在烟酰胺(5mM)的存在下培养MSC增加累积CFU-F计数的图。

图23A-D是说明烟酰胺减少衰老的间充质干细胞的量的照片。在+/-5mMNAM下培养骨髓衍生间充质干细胞5代。将细胞固定并进行X-Gal染色以检测衰老细胞(蓝色染色)。

图24A-B是说明烟酰胺调节间充质干细胞上的表面标志物－VCAM1/CD106(图24A)和CD54(图24B)的表达的棒图。注意在烟酰胺的存在下生长的细胞中增强的VCAM1/CD106表达和减少的CD54表达。

图25A-B是说明在第3次传代采用(图25B)或没有采用(图25A)培养的MSC上进行的体外伤口愈合测定的结果的照片。在伤口形成4天后观察到伤口愈合。

图26是说明烟酰胺对骨髓衍生间充质干细胞倍增时间的影响。从培养开始和在每个随后的传代添加烟酰胺。

图27是说明烟酰胺在有和没有FGF4的情况下，通过5次传代培养对骨髓衍生MSC增殖的影响的图。使用菲科(Ficoll)和塑料粘附方法分离骨髓衍生间充质干细胞，并采用胎牛血清培养几次传代。-NAM,-FGF4＝对照物(浅蓝色圆)；-NAM+FGF4＝使用50ng/ml FGF4的培养物(深蓝色圆)；+NAM–FGF4＝使用5mM NAM的培养物(粉色圆)；+NAM+FGF4＝使用5mMNAM+50ng/ml FGF4的培养物(红色圆)。注意到一起添加的烟酰胺和FGF4在所有传代中对MSC增殖的协同作用。

图28是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的条件培养基的肝细胞生长因子(HGF)含量的提高的棒图。使用菲科(Ficoll)和塑料粘附方法将骨髓与间充质干细胞分离，并且添加烟酰胺和FGF4(+NAM+FGF4)、添加烟酰胺(+NAM-FGF4)和不添加烟酰胺或FGF(-NAM-FGF4)采用胎牛血清培养几次传代。在第4次传代24小时之前，改变培养基并且添加不具有胎牛血清或FGF4的新鲜培养基。收集来自第4次传代培养物的培养基并通过ELISA分析HGF含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mM NAM+50ng/mlFGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对HGF分泌的明显影响；

图29是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的条件培养基的转化生长因子β(TGFβ)含量的提高的棒图。如上图28所示将骨髓间充质干细胞分离并培养。在第4次传代24小时之前，将培养基改变成不具有胎牛血清或FGF4的培养基，将其从第4次传代培养物收集并通过ELISA测定TGFβ含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mM NAM+50ng/ml FGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对TGFβ分泌的明显影响；

图30是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的条件培养基的角质形成细胞生长因子(KGF)含量的提高的棒图。如上图28所示将骨髓间充质干细胞分离并培养。在第4次传代24小时之前，将培养基改变成不具有胎牛血清或FGF4的培养基，将其从第4次传代培养物收集并通过ELISA测定KGF含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mM NAM+50ng/ml FGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对KGF分泌的明显影响；

图31是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的条件培养基的细胞因子IL-6(IL-6)含量的降低的棒图。如上图28所示将骨髓间充质干细胞分离并培养。在第4次传代24小时之前，将培养基改变成不具有胎牛血清或FGF4的培养基，将其从第4次传代培养物收集并通过ELISA测定IL-6含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mMNAM+50ng/ml FGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对IL-6分泌的明显降低；

图32是说明烟酰胺在有和没有FGF4的情况下，通过4次传代培养对脂肪衍生MSC增殖的影响的图。使用胶原酶消化和塑料粘附方法分离脂肪衍生间充质干细胞，并采用胎牛血清培养几次传代。-NAM,-FGF4＝对照物(蓝色菱形)；+NAM–FGF4＝使用5mM NAM的培养物(红色正方形)；+NAM+FGF4＝使用5mM NAM+50ng/ml FGF4的培养物(绿色三角)。注意到一起添加的烟酰胺和FGF4对脂肪衍生MSC增殖的协同作用。

图33是说明烟酰胺在有和没有FGF4的情况下，在第4次传代培养时对脂肪衍生MSC增殖中的有核细胞增殖的影响的图。如图32中所述分离和培养脂肪衍生间充质干细胞。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝使用5mM/ml NAM的培养物；+NAM+FGF4＝使用5mM/ml NAM+50ng/ml FGF4的培养物。注意到烟酰胺和FGF4一起对培养物中总的有核细胞的增殖的协同作用。

图34是说明在烟酰胺和FGF4的存在下培养脂肪衍生MSC对培养的间充质干细胞的大小的有益影响的棒图。如图32中所述分离和培养脂肪衍生间充质干细胞。通过Cedex细胞计数器分析细胞大小。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝使用5mM/ml NAM的培养物；+NAM+FGF4＝使用5mM/ml NAM+50ng/ml FGF4的培养物。注意到在烟酰胺的存在下生长的MSC细胞的较小的大小，以及在烟酰胺和FGF4的存在下生长的MSC的甚至更小的大小。

图35是显示烟酰胺在有和没有FGF4的情况下，对离体扩增的造血细胞的分化的影响的棒图。使用CD133微珠和CliniMACS(Milentyi,Inc)来分离脐带衍生的早期祖(CD133+)造血细胞，并在补充有50ng/ml早作用细胞因子和胎牛血清、±2.5或5mM烟酰胺(NAM)、±10、50或200ng/ml FGF4的MEMα中培养3周。在三周的培养后，通过FACS对CD38-CD133+细胞进行染色和计数。栏1＝对照：-NAM,-FGF4,栏2＝+2.5mM NAM,栏3＝+5mM NAM,栏4＝+10ng/ml FGF4,栏5＝+50ng/ml FGF4,栏6＝+200ng/ml FGF4,栏7＝+2.5mM NAM,+10ng/ml FGF4,栏8＝+2.5mM NAM,+50ng/ml FGF4,栏9＝+2.5mM NAM,+200ng/ml FGF4,栏10＝+5mM NAM,+10ng/ml FGF4,栏11＝+5mM NAM,+50ng/ml FGF4,栏12＝+5mM NAM,+200ng/ml FGF4.

注意到烟酰胺处理的培养物中显著更大的未分化早期祖细胞(CD38-CD133+)部分(栏2和3)、单独的FGF4的任何显著影响的不存在(栏4－6)和FGF4对烟酰胺介导的造血祖细胞分化的抑制的任何显著影响的不存在(栏7－12)。

图36是显示烟酰胺在有和没有FGF4的情况下，对离体扩增的造血细胞的分化的影响的棒图。如图35中所述分离和在有和没有烟酰胺和FGF4的情况下培养脐带衍生的祖(CD133+)造血细胞，。在三周的培养后，通过FACS对CD38+细胞进行染色和计数。栏1－12如图35中所示。注意到烟酰胺处理的培养物中分化(CD38+细胞)的显著抑制(栏2和3)、单独的FGF4对分化的任何显著影响的不存在(栏4－6)和FGF4对烟酰胺介导的造血祖细胞分化的抑制的任何显著影响的不存在(栏7－12)。

图37是显示烟酰胺在有和没有FGF4的情况下，对离体扩增的造血细胞的髓谱系分化的影响的棒图。如图35中所述分离和在有和没有烟酰胺和FGF4的情况下培养脐带衍生的祖(CD133+)造血细胞，。在三周的培养后，通过FACS对髓谱系分化的(CD33+)细胞进行染色和计数。栏1－12如图35中所示。注意到烟酰胺处理的培养物中髓谱系分化(CD33+细胞)的显著抑制(栏2和3)、单独的FGF4对髓谱系分化的适度增强(栏4－6)和FGF4对烟酰胺介导的髓谱系造血细胞分化的抑制的任何显著影响的不存在(栏7－12)。

图38是显示烟酰胺在有和没有FGF4的情况下，对离体扩增的造血细胞的淋巴谱系分化的影响的棒图。如图35中所述分离和在有和没有烟酰胺和FGF4的情况下培养脐带衍生的祖(CD133+)造血细胞，。在三周的培养后，通过FACS对淋巴谱系分化的(CD19+)细胞进行染色和计数。栏1－12如图35中所示。注意到烟酰胺处理的培养物中淋巴谱系分化(CD19+细胞)的显著抑制(栏2和3)、单独的FGF4对淋巴谱系分化的任何显著影响的不存在(栏4－6)和FGF4对烟酰胺介导的淋巴谱系造血细胞分化的抑制的任何显著影响的不存在(栏7－12)。

具体实施方式

本发明在其一些实施方案中，涉及扩增间充质干细胞的方法和由其产生的细胞群。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解本发明不必要将其应用限制于以下的描述中提出或通过实施例例示的细节。本发明能为其它实施方案或能以各种方式实践或进行。

间充质干细胞(MSC)的多能特性使这些细胞成为有吸引力的治疗手段和用于移植的候选物，能在细胞和基因治疗策略两者的背景下在广泛的临床应用中起到重要作用。例如，可将间充质干细胞用于增强移植后的造血植入、帮助组织再生、促进伤口愈合和修正许多其它遗传性和获得性障碍。对细胞的分化潜能和靶组织植入潜能不具有有害影响的有效的间充质干细胞扩增方案对于这些策略中的任何策略的成功都是至关重要的。

此外，MSC由于它们分化、提供营养供给和调节先天免疫反应的能力而对于再生医学和炎症病况的临床治疗是有吸引力的。正在多个临床试验中测试MSC对适应证例如骨和软骨修复、心脏再生、临界性肢体缺血、急性缺血病况、糖尿病、局限性肠炎和移植物抗宿主病的治疗潜力。

MSC是免疫赦免的并且可以在不需要HLA匹配的情况下在供体和受体之间移植，因而可大规模制造并作为现成的细胞产品推向市场。从一个供体的大规模批量生产的成功高度依赖于供体和血清的选择、种子细胞延长扩增的潜能和制造的持续时间。虽然MSC在体外相对容易地增殖，但它们的增值潜能持续减弱并且它们的倍增时间在培养过程中增加。因此，从一个供体成功地商业化制造大批量的均质MSC仍然是一个挑战。

虽然研究了生长因子对MSC扩增的影响，但是本发明人发现当在烟酰胺的存在下培养时生长因子例如碱性FGF(bFGF)、HB-EGF或血小板衍生生长因子(PDGF)对间充质干细胞增殖具有不可再现或甚至负面的影响(图1、2、6)。

而显著相反的是，FGF4连同烟酰胺一起出乎意料地显示对间充质干细胞扩增/增殖的可再现的协同活性。

如图3A-D中所举例说明的，本发明人证明烟酰胺增强FGF4对间充质干细胞增殖的影响。

此外，本发明人表明烟酰胺对采用FGF4培养的间充质干细胞的细胞大小的预料不到的影响。

如图4A-B中所举例说明的，通过在烟酰胺和FGF4中培养而产生的MSC比根据相同的方法但在单独的FGF4的存在下培养的间充质干细胞要更小，以及与使用单独的烟酰胺培养的MSC相似。例如，在10－32天之间，在烟酰胺和FGF4中培养的间充质干细胞在直径上小于约20μm，然而在FGF4存在而烟酰胺不存在下生长的细胞在直径上大于20μm。因此，烟酰胺使采用FGF4培养的MSC处于未分化的状态。

同时进一步减少本发明以实践，本发明人证明表达MSC标志物CD105+CD45-的细胞百分比在使用烟酰胺和FGF4处理的培养物中得到了维持(图5A-D)。

此外，本发明人已发现在选择和扩增方案的特定阶段期间使用烟酰胺对间充质干细胞群是有利的。因此，例如，在烟酰胺和高钙浓度的存在下播种间充质干细胞增加其播种效率，如通过分析细胞的标志物表型所观察到的(图11－13)。间充质干细胞在烟酰胺的存在下可成功地扩增至少六代而不诱导分化，如通过细胞的表面标志物组成所显示的(图12A-C)。此外，已显示烟酰胺促进更均质而较少粒状的MSC群的扩增(图20A-C和21A-B)。

本发明人在实验上显示用烟酰胺培养的MSC更快地增殖，并因此，其倍增时间(参见图26)减少以及培养物在实质上更短的时间段内达到汇合(图14－17、26和27)。在大的MSC培养物中也证明了烟酰胺的增殖性效应(图18。此外，该效应不受限于所选择的血清的批次(图19)，这对于制造大批量的MSC是实质上有利的。进一步，本发明人已显示未观察到与成纤维细胞生长因子4(FGF4)组合的烟酰胺对非间充质来源的干细胞(例如造血干细胞或祖细胞(例如CD133+))的增殖性效应(参见本文中实施例10和图35－38)。的确，单独的或与烟酰胺组合的FGF4不具有对离体培养的造血干细胞或祖细胞的增殖或分化的任何影响(参见图35－38，第1和4－12道)

因此，根据本发明的一个方面，提供了培养间充质干细胞(MSC)的方法，包括在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中培养MSC群。

此外，本发明人现已发现在烟酰胺的存在下培养混合的间充质干细胞群增强间充质干细胞表型，以便随后使用间充质干细胞标志物的选择或预选择提供更均质的间充质干细胞群，从而提供获得富集的间充质干细胞亚类群体的方法。这通过本发明人显示的在烟酰胺的存在下培养MSC增加特定粘附分子－血管细胞粘附蛋白1(VCAM1/CD106；参见图24A)的表达而得到了证实。相反地，本发明人已显示在烟酰胺的存在下培养MSC减少细胞衰老标志物(CD54；参见图24B)的表达，从而提供通过耗尽非相关细胞的细胞群来获得富集的间充质干细胞群的方法。

选择或分选步骤的使用还增强针对MSC的分选和选择特异性的严格度，并且此外潜在地减少来自起始材料的可能的污染。

因此，根据本发明的一个方面，提供了从混合的细胞群分离间充质干细胞(MSC)的方法，所述方法包括：

(a)在包含烟酰胺的培养基中培养混合的细胞群；和

(b)基于细胞表面分子的表达从混合的细胞群选择细胞，从而从混合的细胞群选择MSC。

术语“间充质干细胞”或“MSC”可互换地用于未终末分化的成年细胞，所述细胞可***以产生为任一干细胞的细胞或不可逆地分化以产生间充质细胞谱系(例如脂肪、骨、软骨、弹性和纤维***、成肌细胞)的细胞以及产生不是那些取决于来自生物活性因子例如细胞因子的不同影响而源自胚胎中胚层(例如神经细胞)的组织的组织。

本发明的一些实施方案利用的MSC培养物优选包括三组细胞，这通过它们的形态特征定义：小和非粒状的细胞(以下称为RS-1)、小和粒状的细胞(以下称为RS-2)以及大和适度粒状的细胞(以下称为成熟MSC)。通过使用例如免疫荧光、原位杂交和活性测定来识别各种细胞表面标志物的存在或不存在，可测定培养物中这样的细胞的存在和浓度。

当在本发明的一些实施方案的培养条件下培养MSC时，它们表现出对于造血干细胞标志物CD34、CD11B、CD43和CD45的负染色。小部分的细胞(小于10％)对于CD31和/或CD38可为微阳性的。此外，成熟MSC对于造血干细胞标志物CD117(c-Kit)可为微阳性的，对于成骨MSC标志物Stro-1可为适度阳性的(Simmons,P.J.&Torok-Storb,B.(1991).Blood 78,5562)并且对于胸腺细胞和外周T淋巴细胞标志物CD90(Thy-1)可为阳性的。另一方面，RS-1细胞对于CD117和Strol标志物为阴性的并且对于CD90标志物为微阳性的，并且RS-2细胞对于所有这些标志物为阴性的。

在本发明的一些实施方案的培养条件下培养的间充质细胞可将生物活性因子分泌到培养基中。本发明人已观察到从采用烟酰胺培养的间充质细胞收集的培养基包含升高水平的生长因子和细胞因子(例如肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、转化生长因子β)和降低水平的致炎因子(例如IL6)(参见实施例8和图28-31)。向培养基添加FGF4还提高了培养基中生长因子的水平，同时还降低了培养基中IL6的水平。观察到分离的培养基具有强烈的抗炎症作用以及培养物中细胞增强的增殖。因此，在培养条件下培养的间充质细胞将具有抗炎症和细胞增殖增强活性的生物活性因子分泌至培养基中。

根据本发明的这个方面的优选实施方案，该间充质干细胞为人源的。

根据本发明的这个方面的另一个实施方案，将间充质干细胞与新生儿分离。

可将间充质干细胞与各种组织分离，各种组织包括但不限于骨髓、外周血、血、胎盘(例如胎盘的胎儿侧)、脐带血、脐带、羊水、胎盘和脂肪组织。

由Kassis等人(Bone Marrow Transplant.2006May；37(10):967-76)描述了将间充质干细胞与外周血分离的方法。由Kern等人(Stem Cells,2006；24:1294-1301)描述了分离和培养脂肪组织、胎盘和脐带血间充质干细胞的方法。

可通过抽吸将骨髓与个体的髂嵴分离。可通过FICOL-PAQUE密度梯度或通过使用Hetastarch(羟乙基淀粉)消除血红细胞来分离低密度BM单核细胞(BMMNC)。优选地，通过采用相等体积的汉克平衡盐溶液(HBSS；GIBCO Laboratories,Grand Island,NY,USA)稀释BM吸出物(通常20ml)并且在约10ml的菲科(Ficoll)柱(Ficoll-Paque；Pharmacia,Piscataway,NJ,USA)内将稀释的细胞分层，产生间充质干细胞培养物。在2,500x g下离心30分钟之后，将单核细胞层从界面移除并悬浮在HBSS中。然后将细胞在1,500x g下离心15分钟并且重新悬浮在完全培养基(MEM，不具有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的α培养基；GIBCO)、20％衍生自许多为了MSC的快速生长而选择的胎牛血清(Atlanta Biologicals,Norcross,GA)、100个单位/ml的青霉素(GIBCO)、100μg/ml链霉素(GIBCO)和2mM L-谷氨酰胺(GICBO)中。

可从任何含脂肪的组织例如从附睾脂肪或通过抽脂法获得脂肪组织衍生的MSC，并且可通过脂肪和脂肪细胞的移除或使用Celution***(Cytori Therapeutics)按照如上对于制备MSC所述的相同步骤手动分离单核细胞。

如提及的，该方法通过在包含烟酰胺和FGF4的培养基中培养(例如离体或体外)间充质干细胞来实现。

根据本发明的这个方面，在不诱发分化的条件下(例如在分化因子的不存在下或在非分化量的分化因子的存在下)培养细胞。

本发明考虑在从它们的来源分离之后直接培养间充质干细胞或培养对于间充质干细胞已进行预先选择的细胞群。因此，本发明考虑同时培养包含MSC的异质细胞群和对于MSC被富集的更均质的细胞群，其中大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％为MSC。此外，考虑的是与如下文进一步所述的培养同时富集MSC。

将理解异质细胞群的组成将取决于细胞的来源。因此，例如如果选择胎盘作为细胞来源，那么异质细胞群将包含胎盘细胞以及间充质干细胞。如果选择骨髓作为细胞来源，那么异质细胞群将包含血细胞。然而，如实施例10中所显示的，根据本发明的一些实施方案，在本发明的一些实施方案的培养条件(例如组合的烟酰胺和FGF4)下培养间充质干细胞导致间充质干细胞群的选择性扩增，而对非间充质干细胞群不具有伴随的增殖效应。

根据一种方法，在聚苯乙烯塑料表面上(例如在烧瓶中)培养(体外或离体)细胞群从而通过移除非粘附细胞(即非间充质干细胞)来富集间充质干细胞。可在烟酰胺和FGF4中培养之前、在烟酰胺和FGF4中培养的同时和/或在烟酰胺和FGF4中培养之后实施该富集MSC的方法。

选择MSC的其它方法在本领域是已知的，包括例如针对间充质干细胞标志物的阳性选择和/或针对造血干细胞和祖细胞标志物例如CD34、CD133、CD8等的阴性选择。确定蛋白质表面表达的方法在本领域中公知的。实例包括免疫方法例如FACS分析以及生物化学方法(细胞表面标记，例如放射性、荧光、抗生物素蛋白-生物素)。

将理解还可在烟酰胺和FGF4中培养之后进行选择阶段。这还可作为预先选择阶段或代替预先选择阶段来实施。

如本文中使用的，“烟酰胺”是指烟酰胺以及衍生自烟酰胺、其类似物和烟酰胺或烟酰胺类似物的代谢产物的产物，例如NAD、NADH和NADPH。

如本文中使用的，短语“烟酰胺类似物”是指已知与烟酰胺作用相似的任何分子。烟酰胺类似物的代表性实例包括但不限于苯甲酰胺、烟碱硫代酰胺(nicotinethioamide)(烟酰胺的硫醇类似物)、烟酸、α-氨基-3-吲哚丙酸和组蛋白/蛋白脱乙酰基酶的去乙酰化酶家族的抑制剂。

烟酰胺类似物衍生物的实例包括但不限于取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺和烟碱硫代酰胺和N取代的烟酰胺和烟碱硫代酰胺。

在一个特定的实施方案中，以至少约1mM至20mM的浓度供应烟酰胺。在其它实施方案中，以至少约1mM至10mM、例如约2.5mM、约5mM、约7.5mM的浓度供应烟酰胺浓度。

成纤维细胞生长因子4、FGF4(图谱基因座11q13.3)基因产品、FGF-4/HBGF-4/KFGF是通过前体蛋白质的N端30AA的断裂衍生的176AA长蛋白质。FGF-4包含单一N-连接糖基化位点。未糖基化的FGF-4被切割成两个NH2-末端的截短的肽(13和15kDa)，其活性更强并具有比野生型蛋白质更高的肝素亲和力。

根据一个特定的实施方案，FGF4是人类FGF4。

重组FGF4蛋白质是可商购获得的(例如从Sigma Aldrich，其中在杆状病毒中制备它并且在N端切割以产生148AA蛋白质；或从Invitrogen，其中在大肠杆菌中制备它)。

在一个特定的实施方案中，以至少约1-1000ng/ml的浓度向培养物供应FGF4。在其它实施方案中，以至少约10－200ng/ml、10-100ng/ml、例如约50ng/ml的浓度供应FGF4浓度。

在一个特定的实施方案中，包含烟酰胺和FGF4两者的培养基没有其它的生长因子例如PDGF、HB-EGF或bFGF(FGF2)。

将理解当提到没有特定组分的培养基时，本发明考虑该培养基包含该组分，但是以低于其最小活性的浓度。因此，例如一定的培养基可包含痕量的上述生长因子，然而，本发明的方法涉及在商业培养基的配方所包含的之外没有外源性添加的生长因子的培养基，或由培养基组分浓度的总体调整所产生的培养基。因此，根据特定的实施方案，包含烟酰胺和FGF4的培养基可包含任何上述的其它生长因子但以小于1ng/ml的浓度。

可向其添加烟酰胺和FGF4的典型细胞培养基为Dulbecco's改良MEM(DMEM)。或者，细胞培养基可为Ham's F12。其它考虑的培养基括HEM RPMI、F-12等。

将注意到许多培养基包含作为维生素补充物的烟酰胺，例如MEMα(8.19μM烟酰胺),RPMI(8.19μM烟酰胺),DMEM(32.78μM烟酰胺)和Glascow's培养基(16.39μM烟酰胺)，然而，本发明的方法涉及外源性添加的烟酰胺，其补充培养基配方所包含的或由培养基组分浓度的总体调整所产生的任何烟酰胺和/或烟酰胺部分。

在本发明的一个实施方案中，细胞培养基具有大于约1.8mM或大于约2mM或大于约5mM的高钙浓度。将理解钙浓度计算为包括已经存在于培养基中的总钙浓度。

因此，例如如果培养基为Dulbecco's改良MEM(DMEM)(其已经具有约1.8mM的钙离子浓度)，那么不需要添加额外的钙。如果细胞培养基为具有约0.9mM的钙离子浓度的Ham'sF12，那么应添加额外的钙从而总钙浓度高于1.8mM。在一个实施方案中，额外的钙来源可为血清。

在培养期间，培养基可包含对于细胞新陈代谢所需的补充物例如谷氨酰胺和其它氨基酸、维生素、矿物质和有用的蛋白质例如转铁蛋白等。该培养基还可包含防止受酵母、细菌和真菌污染的抗生素，例如青霉素、链霉素、庆大霉素等。如果要培养细胞，那么条件应接近生理条件(优选地，pH为约6至约8，并且温度为约30℃至约40℃)。

还考虑了常氧或缺氧条件。

根据一个实施方案，培养基不含血清(即不含血清的培养基)并且包含血清替换物，其包括但不限于血小板裂解物(在播种和/或扩增期间)。

根据又一个实施方案，该培养基包含约10％胎牛血清。还考虑了人类血清。

根据本发明的这个方面的培养可实施有限量的时间，使得不发生扩增(例如仅在播种阶段期间)或进行较长的时间段从而允许间充质干细胞扩增(例如细胞增殖)，由此获得其增加的数量。

对于每一轮的增殖，可使用胰蛋白酶/EDTA或通过细胞刮片收获粘附细胞，并且通过窄的巴斯德(Pasteur)塑料移液管而离解，并且优选在约100至约10,000个细胞/cm²的密度下再铺板。

根据本发明的这个方面，足够细胞扩增的时间段可意指对于至少一个细胞***所需要的时间长度。

根据一个实施方案，实施培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少一个星期、至少两个星期、至少三个星期、至少四个星期或至少五个星期。

根据另一个实施方案，实施培养不超过十个星期。

根据又一个实施方案，使细胞扩增至少两个群体倍增数、至少四个群体倍增数、至少六个群体倍增数、至少八个群体倍增数、至少十个群体倍增数、至少15个群体倍增数、至少20个群体倍增数、至少25个群体倍增数、至少30个群体倍增数、至少35个群体倍增数、至少40个群体倍增数、至少45个群体倍增数。

根据另一个实施方案，使细胞扩增不超过50个群体倍增数。

本发明考虑间充质干细胞扩增以及(或者代替)在烟酰胺和FGF4中培养的其它方法。

由于本发明人发现当在烟酰胺的存在下实施扩增过程的至少一部分时间时，获得了增加数目的间充质干细胞，优选包括在烟酰胺的存在下培养的其它扩增方法。

因此，根据本发明的另一方面，提供了扩增间充质干细胞群的方法，所述方法包括以对于细胞扩增为充足的时间段培养经播种的间充质干细胞群，其中在没有烟酰胺的培养基中实施培养至少一部分时间段；对于至少第二部分时间段，在包含烟酰胺和FGF4的培养基中实施该培养，从而产生扩增的间充质干细胞群。

如本文中使用的术语“扩增”是指由于细胞复制而增加细胞群中的细胞数目。

根据本发明的这个方面，在不诱发分化的条件下(例如在分化因子的不存在下)使细胞扩增。

如上文进一步描述的，播种的未分化间充质干细胞群可为异质细胞群或纯化的间充质干细胞群。

如提到的，没有烟酰胺的培养基是指包含小于最小有效量(例如小于0.5mM或更优选小于0.05mM)的烟酰胺的培养基。因此包含痕量的烟酰胺(如上文描述的)培养基可用于本发明的这个方面。因此，根据一个特定的实施方案，没有外源性添加烟酰胺的培养基在添加外源性烟酰胺作为补充物之前可包含在小于0.5mM或更优选小于0.05mM的浓度下的烟酰胺。

根据一个实施方案，MSC为至少50％纯化的、至少75％纯化的或至少90％纯化的。

可在包括上文中描述的那些或在美国专利申请号20050260748(通过引用并入本文)中描述的那些的培养基中播种间充质干细胞群。

在烟酰胺和FGF4的存在下培养与在烟酰胺的不存在下培养的时间比可变化并且可包括来自1:99；2:98；3:97；4:96,5:95；6:94；7:93；8:92；9:91；10:90；11:89；12:88；13:87；14:86；15:85；16:84；17:83；18:82；19:81；20:80；21:79；22:78；23:77；24:76；25:75；26:7427:73；28:72；29:71；30:70；31:69；32:68；33:67；34:66；35:65；36:64；37:63；38:62；39:61；40:60；41:59；42:58；43:57；44:56；45:55；46:54；47:53；48:52；49:51；50:50；51:49；52:48；53:47；54:46；55:45；56:44；57:43；58:42；59:41；60:40；61:39；62:38；63:37；64:36；65:35；66:34；67:33；68:32；69:31；70:30；71:29；72:28；73:27；74:26；75:25；76:24；77:23；78:22；79:21；80:29；81:19；82:18；83:17；84:16；85:15；86:14；87:13；88:12；89:11；90:10；91:9；92:8；93:7；94:6；95:5；96:4；97:3；98:2；99:1的所有比例。

根据一个实施方案，在烟酰胺的存在下实施至少一轮完整的增殖。

将理解可在没有烟酰胺的培养基中培养之前或之后实施在包含烟酰胺的培养基的培养。

根据本发明的实施方案，没有烟酰胺的培养基包含FGF4(以与包含烟酰胺的培养基相同或不同的浓度)。

根据本发明的其它实施方案，没有烟酰胺的培养基也没有FGF4。

此外，本发明人考虑了在烟酰胺和FGF4的存在下多于1个培养阶段，其中穿插在烟酰胺的不存在下的培养阶段，并且反之亦然。

根据一个实施方案，实施在烟酰胺和FGF4的存在下的培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少一个星期、至少二个星期、至少三个星期、至少四个星期或至少五个星期。

根据另一个实施方案，实施在烟酰胺的不存在下的培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少一个星期、至少二个星期、至少三个星期、至少四个星期或至少五个星期。

如提到的，纯化方法的第二步骤基于间充质干细胞表面标志物的表达来选择间充质干细胞。选择或分选步骤可包括通过一个或多个这样的表面标志物从混合的细胞群选择间充质干细胞(MSC)。选择或分选步骤的使用还增强了对于MSC的分选严格性和选择特异性，并且还潜在地减少了来自起始材料的污染。

在分选之前，通常通过使用细胞分散剂将混合的细胞群分散。优选获得单一细胞群。可用于分散细胞的试剂实例包括但不限于胶原酶、分散酶、accutase、胰蛋白酶(胰蛋白酶－EDTA)、木瓜蛋白酶。还可进行作为替代或者另外的研磨以增加细胞的分散。

根据一个特定的实施方案，通过选择表达高于预定水平的VCAM-1/CD106(NP_001069.1)的细胞来实施选择。

根据另一个实施方案，通过选择表达高于预定水平的CD105(SH2)、CD73(SH3/4)、CD44、CD90(Thy-1)、CD71、STRO-1、CD29、CD166、CD146、CD106和CD271中的至少一种的细胞来实施选择。

根据一个特定的实施方案，表面标志物是间充质前体抗原-1(STRO-1)、CD105或VCAM(CD106)。

根据又一个实施方案，通过选择表达低于预定水平的CD34、CD11B、CD43和CD45中的至少一种的细胞来实施选择。

已知许多方法用于基于抗原表达的选择或分选，并且任何这些方法可用于这里描述的选择或分选步骤。在特别优选的实施方案中，使用流式细胞仪实现分析并且随后基于每个细胞特定的光散射和荧光特性来分选细胞。因此，可通过荧光活化细胞分选(FACS)实现选择或分选。

如本领域所知，FACS包括将细胞暴露于报道分子，例如荧光标记的抗体，其结合并标记由细胞表达的抗原。抗体的产生和标记其以形成报道分子的方法在本领域中是已知的，并例如描述于Harlow和Lane。可用于FACS分析的抗体由Schlossman S,Boumell L等人(Leucocyte Typing V.New York:Oxford University Press；1995)教导并可广泛地商购获得。随后细胞通过FACS装置，其基于标记将细胞彼此分选。

可选择地或另外地，可使用磁珠细胞分选(MACS)或免疫盘洗法(immunopanning)来分选细胞。

如上文所述，通过流式细胞仪例如激光扫描细胞计数仪来分析混合的细胞群。流式细胞仪通常由激光源、流量测量室和由透镜、滤光器和光检测器组成的光学***组成。将两个光倍增管(光检测器)(一个在激光器的180度，一个在激光器的90度)用于分别测量前向(FSC)和直角散射(SSC)。将3个荧光检测器(每一个由滤光器和光倍增管组成)用于检测荧光。3个检测器检测绿色(FL1--530nm)、橙色(FL2--585nm)和红色荧光(FL3--650nm)。通过应用于所有5个检测器信号(FSC、SSC、FL1、FL2、FL3)的分选逻辑使用计算机来鉴定细胞。

可用于本发明的这个方面的示例性流式细胞仪由例如Becton Dickinson(USA),Backman Coulter(USA),Partec(Germany)的公司制造。

可这样设置FACS装置以便选择具有特定前向散射和/或边散射的细胞。前向散射光(FSC)与细胞表面面积或大小成比例。FSC是大部分衍射光的测量并且恰好在由光电二极管射入的前向方向的激光束的轴之外被检测。FSC提供了检测大于给定大小的颗粒而不依赖其荧光的适合的方法。

边散射光(SSC)与细胞粒度或内部复杂度成比例。SSC是大多数在其中存在折射率变化的细胞内的任何界面上出现的折射和反射光的测量。通过收集透镜在激光束的约90度收集SSC，随后通过分光器将其重新传入适合的检测器。

因此，例如，本发明考虑选择具有通过在特定前向散射门控的低于约20μm的直径和通过在特定边散射门控的特定粒度的细胞。

本发明考虑基于细胞表面表达的水平选择特定细胞群。因此，在FACS的情况下，可这样设置装置以便针对染色有约20－100(暗的)、约100－500(中等的)或约500－2000或更高(亮的)的荧光强度的事件来门控细胞群。通过本发明考虑了下列细胞群：

VCAM1亮的细胞；

VCAM1中等的细胞；

VCAM1暗的细胞；

STRO-1亮的细胞；

STRO-1中等的细胞；

STRO-1暗的细胞；

CD105亮的细胞；

CD105中等的细胞；

CD105暗的细胞；

将理解，可基于上述标志物的多于一个(例如至少两个上述标志物或至少3个上述标志物)的表达来选择细胞群。

对于不表达CD45的细胞通常富集上述的细胞群。因此，根据另一个实施方案，如由FACS测量的小于10％的上文描述的细胞群的细胞表达CD45。

根据又一个实施方案，如由FACS测量的大于90％的上文描述的细胞群的细胞表达CD90。

根据又一个实施方案，如由FACS测量的大于95％的上文描述的细胞群的细胞表达CD90。

根据又一个实施案，如由FACS测量的大于90％的上文描述的细胞群的细胞表达CD44。

根据又一个实施方案，如由FACS测量的上数细胞群中大于95％的细胞表达CD44。

如提到的，本发明人考虑了在本文中描述的两步法之前、期间或之后的额外步骤。这样的额外步骤可包括在塑料表面培养和/或额外的扩增步骤例如如上文描述的在烟酰胺中的再培养。

在一些实施方案中，例如通过基于Trypan Blue排除和图形分析的细胞计数器根据细胞大小选择细胞。合适的细胞计数器包括但不限于Cedex计数器(Roche Innovatis)。可根据本发明的任何方法培养的细胞数目可为包括从小批－例如100x10⁴个细胞到大批－例如100x10¹²或100x 10¹³个细胞的任何数目。

当需要大批时，通常在生物反应器中(或在多能极工业烧瓶中)培养细胞，根据被培养的细胞数目选择其尺寸。

可用于生长商业数量的MSC的烧瓶和平板的实例包括例如Corning HYPERFlask^TM细胞培养容器、Corning CellSTACK^TM室、Corning HYPERStack^TM细胞培养容器、40堆叠室和NUNC自动细胞工厂操纵器。

如本文中使用的术语“生物反应器”是指其中在受监测和控制的环境和操作条件例如pH、温度、压力、营养供应和废物移除下发生生物和/或生物化学过程的任何装置。根据本发明的一个方案，适用于本发明的基础级生物反应器包括静态生物反应器、搅拌烧瓶生物反应器，旋转壁生物反应器、中空纤维生物反应器和直接灌注反应器(如在WO 2005/007799中进一步描述，通过引用将其内容并入)。

使用本文中描述的方法产生的培养的细胞群还可在培养后进一步在冷藏保存剂的存在下处理或储存(例如冷藏保存)。这样的冷藏保存剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油等。

根据本发明的培养和/或扩增方法产生的细胞群可用于不同的目的包括用于研究、用于筛选影响其分化的试剂和用于治疗用途。另外或可选择地，可将细胞群保存(例如冷冻)直至需要。

根据一个实施方案，使用本文中描述的方法产生的间充质干细胞群可用于进一步的分化方案。

使间充质干细胞朝向不同细胞谱系分化的方法在本领域中是已知的。

可通过在富集具有期望表型的细胞(例如成骨细胞、脂肪细胞)的生长环境中培养或分化MSC来获得分化的细胞。培养物可包含增强至特定谱系的分化的试剂。

可这样进行成骨分化：平板播种细胞并培养至汇合，随后在包含β-甘油磷酸、抗坏血酸和类维生素A的培养基中培养(参见Cowan et al.(2005)Tissue engineering 11,645-658)。

为了诱导脂肪形成分化，可将分离的细胞再播种于24孔板(7x10⁴细胞/ml)中并用脂肪形成培养基处理3周。提供了两个示例性脂肪形成培养基：补充有0.05mg/ml庆大霉素、2mM L-谷氨酰胺、10％FBS、0.5μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,Sigma),0.5μM氢化可的松(Sigma)和60μM吲哚美辛(Sigma)的DMED，或从StemCell Technologies购买的MSC脂肪形成刺激性添加物，如各自制造商的说明书使用。可通过油红染色来评价脂肪形成分化：用甲醇在-20℃固定细胞10分钟，并用60％的异丙醇处理3分钟。可在油红O(Sigma)中将平板染色10分钟并在自来水中漂洗。在漂洗后可使用Mayer苏木素(Sigma)将平板复染色1分钟并在自来水中漂洗。

可通过平板播种细胞和培养至汇合，随后在包含马血清、***和氢化可的松(参见Eun et al.(2004)Stem Cells 22:617-624)或5-胞苷(参见Fukuda et al.(2001)Artificial Organs 25:187)的培养基中培养来进行肌细胞分化。

可通过平板播种细胞和培养至汇合，随后在包含***、2-磷酸抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、***、具有或不具有TGF-β1的培养基中培养来进行软骨细胞分化(参见Williams et al.(2003)Tissue Engineering 9(4):679)。

神经元分化在本领域中是已知的。例如，可如美国专利号20100021434和20090257987中所述来从间充质干细胞产生神经元和/或寡突细胞。

或者或另外地，可遗传上修饰间充质干细胞以表达用于治疗疾病或可选择地驱使其朝向特定谱系分化的试剂(例如多肽、siRNA或miRNA)。

因此，例如，为了促进骨分化，可遗传上修饰间充质干细胞以表达骨形态发生因子2(BMP2)。

或者，为了促进朝向胰腺细胞的分化，可遗传上修饰间充质干细胞以表达Pd-x。

由于已知间充质干细胞以并朝向伤口寻靶和迁移，因此细胞可用作载体，从而将有用的分子运输至损伤的部位。有用的分子可以是固有地发现于间充质干细胞内的分子(例如生长因子)或可以是被人工地置入细胞内的(即转染至细胞内的蛋白或多核苷酸)。

本文中描述的分化的和未分化的间充质干细胞群都可用于治疗大量的病症，其为根据细胞的分化状态而选择的特定病症。

因此，根据本发明的另一个方面，提供了治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括将治疗上有效量的本发明的分离的细胞群移植入有此需要的受试者。

根据一个实施方案，疾病或障碍选自骨或软骨疾病、神经变性疾病、心脏病、肝病、癌症、神经损害、伤口愈合、自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病、脊髓损伤和组织再生。

适合于使用本发明的细胞治疗的骨质缺损包括但不限于成骨不全、断裂、先天性骨质缺损等。

此外，可将本发明的间充质干细胞植入受试者以提供矫形外科和其它(例如牙科)假肢器官装置(例如关节置换术和/或牙齿植入)的骨和***支撑。

可使用本发明的间充质干细胞治疗CNS疾病。

可采用本文中的细胞有益地治疗的CNS疾病或障碍的代表性实例包括但不限于疼痛障碍、运动障碍、分离性障碍、心境障碍、情感障碍、神经变性疾病或障碍和痉挛性障碍。

这样的病况的更具体的实例包括但不限于帕金森症、ALS、多发性硬化、亨廷登(Huntingdon)疾病、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病神经病变、青光眼神经病变、黄斑变性、震颤和迟发性运动障碍、恐慌、焦虑、抑郁、酒精中毒、失眠、躁狂行为、阿尔茨海默氏症和癫痫。

如所提及的，由于MSC可分化为软骨，因而本发明的间充质干细胞可适用于关节病况的治疗，包括但不限于骨关节炎、风湿性关节炎、炎症性关节炎、软骨软化、缺血性坏死、创伤性关节炎等。

已知骨髓衍生间充质干细胞(MSC)与造血干细胞(HSC)和免疫细胞相互作用，并且代表用于增强同种异体造血植入和预防移植物抗宿主疾病(GVHD)的潜在细胞疗法。当限制造血干细胞数目时，只有在共注入不相关的人MSC而非共注入小鼠间充质细胞系后观察到NOD-SCID小鼠的人植入。不相关的人MSC在体外不引发T细胞活化并且以剂量依赖性方式抑制结核菌素和不相关的同种异体淋巴细胞引起的T细胞活化。无细胞MSC培养上清液、小鼠***和人皮肤纤维母细胞不引起这样的效应。这些临床前数据显示不相关的、人骨髓衍生的、扩增培养的MSC可通过促进造血植入和限制GVHD改善同种异体抑制的结果(MaitraB,et al Bone Marrow Transplant.200433(6):597-604)

已知当MSC被引入梗塞的心脏时，它们可阻止有害的重塑和改善恢复。已将MSC直接注入梗塞或将其静脉内施用并且已显示其聚集在损害部位。同种异体MSC与免疫***的细胞的相互作用的检查显示T细胞的很小的排斥。同种异体MSC在体内的持久性显示其潜在的用于多个受体的“现成的”治疗用途(Pittenger MF,et al Circ Res.2004Jul 9；95(1):9-20)。

离体扩增的间充质细胞用于移植的用途具有下列优势：

其减少受体成年组织***的重构所需的血液或其他组织的量。

其使得能够为了潜在的未来使用而储存少量的未扩增的间充质细胞，例如来自脐带血或外周血的细胞。

在患有恶性肿瘤的受体的自体移植中，自体注入中的污染性肿瘤细胞通常促成疾病的复发。选择和扩增间充质细胞会减少最终移植中的肿瘤细胞负荷。

组织再生：本发明的间充质细胞群可用于促进组织再生。间充质干细胞的移植对于再生医学、自身免疫疾病、炎症病况、急性和慢性缺血病况整形外科、组织工程学、再生新组织和自然愈合病变或受损的器官。

基因疗法：为了成功的长期基因疗法，必需的要求是高频率的具有稳定整合至其基因组内的转基因的遗传修饰的细胞。目前至新鲜的干细胞和/或祖细胞的基因转移是非常低效的。离体储存和加工选择的间充质细胞群以及增强其寻靶和植入潜能的能力会提供增加的成功使用遗传修饰细胞移植的概率(Palmiter Proc Natl Acad Sci USA 91(4):1219-1223,(1994))。

在本文中描述的任何方法中，可从自体的、半自体的或非自体(即同种异体或异种异体)的人供体或胚胎或脐带/胎盘获得细胞。例如，可从人尸体或供体受试者分离细胞。

术语半自体的意指在Ⅰ类或Ⅱ类主要组织相容性复合物(MHC)基因座上与受体细胞部分失配的供体细胞。

可使用多种移植方法(其性质取决于植入部位)将本发明的细胞施用至治疗的个体。

根据一个实施方案，不将在包含烟酰胺的培养基中的细胞移植入体内。

可将细胞移植至组织的受损或健康的区域。在一些情况下受损组织区域的确切未知可以是未知的并且将细胞非故意地移植至健康的区域。在其它情况下，可优选地将细胞施用至健康的区域，从而避免该区域的任何其它损害。无论什么情况下，在移植后，细胞优选迁移至受损区域。

术语或短语“移植”“细胞替换”或“植入”在本文中可互换地使用并且意指本发明的细胞至靶组织的引入。如所提及的，细胞可获自受体或获自同种异体、半同种异体或异种异体的供体。还考虑了其它的异种器官。

可通过直接注入器官、注入血液、复膜内注射、直接至淋巴器官的注射等手段来移植本发明的细胞。可通过监控植入的细胞至期望器官的寻靶和植入、期望的器官特异性基因或标志物的表达和受试者的衍生器官的功能来确定合适的移植方法。在胰腺中，例如血糖正常的维持、胰岛素和/或C肽的分泌可以是在如下文描述的细胞替换疗法之后糖尿病宿主动物的功能恢复的量度。在肝脏中，例如可监控白蛋白合成。

MSC通常下调2类MHC，因而是较少免疫原性的。获自脐带血、脐带的Warton胶状物或胎盘的胚胎或新生细胞进一步地较不可能是强免疫原性的并因此较不可能被排斥，尤其因为这样的细胞在起始时是免疫抑制性和免疫调节性的。

虽然当施用至机体时非自体细胞可诱发免疫反应，但可采用几种方法来减少非自体细胞的排斥的可能性。这些方法包括将细胞施用至特殊部位或可选择地抑制受体的免疫***、提供抗炎症治疗(其在起始时可被显示控制自身免疫性障碍)和/或将非自体/半自体细胞在移植前封装在免疫绝缘的、半透过的膜中。封装技术通常分类为微囊化(涉及小的球状媒介物)和宏囊化(macroencapsulation)(涉及大的平薄层和中空纤维膜)(Uludag,H.etal.Technology of mammalian cell encapsulation.Adv Drug Deliv Rev.2000；42:29-64)。

制备微胶囊的方法在本领域是已知的并且包括例如由如下文献描述的那些：Lu MZ,et al.,Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine).Biotechnol Bioeng.2000,70:479-83,Chang T M andPrakash S.Procedures for microencapsulation of enzymes,cells and geneticallyengineered microorganisms.Mol.Biotechnol.2001,17:249-60,and Lu M Z,et al.,Anovel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate).J.Microencapsul.2000,17:245-51。

例如，通过将修饰的胶原与2-羟乙基丙烯酸甲酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯的三元共聚物外壳混合来制备微胶囊，这产生2-5.mu.m的胶囊厚度。可进一步用另外的2-5.mu.m的三元共聚物外壳来封装这样的微胶囊以产生带负电荷的平滑面和最小化血浆蛋白质吸附(Chia,S.M.et al.Multi-layered microcapsules for cellencapsulation Biomaterials.200223:849-56)。

其它的微胶囊基于藻酸盐(一种海洋多糖(Sambanis,A.Encapsulated islets indiabetes treatment.Diabetes Technol.Ther.2003,5:665-8))或其衍生物。例如，可以通过多聚阴离子海藻酸钠和硫酸纤维素钠与多聚氧离子聚(亚甲基-共-胍)氢氯化物在氯化钙的存在下的聚电解质络合作用来制备微胶囊。

将理解当使用较小的胶囊时改善细胞胶囊化。因此，当胶囊大小从1mm减少到400.mu.m时，胶囊化的细胞的质量控制、机械稳定性、弥散性质和体外活性得到改善(Canaple L.et al.,Improving cell encapsulation through size control.JBiomater Sci Polym Ed.2002；13:783-96)。此外，发现具有良好控制的小至7nm的孔径、特定的表面化学和精确的微结构的纳米多孔生物胶囊成功地使细胞的微环境免疫绝缘(Williams D.Small is beautiful:microparticle and nanoparticle technology inmedical devices.Med Device Technol.1999,10:6-9；Desai,T.A.Microfabricationtechnology for pancreatic cell encapsulation.Expert Opin Biol Ther.2002,2:633-46)。

免疫抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢菌素、环孢菌素A、氯喹、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐、D－青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE^TM)、依那西普、TNFα阻断剂、靶向炎症细胞因子的生物试剂和非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸盐、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、醋氨酚、布洛芬、Cox－2抑制剂和曲马朵。

可提供本发明的细胞群本身，与包含其的培养基一起提供，可从培养基分离其，以及可与药物可接受的载体和与另外的可促进细胞植入和/或器官功能的试剂(例如免疫抑制剂、抗生素、生长因子)组合。因此，可在药物可接受的载体或稀释剂例如无菌盐水和缓冲水溶液中施用本发明的细胞群。这样的载体和稀释剂的使用在本领域中是已知的。

如果需要，本发明的组合物可存在于包装或分配设备例如FDA认可的装备中，其可包含一个或多个含有活性成分(例如细胞)的单位剂型。包装例如可包含金属或塑料箔，例如罩板包装。包装或分配设备可带有用于施用的说明。包装或分配装置可带有由政府机关规定的调节药物的制造、使用或销售的形式的公告。该公告反映由机关批准的用于人类或兽医施用的组合物的形式。这样的公告例如可包括由美国食品和药物管理局批准的处方药或定型产品***物的标签。还可制备包含在药物可接受的载体中配制的制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并且如上进一步详述的标志物用于所指出的状况的处理。

可将根据本发明的方法制备的细胞本身施用于受试者、播种于支架上和/或以其中它与合适的载体和赋形剂混合的药物组合物施用。

如本文中使用的，“药物组合物”是指本文中描述的一种或多种活性成分与其它化学组分例如生理上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是便于向生物体施用化合物。

在下文中，短语“生理上可接受的载体”和“药物可接受的载体”可交换使用，是指不对生物体造成明显的刺激并且不消除所施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语中。

在本文中，术语“赋形剂”是指向药物组合物添加以进一步方便施用活性成分的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

可在最新版的“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack PublishingCo.,Easton,PA中找到用于药物的配制和施用的技术，通过引用将其完全并入本文。

合适的施用方法例如可包括口服、直肠、透黏膜、特别是经鼻的、肠内或肠胃外的递送，包括肌肉注射、皮下和髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

或者，可以在局部而不是以全身方式施用药物组合物，例如通过将药物组合物注射到患者的组织区域中。

根据本发明使用的药物组合物可以以常规方式使用一种或多种包含赋形剂和辅助物的生理上可接受的载体，其方便将活性成分加工成药学上可使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径。

对于注射，可在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液例如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐缓冲液中配制药物组合物的活性成分。对于透黏膜施用，在制剂中使用对于待透过的障碍物合适的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的。

适用于本发明的上下文的药物组合物包括其中以对于实现预期目的为有效的量包含活性成分的组合物。更具体地，“治疗有效量”意指有效防止、减轻或改善障碍(例如缺血)的症状或延长被处理的受试者的存活的活性成分(例如核酸组成)。

治疗有效量的确定在本领域技术人员的范围内，特别是考虑到本文中提供的详细公开。

对于在本发明的方法中使用的任何制剂，可由体外和细胞培养测定来评价剂量或治疗有效量。例如，可在动物模型中配制剂量以获得所需的浓度或效价。这样的信息可用于更准确地确定人类的有用剂量。

本文中描述的活性成分的毒性和治疗效果可通过在体外、细胞培养物或试验动物中的标准制药步骤来确定。由这些在体外和细胞培养物测定和动物研究获得的数据可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而变化。精确的制剂、施用途径和剂量可通过单个内科医生鉴于患者的病况来选择(例如参见Fingl,E.et al.(1975),"The PharmacologicalBasis of Therapeutics,"Ch.1,p.1.)。

取决于待处理的病况的严重性和反应性，给药可为单次或多次施用，在持续几天至几个星期的的治疗过程中，或直到实现治愈或获得疾病状态的减轻。

待施用的组合物的量当然将取决于被治疗的受试者、痛苦的严重性、施用方式、开处方的内科医生的判断等。

如本文中使用的术语“方法”是指用于实现给定的任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于要么是化学、制药、生物、生物化学和医学领域的从业人员已知的已知方式、手段、技术和步骤要么是其容易从已知方式、手段、技术和步骤开发的那些。

如本文中使用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状或基本上预防病况的临床或美学症状的出现。

如上文描述和如在下面的权利要求书部分中请求保护的本发明的各个实施方案和方面在以下的实施例中找到实验支持。

在检查以下并不旨在进行限制的实施例时本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得明显。此外，如上文描绘和如在下面的权利要求书部分中请求保护的本发明的各个实施方案和方面在以下的实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考以下实施例连同以上描述以非限制性方式说明本发明。

通常，本文中使用的命名法和本发明中利用的实验室步骤包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中得到充分解释。例如参见"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中提出的方法；"CellBiology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"CurrentProtocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可获得的免疫测定广泛描述于专利和科技文献中，例如参见美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；"AnimalCell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRLPress,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide ToMethods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual"CSHL Press(1996)；通过引用将所有这些并入，如同在本文中完整提出。在整个这篇文件中提供其它的通常参考。其中的步骤据认为在本领域是公知的并且被提供来便于读者。通过引用将其中所包含的所有信息并入本文

实施例

方法和实验步骤

间充质干细胞的分离：基于衍生自骨髓和脂肪组织衍生的间充质干细胞在扩增培养基中的塑料粘附潜力将它们分离，该扩增培养基包含补充有0.05mg/ml庆大霉素(Sigma)和2mM L-谷氨酰胺(Biological Industries,Israel)的高葡萄糖DMEM和10％胎牛血清(FBS,Hyclone,Logan,UT,USA)。使细胞粘附3-4天并且洗掉非粘附细胞并改变培养基。每3-4天进一步采用新鲜培养基交换培养基。

造血干细胞和祖细胞：使用CD133微珠和分离器(Miltenyi，Inc.Auburn,CA)分离脐带衍生的造血干细胞，并在补充有50ng/ml TPO、IL6、SCF、Flt3、胎牛血清、±2.5或5mM烟酰胺和/或10、50或200ng/ml FGF4的MEMα中培养3个星期。在培养物中三周后，细胞染上表面标志物(CD38、CD133、CD33、CD19)并通过FACS分析测定细胞群(参见下文)。结果表达为测定的总群体的百分比。

维持和扩增：一旦粘附细胞达到约80-90％汇合，就采用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Sigma)将它们分离，在DMEM和10％胎牛血清中洗涤两次，以400g离心5分钟，并且在相同的培养条件下以1：2至1：1000的稀释度重新铺板。

细胞大小的测量：使用Cedex自动化细胞计数器(Innovatis)测量细胞大小。在台盼蓝(Trypan Blue)(Sigma)中以1：2稀释该细胞并且在显微镜下自动测量细胞大小。

粒度(Granularicity)的测量：在胰蛋白酶处理之后，通过边散射FACS分析细胞的粒度。

培养物中细胞数目的测量：使用Cedex自动化细胞计数器(Innovatis)测量细胞数目。在台盼蓝(Trypan Blue)(Sigma)中以1：2稀释该细胞并且在显微镜下自动测量细胞数目。

表面抗原分析：在不同的时间点采用0.25％胰蛋白酶-EDTA将细胞分离。采用包含1％BSA的PBS溶液洗涤细胞，并且采用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)缀合的抗体：105PE,105FITC(Serotec,Raleigh,NC),45FITC,14FITC,HLA-DR FITC,106PE,31PE(BD,Franklin Lakes NJ),34PE(Dako,Glostrup,Denmark),73PE,HLA class1PE,49b PE(Phamingen,San Diego,CA),29PE,44PE,54FITC,59PE,90PE(BioLegend,San Diego,CA),CD133-(AC141)PE(Miltenyi,Auburn,CA),CD38FITC(Dako,Glostrup,Denmark),CD19FITC(BD Biosciences,Franklin Lakes NJ),CD33FITC(BD Biosciences,Franklin Lakes NJ)将其染色(在4℃下持续30分钟)。

然后在上述的缓冲液中洗涤该细胞并且使用FACScalibur^R流式细胞仪(BectonDickinson,Franklin Lakes NJ)进行分析。使用488nm氩激光束作为用于激发的光源，使细胞以最高至1000个细胞/秒通过。使用对数放大测量10000个细胞的发射，并且使用CellQuest软件(Becton Dickinson)进行分析。使用采用FITC和PE缀合的同种型对照抗体染色的细胞来确定背景荧光。

CFU-F：以50-100个细胞/cm²将培养的MSC播种在6孔板上并且采用DMEM和10％FBS进行维护。在14天后使用10％冷甲醛(Sigma)将该细胞固定并采用哈里斯氏苏木素(Sigma)染色。将克隆(具有明显集中点的多于50个细胞的簇)染上蓝紫色并且使用显微镜进行计数。

衰老评价测定：使用衰老β-半乳糖苷酶染色法试剂盒(Cell Signaling)将培养的MSC染色。将细胞固定和染色以使用X-Gal在pH 6下检测β-半乳糖苷酶活性，在干燥的培养箱中在37℃中温育过夜。

体外伤口愈合测定：使用200μl或1000μl枪头(tip)在～70％汇合下在MSC培养物中进行创伤。四天以后使用10％冷甲醛(Sigma)将细胞固定并且采用哈里斯氏苏木素(Sigma)染色。使用显微镜评价体外伤口愈合过程。

采用烟酰胺处理间充质培养物：如上所述起始间充质培养物，并且采用单独的1-15mM烟酰胺或与生长因子组合或单独的生长因子来补充培养物，在空气中5％CO₂的潮湿气氛中在37℃下温育。在每次传代时和在每次培养基更换时，采用间充质培养基、烟酰胺和生长因子补充培养物。

在一些实验中，在有或没有烟酰胺和指定的因子的情况下培养粘附细胞，在第4次传代之前24小时，使用无胎牛血清或FGF4的培养基替换培养基。

体外迁移测定：将RPMI和含100ng/ml CXCL12(R&D Systems)的10％FCS(0.6ml)置于Costar 24孔“transwell”培养板(Corning,Inc,Corning,NY)的下室中。将100-μl培养基中的细胞(2x10⁵)在多孔膜(孔径，5μm)上方引入上室中。在4小时后，从两个室收集细胞并且通过流式细胞计(FACSsort,Becton Dickinson and Co,San Jose,CA,USA)进行计数。将在下室中不具有CXCL 12的自发迁移作为对照。

寻靶的体内分析：不致命地辐照(在375cGy下以67cGy/分钟)NOD/SCID老鼠(8-10个星期大)(Harlan Ltd.,Israel)并且在24小时后经由尾部静脉接种在烟酰胺的存在下培养的CFSE标记的间充质干细胞或在烟酰胺的不存在下培养的CFSE标记的间充质干细胞。在注射24小时后牺牲老鼠并且获得骨髓或其它组织样品。使用流式细胞仪通过CFSE染色的细胞相对于未标记的鼠细胞的背景的显影来检测人类细胞的寻靶。CFSE的明亮荧光足以将标记的人类细胞与未标记的鼠细胞分离至少一个对数。为了定量人类祖细胞的寻靶，采用APC缀合的抗人细胞标志物单克隆抗体将骨髓细胞染色并且对CFSE⁺/细胞标志物细胞进行计算。对于每个样品记录和分析100000个事件。

将间充质细胞移植到NOD/SCID老鼠中：使NOD/SCID老鼠繁殖并且保持在消毒的内通风的笼子(Techniplast,Bugugiatte,Italy)中。如上所述不致命地辐照八个星期大的老鼠。经由尾部静脉使老鼠接种在烟酰胺的存在或不存在下培养的间充质干细胞。为了避免供体可变性，混合来自几个部位的间充质干细胞并且将其用于扩增培养物以及集体注射。在第4个星期牺牲老鼠，通过在4℃下使用IMDM冲洗它们的股骨和胫骨来获得骨髓样品。如上文描述的进行NOD/SCID骨髓细胞的流式细胞仪分析，使用针对人类细胞表面分化抗原的单克隆抗体以识别人类细胞植入物。

迟发型超敏反应：使用恶唑酮(4-乙氧基亚甲基-2-苯唑-5-酮)致敏BALB/C小鼠，6天后用恶唑酮注射入耳来攻击。在候选组合物(如指出的)的局部施用后24小时通过使用测径器测量耳厚度来测定候选组合物的免疫调节。

生长因子分泌：收集在第4次传代之前24小时去除胎牛血清和FGF4的如所指出的培养的MSC的培养基，并通过ELISA测定分泌到培养基中的生长因子和免疫相关因子(人生长因子HGF、转化生长因子βTGF-β、角质形成细胞生长因子KGF和白介素6IL-6)。使用特异于人KGF(R&D systems,cat#DKG00),IL-6(R&D systems,cat#D6050),TGF-β1(R&D systems,cat#DB100B),HGF(R&D systems,cat#DHG00)的固相夹心ELISA试剂盒进行ELISA。

角化细胞增殖测定：在角化细胞生长介质中进行正常人表皮角化细胞(Promocell,GmbH,Heidelberg,Germany)的一代培养，分离和再播种于如所指出的用MSC条件培养基稀释的角质化生长介质(包含50％补充物混合物)中。每周两次更换培养基，在达到90％汇合后分离和计数角化细胞。

混合的淋巴细胞反应样测定：通过浮力密度离心分离包含大于50％T细胞的外周血衍生的单核细胞(MNC)并用3μg/ml植物凝集素(PHA)活化。在活化后，在有或没有来自MSC培养物的条件培养基和其它因子的情况下培养细胞。通过起始活化后72小时由ELISA测量的分泌至培养基池中的TFN-α(pg/ml)的程度来测量PBMN细胞对PHA活化的反应。

统计－施加无参数的Wilcoxon秩检验用于检验研究组之间的差异。施加的所有检验是双侧的，并且认为≤5％的p值是统计学上显著的。使用SAS软件(SAS Institute,Cary,NC)分析数据。

实施例1

烟酰胺对在生长因子的存在下培养的间充质干细胞的分析

材料和方法

选择间充质干细胞并且将其在特定的生长因子(碱性成纤维细胞生长因子-bFGF，肝素结合的表皮生长因子-HB-EGF，成纤维细胞生长因子4-FGF-4和血小板衍生生长因子、同源二聚体、亚基B、PDGF-BB)存在下在烟酰胺的存在或不存在下培养三次或四次传代并且计算细胞的数目和大小。

检查了两种浓度(10和50ng/ml)的以下因子中的每个因子。

实验组如下：

1组：对照物

2组：10ng/ml生长因子

3组：50ng/ml生长因子

4组：5mM NAM

5组：5mM NAM+10ng/ml生长因子

6组：5mM NAM+50ng/ml生长因子

此外，与单个补充物相比检查了组合：5mM NAM+50ng/ml FGF4+50ng/ml PDGF-BB的影响。

结果

图1说明了碱性FGF对烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响。

图2A-B说明了肝素结合的类EGF生长因子(HB-EGF)对于烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响。

图3-5说明了烟酰胺具有对FGF4增加间充质干细胞的增殖的能力的增强效应。

图6A-D说明了PDGF-BB对烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力的不一致的影响。

图7A-D说明了与没有采用PDGF-BB处理的培养物相比，采用PDGF-BB或PDGF-BB+NAM的组合处理的MSC培养物受到除了MSC以外较多部分的细胞污染。

图8A-B、9A-B和10A-H说明了与在PDGF-BB的不存在下FGF4和烟酰胺的影响相比三种因子–FGF4、烟酰胺和PDGF-BB的组合对间充质干细胞的增殖具有不利的影响。

图27说明组合的烟酰胺和FGF4在整个5次传代中对扩增(累计细胞计数)的一致的协同作用。

实施例2

烟酰胺对骨髓衍生间充质干细胞培养物的影响

本发明人显示烟酰胺增加了骨髓衍生MSC的播种效率(选择)。在图11和13中显示了在烟酰胺中一次传代后这些细胞的表型表征。图15、17A-B、22和26说明了烟酰胺对骨髓衍生MSC的扩增速率的影响。较低浓度的烟酰胺(例如0.1mM)对于骨髓衍生MSC的扩增速率具有不明显的影响(图未显示)。图20A-C和21A-B说明了在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在相同条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞更小并且较少粒状。

实施例3

烟酰胺增加了脂肪组织衍生的间充质干细胞的扩增

在图12中显示了脂肪组织衍生的MSC的表型表征。如图14和16所示，烟酰胺实质上改善培养物中衍生自脂肪的间充质干细胞扩增。

实施例4

烟酰胺增加培养的间充质细胞的组织寻靶

为了评价烟酰胺对培养的间充质细胞的寻靶的影响，使NOD/SCID小鼠移植未培养的间充质细胞或在有或没有烟酰胺的情况下用细胞因子培养3周后的所有后代。在移植前，用CFSE标记细胞。转移后24小时通过FACS定量所有CFSE标记的细胞和寻靶至受体小鼠的小鼠骨髓的CFSE标记的间充质细胞。

如果烟酰胺处理的间充质细胞的寻靶比未经历烟酰胺的未培养的间充质细胞的寻靶要显著更高，则结果表明烟酰胺对间充质细胞的组织寻靶的效应。

实施例5

烟酰胺增加趋化因子和粘附分子的功能性

为了确定粘附和相关的分子在烟酰胺介导的细胞寻靶和植入的增强中的作用，可检测烟酰胺对粘附分子的体外迁移和功能性的影响。

使用trans-well迁移测定检测CXCL-12诱导的未培养和培养的间充质细胞的迁移，从而评价烟酰胺对整联蛋白和粘附分子功能的影响。相较于在没有烟酰胺的情况下培养的细胞或未培养的细胞，烟酰胺处理的细胞中增强的迁移的刺激显示用烟酰胺处理间充质细胞可潜在地增加粘附分子对其配体的反应性，从而导致增强的烟酰胺处理的细胞的植入和寻靶潜能。

还可使用剪切流分析来研究结合至粘附分子的细胞的功能性质。烟酰胺对粘附分子介导的结合和在底物粘连分子上的停留的强烈效应可通过用烟酰胺处理的间充质细胞中明显的抵抗切应力的去除的起始沉降细胞的显著提高的百分比来证实。

实施例6

烟酰胺增加培养细胞的SCID再增殖能力

通过NOD/SCID小鼠的再增殖来检测烟酰胺处理增强抑制细胞的寻靶和植入的能力。为了评价再增值能力，用未培养的间充质细胞(n＝12)以剂量范围移植入NOD/SCID小鼠以获得亚最佳移植和随后在使用细胞因子扩增3周后在一部分小鼠或其后代中的无移植物植入。在移植后4周评价人细胞植入。如果0.5％的受体骨髓细胞表达人CD45抗原(CD45+)则将小鼠评分为阳性植入。在培养物中烟酰胺的存在导致小鼠中预定剂量范围的间充质细胞的优良和明确植入的事件中，可推断烟酰胺在增强移植的间充质细胞的植入和寻靶中是有效的。

实施例7

烟酰胺对间充质干细胞的影响的进一步分析

材料和方法

如上所述采用塑料粘附方法分离间充质干细胞，并且采用肽牛血清±NAM培养几次传代。在NAM的存在下选择细胞。

在约80％的汇合下，在胰蛋白酶处理后收集粘附细胞、对其进行计数、表征和在1x10³个细胞/cm²的浓度下重新播种。

VCAM1/CD106的测量：在胰蛋白酶处理后使用抗人CD106PE抗体针对FACS中的CD106表达分析来分析细胞。

CD54的测量：在胰蛋白酶处理后使用抗人类CD54抗体在FACS中分析细胞的CD54表达。

结果

图18说明烟酰胺对细胞计数的影响在大批量的间充质干细胞上是明显的，这表明可以采用较少传代制造大批商业MSC。这因通过烟酰胺所致的更短的培养时间和保存干细胞特性而确保较高品质的治疗细胞。此外还有，在烟酰胺中培养之后减少了衰老细胞的数目。

图19说明烟酰胺的影响不依赖于特定的血清批次并给出了进行的两个实验的一个的结果。分别地处理这些实验的培养物(每一组在达到汇合后传代)。

在烟酰胺中培养后衰老细胞的量减少(图23A-D)。

图24A说明在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在同样条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞要表达更多的VCAM1/CD106。

图24B说明在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在同样条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞要表达更少的CD54。

图25说明了在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在同样条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞具有更高的进行伤口闭合的能力。

实施例8

组合的烟酰胺和FGF4对培养的间充质干细胞中生长因子的表达的影响

在烟酰胺和FGF4的存在下培养间充质干细胞提供间充质干细胞的扩增潜能的协同增强，同时将细胞维持在未分化状态(参见图3A-3D、4A-4B、5A-5D和27)。为了进一步表征在这些培养物中扩增的MSC，通过ELISA测量细胞因子至培养基中的分泌。

图28-31说明采用组合的FGF4和烟酰胺相较于单独的烟酰胺，显著增加的肝细胞生长因子(HGF，图28)、转化生长因子β(TGF-β，图29)和角质形成细胞生长因子(KGF，图30)。图31显示烟酰胺的减少分泌的促炎症白介素6(IL-6)，以及添加FGF4的IL6的进一步减少。

当在体内迟发性超敏反应测试中测定来自用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的培养基对炎症的影响时，清楚地观察到对采用致敏变应原(恶唑酮)激发的炎症反应的减少(数据未显示)。在离体混合淋巴细胞反应型测定中的进一步分析清楚地证明来自烟酰胺与烟酰胺和FGF4的MSC培养基在减少外周血单核细胞在响应PHA的激活后分泌的TNFα中的抗炎症潜能(数据未显示)。

当在体外测定来自用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的培养基对角质形成细胞增殖的影响时，清楚地观察到角质形成细胞增殖的显著诱导(数据未显示)。

因此，用烟酰胺和与FGF4组合的烟酰胺培养的粘附间充质干细胞将生物活性因子释放至培养基中，包括具有抗炎症和增殖诱导活性的因子。

实施例9

组合的烟酰胺和FGF4对培养物中脂肪衍生的间充质干细胞的影响

在至多4次传代的培养物中评价采用烟酰胺并且采用或不采用额外的FGF4培养的衍生自脂肪的间充质干细胞中的增殖和细胞大小分布。

图32-33说明了与对照物以及经烟酰胺处理的培养物相比组合的烟酰胺和FGF4对衍生自脂肪的粘附细胞增殖(以培养物中完整有核细胞的数目表示)的显著影响。

培养物中间充质干细胞的大小经常用作MSC的分化程度的指示，未分化的状态在较小大小的细胞中更普遍。图34说明了在暴露于烟酰胺的衍生自脂肪的MSC的培养物中较小大小的细胞的提高的普遍性，而在暴露于烟酰胺和FGF4的衍生自脂肪的MSC中较小大小的细胞的更高的普遍性。

因此，这些结果表明烟酰胺和FGF4的组合协同增加了衍生自脂肪的间充质细胞的增殖速率，同时有效地保持细胞处于未分化状态。

实施例10

烟酰胺和FGF4造血干细胞分化的影响

为了确定组合的烟酰胺和FGF4对间充质干细胞的影响是特定的还是一般的现象，采用或不采用FGF4和烟酰胺培养造血干细胞，并根据细胞表面标志物评估亚群组分的分化程度。

材料和方法

分离脐带衍生CD133+造血干细胞并在补充有早期作用生长因子和胎牛血清、烟酰胺和/或FGF4的培养基中培养3周。在3周的培养后细胞染上表面标志物(CD38、CD133、CD19)并通过FACS分析测定细胞群。通过在3周时计数总共的细胞来评价细胞增殖。

结果：

FGF4不影响培养物中的造血干细胞的分化

当在2.5或5mM烟酰胺的存在下培养造血早期祖细胞(CD133+)3周时，分化的细胞部分显著减少，并清楚地观察到干细胞和祖细胞部分的增加(参见图35，栏1、2和3)。另一方面，细胞对10-200ng/ml的FGF4的暴露对3周培养时的分化程度不具有任何影响，如通过表达CD38和CD133的细胞部分所证实的(参加图35和36，栏1和4-6)。FGF4的添加、采用或不采用烟酰胺对培养物中的总细胞增殖也不具有任何可辨别的影响(数据未显示)。

将任何浓度的FGF4添加至采用烟酰胺培养的细胞既不增加也减少烟酰胺抑制的造血干细胞分化的抑制(参见图35-36，第1和7-12道)。

FGF4不影响HSC至定型的骨髓或淋巴谱系的分化：

为了确定是否定型的造血干细胞受到在培养过程中对FGF4的暴露的影响，在3周培养物中测量表达CD33和CD19的细胞(分别代表分化的定型的谱系骨髓和淋巴细胞)的丰度。虽然烟酰胺稳定地减少定型的细胞部分(参见图37和38，第1-3和7-12道)，单独的或与烟酰胺组合的FGF4的添加对定型的骨髓或淋巴细胞的丰度不具有任何影响(参见图37和38，第1、4-6和7-12道)。

因此，这些结果清楚地显示在间充质干细胞培养物中观察到的FGF4的增殖增强效应和间充质干细胞对组合的烟酰胺和FGF4的暴露的协同效应不是一般的现象，并且在离体造血干细胞培养物中未被观察到。

实施例11

烟酰胺+/－FGF4的组合使用，随后使用VCAM1/CD106、CD105或STRO-1的选择以选择和扩增间充质干细胞。

材料和方法

分离：基于骨髓衍生的和脂肪组织衍生的间充质细胞在扩增培养基中的塑料粘附潜能分离其，所述扩增培养基包含：高糖DMEM和10％胎牛血清(FBS,Hyclone,Logan,UT,USA)、0.05mg/ml庆大霉素(Sigma)和2mM L-谷氨酰胺(Biological Industries,Israel)。使细胞在烟酰胺+/－FGF4的存在下附着3-4天并通过培养基更换洗掉非粘附细胞。

使用胎牛血清、+NAM、±FGF4培养间充质干细胞几次传代(1-3)。可将细胞培养在塑料粘附平板上。

在约80％汇合时，在胰蛋白酶处理后收集粘附细胞，使用直接或间接缀合的小鼠抗人抗体(Miltenyi Biotec)和磁珠细胞分选(MACS)或荧光活化细胞分选(FACS)通过CD105、CD106或STRO-1来计数、表征和选择并重新播种以进一步扩增。

VCAM1/CD106、CD105或STRO-1的测量：在胰蛋白酶处理后在FACS中使用抗人CD106PE抗体、抗人CD105抗体或抗STRO-1抗体分析细胞的CD106表达、STRO-1表达或CD105。

实施例12

烟酰胺+/－FGF4的组合使用，随后使用VCAM1/CD106、CD105或STRO-1的选择以选择间充质干细胞。

材料和方法

骨髓衍生和脂肪衍生MSC的选择：使用直接或间接缀合的小鼠抗人抗体(MiltenyiBiotec)和磁珠细胞分选(MACS)通过CD105、CD106或STRO-1表达来选择骨髓衍生和脂肪衍生的间充质细胞。将选择的细胞以6×10³个细胞/cm²的浓度播种在扩增培养基中，所述扩增培养基包括：高糖DMEM和10％胎牛血清(FBS,Hyclone,Logan,UT,USA)、0.05mg/ml庆大霉素(Sigma)和2mM L-谷氨酰胺(Biological Industries,Israel)。使细胞附着3-4天并通过培养基更换洗掉非粘附细胞。

选择的MSC群在NAM±FGF4中的培养：使用胎牛血清、+NAM、±FGF4培养间充质干细胞几次传代。

理解本发明的某些特征，出于清楚的目的而在分别的实施方案中描述，还可以以在单一实施方案中组合提供。相反地，本发明的某些特征，出于简洁的目的而在单一实施方案中描述，还可分别或以任何合适的组合提供。

尽管已结合其特定实施方案描述了本发明，但是可见的而是许多替代、改变和变化对于本领域技术人员将是明显的。因此，旨在包括所有这样落入所附的权利要求的精神和宽泛范围的替代、改变和变化。通过引用将在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及基因库登录号以其全部并入本文，其程度如同通过引用具体和分别指出将每个单独的出版物、专利和专利申请或基因库登录号纳入本文中。此外，本申请中任何参考文献的引用或确定不应视为承认这样的参考文献作为本发明的现有技术而可获得。

Claims

1.扩增未分化的间充质干细胞(MSC)的方法，其包括：在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中培养包含未分化的MSC的MSC群，其中所述培养基没有另外添加的生长因子和/或分化因子，从而产生未分化的MSC扩增群。

2.权利要求1的方法，其中所述培养基的钙浓度大于1.8mM。

3.权利要求1或2的方法，其中实施所述培养至少一个星期或3次传代。

4.权利要求1或2的方法，其中所述培养基没有血小板衍生生长因子(PDGF)。

5.权利要求1所述的方法，其中所述未分化的MSC是经播种的间充质干细胞群，其中在包含烟酰胺和FGF4的培养基中的所述培养之前在没有烟酰胺的培养基中培养所述经播种的间充质干细胞群。

6.权利要求5的方法，其中所述没有烟酰胺的培养基没有血小板衍生的生长因子(PDGF)。

7.权利要求5方法，其中实施在所述包含烟酰胺和FGF4的培养基中的所述培养至少一个星期。

8.权利要求5的方法，其中实施在所述没有烟酰胺的培养基中的所述培养至少一天。

9.权利要求5-8中的任一项的方法，其中在包含钙的培养基中实施所述培养，其中所述钙的浓度大于1.8mM。

10.产生用于移植到受试者的细胞的方法，所述方法包括：

(a)根据权利要求1-9中的任一项的方法培养间充质干细胞，以产生培养的未分化的间充质干细胞扩增群；

(b)将所述培养的间充质干细胞扩增群与分化剂接触，从而产生用于移植到受试者的细胞。

11.权利要求10的方法，其中所述分化剂包括生长因子。

12.权利要求10的方法，其中所述分化剂包括编码所述分化剂的多核苷酸。

13.权利要求12的方法，其中所述多核苷酸编码骨形态发生蛋白2(BMP2)。

14.权利要求1-9的任一项的方法产生的分离的间充质干细胞扩增群，其中所述间充质干细胞比在同样的但不存在烟酰胺的条件下产生的间充质干细胞呈更小的粒状。

15.根据权利要求1-9中任一项所述的方法产生的分离的间充质干细胞扩增群，其中:

(i)至少40％的所述细胞表达VCAM1/CD106；

(ii)至少90％的所述细胞具有小于20μm的直径；或

(iii)少于30％的所述细胞表达CD45，多于95％的所述细胞表达CD90以及多于90％的所述细胞表达CD105和CD44。

16.权利要求15的分离的间充质干细胞扩增群，其为大体上均质的。

17.权利要求15或16的任一项的分离的细胞扩增群的用途，其用于生产药物，该药物用于将间充质干细胞移植入有此需要的受试者。

18.权利要求17所述的用途，其中有此需要的受试者患有选自由骨或软骨疾病、神经变性疾病、心脏病、肝病、癌症、神经损害、自身免疫性疾病、GvHD、伤口愈合和组织再生所组成的组的疾病或障碍。

19.细胞培养物，其包括间充质干细胞和培养基，所述培养基包含烟酰胺和FGF4，并且不含另外的生长因子。