CN104203980B - 抗‑大‑内皮素‑1(big‑et‑1)抗体及其用途 - Google Patents

抗‑大‑内皮素‑1(big‑et‑1)抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104203980B
CN104203980B CN201380010580.6A CN201380010580A CN104203980B CN 104203980 B CN104203980 B CN 104203980B CN 201380010580 A CN201380010580 A CN 201380010580A CN 104203980 B CN104203980 B CN 104203980B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
big
antigen
purposes
pain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201380010580.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104203980A (zh
Inventor
L·C·莫顿
D·麦克唐纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN104203980A publication Critical patent/CN104203980A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104203980B publication Critical patent/CN104203980B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

本发明提供结合大‑内皮素‑1(“大‑ET‑1”)的抗体，以及使用该抗体的方法。根据本发明的某些实施方案，该抗体特异性结合人类大‑ET‑1但不结合人类小‑ET‑1(即内皮素‑转化酶‑1[ECE‑1]对大‑ET‑1的蛋白水解切割所产生的内皮素‑1的活性形式)。根据本发明的某些实施方案，该抗‑大‑ET‑1抗体能够阻断ECE‑1对大‑ET‑1的切割。本发明抗体用于治疗大‑ET‑1相关障碍，包括高血压障碍、纤维性障碍、神经变性障碍、肾障碍、疼痛和癌症。

Description

抗-大-内皮素-1(BIG-ET-1)抗体及其用途
技术领域
本发明涉及对人类大-内皮素-1特异的抗体及其抗原结合片段。
背景技术
内皮素-1(也称为“ET-1”、“小-ET-1”和“EDN1”)是21个氨基酸的血管收缩剂，其最初从猪主动脉内皮细胞的培养基分离并表征。(Yanagisawa等(1988),Nature 332:411-415)。ET-1衍生自～200个氨基酸的前原-ET-1分子，内肽酶切割该前原-ET-1分子产生38个氨基酸的形式，称为“大-ET-1”(也称为“原-ET-1”)。内皮素转化酶(ECE-1)进一步切割大-ET-1产生21个氨基酸的血管活性ET-1肽。ET-1可激活内皮素受体A型(“ETaR”)和B型(“ETbR”)。ETaR或ETbR在平滑肌细胞中的激活导致血管收缩，而对实验动物模型静脉内施用ET-1导致动脉压持续升高。在肺中，内皮素基因表达因缺氧而上调，导致对血管平滑肌肥厚、血管收缩、炎症和心脏肥大及肺高压(pulmonary hypertension)中的纤维化的前馈效应(feed-forward effect)。
与前述特性相符，内皮素-1涉及多种疾病和障碍，包括，例如肺高压、心力衰竭、全身性高血压、纤维性疾病、神经变性疾病和癌症。例如，由于其诱导成纤维细胞增殖以及刺激胶原代谢的能力，认为ET-1(大-ET-1切割的产物)涉及肺纤维化的病理发生(见Fonseca等(2011)Am J Respir Cell Mol Biol 44:1-10)。还已将提高的内皮素-1水平与眼病(例如青光眼[例如正常眼压型青光眼、高眼压型青光眼、开角型青光眼])相联系(见Sugiyama等(1995)Surv Ophthalmol 39，增刊1:S49-56；Emre等(2005)Br J Ophthalmol 89:60-63；Galassi等(2011)Invest Opthalmol Vis Sci52:4467-4471；Ghanem等(2011)OphthalmicRes 46:98-102；Tezel等(1997)J.Glaucoma 6:83-89；Chauhan(2008)Can JOphthalmol43:356-360)。因此，已测试或提议内皮素受体(ETA与ETB)的若干种小分子拮抗剂用于治疗诸如肺高压、心血管障碍、炎性疾病、肾病、癌症和阿尔茨海默病的障碍。
在EP0406628B1中提及抗-ET-1抗体；但是，EP0406628B1的抗体是针对与牛甲状腺球蛋白缀合的合成ET-1(即小-ET-1)产生的。由于用小-ET-1作为免疫原，EP0406628B1的抗体预期不会结合大-ET-1，也预期它们不具有降低或抑制内皮素转化酶对大-ET-1的切割的能力。阻断大-ET-1切割为小-ET-1的治疗剂在内皮素信号发放过程中的早期时间点发挥作用，因此可能提供比对ET-1本身特异的抗体更为有效的抑制活性。因此，本领域中存在对内皮素信号发放的新抑制剂的需要，其包括特异性结合人类大-ET-1并阻断小-ET-1形成的抗体。
发明概述
本发明提供结合人类大-ET-1的抗体。本发明的抗体尤其可用于抑制ET-1介导的信号发放以及用于治疗由ET-1活性和/或信号发放引起或与ET-1活性和/或信号发放相关的疾病和障碍。
根据某些实施方案，本发明的抗体特异性结合人类大-ET-1但不结合人类小-ET-1。本发明还提供阻断大-ET-1的内皮素转化酶-1(ECE-1)介导的切割的抗体。如本文所述，阻断大-ET-1的ECE-1介导的切割的抗-大-ET-1抗体在体外和体内都是内皮素-1活性的有效抑制剂。
本发明的抗体可以是全长(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅含有抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可经修饰而影响功能性，例如减少残基效应子功能(Reddy等,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明提供包含重链可变区(HCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段，该重链可变区具有选自SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402和418的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供包含轻链可变区(LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段，该轻链可变区具有选自SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410和426的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供包含选自SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410和418/426的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供包含重链CDR3(HCDR3)结构域和轻链CDR3(LCDR3)结构域的抗体或抗体的抗原结合片段，该重链CDR3结构域具有选自SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408和424的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列，该轻链CDR3具有选自SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416和432，的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
在某些实施方案中，该抗体或抗体的抗原结合部分包含选自SEQ ID NO:8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、376/384、392/400、408/416和424/432的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明还提供抗体或其片段，其进一步包含：重链CDR1(HCDR1)结构域，其具有选自SEQ ID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404和420的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列；重链CDR2(HCDR2)结构域，其具有选自SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406和422的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列；轻链CDR1(LCDR1)结构域，其具有选自SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412和428的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列；以及轻链CDR2(LCDR2)结构域，其具有选自SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414和430的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
本发明的某些非限制性的示例性抗体和抗原结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别具有选自SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16(例如H2M6486N)、20-22-24-28-30-32(例如H2M6490N)、36-38-40-44-46-48(例如H1M6492N)、52-54-56-60-62-64(例如H1M6494N)、68-70-72-76-78-80(例如H2M6495N)、84-86-88-92-94-96(例如H2M6741N)、100-102-104-108-110-112(例如H4H6311P)、116-118-120-124-126-128(例如H4H6316P)、132-134-136-140-142-144(例如H4H6317P)、148-150-152-156-158-160(例如H4H6323P)、164-166-168-172-174-176(例如H4H6327P2)、180-182-184-188-190-192(例如H4H6328P)、196-198-200-204-206-208(例如H4H6329P)、212-214-216-220-222-224(例如H4H6330P)、228-230-232-236-238-240(例如H4H6332P)、244-246-248-252-254-256(例如H4H6334P)、260-262-264-268-270-272(例如H4H6334P2)、276-278-280-284-286-288(例如H4H6335P)、292-294-296-300-302-304(例如H4H6337P)、308-310-312-316-318-320(例如H4H6338P)、324-326-328-332-334-336(例如H4H6340P)、340-342-344-348-350-352(例如H4H6343P)、356-358-360-364-366-368(例如H4H6345P)、372-374-376-380-382-384(例如H4H6347P)、388-390-392-396-398-400(例如H4H6353P)、404-406-408-412-414-416(例如H4H6490N2)和420-422-424-428-430-432(例如H4H6492N2)的氨基酸序列。
在相关实施方案中，本发明包括特异性结合人类大-ET-1的抗体或抗体的抗原结合片段，其中该抗体或片段含有包含在选自SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410和418/426的重链和轻链序列内的重链和轻链CDR结构域。用于鉴定HCVR与LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术为本领域公知，且可用于鉴定本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR边界的示例性约定包括，例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。在一般性术语中，Kabat定义是以序列变异性为基础，Chothia定义是以结构环区的位置为基础，而AbM定义是介于Kabat与Chothia法之间的折衷法。参见，例如Kabat，”Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutesof Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948；及Martin等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272。公开数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。
在另一个方面，本发明提供编码抗-人类大-ET-1抗体或其片段的核酸分子。携带本发明的核酸的重组表达载体和引入了此类载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体的条件下培养宿主细胞来产生抗体并回收所产生的抗体的方法也为本发明所涵盖。
在一个实施方案中，本发明提供抗体或其片段，其包含由选自SEQ ID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、401和417的核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的HCVR。
本发明还提供抗体或其片段，其包含由选自SEQ ID NO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409和425的核酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的LCVR。
本发明还提供抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由选自SEQ ID NO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375、391、407和423的核苷酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的HCDR3结构域，以及由选自SEQ ID NO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383、399、415和431的核苷酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的LCDR3结构域。
本发明还提供抗体或其片段，其进一步包含：由选自SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403和419的核苷酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的HCDR1结构域；由选自SEQ ID NO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、389、405和421的核苷酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的HCDR2结构域；由选自SEQ ID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411和427的核苷酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的LCDR1结构域；以及由选自SEQ ID NO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、397、413和429的核苷酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的基本相同的序列编码的LCDR2结构域。
根据某些实施方案，该抗体或其片段包含由下列SEQ ID NO的核酸序列编码的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NO:1和9(例如H2M6486N)、17和25(例如H2M6490N)、33和41(例如H1M6492N)、49和57(例如H1M6494N)、65和73(例如H2M6495N)、81和89(例如H2M6741N)、97和105(例如H4H6311P)、113和121(例如H4H6316P)、129和137(例如H4H6317P)、145和153(例如H4H6323P)、161和169(例如H4H6327P2)、177和185(例如H4H6328P)、193和201(例如H4H6329P)、209和217(例如H4H6330P)、225和233(例如H4H6332P)、241和249(例如H4H6334P)、257和265(例如H4H6334P2)、273和281(例如H4H6335P)、289和297(例如H4H6337P)、305和313(例如H4H6338P)、321和329(例如H4H6340P)、337和345(例如H4H6343P)、353和361(例如H4H6345P)、369和377(例如H4H6347P)、385和393(例如H4H6353P)、401和409(例如H4H6490N2)及417和425(例如H4H6492N2)。
本发明包括抗-大-ET-1抗体，其具有经修饰的糖基化模式。在一些应用中，可以使用去除不希望的糖基化位点的修饰，或缺乏存在于寡醣链上的岩藻糖部分的抗体，例如增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC 277:26733-26740)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含特异性结合大-ET-1的重组人抗体或其片段，以及可药用载体。在一个相关方面，本发明涉及这样的组成物，该组合物是内皮素-1抑制剂和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，该内皮素-1抑制剂是抗体或其片段。在一个实施方案中，该第二治疗剂是有利地与内皮素-1抑制剂组合的任意物质。可有利地与内皮素-1抑制剂组合的示例性物质非限制性地包括其他抑制内皮素-1和内皮素-1受体之间的相互作用的物质(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)，和/或干扰内皮素上游或下游信号发放的物质。
还在另一个方面，本发明提供用本发明的抗-大-ET-1抗体或抗体的抗原结合部分来抑制内皮素-1活性的方法，其中该治疗方法包括施用治疗有效量的含有本发明的抗体或抗体的抗原结合片段的药物组成物。所治疗的障碍是通过去除、抑制或降低内皮素-1活性而得以改善、减轻、抑制或预防的任意疾病或病症。本发明的抗-大-ET-1抗体或抗体片段可具有阻断内皮素-1和内皮素-1受体(例如ETaR和/或ETbR)之间的相互作用或以其他方式抑制内皮素-1信号发放活性的功能。在本发明的一些实施方案中，通过本发明的方法治疗、预防或减轻的疾病或病症包括肺高压(包括肺动脉高血压(pulmonary arterialhypertension)、与左心疾病相关的肺高压、与肺病相关的肺高压，或由慢性血栓性疾病引起的肺高压或由栓塞性疾病引起的肺高压)、肾病、同种异体移植排斥、糖尿病、癌症(包括***癌、乳腺癌、卵巢癌和黑素瘤)、心力衰竭、动脉粥样硬化、纤维性疾病、眼病和疼痛(包括伤害性疼痛和内脏疼痛)。在本发明的一些实施方案中，待通过本发明的方法治疗、预防或减轻的疼痛包括与炎症、手术后切口、神经病、骨折、烧伤、骨质疏松性骨折、骨癌相关的疼痛；痛风、偏头痛、纤维肌痛、癌症相关疼痛或化疗诱发的疼痛。在本发明的一些实施方案中，待通过本发明的方法治疗、预防或减轻的眼睛疾病或病症包括年龄相关黄斑变性(AMD)、渗出性AMD、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、虹膜新血管形成、青光眼(例如新生血管性青光眼)、青光眼中的手术后纤维化、增生性玻璃体视网膜病(PVR)、脉络膜新血管形成、视盘新血管形成、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、玻璃体新血管形成、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)、血管源性视网膜病、视网膜变性、葡萄膜炎和炎性眼病。在本发明的一些实施方案中，待通过本发明的方法治疗、预防或减轻的纤维性疾病或病症包括肺纤维化、眼纤维化、皮肤纤维化、肾纤维化或肝纤维化。
本发明还包括本发明抗-大-ET-1抗体或抗体的抗原结合部分在制备用于在患者中治疗与内皮素-1活性相关或由内皮素-1活性引起的疾病或障碍的药物中的用途。
其他实施方案将从以下发明详述的检阅变得显而易见。
附图简述
图1：肺动脉截面积(PA CSA)。H4H6327P2以及波生坦(Bosentan)治疗明显减小长期缺氧所引起的PA CSA的降低。相对于基线(即常氧)的PACSA维持反映了较小的肌肉壁增厚(即血管重塑)和/或较小的血管紧张性(即血管收缩)。#表示相对常氧P<0.001。**、***分别表示P<0.01和0.001。
图2：右心室心搏出量(RV CO)。H4H6327P2以比波生坦更高的效力维持RV CO。长期缺氧期间RV CO的减小与肺动脉中的血管阻力升高有关。RV CO维持在经H4H6327P2治疗的动物中比在经波生坦治疗的动物中更高，暗示H4H6327P2可以在降低RV后负荷(即肺动脉阻力)上具有更高的效力。#表示相对常氧P<0.001。*、**、***分别表示P<0.05、0.01和0.001。
图3：右心室至左心室+中膈(RV/(LV+S))。长期缺氧期间的H4H6327P2治疗显著减小RV/(LV+S)重量比的增加。比值相对于基线(即常氧)越大，RV肥大的程度越高，其作为维持血流通过肺动脉所需的补偿机制产生，尽管血管阻力更大。波生坦治疗的重量比类似于载体和同种型对照组，表明暴露于长期缺氧下发生RV肥大。#表示相对常氧P<0.001。*表示P<0.05。
图4：右心室游离壁厚度，收缩期(RVFW，s)。H4H6327P2治疗显著减少长期缺氧中的RVFW增厚。RV的壁增厚(即肥大)发展为维持血流通过肺动脉所需的补偿机制，尽管血管阻力更大。载体和同种型对照组中更大的RV壁厚度(相对于常氧)表示发生RV肥大；与载体治疗相比，波生坦治疗倾向于减少(不显著)RVFW的增厚。#表示相对常氧P<0.001。***表示P<0.001。
图5：远端肺小动脉壁增厚。用H4H6327P2和波生坦治疗显著逆转由长期缺氧引起的远端肺小动脉壁增厚，如更小的壁厚度/血管直径比(反映较少的平滑肌层增生和/或平滑肌细胞招募(即较少血管重塑))所示。血管壁增厚在动物回复至常氧数日后可逆转。表示相对常氧P<0.001。*、***分别表示P<0.05、0.001。[源自图式说明的原文]
图6：肺动脉截面积(PA CSA)。H4H6327P2和波生坦显著逆转由长期缺氧引起的肺动脉截面积(PA CSA)上的降低。相对于基线(即常氧)的PACSA维持反映了较小的肌肉壁增厚(即血管重塑)和/或较小的血管紧张性(即血管收缩)。血管截面积的减小在动物回复至常氧数日后可逆转。表示相对常氧P<0.001。**、***表示P<0.01、0.001。
图7：右心室游离壁(RVFW)增厚。H4H6327P2和波生坦治疗显著逆转长期缺氧中的右心室游离壁(RVFW)增厚。RV的壁增厚(即肥大)发展为维持血流通过肺动脉所需的补偿机制，尽管血管阻力更大。同种型对照组中更大的RV壁厚度(相对于常氧)表示发生RV肥大。心室壁增厚在动物回复至常氧数日后可逆转。表示相对常氧P<0.001。***表示P<0.001。
图8：右心室至左心室+中膈[RV/(LV+S)]重量比。长期缺氧期间的H4H6327P2治疗对右心室至左心室+中膈[RV/(LV+S)]重量比具有很小的影响。比值相对于基线(即常氧)越大，RV肥大的程度越高，其作为维持血流通过肺动脉所需的补偿机制产生，尽管血管阻力更高。H4H6327P2和波生坦治疗的重量比类似于同种型对照组，表明在暴露于长期缺氧下发生RV肥大。表示相对常氧P<0.001。*、***表示P<0.05、0.001。
图9：右心室心搏出量(RV CO)。H4H6327P2倾向于维持右心室心搏出量(RV CO)。长期缺氧期间RV CO的减小与肺动脉中的血管阻力升高有关。相对于经抗体治疗的动物，经波生坦治疗的动物中RV CO维持更高，暗示波生坦可以在降低RV后负荷(即肺动脉阻力)上具有更高的效力。RV CO在动物回复至常氧数日后恢复。表示相对常氧P<0.001。*、**、***表示P<0.05、0.01、0.001。
图10：右心室收缩压。H4H6327P2治疗未降低右心室收缩压(RVSP)。长期缺氧期间RVSP升高与肺动脉中的血管阻力增加有关；此为开启肺动脉瓣所需的压力。波生坦倾向于降低RVSP，而抗-大ET-1抗体治疗则不然。RVSP升高在动物回复至常氧数日时恢复至接近基线。表示相对常氧P<0.001。**、***表示P<0.01、0.001。
图11：痛觉行为。施用抗-大ET-1抗体H4H6327P2的小鼠中痛觉行为减少。将12周龄C57BL/6雄性小鼠分成三个实验组：对照组(n＝6)，接受30mg/kg的非大-ET-1结合同种型对照抗体(同种型)(实心柱)；低剂量组(n＝7)，接受3mg/kg的抗大-ET-1抗体H4H6327P2(灰色柱)；以及高剂量组(n＝7)，接受30mg/kg的H4H6327P2(斜纹交叉柱)。*表示相对对照P<0.05。
发明详述
在描述本发明之前，应理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以改变。还应理解本文中所用术语仅是为了说明具体实施方案的目的，而并非旨在限制，因为本发明的范围将仅通过所附权利要求来限制。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如本文所用，在用于提到具体引用数值时，术语”约”意指该数值可自所引用的数值起改变不超过1％。例如，如本文所用，表述”约100”包括99和101以及其间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管任何类似或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料都可用于实施或测试本发明，但现将描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利公开文献在此以其整体并入作为参考。
定义
本文所用的表述“前-原-内皮素-1”、“前-原-ET-1”、“前-原-EDN-1”等意指具有如SEQ ID NO:433中所示的氨基酸序列的多肽。
本文所用的表述“大-内皮素-1”、“大-EDN-1”、“大-ET-1”等意指具有SEQ ID NO:434之氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO:433的氨基酸53至90相同。
本文所用的表述“内皮素-1”、“ET-1”、“EDN-1”、“小-内皮素-1”、“小-ET-1”、“小-EDN-1”等意指具有SEQ ID NO:435的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO:433的氨基酸53至73相同。(小-ET-1的氨基酸序列就该肽的小鼠形式和人类形式而言是相同的。)
除非指明来自非人物种(例如“小鼠前-原-ET-1”、“小鼠大-ET-1”、“小鼠小-ET-1”、“小鼠内皮素-1”等)，本文所用的所有前述表述(例如“前-原-ET-1”、“大-ET-1”、“小-ET-1”、“内皮素-1”等)指对应分子的人类形式。
本文所用的表述“内皮素-转化酶-1”、“ECE-1”等意指能够在SEQ ID NO:434的Trp-21和Val-22连接(即“Tpr21/Val22连接”)处特异性切割大-ET-1，从而产生小-ET-1及具有SEQ ID NO:434的氨基酸22至38的非活性C端产物的酶。示例性ECE-1是具有SEQ IDNO:436的氨基酸序列的人类酶。
本文所用的术语“抗体”意指特异性结合至特定抗原(例如大-ET-1)或与特定抗原相互作用的任意抗原结合分子或分子复合物，其包含至少一个互补决定区(CDR)。术语“抗体”包括含有4条多肽链(通过二硫键相互连结的2条重(H)链和2条轻(L)链)的免疫球蛋白分子，及其多聚体(例如IgM)。每条重链含有重链可变区(此处缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链含有轻链可变区(此处缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区含有1个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为具有高变异性的区域(命名为互补决定区(CDR))，散布有更为保守的区域(命名为骨架区(FR))。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗-大-ET-1抗体(或其抗原-结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或可以经天然修饰或人工修饰。氨基酸共有序列可以根据两个或多个CDR的并行分析来定义。
本文所用的术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任意天然存在的、可酶促获得的、合成的或经遗传改造的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原而形成复合物。抗体的抗原结合片段可以使用任意适宜的标准技术(如蛋白水解消化或涉及操作和表达编码抗体可变结构域和可选的恒定结构域的DNA的重组遗传工程技术)而衍生自例如完整抗体分子。这种DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得或可以合成。DNA可以测序并以化学方式或通过使用分子生物学技术来操作，例如将一或多个可变结构域和/或恒定结构域排列为适当的构型，或引入产生半胱胺酸残基的密码子，修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小辨识单元(例如分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或限制FR3-CDR3-FR4肽。其他经改造的分子(如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小调节分子免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域)也含括在本文所用的表述“抗原结合片段”之内。
抗体的抗原结合片段通常将含有至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任意大小或氨基酸组成，且通常将含有至少一个邻近一个或多个构架序列或在一个或多个构架序列的框架中的CDR。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可相对于彼此处于任意适宜的排列中。例如，可变区可以是二聚体且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。备选地，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有至少一个共价连结至少一个恒定结构域的可变结构域。可在本发明的抗体的抗原结合片段内找到的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任意构型(包括上文列出的示例性构型中的任一种)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连结或可以通过完整的或部分的铰链区或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，它在单个多肽分子中相邻的可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含上列任意可变结构域和恒定结构域构型彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价结合(例如通过一个或多个二硫键)的同二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
就完整抗体分子而言，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域域能够特异性结合至分开的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规技术，可以改造任意多特异性抗体形式(包括此处公开的示例性双特异性抗体形式)用于本发明的抗体的抗原结合片段的背景中。
本发明的抗体可通过依赖补体的细胞毒性(CDC)或依赖抗体的细胞毒性(ADCC)来发挥作用。“依赖补体的细胞毒性”(CDC)指在补体存在下通过本发明的抗体裂解表达抗原的细胞。“依赖抗体的细胞毒性”(ADCC)指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，从而导致靶细胞的裂解。CDC和ADCC可用本领域公知和可用的测定来测量。(参见，例如U.S.5,500,362和5,821,337及Clynes等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656)。抗体的恒定区在抗体固定补体并介导细胞依赖性细胞毒性的能力中很重要。因此，可根据是否希望抗体介导细胞毒性来选择抗体同种型。
本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定位突变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，尤其是在CDR3中。但是，本文所用的术语“人抗体”并非旨在包括已将衍生自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列移植至人构架序列上的抗体。
本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)、分离自重组的组合人抗体文库的抗体(下文进一步描述)、分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体(参见，例如Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或通过任意其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的手段制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，这类重组人抗体经体外诱变(或在使用人Ig序列的转基因动物时经体内体细胞诱变)，因此该重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，虽然其衍生自人种系VH和VL序列或与人种系VH和VL序列相关，但可以并非在体内天然存在于人抗体种系库内。
人抗体可以以两种与铰合部异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不是经由链间二硫键连结，而是形成由共价偶联的轻链和重链组成的约75-80kDa的分子(半抗体)。这些形式即使在亲和纯化之后也极其难以分开。
第二种形式在多种完整IgG同种型中的出现频率是由于(但不限于)与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。在人IgG4铰合部的铰链区中，单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现显著降低至一般用人IgG1铰合部观察到的水平(Angal等(1993)Mol Immunol 30:105-108)。本发明涵盖具有一个或多个铰链CH2或CH3区中的突变的抗体，其可以是例如产生中所希望的，以改善所希望的抗体形式的产率。
本文所用的“分离的抗体”意指已鉴定并从其天然环境的至少一种成分分开和/或回收的抗体。例如，为了本发明的目的，已从抗体在其中天然存在或天然产生的生物或组织或细胞的至少一种成分分开或回收的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离抗体是已进行了至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
术语“特异性结合”等意指抗体或其抗原结合片段与抗原在生理条件下形成相对稳定的复合物。用于测定抗体是否特异性结合抗原的方法为本领域公知，且包括例如平衡透析、表面等离振子共振等。例如，在本发明的背景中所用的“特异性结合”人类大-ET-1的抗体包括以低于约1000nM、低于约500nM、低于约300nM、低于约200nM、低于约100nM、低于约90nM、低于约80nM、低于约70nM、低于约60nM、低于约50nM、低于约40nM、低于约30nM、低于约20nM、低于约10nM、低于约5nM、低于约4nM、低于约3nM、低于约2nM、低于约1nM或低于约0.5nM的KD结合人类大-ET-1或其部分的抗体，如在表面等离振子共振测定中所测量(参见，例如本文的实施例3)。但是，特异性结合人类大-ET-1的分离的抗体可以对其他抗原(如来自其他物种(非人类)的内皮素分子)具有交叉反应性。
本文所用的“中和”或“阻断”抗体旨在指这样的抗体，其与大-ET-1的结合：(i)抑制或干扰内皮素转化酶(例如ECE-1)对大-ET-1的切割，和/或(ii)导致内皮素-1的至少一种生物功能的抑制。由大-ET-1中和或阻断抗体引起的抑制无需是完全的，只要其可用适当的测定检测到。用于检测大-ET-1切割抑制的示例性测定在本文中其他地方描述。
与抗体所衍生自的对应的种系序列相比，本文公开的抗-大-ET-1抗体可在重链和轻链可变结构域的构架区和/或CDR区中含有一个或多个氨基酸取代、***和/或缺失。这类突变可通过将本文公开的氨基酸序列与可得自例如公开的抗体序列数据库的种系序列相比较来容易地确认。本发明包括抗体及其抗原结合片段，其衍生自本文公开的任意氨基酸序列，其中将一个或多个构架区和/或CDR区中的一个或多个氨基酸突变为该抗体所衍生自的种系序列的对应残基，或另一人种系序列的对应残基，或对应的种系残基的保守氨基酸取代(这类序列改变在本文中统称为“种系突变”)。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域普通技术人员可容易地产生许多含有一个或多个个别种系突变或其组合的抗体及抗原结合片段。在某些实施方案中，将VH和/或VL结构域内的所有构架残基和/或CDR残基回复突变为见于该抗体所衍生自的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅将某些残基回复突变为原始种系序列，例如仅有见于FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸内的突变残基，或仅有见于CDR1、CDR2或CDR3内的突变残基。在其他实施方案中，将构架残基和/或CDR残基中的一个或多个突变为不同种系序列(即不同于抗体最初所衍生自的种系序列的种系序列)的对应残基。此外，本发明的抗体可含有两个或更多个构架区和/或CDR区内的种系突变的任意组合，例如将其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而将不同于原始种系序列的某些其他残基维持原状或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得，即可针对一种或多种希望的特性(如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物特性(视情况而定)、降低的免疫原性等)容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段。以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段包含在本发明之内。
本发明还包括含有本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体的抗-大-ET-1抗体，该变体具有一个或多个保守取代。例如，本发明包括具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗-大-ET-1抗体，该HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。
本文所用的术语“表面等离振子共振”指允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度变化来分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIAcoreTM***(Biacore LifeScience division of GE Healthcare,Piscataway,N.J.)。
本文所用的术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”指与抗体分子可变区内称为互补位的特异性抗原结合部位相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可结合至抗原上的不同区域，且可以具有不同的生物效用。表位可以是构象表位或线性表位。构象表位可由来自线性多肽链不同区段的在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包括抗原上的醣类、磷酰基或磺酰基的部分。
在提到核酸或其片段时，术语“实质同一性”或“基本相同的”表示，如通过任意公知的序列同一性算法(如FASTA、BLAST或Gap，如下文所讨论)测量，在有适当核苷酸***或缺失的情况下与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，在至少约95％、更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质同一性的核酸分子可编码具有与该参考核酸分子所编码的多肽相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
在应用于多肽时，术语“实质相似性”或“基本相似的”意指两个肽序列在最佳比对(如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT)时具有至少95％序列同一性，甚至更优选至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是用具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链的另一氨基酸残基取代氨基酸残基的取代。一般而言，保守氨基酸取代将基本上不改变蛋白质的官能性质。在两个或多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，百分比序列同一性或相似度可以向上调整来校正取代的保守性质。用于进行此调整的方法为本领域技术人员公知。参见，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，其在此引入作为参考。具有相似化学性质的侧链的氨基酸分组的实例包括：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守取代可以是在Gonnet等(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数-相似矩阵中具有正值的任意改变。“中度保守”取代是在PAM250对数-相似矩阵中具有非负值的任意改变。
多肽的序列相似性(也称为序列同一性)通常用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件用赋予多种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性的测量来配对相似的序列。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit的程序，它们可以以默认参数使用来确定密切相关的多肽(如来自不同物种的生物的同源多肽)之间或野生型蛋白质和其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG第6.1版。多肽序列也可以用使用默认或推荐参数的FASTA(GCG第6.1版中的程序)来比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(2000)Methods MolBiol132:185-219)。在将本发明的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库比较时，另一优选的算法是计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见，例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410以及Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-402，各自在此引入作为参考。
抗体的生物学特性
本发明的抗体特异性结合人类大-ET-1(SEQ ID NO:434)但不结合人类小-ET-1(SEQ ID NO:435)。定量或定性测量抗体与抗原之间的相互作用的任意测定形式都可用来确定抗体是否特异性结合或不结合人类大-ET-1和/或人类小-ET-1。例如，表面等离振子共振测定(如本文实施例3中所说明)可用来确定特定测试抗体是否特异性结合或不结合人类大-ET-1和/或人类小-ET-1。为了本公开的目的，将在表面等离振子共振测定中测试与小-ET-1的结合时显示大于约1.0E-06M(即>1000nM)的KD值或不显示任何可检测到的与小-ET-1的结合的抗体视为“不结合人类小-ET-1”的抗体。不结合人类小-ET-1的本发明某些示例性抗体，如本文所定义的表述，在本文实施例3中所述的表面等离振子共振测定或类似测定中测试与人类大-ET-1的结合时，证明以小于约1.0E-07M的KD值(例如1.0E-08M、1.0E-09M、1.0E-10M、1.0E-11M、1.0E-12M或更小)特异性结合人类大-ET-1。
本发明的某些示例性抗体的另一特性是阻断内皮素-转化酶-1(ECE-1)对大-ET-1(SEQ ID NO:434)的切割的能力。ECE-1切割大-ET-1产生两个片段：小-ET-1(对应于SEQ IDNO:434的N端21个氨基酸)，以及非活性C端产物(对应于SEQ ID NO:434的C端17个氨基酸)。因此，在将大-ET-1与ECE-1混合时，具有生物活性的小-ET-1的出现和/或非活性C端肽的出现可作为ECE-1切割大-ET-1的程度的指标。
检测ECE-1对大-ET-1的切割的任意测定形式都可用来确定抗体是否“阻断切割”，如本文所用的表述。可用来确定抗体是否阻断ECE-1对大-ET-1的切割的非限制性、示例性测定形式显示于本文实施例4中。在此实施例中，用仅响应内皮素-1(即小-ET-1，大-ET-1的切割产物)的存在而产生报道信号的改造细胞系间接检测大-ET-1的切割。具体而言，此测定形式使用表达人内皮素受体A型(ETaR)与荧光素酶报道元件的细胞系。首先建立切割分应，其中将抗体加至大-ET-1，接着加入ECE-1，然后使反应在有助于大-ET-1的酶促切割的条件(即在37℃下过夜)下孵育适当的时间量。然后将切割反应加至表达ETaR的报道细胞系，并测量报道活性的量(如果有的话)。阻断抗体将抑制大-ET-1的切割，从而抑制小-ET-1的形成。因此，包括阻断抗体的反应将在添加至报道细胞系时产生降低的报道活性或无报道活性。通过改变用于此测定形式的抗体的量，可计算抑制50％的大-ET-1切割所需的抗体量并表示为IC50值(参见，例如实施例4，表4-5)。根据本发明，如果在上述测定形式或基本相似的测定中测试时抗体显示小于约1.0E-08M的IC50(例如约9.0E-09M、约8.5E-09M、约8.0E-09M、约7.5E-09M、约7.0E-09M、约6.5E-09M、约6.0E-09M、约5.5E-09M、约5.0E-09M、约4.5E-09M、约4.0E-09M、约3.5E-09M、约3.0E-09M、约2.5E-09M、约2.0E-09M、约1.5E-09M、约1.0E-09M、约9.0E-10M、约8.5E-10M、约8.0E-10M、约7.5E-10M、约7.0E-10M、约6.5E-10M、约6.0E-10M、约5.5E-10M、约5.0E-10M、约4.5E-10M、约4.0E-10M、约3.5E-10M、3.0E-10M、约2.5E-10M、约2.0E-10M、约1.5E-10M、约1.0E-10M或更小的IC50)，则抗-大-ET-1抗体“阻断ECE-1对大-ET-1的切割”。
可用于确定抗体是否阻断ECE-1对大-ET-1的切割的其他的或备选的示例性测定形式显示于本文实施例5中。在此测定形式中，建立切割反应，其中将抗体加至大-ET-1，接着加入ECE-1。使反应在有助于大-ET-1的酶促切割的条件(即在37℃下)下孵育，并在起始反应后的多种时间点(例如0、15、30和60分)采集整分试样。对整分试样进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪分析来确定切割产物的存在或缺乏。ECE-1切割大-ET-1产生具有特征分子量的肽产物。例如，ECE-1切割人类大-ET-1产生具有2475Da的分子量的小-ET-1，以及具有1809Da的分子量的非活性C端肽。通过MALDI-TOF出现这些片段中的任一个或二者指示ECE-1在此测定中对大-ET-1的切割。但是，如果在将大-ET-1与抗-大-ET-1抗体组合后，加入ECE-1不产生切割产物之一或二者(或与阴性对照抗体相比产生实质较少的切割产物)，则得出结论，该抗体“阻断ECE-1对大-ET-1的切割”，如本文所用的表述。
本发明还包括抑制或降低内皮素-1介导的动脉压增加的抗体。可用来评估内皮素介导的动脉压增加的示例性动物模型在本文实施例6中阐述。在此实施例中，对小鼠施用抗-大-ET-1抗体，接着施用人类大-ET-1肽。在大-ET-1攻击后实时测量动脉压的变化。大-ET-1在体内切割为生物活性小-ET-1反应为平均动脉血压的增加。在此测定形式中施用阻断抗-大-ET-1抗体时，与施用同种型对照抗体相比，平均动脉血压不增加或增加至较少的程度。
本发明还包括在多种动物疼痛模型中抑制或减少疼痛反应的抗体。用于表征本发明的抗-大-ET-1抗体的示例性动物疼痛模型在本文实施例9中阐述(例如痛觉行为减少)。本发明还包括减轻或抑制内脏疼痛(例如小鼠模型中对酸诱发的内脏疼痛的反应)的抗-大-ET-1抗体。具体而言，本发明包括在动物模型中按约1至10mg/kg的剂量施用时显示内脏疼痛反应(例如，响应腹膜内注射0.6％乙酸的腹缢)的至少20％抑制的抗-大-ET-1抗体。在某些情况下，在动物疼痛模型中测试时，施用本发明的抗体引起的疼痛反应的百分比抑制可以高达约30％、35％、40％、45％、50％或更高。可以用来表征本发明的抗-大-ET-1抗体的其他动物疼痛模型包括，例如，机械伤害疼痛反应模型、肌肉疼痛模型和本领域可得的其他类似的动物模型。因此，本发明包括能够减轻或抑制对有害机械刺激的疼痛反应和/或酸性盐溶液或角叉藻聚糖诱发的肌肉痛觉过敏的抗-大-ET-1抗体。
表位定位和相关技术
本发明包括与定位在大-ET-1的ECE-1切割位点处或邻近处的一个或多个氨基酸相互作用的抗体。ECE-1在大-ET-1(SEQ ID NO:434)的Trp-21和Val-22连接处切割大-ET-1。因此，本发明包括与定位在大-ET-1(SEQ ID NO:434)的Trp-21/Val-22连接处的10个氨基酸内的一个或多个氨基酸相互作用的抗-大-ET-1抗体。抗体结合的表位可由定位在大-ET-1的ECE-1切割位点处或邻近处的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的单一连续序列组成。备选地，表位可由定位在大-ET-1的ECE-1切割位点处或邻近处(例如，约10个氨基酸内)的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。
可用本领域普通技术人员已知的多种技术来确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括，例如，如Antibodies,Harlow和Lane(ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)所述的常规交叉-阻断测定、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)及肽切割分析。此外，可以利用诸如表位切除、表位抽出以及抗原的化学修饰的方法(Tomer,2000,ProteinScience 9:487-496)。可用于鉴定多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一种方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换法涉及氘标记目的蛋白质，然后使抗体与氘标记的蛋白质结合。然后，将蛋白质/抗体复合物转移至水中以允许氢-氘交换在除受抗体保护的残基(其维持氘标记)以外的所有残基处发生。在抗体解离后，对靶蛋白质进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，其对应于抗体相互作用的具体氨基酸。参见，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本发明进一步包括结合至与本文所述的具体示例性抗体(例如，H2M6486N、H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H2M6741N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6323P、H4H6327P2、H4H6328P、H4H6329P、H4H6330P、H4H6332P、H4H6334P、H4H6334P2、H4H6335P、H4H6337P、H4H6338P、H4H6340P、H4H6343P、H4H6345P、H4H6347P、H4H6353P、H4H6490N2、H4H6492N2等)中的任一个相同的表位的抗-大-ET-1抗体。同样，本发明还包括与本文所述的具体示例性抗体(例如，H2M6486N、H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H2M6741N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6323P、H4H6327P2、H4H6328P、H4H6329P、H4H6330P、H4H6332P、H4H6334P、H4H6334P2、H4H6335P、H4H6337P、H4H6338P、H4H6340P、H4H6343P、H4H6345P、H4H6347P、H4H6353P、H4H6490N2、H4H6492N2等)中的任一个竞争结合至大-ET-1的抗-大-ET-1抗体。
可通过使用本领域已知的常规技术来容易地确定抗体是否与参考抗-大-ET-1抗体结合相同的表位，或与参考抗-大-ET-1抗体竞争结合相同表位。例如，为了确定测试抗体是否结合与本发明的参考抗-大-ET-1抗体相同的表位，使该参考抗体在饱合条件下与大-ET-1蛋白或肽结合。然后，评估测试抗体结合大-ET-1分子的能力。如果测试抗体能够在参考抗-大-ET-1抗体饱合结合之后结合大-ET-1，则可以得出结论，该测试抗体结合与参考抗-大-ET-1抗体不同的表位。另一方面，如果测试抗体不能在参考抗-大-ET-1抗体饱合结合之后结合大-ET-1分子，则该测试抗体可以结合与本发明的参考抗-大-ET-1抗体所结合的表位相同的表位。然后可以进行其他常规实验(例如肽突变和结合分析)来确认所观察到的测试抗体的结合的缺乏是否是由于结合与参考抗体相同的表位，或所观察到的结合的缺乏是否是由空间阻断(或另一现象)造成。这类实验可用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域可得的任意其他定量或定性抗体结合测定来进行。根据本发明的某些实施方案，如果例如在竞争性结合测定中测量，一种过量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗体抑制另一种抗体的结合达至少50％、但优选75％、90％或甚至99％，则两种抗体结合相同(或重叠)的表位(参见，例如Junghans等,(1990)Cancer Res.50:1495-1502)。备选地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变也减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合相同的表位。如果仅有一部份减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠的表位”。
为了确定抗体是否与参考抗-大-ET-1抗体竞争结合，以两个方向来进行上述结合方法学：在第一个方向，使参考抗体在饱和条件下结合大-ET-1分子，然后评估测试抗体与大-ET-1分子的结合。在第二个方向，使测试抗体在饱和条件下结合大-ET-1分子，然后评估参考抗体与大-ET-1分子的结合。如果在两个方向上，仅有第一(饱和)抗体能够结合大-ET-1分子，则得出结论，测试抗体与参考抗体竞争结合大-ET-1。如本领域普通技术人员将理解，与参考抗体竞争结合的抗体并非必然与参考抗体结合相同的表位，但可以通过结合重叠表位或邻近表位来在空间上阻断参考抗体的结合。
人类抗体的制备
用于产生单克隆抗体(包括全人单克隆抗体)的方法为本领域已知。任意这类已知方法都可以在本发明的背景中用来制备特异性结合人类大-ET-1的人抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术或任意其他用于产生单克隆抗体的已知方法，首先分离出具有人可变区和小鼠恒定区的抗大-ET-1的高亲和力嵌合抗体。如同下文实验章节中，针对包括亲和力、选择性、表位等的希望的特征表征并选择抗体。用希望的人恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明的全人抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管所选择的恒定区可以根据具体的用途而变，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征保留在可变区中。
生物等效性
本发明的抗-大-ET-1抗体和抗体片段涵盖具有不同于所述抗体的氨基酸序列但仍保留结合人类大-ET-1的能力的氨基酸序列的蛋白质。在与亲代序列相比时，这类变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但仍显示与所述抗体基本等效的生物活性。同样，本发明的抗-大-ET-1抗体编码DNA序列涵盖这样的序列，在与所公开的序列相比时，其包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代，但编码与本发明的抗-大-ET-1抗体或抗体片段基本上生物等效的抗-大-ET-1抗体或抗体片段。上文讨论了这类变体氨基酸序列和DNA序列的实例。
例如，如果两种抗原结合蛋白或抗体是在以相同的摩尔剂量在相似的实验条件下施用时的吸收速率和程度未显示显著差异(不论是单剂量或多剂量)的药学等效物或药学代用品，则认为它们是生物等效的。如果一些抗体在它们的吸收程度上等同但在它们的吸收速率不等同，则认为它们是等效物或药学代用品，但不视为生物等效，因为吸收速率上的这类差异是有意的，并反映在标签中，对在例如长期使用上维持有效的身体药物浓度不是必要的，并且就所研究的具体药物产品而言视为在医学上不显著。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在临床上就其安全性、纯度和效力而言并无有意义的差异，则它们是生物等效的。
在一个实施方案中，如果患者在参考产品和生物产品之间可以转换一次或多次而没有预期提高的不良反应的风险(包括与持续治疗而没有这样的转换的情况相比，在临床上显著的免疫原性变化，或减低有效性)，则它们是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白就条件或使用条件而言都通过共同的机制或作用机制发挥作用来达到这种机制已知的程度，则它们是生物等效的。
生物等效性可以通过体内和体外方法来证明。生物等效性测量包括，例如(a)人类或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量抗体或其代谢物在血液、血浆、血清或其他生物液中的浓度作为时间的函数；(b)已用人类体内生物利用率数据校正并且可合理预测的体外测试；(c)人类或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理学效应作为时间的函数；以及(d)在建立抗体的安全性、效力或生物利用率或生物等效性的充分控制的临床试验中。
本发明的抗-大-ET-1抗体的生物等效变体可以通过例如进行多种残基或序列取代，或缺失并非生物活性所需的末端或内部残基或序列来构建。例如，可以缺失或用其他氨基酸取代并非生物活性所必要的半胱氨酸残基来防止在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫键。在其他背景中，生物等效的抗体可包括抗-大-ET-1抗体变体，其含有修饰抗体的糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或移除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施方案，抗-大-ET-1抗体结合人类大-ET-1而不结合来自其他物种的大-ET-1。本发明还包括结合人类大-ET-1和来自一个或多个非人物种的大-ET-1的抗-大-ET-1抗体。例如，本发明的抗-大-ET-1抗体可以结合人类大-ET-1并且视情况可以结合或不结合小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、狨猿、恒河猴或黑猩猩大-ET-1中的一种或多种。
免疫缀合物
本发明涵盖缀合至治疗部分(如细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素)的抗-大-ET-1单克隆抗体(“免疫缀合物”)。细胞毒性剂包括对细胞有害的任意药物。用于形成免疫缀合物的适当细胞毒性剂和化学治疗剂的实例为本领域已知(参见例如WO05/103081)。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位特异或者可以含有对超过一种靶多肽特异的抗原结合结构域。参见例如Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗-大-ET-1抗体可以与另一功能性分子(例如另一肽或蛋白质)连接或共表达。例如，抗体或其片段可以与一个或多个其他分子实体(如另一抗体或抗体片段)功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂对人类大-ET-1或其片段特异，而免疫球蛋白的另一条臂对第二治疗靶标特异或缀合至治疗部分。
可以用于本发明的背景中的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中该第一和第二Ig CH3结构域因至少一个氨基酸而彼此不同，且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，该至少一个氨基酸差异减少了该双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，该第一Ig CH3结构域结合蛋白A而该第二Ig CH3结构域含有一个减少或消除蛋白A结合的突变，如H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号为H435R)。该第二CH3可进一步包含Y96F修饰(按照IMGT；按照EU为Y436F)。可见于该第二CH 3中的其他修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT；按照EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；按照EU为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT；按照EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体形式的变异在本发明范围内是可设想的。
治疗制剂和施用
本发明提供包含本发明的抗-大-ET-1抗体或其抗原结合片段的药物组成物。本发明的药物组合物可以用适当的载体、赋形剂和其他提供改善的转移、递送、耐受性等的物质配制。许多适当的制剂可以在所有药物化学家已知的配方集中找到：Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括，例如粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳化卡波蜡(具有多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶以及含有卡波蜡的半固体混合物。还参见Powell等”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm SciTechnol 52:238-311。
对患者施用的抗体的剂量可以取决于患者的年龄和身材、靶疾病、病症、给药途径等而变。优选的剂量通常根据体重或体表面积来计算。在本发明的抗体用于在成年患者中治疗与内皮素-1活性相关的病症或疾病时，通常按约0.01至约20mg/kg体重、更优选约0.02至约7、约0.03至约5、或约0.05至3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明的抗体是有利的。取决于病症的严重性，可以调整治疗的频率和持续时间。用于施用抗-大-ET-1抗体的有效剂量和时间表可按经验来确定；例如，可通过定期评估来监测患者进展，并相应地调整剂量。此外，剂量的物种间标度可以用本领域公知的方法来进行(例如Mordenti等,1991,Pharmaceut.Res.5:1351-1359)。
多种递送***是已知的，并可用于施用本发明的药物组合物，例如封装在脂质体内、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见，例如Wu等,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括，但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外以及口服途径。组合物可以通过任意方便的途径来施用，例如通过输注或快速浓注、通过透过上皮或黏膜内衬(例如口腔黏膜、直肠和小肠黏膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。
本发明的药物组合物可以用标准注射针和注射器来皮下或静脉内施用。此外，就皮下递送而言，笔型递送装置很容易应用于递送本发明的药物组合物。这种笔型递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔型递送装置通常使用含有药物组合物的可替换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物都已施用且药筒变空，即可容易地将空药筒丢弃并更换成含有药物组合物的新药筒。这样就可以重复使用笔型递送装置。就一次性笔型递送装置而言，不存在可更换的药筒。相反，一次性笔型递送装置在装置的贮器内预先填充了药物组合物供。一旦贮器不含药物组合物，即可将整个装置丢弃。
许多可重复使用的笔型以及自动注射递送装置在皮下递送本发明的药物组合物中具有应用。实例包括，但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,英国)、DISETRONICTMpen(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TMpen、HUMALOGTMpen、HUMALIN 70/30TMpen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,丹麦)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,丹麦)、BDTMpen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,德国)，仅举几个为例。在皮下递送本发明的药物组合物中具有应用的一次性笔型递送装置的实例包括，但不限于SOLOSTARTMpen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(NovoNordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,德国)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATMPen(AbbottLabs,Abbott Park IL)，仅举几个为例。
在某些情况下，药物组合物可以在受控释放***中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，上文；Sefton(1987)Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-240)。在另一实施方案中，可使用聚合材料；参见MedicalApplications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。还在另一实施方案中，受控释放***可以放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身性剂量的一部分(参见，例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,上文,第2卷,115-138页中)。其他受控释放***在Langer,(1990)Science 249:1527-1533的综述中讨论。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、点滴输注等的剂型。这类可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可以例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在通常用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，例如有生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，其可与适当的助溶剂(如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化菎麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，利用例如芝麻油、大豆油等，其可与助溶剂(如苯甲酸苄酯、苄醇等)组合使用。由此制备的注射剂优选填充于适当的安瓿中。
有利地，将上述用于口服或胃肠外使用的药物组合物制备为呈适于活性成分的剂量的单位剂量的剂型。这类呈单位剂量的剂型包括，例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。在1个单位剂量中，所含前述抗体的量通常为每剂型约5至约500mg；尤其是呈注射剂的形式，对于其他剂型，优选按约5至约100mg和约10至约250mg包含前述抗体。
抗体的治疗用途
本发明的抗体尤其用于治疗、预防和/或改善与内皮素-1活性相关或由内皮素-1活性介导，或可通过阻断大-ET-1切割为小-ET-1来治疗的任意疾病或障碍。本发明的抗体和抗原结合片段可用于治疗，例如纤维性疾病[例如纤维化(例如肺纤维化)]、炎性病症、肥大(例如心肌和/或血管***的肥大)、血管疾病(例如表征为血管收缩的疾病和障碍)、眼病、癌症(例如肿瘤生长抑制)和疼痛。可用本发明的抗-大-ET-1抗体治疗的具体的示例性疾病和障碍包括，例如肺高压、动脉高血压、肾病、同种异体移植排斥、糖尿病、胰岛素抗性、心力衰竭、动脉粥样硬化、中风、心律不整、哮喘、镰形细胞贫血、脑血管痉挛、糖尿病性肾病、硬皮病、COPD、痛觉疼痛和内脏疼痛(例如源自炎性肠病/肠易激综合症、间质性膀胱炎、胰腺炎、子宫内膜异位、慢性盆腔疼痛综合症等的疼痛)。可以用本发明的抗体和抗原结合片段治疗、预防或改善的其他疼痛相关疾病和障碍包括与炎症(例如炎性肌痛)、多肌炎、手术后切口(例如手术后疼痛)、神经病(例如糖尿病性神经病)、坐骨神经痛、疱疹后神经痛、肌筋膜疼痛综合症(例如慢性肌筋膜疼痛)、关节炎、镰形细胞、肠神经缺血、跛行疼痛、骨折、烧伤、骨质疏松性骨折、痛风、偏头痛、纤维肌痛、复合性区域性疼痛综合症和急性疱疹性疼痛相关的疼痛。
可用本发明的抗-大-ET-1抗体治疗的肺高压子类包括，例如肺动脉高压、与左心疾病相关的肺高压、与肺病相关的肺高压，由慢性血栓性疾病引起的肺高压或由栓塞性疾病引起的肺高压。
可通过施用本发明的抗-大-ET-1抗体治疗的示例性眼病包括年龄相关黄斑变性(例如“湿性”AMD)、渗出性AMD、糖尿病性视网膜病变(例如增生性糖尿病性视网膜病变)、视网膜静脉阻塞性疾病(视网膜中央静脉阻塞(CRVO))、虹膜新血管形成、新生血管性青光眼、青光眼中的手术后纤维化、增生性玻璃体视网膜病(PVR)、脉络膜新血管形成、视盘新血管形成、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、玻璃体新血管形成、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)、血管源性视网膜病、视网膜变性、葡萄膜炎和炎性眼病。例如，施用本发明的抗大-ET-1抗体可以通过阻断ET-1引起的血管收缩以及ET-1对星形细胞(例如轴突丢失)和视网膜神经节细胞(例如凋亡)的作用来预防和/或治疗与青光眼相关的神经变性作用和视神经损伤。
可通过施用本发明的抗-大-ET-1抗体治疗的其他示例性纤维性疾病包括特发性肺纤维化、博来霉素诱发的肺纤维化、石棉诱发的肺纤维化、闭塞性细支气管综合症、慢性哮喘、与急性肺损伤和急性呼吸窘迫相关的纤维化(例如细菌性肺炎诱发的纤维化、创伤诱发的纤维化、病毒性肺炎诱发的纤维化、呼吸机诱发的纤维化、非肺部脓毒病诱发的纤维化和吸尘诱发的纤维化)、矽肺、辐射诱发的纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、眼纤维化、皮肤纤维化(例如硬皮病)、肝纤维化(例如肝纤维化、酒精诱发的肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胆管损伤、原发性胆汁性肝硬化、感染或病毒诱发的肝纤维化[例如慢性HCV感染]、自身免疫性肝炎)、肾纤维化、心脏纤维化、动脉粥样硬化、模具再狭窄和骨髓纤维化。
本发明的抗-大-ET-1抗体和抗原结合片段还用于治疗癌症(例如***癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肾癌、结肠直肠癌、***、子宫内膜癌、膀胱癌、卡波西肉瘤和神经胶质瘤)、抑制肿瘤生长、促进肿瘤消退、抑制转移和/或抑制病理性血管发生(例如与肿瘤生长相关的血管发生)。因此，本发明包括通过对需要这种治疗的患者施用本文所述的抗-大-ET-1抗体来治疗癌症、抑制肿瘤生长、促进肿瘤消退、抑制转移和/或抑制病理性血管发生(例如与肿瘤生长相关的血管发生)的方法。例如，本发明的抗体和抗原结合片段可以用来治疗例如出现在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附属物、***、脾、免疫***、造血细胞和骨髓、肝和尿道及特殊感觉器官(如眼)中的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本发明的抗体和抗原结合片段用来治疗以下癌症中的一种或多种：肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌(例如脑、口腔、口咽、鼻咽、舌、鼻腔、鼻旁窦、喉、嘴唇等的癌症)、***癌、泌尿膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、骨软骨瘤、结肠直肠癌、胃癌(例如伴随MET扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成视网膜细胞瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、***瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤。
组合疗法
本发明包括治疗性施用方案，其包含将本发明的抗-大-ET-1抗体与至少一种其他治疗活性成分组合施用。这类其他治疗活性成分的非限制性实例包括其他内皮素-1拮抗剂(例如抗-内皮素-1抗体、不同的抗-大-ET-1抗体或内皮素-1的小分子抑制剂)、内皮素-A受体拮抗剂、内皮素-B受体拮抗剂、非选择性内皮素受体拮抗剂、前列环素、前列环素类似物、非***素类磷酸肌醇(前列环素)受体激动剂、磷酸二酯酶5型抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激物、内皮素-转化酶-1(ECE-1)抑制剂、中性溶酶抑制剂、血管紧张肽-II受体激动剂和NF-κB抑制剂。可与本发明的抗-大-ET-1抗体组合施用的示例性药物包括，例如内皮素受体拮抗剂，如波生坦(Bosentan)(Roche)、安立生坦(Ambrisentan)(Abbott)、西他生坦(Sitaxentan)(Encysive)、克拉生坦(Clazosentan)(Chugai)、达洛生坦(Darusentan)(Abbott)、ZD4054(AstraZeneca)、玛西替坦(Macitentan)(Actelion)、阿伏生坦(Avosentan)(Roche)、达格鲁曲(Daglutril)(Solvay)、PS433540(Bristol-MyersSquibb)、S0139(Shionogi)、SLV334(Solvay)、TBC3711(Encysive)、泛多生坦(Fandosentan)(Pfizer)、PABSA(Shionogi)、YM598(Astellas)和YM62899(Astellas)；磷酸二酯酶5型抑制剂，如Sildenafil(Pfizer)和他达那非(Tadalafil)(Lilly ICOS)；可溶性鸟氨酸环化酶刺激物，如Riociguat(Bayer)；及前列环素、***素类和前列环素受体激动剂，如伊洛前列素(iloprost)(Actelion)、treprostinil(United Therapeutics)、贝前列素(beraprost)(United Therapeutics)、依前列醇(epoprostenol)(Actelion)和selexipag(Actelion)。
本发明的抗-大-ET-1抗体可以与以下配置在一起和/或与以下组合施用：例如，VEGF拮抗剂，例如“VEGF陷阱”，如aflibercept或US 7,087,411中所示的其他抑制VEGF的融合蛋白质、抗-VEGF抗体或其抗原结合片段(例如贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或pazopanib)或抗-VEGF受体抗体。抗-大-ET-1抗体还可以与抗-PDGFR-β抗体(例如2A1E2[US 7,060,271]；HuM4Ts.22[US 5,882,644]；或1B3或2C5[US 7,740,850])、抗PDGF配体拮抗剂(例如抗-PDGF-BB抗体、抗-PDGF-DD抗体、抗-PDGF-CC抗体、抗-PDGF-AB抗体，或其他PDGF配体拮抗剂，如抗PDGF配体的适体、反义分子、核酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段)组合。在其他实施方案中，本发明的抗-大-ET-1抗体可以与以下配制在一起和/或与以下组合施用：EGFR拮抗剂(例如抗-EGFR抗体[例如西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制剂[例如吉非替尼(gefitinib)或埃罗替尼(erlotinib)])、诸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的另一EGFR家族成员的拮抗剂(例如抗-ErbB2、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗体，或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、对EGFRvIII特异的拮抗剂(例如特异性结合EGFRvIII的抗体)、cMET拮抗剂(例如抗-cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如抗-IGF1R抗体)或B-raf抑制剂(例如vemurafenib、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)。在某些情况下，本发明的抗-大-ET-1抗体与以下组合、配制在一起和/或与以下组合施用：PDGFR-α抑制剂(例如抗-PDGFR-α抗体)、DLL4拮抗剂(例如公开于US2009/0142354中的抗-DLL4抗体，如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如公开于US 2011/0027286中的抗-Ang2抗体，如REGN421)等。本发明还包括治疗组合，其包含本文提到的任意抗-大-ET-1抗体以及Ang2、Tie2、VEGF、DLL4、EGFR中的一种或多种或任意前述细胞因子的抑制剂，其中该抑制剂是适体、反义分子、核酶、siRNA、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他经改造的分子，如双抗体、三抗体、四抗体、微抗体和最小识别单元)。可以有益地与本发明的抗-大-ET-1抗体组合施用的其他药物包括细胞因子抑制剂，包括结合诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18的细胞因子或其各自的受体的小分子细胞因子抑制剂和抗体。
本发明的抗-大-ET-1抗体还可以与抗病毒药、抗生素、镇痛药、他汀类药物、利尿药、抗凝剂、地高辛、糖皮质激素、类固醇、氧、抗氧化剂、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAID组合施用和/或配制在一起。本发明的抗-大-ET-1抗体还可以作为还包括放射治疗和/或常规化疗的治疗方案的部分施用(例如在治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的背景中)。
任意前述其他治疗活性成分可以与本发明的任意抗-大-ET-1抗体组合施用来治疗施用抗-大-ET-1抗体有益的任意疾病或障碍，包括例如本文提到的眼病、纤维性疾病、血管疾病和/或癌症中的任一种。例如，在治疗眼病(例如湿性AMD、糖尿病性视网膜病变、CRVO或本文所述的任意其他眼病)的背景中，本发明的抗-大-ET-1抗体可以与以下配制在一起和/或与以下组合施用：VEGF拮抗剂，例如“VEGF陷阱”，如aflibercept或US7,087,411中所示的其他抑制VEGF的融合蛋白质，或抗-VEGF抗体或其抗原结合片段(例如贝伐单抗、兰尼单抗)。
其他治疗活性成分可以在施用本发明的抗-大-ET-1抗体之前、与施用本发明的抗-大-ET-1抗体同时或在施用本发明的抗-大-ET-1抗体之后施用；(为了本公开的目的，将这类施用方案视为施用与其他治疗活性成分“组合”的抗-大-ET-1抗体)。在本发明的一些实施方案中，该其他治疗活性成分可以在施用本发明的抗-大-ET-1抗体之前对个体施用。例如，如果在施用第二成分1周前、72小时前、60小时前、48小时前、36小时前、24小时前、12小时前、6小时前、5小时前、4小时前、3小时前、2小时前、1小时前、30分钟前、15分钟前、10分钟前、5分钟前或不到1分钟前施用第一成分，则认为在第二成分之前施用第一成分。在其他实施方案中，该其他治疗活性成分可以在施用本发明的抗-大-ET-1抗体后对个体施用。例如，如果在施用第二成分1分钟后、5分钟后、10分钟后、15分钟后、30分钟后、1小时后、2小时后、3小时后、4小时后、5小时后、6小时后、12小时后、24小时后、36小时后、48小时后、60小时后、72小时后施用第一成分，则认为在第二成分之后施用第一成分。还在其他实施方案中，该其他治疗活性成分可以与施用本发明的抗-大-ET-1抗体同时对个体施用。为了本发明的目的，“同时”施用包括，例如在单个剂型中或在于约30分钟或更少时间内对个体施用的分开的剂型中对个体施用抗-大-ET-1抗体和其他治疗活性成分。如果在分开的剂型中施用，则可以经相同的途径施用每种剂型(例如，抗-大-ET-1抗体和其他治疗活性成分都可以玻璃体内施用、皮下施用等)；备选地，可以经不同的途径施用每种剂型(例如，抗-大-ET-1抗体可以玻璃体内施用，而其他治疗活性成分可以全身施用)。在任何情况下，为了本公开的目的，将通过相同的途径施用单剂型中、分开的剂型中的成分，或通过不同的途径施用分开的剂型中的成分都视为“同时施用”。为了本公开的目的，将在施用其他治疗活性成分之前、与施用其他治疗活性成分同时或在施用其他治疗活性成分之后(如上文定义的那些术语)施用抗-大-ET-1抗体视为与其他治疗活性成分组合施用抗-大-ET-1抗体。
本发明包括药物组合物，其中将本发明的抗-大-ET-1抗体与本文中其他地方所述的一种或多种其他治疗活性成分配制在一起。
抗体的诊断用途
本发明的抗-大-ET-1抗体也可以用来检测和/或测量样品中的大-ET-1，例如用于诊断目的。例如，抗-大-ET-1抗体或其片段可以用来诊断表征为大-ET-1或内皮素-1的异常表达(例如过量表达、表达不足、表达缺乏等)的病症或疾病。大-ET-1的示例性诊断测定可以包括，例如使获自患者的样品与本发明的抗-大-ET-1抗体接触，其中该抗-大-ET-1抗体用可检测标记或报道分子标记。备选地，未标记的抗-大-ET-1抗体可以与本身带有可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测标记或报道分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，如荧光素异硫氰酸盐或罗丹明；或诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或荧光素酶的酶。可用来检测或测量样品中的大-ET-1的具体的示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。
可用于本发明的大-ET-1诊断测定的样品包括可获自患者的任意组织或体液样品，其在正常或病理条件下含有可检测量的大-ET-1蛋白或其片段。通常，测量大-ET-1在获自健康患者(例如未罹患与异常的内皮素-1水平或活性相关的疾病或病症的患者)的具体样品中的水平来在开始时建立基线，或大-ET-1的标准水平。然后可将大-ET-1的这个基线水平与在获自疑似患有大-ET-1相关疾病或病症的个体的样品中测得的大-ET-1水平相比较。
实施例
给出以下实施例，为本领域普通技术人员提供有关如何制备和使用本发明的方法和组成物的完整公开内容和说明，并非旨在限制发明人就其发明所认为的范围。已进行了努力来确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但可产生某些实验误差和偏差。除非另有指明，否则份为按重量计的份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，而压力为大气压或近乎大气压。
实施例1.抗人类大-内皮素-1(大-ET-1)的人抗体的产生
直接对小鼠(含有编码人免疫球蛋白重链与κ轻链可变区的DNA)施用包含人类大-ET-1多肽(SEQ ID NO:434)的免疫原和佐剂来刺激免疫反应。通过大-ET-1-特异性免疫测定来监测抗体免疫反应。在达到所希望的免疫反应时，收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以保留其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选并选择杂交瘤细胞系来鉴定产生大-ET-1-特异性抗体的细胞系。使用此技术，获得了数种抗-大-ET-1嵌合抗体(例如具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；以此方式产生的示例性抗体命名如下：6486N、6490N、6492N、6494N、6495N、6741N、6490N2，和6492N2。
如US 2007/0280945A1中所述，还在不与骨髓瘤细胞融合的情况下直接从抗原阳性B细胞分离抗-大-ET-1抗体。使用此方法，获得了数种全人抗-大-ET-1抗体(即具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)；以此方式产生的示例性抗体命名如下：6311P、6316P、6317P、6323P、6327P2、6328P、6329P、6330P、6332P、6334P、6335P、6337P、6338P、6340P、6343P、6345P、6347P和6353P。
按照本实施例的方法产生的示例性抗-大-ET-1抗体的某些结构和功能特性详细描述于下文所示的实施例中。
实施例2.重链和轻链可变区氨基酸序列
表1显示所选择的抗-大-ET-1抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列及其对应的抗体标识符。
表1
在本文中通常按照以下命名法来提及抗体：Fc前缀(例如“H4H”、“H1M”、“H2M”)，接着是数字标识符(例如表1中所示的“6311”)，然后为“P”或“N”后缀。因此，根据此命名法，抗体在本文中可称为例如“H4H6311P”。本文中所用抗体命名的H4H、H1M和H2M前缀表示抗体的具体Fc区。例如，“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc，而“H4H”抗体具有人IgG4Fc。如本领域普通技术人员将理解，H1M或H2M抗体可转换成H4H抗体，反之亦然，但在任何情况下，可变结构域(包括CDR)——由表1中所示数字标识符指示——将保持相同。
实施例3.表面等离振子共振衍生的人单克隆抗-大-ET-1抗体的结合亲和力和动力学常数
通过使用mAb捕获形式的37℃下的表面等离振子共振来测定人单克隆抗-大-ET-1抗体的结合亲和力和动力学常数(表2-3)。在T200Biacore仪器(Biacore Life Sciencesdivision of GE Healthcare,Piscataway,NJ)上进行测量。Biacore传感器表面衍生为兔抗-小鼠用于杂交瘤捕获(前缀H1M或H2M)或衍生为小鼠抗-人Fc表面用于人IgG形式抗体(前缀H4H)。将不同浓度的小-ET-1(SEQ ID NO：435)、人类大-ET-1(SEQ ID NO：434)或小鼠大-ET-1(SEQ ID NO：437)以100μl/分的流速注射通过抗-大-ET-1捕获表面。监测肽结合3分钟，同时在HBST运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％v/v表面活性剂P20)中监测mAb-结合肽的解离4分钟。通过用Scrubber 2.0曲线拟合软件处理并将数据拟合至1：1结合模型来测定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。按以下从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka；且t1/2(分)＝(ln2/(60*kd)。结果显示于表2和3中(NB＝在测试条件下的非结合)。
表2：杂交瘤mAb(H1M和H2M)在37℃下的Biacore结合亲和力
表3：人Fc mAb(H4H)在37℃下的Biacore结合亲和力
NB：无结合；ND：未测定
如表2和3中所示，数个示例性抗体结合人类大-ET-1(SEQ ID NO:434)和小鼠大-ET-1(SEQ ID NO:437)二者。但是，本实施例中所测试的许多示例性抗体显示优先结合人类大-ET-1更甚于小鼠大-ET-1。例如，在本实施例中所用的测试条件下，抗体H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6328P和H4H6335P各证明与人类大-ET-1的高亲和力结合，但未显示与小鼠大-ET-1的任何结合。抗体H2M6495N、H4H6328P和H4H6334P各显示与人类大-ET-1的非常高的结合亲和力，KD值小于50pM。
显著地，本发明的抗体中没有一种结合人类小-ET-1(SEQ ID NO:435)。
实施例4.本发明的抗-大-ET-1抗体在体外阻断ECE1介导的大-ET-1切割
为了确定本发明的示例性抗-大-ET-1抗体是否能够阻断小鼠和/或人类大-ET-1的内皮素-转化酶-1(ECE-1)介导的切割，利用了NFAT荧光素酶报道测定。简言之，产生稳定表达全长人内皮素受体A型(ETaR)与荧光素酶报道元件[NFAT(4X)-荧光素酶]的HEK293细胞系。分离单克隆并维持在10％FBS、DMEM、NEAA、Pen/Strep及500μg/ml G418和100μg/ml潮霉素B中。
为了测定抑制效力，将抗体(100nM至0.002nM)与10nM人类大-ET-1(SEQ ID NO:434)或20nM小鼠大-ET-1(SEQ ID NO:437)孵育(1小时；25℃)，接着分别加入3nM人类ECE-1或5nM小鼠ECE-1。使人类和小鼠大-ET-1阻断实验孵育(37℃；5％CO2)过夜。次日早晨，将这些溶液加至293/ETaR/NFAT-Luc细胞(20,000细胞/孔)，并在5.5小时(37℃；5％CO2)后用Victor X酶标仪(Perkin Elmer)检测荧光素酶活性。在这些条件下观察到的荧光素酶活性的量与从小鼠或人类大-ET-1的切割产生的小-ET-1的量成比例呈现。(小-ET-1在小鼠和人类之间是相同的。)结果呈现于表4和5中(NB＝在测试条件下非阻断；NT＝未测试)。
表4：所选择的抗-大-ET-1杂交瘤mAb(H1M和H2M)对人ECE-1介导的人类大-ET-1切割的阻断效力
表5：所选择的抗-大-ET-1人Fc mAb(H4H)对人ECE-1介导的人类和小鼠大-ET-1切割的阻断效力
如表4中可见，本发明的数个杂交瘤抗体实质上抑制人类大-ET-1的ECE-1介导的切割(IC50值<10nM)。此外，人IgG4形式中所选择的抗体显示不仅阻断人类大-ET-1切割的能力(表5；栏2)，还阻断小鼠大-ET-1切割的能力(表5；栏3)。
实施例5.通过MALDI-TOF评估大-ET-1切割的抗体保护
用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间(MALDI-TOF)质谱来确定所选择的抗-大-ET-1抗体是否可在小鼠内皮素转化酶1(ECE-1)存在下阻断人类大-ET-1(SEQ ID NO:434)或小鼠大-ET-1(SEQ ID NO:437)转化为其各自的肽。人类大-ET-1由mECE-1在Trp-21/Val-22处特异性切割，形成具有生物活性的小-ET-1(SEQ ID NO:435；MH+2474)和非活性的C端产物(SEQ ID NO:434的氨基酸22-38；MH+1809)。小鼠大-ET-1在Trp-21/Val-22处切割为小-ET-1(SEQ ID NO:435；MH+2474)及其非活性C端产物(SEQ ID NO:437的氨基酸22-39；MH+1875)。在抗体存在下，可以通过MALDI-TOF来监测这些质量的出现或缺缺乏。在下面的实施例中，将C端产物的出现或缺乏当作大-ET-1切割的指示，因为这些肽比小-ET-1(SEQ IDNO:435；MH+2474)更有效地离子化，从而产生更灵敏的读出。
简言之，将人类或小鼠大-ET-1(0.5μM)与抗体(2.5μM)在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中以1：5的摩尔比(大-ET-1：mAb)混合。在1小时孵育后(25℃)，按40nM加入小鼠ECE-1(R&DSystems)，并将溶液放置在37℃下。在0、15、30和60分钟时取出用于质谱分析的整分试样。各整分试样经C18Ziptip(Millipore)脱盐，并用Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF仪器(Bruker Daltonics)以reflextron-阳性模式分析。
来自抗体存在下的人类或小鼠大-ET-1的切割的C端产物检测总结在表6中。
表6：来自大-ET-1的切割的C端肽产物的检测
在抗体H2M6490N与人类大-ET-1和小鼠ECE-1孵育时，未检测到C端产物(在表6中表示为“-”)。相反，在小鼠ECE-1存在下，小鼠Fc对照抗体未阻止人类大-ET-1的切割，从而在时间0以外的所有时间点鉴定出C端产物(在表6中表示为”+”)。针对抗体H4H6334P获得了类似的结果。但是，就H4H6327P2而言，证明此抗体可以在小鼠ECE-1存在下防止人类和小鼠大-ET-1二者的切割，因为没有检测到C端产物。因此，此实施例确认，本发明的抗-大-ET-1抗体(例如H2M6490N)能够在体外阻断人类大-ET-1酶促转化为其小-ET-1的生物活性形式。
实施例6.抗-大-ET-1抗体阻断小-ET-1介导的平均动脉血压增加
本实施例的目的是评估示例性抗-大-ET-1抗体(H2M6490N)阻断小-ET-1介导的动脉压增加的能力。用大-ET-1肽攻击先前已输注了阻断抗-大-ET-1抗体或同种型对照的小鼠。测量由大-ET-1内源性转化为小-ET-1或使其转化受到循环抗-大-ET-1抗体阻断所造成的动脉压变化。为便于在这些实验期间实时测量动脉压，使用标准程序对小鼠进行导管处理。
简言之，用异氟烷麻醉首次用于实验的Taconic C57BL/6小鼠(8-10周龄)并切开颈动脉和颈静脉上的皮肤。分离右颈静脉和左颈动脉，小心不要伤及迷走神经或其他血管。使用标准技术，移回颈静脉并用32号注射针(以90度角弯折)穿刺静脉以***充填盐水的颈静脉导管。然后，分离左颈动脉并用标准程序引入Millar导管。在所有程序进行期间，用温度探针来监测动物体温，用Gaymar热水循环垫使动物体温维持在约36.5℃。上述程序允许在所有大ET-1攻击实验期间记录实时血压测量值(收缩压、舒张压、平均动脉压和体温)。
在第一个研究中，使用颈静脉口静脉内注射150μg(～2mg/kg；1x10-9摩尔)H2M6490N或同种型对照mAb，接着快速浓注盐水来冲洗导管。这造成血压的轻微和暂时下降，其回复至基线并建立本实验的T＝0。抗体给药后30分钟，每15分钟静脉内注射人类大-ET-1肽(SEQ ID NO:434)直到平均动脉压显著增加高于基线。结果总结在表7中。
表7：研究1-大-ET-1攻击(IV抗体给药后30分钟注射大-ET-1)后的平均动脉压变化
表7证明，将人类大-ET-1注射入已接受同种型对照的小鼠反应显著增加的平均动脉压，如同在大-ET-1内源性切割为生物活性小-ET-1肽(SEQ ID NO:435)时所预期。相反，接受示例性抗-大-ET-1阻断抗体H2M6490N的小鼠维持基线平均动脉压，直到人类大-ET-1肽的量接近等摩尔的板上(on board)抗体。
在第二个实验中，除了在用人类大-ET-1肽攻击前24小时将H2M6490N(～2mg/kg；1x10-9摩尔)皮下(s.c.)注射入小鼠外，利用相同的实验流程。第二个实验的结果总结在表8中。
表8：研究2-大-ET-1攻击(SC抗体给药后24小时注射大-ET-1)后的平均动脉压变化
如表8中所示，在皮下抗体施用后24小时用大-ET-1攻击小鼠得到的结果类似于在静脉内抗体给药后30分钟用大-ET-1攻击小鼠时所观察到的结果(表7)。在两种实验条件下，用抗-大-ET-1抗体H2M6490N预输注的小鼠比用同种型对照抗体处理的那些小鼠更长时间地维持正常动脉压。
因此，这些研究显示，施用H2M6490N在体内有效抑制内皮素-1介导的动脉压增加。与对照相比，在用人类大-ET-1刺激前30分钟或24小时施用抗体显著降低动脉压反应。
实施例7.用抗大-ET-1抗体阻断/预防缺氧诱发的肺高压
在本实施例中，评价了抗-大-ET-1抗体H4H6327P2在小鼠中阻断缺氧诱发的肺高压的能力。在缺氧条件之前和缺氧条件期间用治疗剂(抗-大-ET-1抗体H4H6327P2或波生坦)或对照剂(抗体载体(50:50PEG 400(v/v))或同种型对照抗体)对动物给药，并用超声影像及心室压力和心脏肥大的测量结果来评价，与维持在常氧条件下的对照动物相比。
评价材料和方法
用下列流程获得超声测量结果。将小鼠麻醉，以仰位放置在加热平台(THM 100,Indus Instruments)上并用Vevo 2100超声***(VisualSonics)进行肺漏斗(B模式和M模式)的2D成像。在主动脉瓣水平处从胸骨旁短轴切面获得图像。在扫描头对准最大层流后，于肺瓣膜小叶顶端获得脉冲波多普勒测量结果。此外，在短轴B模式成像平面上获得右心室的M模式记录，以获得整个心搏周期的右心室游离壁动力学。
超声数据分析以盲化方式进行来分析下列参数：舒张和收缩右心室游离壁厚度(RVFW，短轴M模式)、收缩末期时的肺动脉直径(短轴B模式)，以及肺动脉流(PA流，PW多普勒)。从这些测量结果计算出肺流的时间-速度积分、肺动脉截面积(PA CSA)和右心室心搏出量(RV CO)。对于各治疗组，计算各时间点的测量结果的平均值和平均值的标准误差。所有测量值是以3个心搏周期来进行平均。用下列流程记录21天缺氧时的右心室压：将小鼠麻醉，以仰位放置在加热平台(用Gaymar加热泵加热的水套垫)上，并切开右颈总动脉，且将右颈静脉分出右颈，小心不要伤及颈动脉和/或迷走神经。将一段5-0丝缝线放在分出的颈静脉下以允许从颅侧移回血管，接着用30号注射针在颈静脉远段引入孔洞。将高保真压力导管(SPR-1000,Millar Instruments,Inc.)引入颈静脉并进一步通过右心房而进入右心室(RV)。导管允许记录心率以及舒张压和收缩压二者。用PowerLab 4/35控制端(ADInstruments)数字化获取数据。
用LabChart Pro软件(ADInstruments)以约60秒间隔的压力追踪(接着为2分钟的记录期，以允许压力稳定)进行右心室收缩压分析。所分析的参数为RV舒张压和收缩压、心率和动物体温。所报道的RV收缩压是最小收缩压和最大收缩压的差异(解释起始基线RV压力值的差异)。
完成RV收缩压测量后，将麻醉动物安乐死并打开胸腔切下心脏。小心将RV从左心室和中膈(LV+S)切开。用微量天平将心脏的两个部分分开称重，以估计RV肥大的程度[RV/(LV+S)；Fulton指数]。
实验程序
用允许处理动物和对动物给药同时维持常压缺氧氛围(10％O2)的改进腔室(Biospherix,Ltd.)诱发肺高压。将C57BL/6雄性小鼠(10-11周龄)称重并在如表9中所列的23天的时程内连续给药。波生坦和载体口服(PO)施用；抗-大-ET-1抗体H4H6327P2和同种型对照抗体皮下(SC)施用。在此研究的过程中，两组间的体重一致。用波生坦(内皮素受体-A和-B的口服活性非选择性拮抗剂)作为阳性对照，而载体[50：50PEG 400(v/v)]和不相关的同种型匹配抗体作为阴性对照。所有程序经Regeneron Institutional Animal Care andUse Committee(IACUC)批准。
表9.缺氧诱发的肺高压模型中的小鼠的治疗组和给药方案
在缺氧第18天进行非侵入性超声扫描来测定肺动脉截面积(PA CSA)、右心室心搏出量(RV CO)和右心室游离壁厚度(RVFW)。用高保真压力导管MillarInstruments)获得右心室中的右心室舒张压和收缩压；此外，在缺氧21天时测量右心室肥大测量结果(即右心室对左心室+中膈的重量比；Fulton指数)。
结果
在小鼠中用抗-大-ET-1抗体H4H6327P2治疗减弱了缺氧诱发的肺高压的发展。相对于经同种型对照治疗的小鼠，经抗体治疗的动物在所测量的PA CSA上显示显著(P≤0.001)较小的降低(图1)，表明暴露于长期缺氧所诱发的血管收缩较少和/或肺动脉重塑减少。波生坦(已知在啮齿动物中减少与缺氧诱发的肺动脉高压相关的症状)显示相似但降低的维持基线PA CSA的能力。与载体治疗组相比，经波生坦治疗的动物显示RV CO的更高的维持(图2)。与经波生坦治疗和经同种型治疗的群组相比，用抗-大-ET-1抗体治疗的动物显示统计学上更高(P≤0.05)的RV CO维持。此外，如通过超声(RVFW)和Fulton指数测量二者所确认，用抗-大-ET-1抗体治疗的动物显示显著更小的RV肥大(图3)。此外，相对于同种型对照，经抗-大-ET-1抗体治疗的小鼠中心脏显著更薄的右心室壁证明RV肥大减少(图4)。
结论
因此，本研究证明，本发明的抗-大-ET-1抗体有效减弱与缺氧诱发的肺动脉高压相关的症状，并在一些终点上胜过基准分子波生坦。
实施例8.用抗-大-ET-1抗体治疗缺氧诱发的肺高压
在本实施例中，评价了抗-大-ET-1抗体H4H6327P2在小鼠中治疗缺氧诱发的肺高压的能力。使实验组动物经受缺氧条件21天(第1-21天)，并从第14天起用H4H6327P2、波生坦或对照同种型抗体给药。在第21天，用超声影像及心室压力和心脏肥大的测量结果评估动物(参见实施例7中的评价材料和方法)，并与对照动物相比较(维持在常氧条件下、缺氧14天，或缺氧14天后常氧7天)。
实验程序
通过暴露于常压缺氧氛围(10％O2)经由改进的腔室(Biospherix,Ltd.)诱发肺高压。将C57BL/6雄性小鼠(10-11周龄)称重并在如表10中所列的21天的时程内治疗或治疗并给药。波生坦口服(PO)施用；抗-大-ET-1抗体H4H6327P2和同种型对照抗体皮下(SC)施用。在此研究的过程中组间的体重一致。用波生坦(内皮素受体-A和-B的口服活性非选择性拮抗剂)作为阳性对照，而不相关的同种型匹配抗体作为阴性对照。所有程序RegeneronInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准。
表10.缺氧诱发的肺高压模型中的小鼠的治疗组和给药方案
在缺氧第21天进行非侵入性超声扫描来测定肺动脉截面积(PA CSA)、右心室心搏出量(RV CO)和右心室游离壁厚度(RVFW)。用高保真压力导管MillarInstruments)获得右心室中的右心室舒张压和收缩压；此外，在缺氧21天时测量右心室肥大测定结果(即右心室对左心室+中膈的重量比；Fulton指数)。
结果
用H4H6327P2或波生坦治疗减弱了远端肺动脉收缩和重塑，包括更少的血管收缩和通常与缺氧诱发的PH相关的血管平滑肌细胞增殖。与未治疗组或同种型对照组相比，用抗-大-ET-1抗体H4H6327P2治疗显著降低长期缺氧诱发的小动脉壁增厚(图5)。用H4H6327P2和波生坦治疗还减小管腔直径丢失，如通过维持肺动脉截面积(PA CSA)所证明(图6)，并且减弱右心室游离壁(RVFW)增厚(图7)。抗-大-ET-1抗体治疗还维持右心室心搏出量(RVCO)，其通常因肺动脉血管阻力提高而在肺高压中降低，尽管程度比波生坦小(图9)。但是，抗-大-ET-1抗体治疗未显著减小右心室肥大，这是为了维持至肺动脉的血流(图8)或右心室收缩压(RSVP)(图10)而产生的补偿机制，两者都与肺高压引起的血管阻力增加相关。
结论
因此，本研究证明，本发明的抗-大-ET-1抗体在减弱肺高压诱发的血管***重塑上显示最大的效力，与波生坦不分上下，而波生坦治疗在恢复心脏功能的测量结果上显示更大的作用。
实施例9：施用抗-大ET-1抗体减少痛觉反应行为
在本实施例中，评价了抗-大-ET-1抗体H4H6327P2在小鼠中阻断大-ET-1诱发的对疼痛的防御反应的能力。H4H6327P2阻断内皮素转化酶(ECE)介导的大-ET-1切割为21个氨基酸的生物活性ET-1。已记录了在动物中外源性施用ET-1诱发明显疼痛相关行为(痛觉)，如腹部扭曲、退缩、啃咬或添砥。
实验程序
在本研究中，将12周龄C57BL/6雄性小鼠分为三个实验群组：对照组(n＝6)，接受30mg/kg的非大-ET-1结合同种型对照抗体(同种型)；低剂量组(n＝7)，接受3mg/kg的抗大-ET-1抗体H4H6327P2；以及高剂量组(n＝7)，接受30mg/kg的H4H6327P2。所有抗体都皮下施用。抗体给药后约48小时，所有小鼠都接受2μg(0.2mg/ml)的大hET-1肽(溶于磷酸缓冲盐溶液中)注射入右后掌的跖侧。立刻将小鼠放入干净的圆筒中并在注射后录像记录它们的痛觉行为60分钟。对群组身份一无所知的研究人员记录60分钟测试期内右后掌舔舐/啃咬行为的总数。数据报道为群组平均值±SEM(图11)。
结果和结论
用H4H6327P2预处理显著减少60分钟测试期内的大-hET-1肽诱发的痛觉行为(p＝0.0173，通过重复测量ANOVA)。仅在30mg/kg的剂量组中观察到剂量依赖性效应(p<0.05，Tukey)。此实施例说明施用抗-大-ET-1抗体可以通过阻止ET-1副产物的形成和随后的受体激活来减轻疼痛相关行为。
实施例10：在博来霉素诱发的肺纤维化模型中用抗-大ET-1抗体预防性给药减弱生理重塑并恢复肺功能
在此实施例中，评价了抗-大-ET-1抗体H4H6327P2作为用于博来霉素诱发的肺纤维化的预防性治疗的能力。
实验程序
用博来霉素诱发的肺损伤来在10周龄C57BL/6雄性小鼠中模拟肺纤维化。通过单个口咽剂量(2.0ml/kg体积中的3.2U/kg(2.0mg/kg))来施用硫酸博来霉素。未处理的对照小鼠接受无菌0.9％盐水的经口滴注(2.0ml/kg)。用波生坦(内皮素受体-A和-B的口服活性非选择性拮抗剂)作为治疗的阳性对照，而载体和不相关的同种型匹配抗体作为阴性对照。将小鼠分配至具有表11中所列出的给药方案的治疗组或对照组。
表11.博来霉素诱发的肺纤维化模型中的小鼠的治疗组和给药方案
BID＝每日两次/2x每日施用，SID＝1x每日施用，SC＝皮下，PO＝经口(口服)
结果
作为治疗效力的测量，在暴露于博来霉素21天后测量每个群组中的动物的右肺重量。肺重量的增加是常观察到的博来霉素诱发的肺纤维化的生理效应(表12；组1对组2和3)。在与同种型对照相比时，用抗-大-ET-1抗体H4H6327P2治疗倾向于降低肺湿重以及水重量增加(水肿)的百分比。但是，只有波生坦治疗显示统计上显著的肺湿重降低。
表12.博来霉素诱发的肺纤维化模型中的治疗组的结果参数
*博来霉素：在2.0ml/kg体积中按3.2U/kg经单个口咽剂量施用；B.I.D.：每天两次(2x/天施用)
结论
还评估了抗体或波生坦治疗对维持肺功能的影响。与载体或同种型对照治疗的群组相比，H4H6327P2和波生坦二者都倾向于在施用博来霉素20天后使动脉血氧饱和恢复至更接近基线水平，还减少了博来霉素暴露后肺中的胶原累积。
材料和方法
动物处理程序：将每个鼠笼随机分配至治疗性处理组，使得笼中的所有小鼠接受相同的处理。各处理组的初始平均体重相似。整个研究过程中每天记录体重。分析组体重平均值和百分比变化并作图。对在研究过程中显示>25％的体重减轻或健康严重恶化的动物实施安乐死。
博来霉素的施用：在动物处于麻醉状态时进行博来霉素或盐水的施用(处于3.5％至2升/分钟氧流速的异氟烷)。将镇静的小鼠放置在60度斜板上，用缠绕切牙的弹性绷带使头部向上。用小棉签将舌头擀出口外，然后用镊子夹住舌头并打开颌。在重吸气期间，将流体吸入口中。保持舌和颌位置，同时使小鼠留在斜板上。吸取约20秒后流体消失，“喘鸣”停止。治疗滴注后，由于***的生物危害物而在一次性鼠笼中按治疗条件分组饲养小鼠(每个鼠笼5只动物)7天，然后返回主笼。一次性鼠笼仅因使用笼顶部的水瓶而不是使用Thoren架供水***而不同于主笼。按12小时(上午7点-下午7点)光照-黑暗周期以群体饲养所有小鼠。
波生坦的施用：在该周内每天两次(上午9:30和下午6:30)通过口腔管饲法施用波生坦。作为单个组合BID施用初始预处理剂量和周末日剂量。如表11中所列出，波生坦给药每天持续直至研究的第20天，而抗体和载体每3天皮下给药直至第18天。
肺功能的测量：通过用Starr Life Sciences,MouseOx小动物生命体征监测器测量动脉氧饱和来度量肺功能。在第14和17天，去除毛发后在颈部周围进行测量。MouseOx可以通过测量红细胞中的血红蛋白分子上携带至组织的氧气的水平来监测心肺健康和肺损伤的程度。在意识清醒的小鼠中用咽喉项圈传感器来通过颈动脉测量动脉氧饱和。用手轻微约束小鼠来限制于鼠笼顶部食物漏斗并减少活动。软件(具有InstCal.的MouseOxVer.6.3.12)测量脉冲延长、心率、氧饱和及每秒的呼吸率。一旦记录到连续15秒阻断，软件即计算以上参数的平均值。取决于小鼠活动性，测量时间在1分钟至3分钟的范围内。计算各治疗组的平均动脉氧饱和，并用具有所有治疗组的Bonferroni检验后分析的单因素方差分析来分析。
终点程序/组织学：在第21天，对小鼠施用最终剂量的开他敏(Ketamine)/赛拉嗪(Xylazine)(分别为120mg/kg/5mg/kg IP)。镇静后，打开腹腔，通过注射器经下腔静脉采集用于分离血清的血液。然后切断腹主动脉。在放血期间，打开胸腔，暴露肺。用缝线系住所有右肺叶上方的右支气管。对于所有小鼠，取出整个右肺(由上叶、中叶、前叶和后腔叶组成)，称重，在液氮中急速冷冻，然后保存在-80℃冰箱中用于胶原测量。在胶原提取之前，在干燥器中干燥右肺叶，并重新称重。计算各治疗组的的肺湿重和干重及湿重与干重的比值。在胃蛋白酶-乙酸溶液中匀浆肺来提取可溶性胶原。用来自Biocolor的Sircol胶原测定来定量每个右肺的可溶性胶原及每毫克湿肺组织和干肺组织的胶原。
对于各治疗组，左肺叶的用途在组织学和微阵列之间随机划分。对于组织学主题，在腹颈(ventral neck)上产生切口，分开颌下腺，通过切断周围的肌肉纤维来暴露气管。将缝线轻轻系在口远端的气管上。然后在缝线上方靠近口处在气管中切出小孔。将固定于管的22g钝注射针和装有10％NBF的250ml抽吸器***孔。然后系紧缠绕缝合的气管的缝线结，以密封开口并保持注射针在位。在25cm高度，通过重力膨胀左肺约30至60秒。膨胀后，取出注射针，系紧左肺。将仍附着于支气管、气管、胸腺、食管和心脏的左肺作为1片取出，并保存在***中。固定后，分离左肺叶并取出用于组织学处理(irius Red,Masson’strichrome and H&E)。将指定微阵列的小鼠的左肺叶在室温下无膨胀地在RNA-Later中放置24小时，然后放入-20℃冰箱，直至基因测序。
本发明将不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，对本领域技术人员而言，除本文所述的那些之外的本发明的多种修改将从前面的描述和附图变得显而易见。这类修改旨在落在所附权利要求的范围之内。

Claims (24)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人类大-ET-1(SEQ ID NO:434)，且不结合小-ET-1(SEQ ID NO:435)，其中抗体或其抗原结合片段阻断内皮素-转化酶-1(ECE-1)对大-ET-1的切割，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)及轻链可变区(LCVR)CDR，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、146/154、162/170、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、322/330、338/346、370/378和386/394。
2.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别选自SEQ ID NO：4-6-8-12-14-16、20-22-24-28-30-32、36-38-40-44-46-48、52-54-56-60-62-64、68-70-72-76-78-80、148-150-152-156-158-160、164-166-168-172-174-176、196-198-200-204-206-208、212-214-216-220-222-224、228-230-232-236-238-240、244-246-248-252-254-256、260-262-264-268-270-272、276-278-280-284-286-288、292-294-296-300-302-304、324-326-328-332-334-336、340-342-344-348-350-352、372-374-376-380-382-384和388-390-392-396-398-400。
3.权利要求2的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、146/154、162/170、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、322/330、338/346、370/378和386/394。
4.权利要求3的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对是SEQ ID NO：242/250。
5.权利要求1-4中任一项的抗体或抗原结合片段，其是抗体。
6.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段，和可药用载体或稀释剂。
7.权利要求6的药物组合物在制备用于治疗、预防或减轻选自肺高压、肾病、同种异体移植排斥、糖尿病、癌症、心力衰竭和动脉粥样硬化的疾病或障碍的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中疾病或障碍是肺高压。
9.权利要求8的用途，其中肺高压是肺动脉高血压、与左心疾病相关的肺高压、与肺病相关的肺高压，或由慢性血栓性疾病引起的肺高压或由栓塞性疾病引起的肺高压。
10.权利要求7的用途，其中疾病或障碍是癌症。
11.权利要求10的用途，其中癌症是选自***癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肾癌、结肠直肠癌、***、子宫内膜癌、膀胱癌、卡波西肉瘤和胶质瘤的癌症。
12.权利要求7的用途，其中药物与第二药物组合物一起使用，其中第二药物组合物包含一或多种选自内皮素-A受体拮抗剂、内皮素-B受体拮抗剂、内皮素-转化酶-1(ECE-1)抑制剂、中性溶酶抑制剂、血管紧张肽-II受体激动剂和NF-κB抑制剂的活性成分。
13.权利要求6的药物组合物在制备用于治疗或减弱疼痛的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中疼痛是痛觉疼痛或内脏疼痛。
15.权利要求14的用途，其中疼痛与选自炎症、手术后切口、神经病、骨折、烧伤、骨癌、痛风、偏头痛和纤维肌痛的病症相关。
16.权利要求15的用途，其中骨折是骨质疏松性骨折。
17.权利要求13的用途，其中疼痛是癌症相关疼痛或化疗诱发的疼痛。
18.权利要求6的药物组合物在制备用于治疗眼病的药物中的用途。
19.权利要求18的用途，其中眼病选自年龄相关黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、虹膜新血管形成、新生血管性青光眼、青光眼中的手术后纤维化、增生性玻璃体视网膜病(PVR)、脉络膜新血管形成、视盘新血管形成、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、玻璃体新血管形成、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、血管源性视网膜病、视网膜变性和炎性眼病。
20.权利要求19的用途，其中AMD是渗出性AMD。
21.权利要求19的用途，其中黄斑水肿是糖尿病性黄斑水肿(DME)。
22.权利要求19的用途，其中炎性眼病是葡萄膜炎。
23.权利要求6的药物组合物在制备用于治疗纤维化的药物中的用途。
24.权利要求23的用途，其中纤维性病症是肺纤维化、眼纤维化、皮肤纤维化、肾纤维化或肝纤维化。
CN201380010580.6A 2012-02-22 2013-02-22 抗‑大‑内皮素‑1(big‑et‑1)抗体及其用途 Expired - Fee Related CN104203980B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261601622P 2012-02-22 2012-02-22
US61/601,622 2012-02-22
US201261677024P 2012-07-30 2012-07-30
US61/677,024 2012-07-30
PCT/US2013/027380 WO2013126740A1 (en) 2012-02-22 2013-02-22 Anti-big-endothelin-1 (big-et-1) antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104203980A CN104203980A (zh) 2014-12-10
CN104203980B true CN104203980B (zh) 2018-01-12

Family

ID=47790543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380010580.6A Expired - Fee Related CN104203980B (zh) 2012-02-22 2013-02-22 抗‑大‑内皮素‑1(big‑et‑1)抗体及其用途

Country Status (23)

Country Link
US (1) US9751932B2 (zh)
EP (1) EP2817336A1 (zh)
JP (1) JP2015509946A (zh)
KR (1) KR20140130713A (zh)
CN (1) CN104203980B (zh)
AR (1) AR090128A1 (zh)
AU (1) AU2013222203B2 (zh)
BR (1) BR112014020043A2 (zh)
CA (1) CA2864830A1 (zh)
CL (1) CL2014002232A1 (zh)
CO (1) CO7071097A2 (zh)
EA (1) EA201491562A1 (zh)
HK (1) HK1205523A1 (zh)
IL (1) IL233781A0 (zh)
MX (1) MX2014010060A (zh)
MY (1) MY169210A (zh)
NZ (1) NZ629553A (zh)
PH (1) PH12014501730A1 (zh)
SG (2) SG10201606802PA (zh)
TW (1) TWI613215B (zh)
UY (1) UY34637A (zh)
WO (1) WO2013126740A1 (zh)
ZA (1) ZA201405554B (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101438146B (zh) 2006-04-04 2014-12-10 神谷来克斯公司 高灵敏标志物分析和分子检测的方法和组合物
US7838250B1 (en) 2006-04-04 2010-11-23 Singulex, Inc. Highly sensitive system and methods for analysis of troponin
WO2010144358A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Singulex, Inc. Highly sensitive biomarker panels
TWI613215B (zh) 2012-02-22 2018-02-01 再生元醫藥公司 抗－大－內皮素－１（ｂｉｇ－ｅｔ－１）抗體及其用途
US9719981B2 (en) * 2012-08-17 2017-08-01 Father Flanagan's Boys' Home RAC1 inhibitors for the treatment of alport glomerular disease
WO2015057906A1 (en) * 2013-10-16 2015-04-23 Janssen Biotech, Inc. Cd200 receptor 1 agonists
WO2017024032A2 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Enb Therapeutics, Llc Compositions and methods for treating cancers associated with etbr activation
KR102677543B1 (ko) 2015-09-16 2024-06-24 아블렉시스, 엘엘씨 항-cd115 항체
CN108341877B (zh) * 2017-01-23 2021-04-30 吴剑波 一种抗活化凝血因子v单克隆抗体及其制备方法和用途
JP2021510680A (ja) 2018-01-12 2021-04-30 イーエヌビー・セラピューティクス・インク Ｅｔｂｒ活性化に関連する癌を処置するための重水素化化合物、組成物、および方法
CA3104470A1 (en) * 2018-06-19 2019-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-factor xii/xiia antibodies and uses thereof
WO2020257636A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Father Flanagan's Boys' Home Doing Business As Boys Town National Research Hospital Neutralizing antibodies to human endothelin
US20240011986A1 (en) * 2020-11-06 2024-01-11 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Bacterial biomarker for rheumatoid arthritis and related materials and methods

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0331100A1 (en) 1988-03-02 1989-09-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Anti-endothelin antibodies and their use
CA2008122A1 (en) 1989-01-26 1990-07-26 Tetsuro Okabe Pharmaceutical composition for diseases caused by vasoconstriction
JP3017773B2 (ja) * 1989-06-22 2000-03-13 塩野義製薬株式会社 エンドセリン認識モノクローナル抗体、該抗体産生ハイブリドーマおよび該抗体を用いるエンドセリンのラジオイムノアッセイ
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
US5817310A (en) 1991-12-02 1998-10-06 Cor Therapeutics, Inc. Inhibitory immunoglobulin polypeptides to human PDGF beta receptor
US5882644A (en) 1996-03-22 1999-03-16 Protein Design Labs, Inc. Monoclonal antibodies specific for the platelet derived growth factor β receptor and methods of use thereof
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
DK2374818T3 (da) 2006-06-02 2013-01-21 Regeneron Pharma Højaffinitetsantistoffer mod human IL-6-receptor
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
CN101707882A (zh) 2007-04-17 2010-05-12 伊姆克罗尼责任有限公司 PDGFRβ特异性抑制剂
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
CA2797033C (en) 2010-04-22 2021-10-19 Longevity Biotech, Inc. Highly active polypeptides and methods of making and using the same
TWI613215B (zh) 2012-02-22 2018-02-01 再生元醫藥公司 抗－大－內皮素－１（ｂｉｇ－ｅｔ－１）抗體及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sandwich-type enzyme immunoassay for big endothelin-1 in plasma: concentrations in healthy human subjects unaffected by sex or posture;Philippe Aubin et al.;《Clinical Chemistry》;19971231;第43卷(第1期);64-70 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20130216547A1 (en) 2013-08-22
PH12014501730B1 (en) 2014-11-10
ZA201405554B (en) 2015-12-23
TWI613215B (zh) 2018-02-01
EA201491562A1 (ru) 2014-12-30
CN104203980A (zh) 2014-12-10
KR20140130713A (ko) 2014-11-11
CL2014002232A1 (es) 2015-01-16
AU2013222203A1 (en) 2014-09-18
SG11201404487SA (en) 2014-10-30
TW201348255A (zh) 2013-12-01
AU2013222203B2 (en) 2017-12-07
BR112014020043A2 (pt) 2017-07-04
MY169210A (en) 2019-03-18
CA2864830A1 (en) 2013-08-29
EP2817336A1 (en) 2014-12-31
WO2013126740A1 (en) 2013-08-29
IL233781A0 (en) 2014-09-30
SG10201606802PA (en) 2016-10-28
MX2014010060A (es) 2014-09-22
AR090128A1 (es) 2014-10-22
PH12014501730A1 (en) 2014-11-10
CO7071097A2 (es) 2014-09-30
JP2015509946A (ja) 2015-04-02
UY34637A (es) 2013-05-31
HK1205523A1 (zh) 2015-12-18
US9751932B2 (en) 2017-09-05
NZ629553A (en) 2016-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104203980B (zh) 抗‑大‑内皮素‑1(big‑et‑1)抗体及其用途
CN104411722B (zh) 抗egfr抗体及其使用
CN104936614B (zh) 抗-PDGFR-β抗体及其使用
CN104258390B (zh) 针对人血管生成素‑2的高亲和力人抗体
CN102933602B (zh) 人gdf8的抗体
CN103314011B (zh) 胰高血糖素受体的人抗体
CN104411719B (zh) 针对fel d1的人源抗体及其使用方法
US8980268B2 (en) Methods for treating cancer by administering an anti-Ang-2 antibody
CN107922478A (zh) 抗angptl8抗体及其用途
CN106459199A (zh) 抗‑egfrviii抗体及其用途
CN105592858A (zh) 抗激活蛋白a抗体及其用途
CN105189548A (zh) Grem1的人抗体
CN110036029A (zh) 用抗angptl8抗体处理肥胖的方法
US9371379B2 (en) Methods for treating malaria by administering an antibody that specifically binds angiopoietin-2 (ang-2)
CN109641954A (zh) 抗-gremlin-1(grem1)抗体及其用于治疗肺动脉高血压的使用方法
CN104781280A (zh) 抗前动力蛋白受体(prokr)抗体及其使用
US12030935B2 (en) Anti-PDGF-B antibodies and pharmaceutical composition thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180112

Termination date: 20190222

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee