KR20140130713A - 항-ｂｉｇ-엔도텔린-1 (ｂｉｇ-ｅｔ-1) 항체들 및 이들의 용도 - Google Patents

항-ｂｉｇ-엔도텔린-1 (ｂｉｇ-ｅｔ-1) 항체들 및 이들의 용도 Download PDF

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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명은, big-엔도텔린-1("big-ET-1")에 결합하는 항체들, 및 이들을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 소정 실시형태에 따르면, 상기 항체들은 사람 big-ET-1에 특이적으로 결합하지만, 사람 small-ET-1(즉, 엔도텔린-전환 효소-1[ECE-1]에 의한 big-ET-1의 단백질분해성 개열로부터 얻어지는 엔도텔린-1의 활성형)에는 결합하지 않는다. 본 발명의 소정 실시형태에 따르면, 항-big-ET-1 항체들은 ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열을 차단할 수 있다. 본 발명의 항체들은, 고혈압 장애, 섬유성 장애, 신경변성 장애, 망막 장애, 통증 및 암을 포함하는, big-ET-1-관련 장애의 치료에 유용하다.

Description

항-ＢＩＧ-엔도텔린-1 (ＢＩＧ-ＥＴ-1) 항체들 및 이들의 용도{ANTI-BIG-ENDOTHELIN-1 (BIG-ET-1) ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은, 사람 big-엔도텔린-1에 대해 특이적인, 항체들, 및 이들의 항원-결합 단편들에 관한 것이다.
엔도텔린-1("ET-1", "small-ET-1", 및 "EDN1"로서도 나타냄)은, 본래 돼지의 대동맥 내피 세포의 배양 배지로부터 단리되어 특성확인된, 21개 아미노산 혈관 수축제이다. (Yanagisawa et al. (1988) Nature 332:411-415). ET-1은, 엔도펩티다제에 의해 개열되는 약 200개 아미노산 프리프로(prepro)-ET-1 분자로부터 유도되어, "big-ET-1"("프로-ET-1"으로서도 나타냄)이라고 칭하는 38개 아미노산 형태로 제조된다. Big-ET-1은 엔도텔린 전환 효소(ECE-1)에 의해 추가로 개열되어 혈관 활성(vasoactive) 21개 아미노산 ET-1 펩타이드가 제조된다. ET-1은 엔도텔린 수용체 A형("ETaR") 및 B형("ETbR")을 활성화시킬 수 있다. 평활근 세포에서의 ETaR 또는 ETbR의 활성화는 혈관 수축을 초래하고, 실험 동물 모델에의 ET-1의 정맥내 투여는 동맥 혈압의 지속적인 상승을 야기한다. 폐에서, 엔도텔린 유전자 발현은 저산소증에 의해 상향조절되고, 이는, 혈관 평활근 비대, 혈관 수축, 염증 및 심장 비대, 및 폐 고혈압에서의 섬유증에 대한 피드-포워드(feed-forward) 효과로 이어진다.
상기 특성들과 일치하여, 엔도텔린-1은, 예를 들면, 폐 고혈압, 심부전, 전신성 고혈압, 섬유성 질환, 신경변성 질환, 및 암을 포함하는 각종 질환 및 장애에 연루되어 왔다. 예를 들면, Big-ET-1 개열의 생성물인 ET-1은, 섬유아세포 증식을 유도하는 능력 및 콜라겐 대사의 자극으로 인한 폐 섬유증의 발병에 연루되어 있는 것으로 생각된다(참조: Fonseca et al. (2011) Am J Respir Cell Mol Biol 44:1-10). 상승된 엔도텔린-1 수준은, 또한, 안 질환과 연관되어 왔다(예를 들면, 녹내장[예를 들면, 정상 안압 녹내장, 고혈압 녹내장, 개방각 녹내장])(참조: Sugiyama et al . (1995) Surv Ophthalmol 39 Suppl 1:S49-56; Emre et al. (2005) Br J Ophthalmol 89:60-63; Galassi et al. (2011) Invest Opthalmol Vis Sci 52:4467-4471; Ghanem et al . (2011) Ophthalmic Res 46:98-102; Tezel et al. (1997) J. Glaucoma 6:83-89; Chauhan (2008) Can J Ophthalmol 43:356-360). 따라서, 엔도텔린 수용체(ETA 및 ETB)의 몇몇의 소분자 길항제는 폐 고혈압, 심혈관 장애, 염증성 질환, 신장 질환, 암, 및 알츠하이머 질환과 같은 장애의 치료를 위해 시험되거나 제안되어 왔다.
항-ET-1 항체들은 EP0406628B1에 언급되어 있지만; EP0406628B1의 항체들은, 소 티로글로불린에 접합된 합성 ET-1(즉, small-ET-1)에 대해 발생되었다. small-ET-1은 면역원으로서 사용되었으므로, EP0406628B1의 항체들은 big-ET-1에 결합하는 것으로 기대되지 않았고, 또한, 상기 항체들은 엔도텔린 전환 효소에 의한 big-ET-1의 개열을 감소시키거나 저해시키는 능력을 갖는 것으로 기대되지 않았다. small-ET-1로의 big-ET-1의 개열을 차단하는 치료제는, 엔도텔린 신호전달 과정에서의 보다 이른 시점에 작용하여, 잠재적으로 ET-1에 대해 특이적인 항체 자체보다 더욱 강한 저해 활성을 제공할 수 있다. 따라서, 당해 분야에는, 사람 big-ET-1에 특이적으로 결합하여 small-ET-1의 형성을 차단하는 항체들을 포함하는, 신규의 엔도텔린 신호전달 저해제가 여전히 요구된다.
본 발명의 간단한 요약
본 발명은, 사람 big-ET-1에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체들은, 특히, ET-1-매개된 신호전달을 저해하는데, 그리고, ET-1 활성 및/또는 신호전달에 의해 야기되거나 ET-1 활성 및/또는 신호전달에 관련된 질환 및 장애를 치료하는데 유용하다.
소정 실시형태에 따르면, 본 발명의 항체들은 사람 big-ET-1에 특이적으로 결합하지만 사람 small-ET-1에는 결합하지 않는다. 본 발명은, 또한, big-ET-1의 엔도텔린-전환 효소-1(ECE-1)-매개된 개열을 차단하는 항체들을 제공한다. 본원에 설명되는 바와 같이, big-ET-1의 ECE-1-매개된 개열을 차단하는 항-big-ET-1 항체들은, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 엔도텔린-1 활성의 강력한 저해제이다.
본 발명의 항체들은, 전장(예를 들면, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나, 항원-결합부(예를 들면, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있고, 변형되어 기능성에 영향을 미칠 수 있고, 예를 들면, 나머지 이펙터 기능을 제거할 수 있다(Reddy et al., (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).
본 발명은, 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 402, 및 418로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은, 또한, 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 394, 410, 및 426으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR), 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은, 또한, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/394, 402/410, 및 418/426으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR(HCVR/LCVR) 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은, 또한, 서열번호 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 408, 및 424로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 서열번호 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 400, 416, 및 432로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 이들과 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 제공한다.
소정 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체의 항원-결합부는, 서열번호 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 376/384, 392/400, 408/416, 및 424/432로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은, 또한, 서열번호 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 388, 404, 및 420으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; 서열번호 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 390, 406, 및 422로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; 서열번호 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 396, 412, 및 428로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 서열번호 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 398, 414, 및 430으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 소정의 비제한적 예시 항체들 및 항원-결합 단편들은, 각각, 서열번호 4-6-8-12-14-16(예를 들면, H2M6486N); 20-22-24-28-30-32(예를 들면, H2M6490N); 36-38-40-44-46-48(예를 들면, H1M6492N); 52-54-56-60-62-64(예를 들면, H1M6494N); 68-70-72-76-78-80(예를 들면, H2M6495N); 84-86-88-92-94-96(예를 들면, H2M6741N); 100-102-104-108-110-112(예를 들면, H4H6311P); 116-118-120-124-126-128(예를 들면, H4H6316P); 132-134-136-140-142-144(예를 들면, H4H6317P); 148-150-152-156-158-160(예를 들면, H4H6323P); 164-166-168-172-174-176(예를 들면, H4H6327P2); 180-182-184-188-190-192(예를 들면, H4H6328P); 196-198-200-204-206-208(예를 들면, H4H6329P); 212-214-216-220-222-224(예를 들면, H4H6330P); 228-230-232-236-238-240(예를 들면, H4H6332P); 244-246-248-252-254-256(예를 들면, H4H6334P); 260-262-264-268-270-272(예를 들면, H4H6334P2); 276-278-280-284-286-288(예를 들면, H4H6335P); 292-294-296-300-302-304(예를 들면, H4H6337P); 308-310-312-316-318-320(예를 들면, H4H6338P); 324-326-328-332-334-336(예를 들면, H4H6340P); 340-342-344-348-350-352(예를 들면, H4H6343P); 356-358-360-364-366-368(예를 들면, H4H6345P); 372-374-376-380-382-384(예를 들면, H4H6347P); 388-390-392-396-398-400(예를 들면, H4H6353P); 404-406-408-412-414-416(예를 들면, H4H6490N2); 및 420-422-424-428-430-432(예를 들면, H4H6492N2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은, 사람 big-ET-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 단편은, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/394, 402/410, 및 418/426으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 서열 내에 함유된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인들을 포함하는, 사람 big-ET-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열들 내의 CDR들을 동정하기 위한 방법 및 기술은, 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 본원에 개시되어 있는 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열들 내의 CDR들을 동정하는데 사용될 수 있다. CDR들의 경계를 동정하는데 사용될 수 있는 예시의 종래 기술로는, 예를 들면, 캐뱃(Kabat) 정의, 쵸티아(Chothia) 정의, 및 AbM 정의가 포함된다. 일반적인 표현으로, 캐뱃 정의는 서열 가변성에 근거하고, 쵸티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 근거하며, AbM 정의는 캐뱃과 쵸티아 접근법 사이의 절충이다. 예를 들면, 문헌[Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948; 및 Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272]을 참조한다. 또한, 공공의 데이터베이스도 항체 내의 CDR 서열들을 동정하는데 이용가능하다.
다른 양상에서, 본 발명은, 항-사람 big-ET-1 항체들 또는 이들의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산을 지니는 재조합 발현 벡터, 및 이러한 벡터들이 도입된 숙주 세포도 또한 본 발명에 포함되고, 항체의 제조를 허용하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하고, 제조된 항체를 회수함으로써 항체를 제조하는 방법과 같다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 401, 및 417로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명은, 또한, 서열번호 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 393, 409, 및 425로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명은, 또한, 서열번호 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 391, 407, 및 423으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCDR3 도메인; 및 서열번호 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 399, 415, 및 431로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCDR3 도메인을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편도 제공한다.
본 발명은, 또한, 서열번호 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 387, 403, 및 419로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCDR1 도메인; 서열번호 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 389, 405, 및 421로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCDR2 도메인; 서열번호 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 395, 411, 및 427로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCDR1; 및 서열번호 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 397, 413, 및 429로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCDR2 도메인을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편도 제공한다.
소정 실시형태에 따르면, 상기 항체 또는 이의 단편은, 하기 서열번호들의 핵산 서열들: 서열번호 1 및 서열번호 9(예를 들면, H2M6486N), 서열번호 17 및 서열번호 25(예를 들면, H2M6490N), 서열번호 33 및 서열번호 41(예를 들면, H1M6492N), 서열번호 49 및 서열번호 57(예를 들면, H1M6494N), 서열번호 65 및 서열번호 73(예를 들면, H2M6495N), 서열번호 81 및 서열번호 89(예를 들면, H2M6741N), 서열번호 97 및 서열번호 105(예를 들면, H4H6311P), 서열번호 113 및 서열번호 121(예를 들면, H4H6316P), 서열번호 129 및 서열번호 137(예를 들면, H4H6317P), 서열번호 145 및 서열번호 153(예를 들면, H4H6323P), 서열번호 161 및 서열번호 169(예를 들면, H4H6327P2), 서열번호 177 및 서열번호 185(예를 들면, H4H6328P), 서열번호 193 및 서열번호 201(예를 들면, H4H6329P), 서열번호 209 및 서열번호 217(예를 들면, H4H6330P), 서열번호 225 및 서열번호 233(예를 들면, H4H6332P), 서열번호 241 및 서열번호 249(예를 들면, H4H6334P), 서열번호 257 및 서열번호 265(예를 들면, H4H6334P2), 서열번호 273 및 서열번호 281(예를 들면, H4H6335P), 서열번호 289 및 서열번호 297(예를 들면, H4H6337P), 서열번호 305 및 서열번호 313(예를 들면, H4H6338P), 서열번호 321 및 서열번호 329(예를 들면, H4H6340P), 서열번호 337 및 서열번호 345(예를 들면, H4H6343P), 서열번호 353 및 서열번호 361(예를 들면, H4H6345P), 서열번호 369 및 서열번호 377(예를 들면, H4H6347P), 서열번호 385 및 서열번호 393(예를 들면, H4H6353P), 서열번호 401 및 서열번호 409(예를 들면, H4H6490N2), 및 서열번호 417 및 서열번호 425(예를 들면, H4H6492N2)에 의해 암호화된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열들을 포함한다.
본 발명은, 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-big-ET-1 항체들을 포함한다. 몇몇의 적용에서, 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형, 또는, 예를 들면, 항체 의존적 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위한, 올리고사카라이드 쇄 상에 존재하는 퓨코스 모이어티가 결여되어 있는 항체가 유용할 수 있다(참조: Shield et al. (2002) JBC 277:26733-26740). 다른 적용에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)를 변형시키기 위해 갈락토실화의 변형이 이루어질 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, big-ET-1에 특이적으로 결합하는 재조합 사람 항체 또는 이의 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 관련 양상에서, 본 발명은, 엔도텔린-1 저해제와 제2 치료제의 병용물인 조성물을 특징으로 한다. 한 실시형태에서, 상기 엔도텔린-1 저해제는 항체 또는 이의 단편이다. 한 실시형태에서, 상기 제2 치료제는, 엔도텔린-1 저해제와 유리하게 병용되는 임의의 제제이다. 엔도텔린-1 저해제와 유리하게 병용될 수 있는 예시의 제제는, 제한 없이, 엔도텔린-1과 엔도텔린-1 수용체 사이의 상호작용을 저해하는 다른 제제, 및/또는 엔도텔린-1 상류 또는 하류 신호전달을 간섭하는 제제를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 항-big-ET-1 항체 또는 항체의 항원-결합부를 이용하여 엔도텔린-1 활성을 저해하는 방법을 제공하고, 여기서, 치료 방법은, 본 발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다. 치료되는 장애는, 엔도텔린-1 활성의 제거, 저해 또는 감소에 의해 개선되거나, 완화되거나, 저해되거나, 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체 또는 항체 단편은, 엔도텔린-1과 엔도텔린-1 수용체(예를 들면, ETaR 및/또는 ETbR) 사이의 상호작용을 차단하는 기능을 하거나, 그렇지 않으면, 엔도텔린-1의 신호전달 활성을 저해하는 기능을 할 수 있다. 본 발명의 몇몇의 실시형태에서, 본 발명의 방법을 통해 치료되거나, 예방되거나, 완화되는 질환 또는 병태로는 폐 고혈압(폐 대동맥 고혈압, 좌심 질환과 관련된 폐 고혈압, 폐 질환과 관련된 폐 고혈압, 또는 만성 혈전성 질환으로 인한 폐 고혈압 및 색전성 질환으로 인한 폐 고혈압 포함), 신장 질환, 동종이식편 거부, 당뇨병, 암(전립선암, 유방암, 난소암, 및 흑색종 포함), 심부전, 죽상 동맥경화증, 섬유성 질환, 안 질환, 및 통증(통각수용성 통증 및 내장 통증 포함)이 포함된다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법을 통해 치료되거나, 예방되거나, 안화되는 통증으로는, 염증과 관련된 통증, 수술 절개 후, 신경병증, 골절, 화상, 골다공증성 골절, 골암, 통풍, 편두통, 섬유근육통, 암-관련 통증 또는 화학치료요법-유도된 통증이 포함된다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법을 통해 치료되거나, 예방되거나, 완화되는 안 질환 또는 병태로는, 노화-관련 황반 변성(AMD), 삼출성 AMD, 당뇨성 망막병증, 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO), 홍채 혈관신생, 녹내장(예를 들면, 혈관신생성 녹내장), 녹내장에서의 수술 후 섬유증, 증식성 초자체 망막병증(PVR), 맥락막 혈관신생, 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 초자체 혈관신생, 판누스(pannus), 익상편(pterygium), 황반 부종, 당뇨성 황반 부종(DME), 혈관 망막병증, 망막 변성, 포도막염, 및 눈의 염증성 질환이 포함된다. 본 발명의 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법을 통해 치료되거나, 예방되거나, 완화되는 섬유성 질환 또는 병태로는 폐 섬유증, 안구 섬유증, 피부 섬유증, 신장 섬유증, 또는 간 섬유증이 포함된다.
본 발명은, 또한, 환자에서의 엔도텔린-1 활성과 관련되거나 엔도텔린-1 활성에 의해 야기되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조시, 본 발명의 항-big-ET-1 항체 또는 항체의 항원 결합부를 사용하는 것을 포함한다.
다른 실시형태들은, 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1. 폐 동맥 단면적( PA CSA ). H4H6327P2 및 보센탄 치료는, 만성 저산소증에 의해 유도된 PA CSA의 감소를 유의하게 줄인다. 기저선(즉, 정상 산소증)으로부터의 PA CSA의 보존은 보다 적은 근육 벽 비후(muscular wall thickening)(즉, 혈관 재형성(vessel remodeling)) 및/또는 보다 적은 혈관 긴장(vascular tone)(즉, 혈관 수축)을 반영한다. #은, P < 0.001 대 정상 산소증을 표시한다. **, ***은 각각 P < 0.01, 및 0.001을 나타낸다.
도 2. 우심실 심박출량( RV CO ). H4H6327P2는 보센탄보다 더 큰 효능으로 RV CO를 보존한다. 만성 저산소증 동안의 RV CO의 감소는, 폐 동맥에서의 상승된 혈관 저항과 관련되어 있다. 보센탄-치료된 동물보다 H4H6327P2-치료된 동물에서 더 큰 RV CO의 보존은, H4H6327P2가 RV 후부하(afterload)(즉, 폐 동맥 저항)를 감소시키는데 있어서 더 큰 효능을 가질 수 있음을 시사한다. #은, P < 0.001 대 정상 산소증을 표시한다. *, **, ***은 각각 P < 0.05, 0.01, 및 0.001을 나타낸다.
도 3. 우심실-대-좌심실 + 격막( RV /( LV +S)). 만성 저산소증 동안의 H4H6327P2 치료는 RV/(LV+S) 중량비의 증가를 유의하게 줄인다. 기저선(즉, 정상 산소증)으로부터의 비가 클수록, 비대증의 정도가 커지고, 이는, 보다 큰 혈관 저항에도 불구하고 폐 동맥을 통한 혈류를 유지하기 위해 요구되는 보상 메커니즘으로서 발생한다. 보센탄 치료로부터의 중량비는 비히클 및 아이소타입 대조군 그룹 둘 다와 유사하고, 이는, 만성 저산소증에 노출된 RV 비대증의 발달을 나타낸다. #은, P < 0.001 대 정상 산소증을 나타낸다. *은 P < 0.05를 표시한다.
도 4. 우심실 자유벽 ( free wall ) 두께, 수축기( systole )( RVFW , s). H4H6327P2 치료는, 만성 저산소증에서의 RVFW 비후를 유의하게 감소시킨다. RV의 벽 비후(즉, 비대증)는, 보다 큰 혈관 저항에도 불구하고 폐 동맥을 통한 혈류를 유지하는데 필요한 보상 메커니즘으로서 발달한다. 비히클 및 아이소타입 대조군 그룹에서의 (정상 산소증에 비하여) 보다 큰 RV 벽 두께는 RV 비대증의 발달을 나타내고; 보센탄 치료는, 비히클 치료와 비교하여 RVFW의 비후를 감소(유의한 정도는 아님)시키는 경향이 있다. #은, P < 0.001 대 정상 산소증을 나타낸다. ***은 P < 0.001을 나타낸다.
도 5. 원위 폐 세동맥 벽 비후 . H4H6327P2 및 보센탄으로의 치료는, 보다 작은 벽 두께-대-혈관 직경 비(보다 적은 평활근 층 증식 및/또는 평활근 세포 동원(즉, 보다 적은 혈관 재형성)의 반영)로 나타나는 바와 같이, 만성 저산소증에 의해 유도된 원위 폐 세동맥 벽 비후를 유의하게 반전시킨다. 혈관 벽 비후는, 동물이 일단 몇일 동안 정상 산소증으로 돌아오면 원상회복될 수 있다. †††는 P < 0.001 대 정상 산소증을 표시한다. *, ***은 P < 0.05, 0.001을 나타낸다. [본래 도면 설명으로부터의 텍스트]
도 6. 폐 동맥 단면적( PA CSA ). H4H6327P2 및 보센탄은, 만성 저산소증에 의해 유도된 폐 동맥 단면적(PA CSA)의 감소를 반전시킨다. 기저선(정상 산소증)으로부터의 PA CSA의 보존은, 보다 적은 근육 벽 비후(즉, 혈관 재형성) 및/또는 보다 적은 혈관 긴장(즉, 혈관 수축)을 반영한다. 혈관 단면적 감소는, 동물이 일단 몇일 동안 정상 산소증으로 돌아오면 원상회복될 수 있다. †††는, P < 0.001 대 정상 산소증을 표시한다. **, ***은 P < 0.01, 0.001을 나타낸다.
도 7. 우심실 자유벽 ( RVFW ) 비후 . H4H6327P2 및 보센탄 치료는 만성 저산소증에서 우심실 자유벽(RVFW) 비후를 유의하게 반전시킨다. RV의 벽 비후(즉, 비대증)는, 보다 큰 혈관 저항에도 불구하고 폐 동맥을 통한 혈류를 유지하는데 필요한 보상 메커니즘으로서 발달한다. 아이소타입 대조군 그룹에서의 (정상 산소증에 비하여) 보다 큰 RV 벽 두께는 RV 비대증의 발달을 나타낸다. 혈관 벽 비후는, 동물이 일단 몇일 동안 정상 산소증으로 돌아오면 원상회복될 수 있다. †††는, P < 0.001 대 정상 산소증을 표시한다. ***은 P < 0.001을 나타낸다.
도 8. 우심실-대-좌심실+격막[ RV /( LV +S)] 중량의 비. 만성 저산소증 동안의 H4H6327P2 치료는, 우심실-대-좌심실+격막[RV/(LV+S)] 중량의 비에 대해 영향이 거의 없다. 기저선(정상 산소증)으로부터의 중량비가 클수록, RV 비대증의 정도가 커지고, 이는, 보다 큰 혈관 저항에도 불구하고 폐 동맥을 통한 혈류를 유지하기 위해 요구되는 보상 메커니즘으로서 발생한다. H4H6327P2 및 보센탄 치료에 대한 중량비는 아이소타입 대조군 그룹과 유사하고, 이는, 만성 저산소증에 노출된 RV 비대증의 발달을 나타낸다. †††는, P < 0.001 대 정상 산소증을 나타낸다. *, ***은 P < 0.05, 0.001을 표시한다.
도 9. 우심실 심박출량( RV CO ). H4H6327P2는, 우심실 심박출량(RV CO)을 보존하는 경향이 있다. 만성 저산소증 동안의 RV CO의 감소는, 폐 동맥에서의 상승된 혈관 저항과 관련되어 있다. 항체-치료된 동물에 비해 보센탄-치료된 동물에서 더 큰 RV CO의 보존은, 보센탄이 RV 후부하(즉, 폐 동맥 저항)를 감소시키는데 있어서 더 큰 효능을 가질 수 있음을 시사한다. †††는, P < 0.001 대 정상 산소증을 표시한다. *, **, ***은 P < 0.05, 0.01, 및 0.001을 나타낸다.
도 10. 우심실 수축기압. H4H6327P2 치료는 우심실 수축기압(RVSP)을 감소시키지 않는다. 만성 저산소증 동안의 상승된 RVSP는, 폐 동맥에서의 증가된 혈관 저항과 관련되어 있고; 이는, 폐 동맥 판막을 개방하는데 요구되는 압력이다. 보센탄은 RVSP를 감소시키는 경향이 있고, 반면, 항-Big ET-1 항체 치료는 그렇지 않다. RVSP의 상승은, 동물이 몇일 동안 정상 산소증으로 돌아가는 경우에 기저선에 가깝게 회복된다. †††는, P < 0.001 대 정상 산소증을 표시한다. **, ***은 P < 0.01, 0.001을 나타낸다.
도 11. 통각방위성 ( nocifensive ) 행동. 통각방위성 행동은, 항-big ET-1 항체 H4H6327P2가 투여된 마우스에서 감소된다. 12주령 C57BL/6 수컷 마우스는 3개의 실험 코호트로 분리되었다: 30mg/kg의 비-big ET-1 결합 아이소타입 대조군 항체가 투여된 대조군 그룹(n=6)(아이소타입)(단색 막대); 3mg/kg의 항 big-ET-1 항체 H4H6327P2가 투여된 저용량 그룹(n=7); 및 30mg/kg의 H4H6327P2가 투여된 고용량 그룹(n=7)(대각선 크로스-해치 막대). *은 P < 0.05 대 대조군을 나타낸다.
본 발명을 기술하기 전에, 본 발명은, 기술되는 특정 방법들 및 실험 조건들에 한정되지 않고, 따라서, 이러한 방법들 및 조건들은 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시형태만을 기술할 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에만 한정될 것이므로, 제한되도록 의도되지 않음이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은, 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "약"은, 인용된 특정 수적 값과 관련하여 사용되는 경우, 상기 값이 인용된 값으로부터 1% 이하만큼 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같은 표현 "약 100"은 99 및 101, 및 이들 사이의 모든 값(예를 들면, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기술되는 바와 유사하거나 등가인 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 재료들이 하기에 기술된다. 본 명세서에 언급되는 모든 특허 출원들 및 비-특허 공개들은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같은 표현 "프리-프로-엔도텔린-1", "프리-프로-ET-1", 및 "프리-프로-EDN-1" 등은, 서열번호 433에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 표현 "big-엔도텔린-1", "big-EDN-1", 및 "big-ET-1" 등은, 서열번호 433의 아미노산 53 내지 90과 동일한 서열번호 434의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 표현 "엔도텔린-1", "ET-1", "EDN-1", "small-엔도텔린-1", "small-ET-1", 및 "small-EDN-1" 등은, 서열번호 433의 아미노산 53 내지 73과 동일한 서열번호 435의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. (small-ET-1의 아미노산 서열은 펩타이드의 마우스 및 사람 버젼에 대해 동일하다.)
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 표현들 모두(예를 들면, "프리-프로-ET-1", "big-ET-1", "small-ET-1", "엔도텔린-1" 등)는 비-사람 종 유래(예를 들면, "마우스 프리-프로-ET-1", "마우스 big-ET-1", "마우스 small-ET-1", "마우스 엔도텔린-1" 등)인 것으로 명시되지 않는 한 상응하는 분자의 사람 버젼을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 표현 "엔도텔린-전환 효소-1", 및 "ECE-1" 등은, 서열번호 434의 Trp-21 및 Val-22의 연결부(junction)에서 big-ET-1을 특이적으로 개열시켜, 서열번호 434의 아미노산 22 내지 38을 갖는 small-ET-1 및 비활성 C-말단 생성물을 생성할 수 있는 효소를 의미한다. 예시 ECE-1은, 서열번호 436의 아미노산 서열을 갖는 사람 효소이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는, 특정 항원(예를 들면, big-ET-1)에 특이적으로 결합하거나 특정 항원과 상호작용하는 1개 이상의 상보성 결정 영역(CDR)들을 포함하는, 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는, 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중(H)쇄들 및 2개의 경(L)쇄들의 4개의 폴리펩타이드 쇄들뿐만 아니라 이들의 다량체들(예를 들면, IgM)을 포함하는, 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에 HCVR 또는 VH로 약기함) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인들인 CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에 LCVR 또는 VL로 약기함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역들은, 프레임워크 영역(FR)이라고 칭하는 보다 보존된 영역들에 의해 간삽된(interspersed) 상보성 결정 영역(CDR)들이라고 칭하는 초가변성 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기 순서로 배열된, 3개의 CDR들 및 4개의 FR들로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 실시형태에서, 항-big-ET-1 항체 (또는 이의 항원-결합부)의 FR들은 사람 생식선 서열과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스(consensus) 서열은, 2개 이상의 CDR들의 병렬 분석(side-by-side analysis)에 기초하여 정의될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는, 또한, 전장 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 항체의 "항원-결합부", 및 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는, 임의의 천연 발생 폴리펩타이드 또는 당단백질, 효소적으로 수득가능한 폴리펩타이드 또는 당단백질, 합성 폴리펩타이드 또는 당단백질, 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 항체 가변 및 임의의 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현에 관여하는 단백질분해성 소화 또는 재조합 유전자 조작 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 이용하여, 예를 들면, 전장 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/공지되어 있거나, 예를 들면, 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들면, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 용이하게 입수가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 서열분석하고, 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용함으로써 조작하여, 1개 이상의 가변 및/또는 불변 도메인들을 적합한 입체배치(configuration)로 배열하거나, 또는 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산 등을 변형, 부가, 또는 결실시킬 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적 예로는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변성 영역을 모방하는 아미노산 잔기들로 이루어진 최소 인식 단위(예를 들면, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들면, CDR3 펩타이드), 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드가 포함된다. 다른 조작된 분자, 예를 들면, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-절편이식된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들면, 1가의 나노바디, 2가의 나노바디 등), 소형 모듈 면역약제(SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인은, 또한, 본원에서 사용되는 바와 같은 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 1개 이상의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은, 임의의 크기 또는 아미노산 조성으로 이루어질 수 있고, 일반적으로, 1개 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 1개 이상의 프레임워크 서열과 프레임 내에 존재하는, 1개 이상의 CDR을 포함할 것이다. VL과 연합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인들은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치될 수 있다. 예를 들면, 가변 영역은 이량체일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
소정 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은, 1개 이상의 불변 도메인에 공유 연결된 1개 이상의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적 예시 입체배치로는: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL이 포함된다. 상기 열거된 예시 입체배치 중 어느 하나를 포함하는, 가변 및 불변 도메인들의 임의의 입체배치에서, 가변 및 불변 도메인들은, 서로 직접적으로 연결될 수 있거나, 전장 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 2개 이상(예를 들면, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산들로 이루어질 수 있고, 이는, 단일 폴리펩타이드 분자 내에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인들 사이의 가요성 또는 반-가요성 연결을 초래한다. 또한, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은, 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 입체배치들 중 어느 하나의 동종-이량체 또는 이종-이량체 (또는 다른 다량체)를, 서로의 비공유 연합으로 그리고/또는 1개 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과의 비공유 연합으로(예를 들면, 디설파이드 결합(들)에 의해) 포함할 수 있다.
전장 항체 분자에 관해서, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들면, 이특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 2개 이상의 상이한 가변 도메인들을 포함할 것이고, 여기서, 각각의 가변 도메인은, 별개의 항원에 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시 이특이적 항체 포맷을 포함하는 임의의 다중특이적 항체 포맷은, 당해 분야에서 이용가능한 일상적인 기술을 이용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편과 관련하여 사용하기에 적합할 수 있다.
본 발명의 항체들은 보체-의존적 세포독성(CDC) 또는 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 통해 기능할 수 있다. "보체-의존적 세포독성"(CDC)은, 보체의 존재시 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 분해를 말한다. "항체-의존적 세포-매개된 세포독성"(ADCC)은, Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들면, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식함으로써, 표적 세포의 분해를 유도하는, 세포-매개 반응을 말한다. CDC 및 ADCC는, 익히 공지되어 있고 당해 분야에서 이용가능한 검정을 이용하여 측정될 수 있다. (예를 들면, U.S. 5,500,362 및 5,821,337, 및 Clynes et al . (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:652-656 참조). 항체의 불변 영역은, 보체를 고정하고 세포-의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 아이소타입은, 항체가 세포독성을 매개하는데 바람직한지의 여부에 기초하여 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "사람 항체"는, 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 항체들은, 예를 들면, CDR들에, 특히, CDR3에, 사람 생식선 면역글로불린 서열들에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "사람 항체"는, 다른 포유동물 종, 예를 들면, 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열에 절편이식된 항체를 포함하도록 의도되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 사람 항체"는, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리되는, 모든 사람 항체, 예를 들면, 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현되는 항체(하기에 추가로 기술함), 재조합으로부터 단리된 항체, 조합적 사람 항체 라이브러리(하기에 추가로 기술함), 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들면, Taylor et al. (1992) Nucl . Acids Res 20:6287-6295 참조), 또는 다른 DNA 서열에의 사람 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱에 관여하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리되는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 사람 항체는, 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역들을 갖는다. 그러나, 소정 실시형태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 사람 Ig 서열에 대해 유전자이식된 동물이 사용되는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)되므로, 재조합 항체들의 VH 및 VL 영역들의 아미노산 서열은, 사람 생식선 VH 및 VL 서열들로부터 유도되고 이들에 관련된 한편, 생체내에서 사람 항체 생식선 레퍼토리 내에 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
사람 항체는, 힌지 이질성과 관련된 2개의 형태로 존재할 수 있다. 한 형태에서, 면역글로불린 분자는, 이량체가 쇄간 중쇄 디설파이드 결합에 의해 유지되는, 대략 150 내지 160kDa의 안정한 4개 쇄 작제물을 포함한다. 제2 형태에서, 이량체는 쇄간 디설파이드 결합을 통해 연결되지 않고, 공유적으로 커플링된 경쇄 및 중쇄(반-항체)로 이루어진 약 75 내지 80kDa의 분자가 형성된다. 이들 형태는 친화성 정제 후에도 분리하기 매우 곤란하였다.
각종 온전한 IgG 아이소타입에서 제2 형태의 출현 빈도는, 항체의 힌지 영역 아이소타입과 관련된 구조적 차이에 기인하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 사람 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은, 제2 형태의 출현을 사람 IgG1 힌지를 이용하여 전형적으로 관찰되는 수준으로 유의하게 감소시킬 수 있다(Angal et al. (1993) Mol Immunol 30:105-108). 본 발명은, 바람직한 항체 형태의 수율을 향상시키기 위해, 예를 들면, 제조시에 바람직할 수 있는, 힌지, CH2, 또는 CH3 영역에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "단리된 항체"는, 자연 환경의 하나 이상의 구성성분으로부터 동정되어 분리되고/분리되거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들면, 유기체의 하나 이상의 구성성분으로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생성된 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체는, 본 발명의 목적을 위해 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는, 또한, 재조합체 세포 내의 원위치에(in situ) 항체를 포함한다. 단리된 항체는, 하나 이상의 정제 또는 단리 단계를 행한 항체이다. 소정 실시형태에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.
용어 "특이적으로 결합한다" 등은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 생리학적 조건 하에 상대적으로 안정한 항원과 복합체를 형성함을 의미한다. 항체가 항원에 특이적으로 결합하는지의 여부를 측정하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 평형 투석, 및 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 예를 들면, 본 발명과 관련하여 사용되는 바와 같은 사람 big-ET-1에 "특이적으로 결합하는" 항체는, 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정시, 약 1000nM 미만, 약 500nM 미만, 약 300nM 미만, 약 200nM 미만, 약 100nM 미만, 약 90nM 미만, 약 80nM 미만, 약 70nM 미만, 약 60nM 미만, 약 50nM 미만, 약 40nM 미만, 약 30nM 미만, 약 20nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5nM 미만, 약 4nM 미만, 약 3nM 미만, 약 2nM 미만, 약 1nM 미만, 또는 약 0.5nM 미만의 KD로 사람 big-Et-1 또는 이의 부분에 결합하는 항체를 포함한다(예를 들면, 본원에서 실시예 3 참조). 그러나, 사람 big-ET-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들면, 다른 (비-사람) 종 유래의 엔도텔린 분자에 대해 교차-반응성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "중화" 또는 "차단" 항체는, big-ET-1에 대한 이들 항체의 결합이: (i) 엔도텔린 전환 효소(예를 들면, ECE-1)에 의한 big-ET-1의 개열을 저해하거나 방해하고/하거나, (ii) 엔도텔린-1의 하나 이상의 생물학적 기능의 저해를 초래하는, 항체를 말하는 것으로 의도된다. big-ET-1 중화 또는 차단 항체에 의해 야기된 저해는, 적절한 검정을 이용하여 검출가능한 한, 완전할 필요는 없다. big-ET-1 개열 저해를 검출하기 위한 예시 검정은 본원의 다른 곳에서 기술된다.
본원에 개시된 항-big-ET-1 항체는, 이들 항체들이 유도된 상응하는 생식선 서열과 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들의 프레임워크 및/또는 CDR 영역들에 1개 이상의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들면, 공공의 항체 서열 데이터베이스로부터 이용가능한 생식선 서열에 대해 본원에 개시된 아미노산 서열을 비교함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명은, 본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유도된 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서, 1개 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 1개 이상의 아미노산은, 이들 항체들이 유도된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 다른 사람 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환에 대해 돌연변이된다(이러한 서열 변화는 본원에서 총체적으로 "생식선 돌연변이"로 나타냄). 당해 분야 숙련가는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 출발하여, 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체들 및 항원-결합 단편을 쉽게 제조할 수 있다. 소정 실시형태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기들 전부는, 항체가 유도된 본래 생식선 서열에서 발견된 잔기로 역 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 소정 잔기들만이, 예를 들면, FR1의 처음 8개의 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이, 또는 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이 본래 생식선 서열로 역 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은, 상이한 생식선 서열(즉, 항체가 본래 유도된 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체는, 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 예를 들면, 여기서, 소정 개별 잔기들은 특정 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이되고, 한편, 본래 생식선 서열과 상이한 소정의 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 단편은, 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들면, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 개선되거나 향상된 길항제 또는 작용제 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명 내에 포함된다.
본 발명은, 또한, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는, 본원에 개시되어 있는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체를 포함하는, 항-big-ET-1 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 본원에 개시되어 있는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여, 예를 들면, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는, HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는, 항-big-ET-1 항체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "표면 플라스몬 공명"은, 예를 들면, BIAcoreTM 시스템(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 이용하여, 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경의 검출에 의한 실시간 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "KD"는, 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 나타내는 것으로 의도된다.
용어 "에피토프"는, 파라토프로서 공지되어 있는 항체 분자의 가변 영역에서의 특정 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원성 결정인자를 말한다. 단일 항원은 1개 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체들은 항원 상의 상이한 구역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체배좌 또는 선형일 수 있다. 입체배좌 에피토프는, 선형 폴리펩타이드 쇄의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 제조된다. 선형 에피토프는, 폴리펩타이드 쇄 내에서 인접한 아미노산 잔기들에 의해 제조된 에피토프이다. 소정 상황에서, 에피토프는 항원 상의 사카라이드, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹의 모이어티들을 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 나타내는 경우의 용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)으로의 결실로 최적으로 정렬되는 경우, 서열 동일성의 임의의 익히 공지되어 있는 알고리듬, 예를 들면, 하기에 논의되는 바와 같은 FASTA, BLAST, 또는 Gap에 의해 측정시, 뉴클레오타이드 염기들의 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재함을 나타낸다. 참조 핵산 분자에 대해 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 소정 예에 있어서, 표준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용되는 바와 같은 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 2개의 펩타이드 서열들이, 예를 들면, 디폴트 갭 중량을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 95%의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환이 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은, 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 그룹)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 서열 동일성 백분율 또는 유사성 정도는 상향 조정하여 치환의 보존적 성질을 교정할 수 있다. 이러한 조정을 이루기 위한 수단은 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[Pearson (1994) Methods Mol Biol 24: 307-331]을 참조한다. 유사한 화학적 특성을 지닌 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌이 포함된다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존적 대체는, 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445]에 개시되어 있는 PAM250 로그-우도(log-likelihood) 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도 보존적" 대체는, PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성이라고도 나타내는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은, 전형적으로, 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는, 보존적 아미노산 치환을 포함하는 각종 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성의 측정값을 이용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들면, GCG 소프트웨어는, 밀접하게 관련되어 있는 폴리펩타이드들, 예를 들면, 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩타이드들 사이의 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위해, 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 프로그램, 예를 들면, Gap 및 Bestfit을 함유한다. 예를 들면, GCG 버젼 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은, 또한, GCG 버젼 6.1로의 프로그램인 디폴트 또는 추천된 파라미터를 이용한 FASTA를 이용하여 비교할 수 있다. FASTA(예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는, 쿼리 서열과 검색 서열 사이의 최고 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다(Pearson (2000) Methods Mol Biol 132:185-219). 상이한 유기체 유래의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 본 발명의 서열을 비교하는 경우의 다른 바람직한 알고리듬은, 디폴트 파라미터를 이용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히, BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들면, 각각 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:3389-402]을 참조한다.
항체들의 생물학적 특징
본 발명의 항체들은 사람 big-ET-1(서열번호 434)에 특이적으로 결합하지만, 사람 small-ET-1(서열번호 435)에는 결합하지 않는다. 항체와 항원 사이의 상호작용을 정량적으로 또는 정성적으로 측정하는 임의의 검정 포맷을 사용하여, 항체가 사람 big-ET-1 및/또는 사람 small-ET-1에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않는지의 여부를 측정할 수 있다. 예를 들면, 본원 실시예 3에 설명되는 바와 같은 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여, 특정 시험 항체가 사람 big-ET-1 및/또는 사람 small-ET-1에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않는지의 여부를 측정할 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 표면 플라스몬 공명 검정에서 small-ET-1에 대한 결합을 시험하는 경우에 약 1.0E-06M(즉, > 1000nM)보다 더 큰 KD 값을 나타내거나, small-ET-1에 대한 임의의 검출가능한 결합을 나타내지 않는 항체는, "사람 small-ET-1에 결합하지 않는" 항체인 것으로 고려된다. 그럼에도 불구하고, 본원에 표현이 정의되어 있는 사람 small-ET-1에 결합하지 않는 본 발명의 소정 예시 항체들은, 본원 실시예 3에 설명된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 검정, 또는 유사한 검정으로 사람 big-ET-1에 대한 결합을 시험하는 경우에 1.0E-07M(예를 들면, 1.0E-08M, 1.0E-09M, 1.0E-10M, 1.0E-11M, 1.0E-12M, 또는 그 이하)보다 더 적은 KD 값으로의 사람 big-ET-1에 대한 특이적 결합을 입증한다.
본 발명의 소정 예시 항체들의 다른 특징은, 엔도텔린-전환 효소-1(ECE-1)에 의한 big-ET-1(서열번호 434)의 개열을 차단하는 능력이다. ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열은 2개의 단편들을 생산한다: small-ET-1(서열번호 434의 N-말단 21개 아미노산에 상응), 및 비활성 C-말단 생성물(서열번호 434의 C-말단 17개 아미노산에 상응). 따라서, big-ET-1이 ECE-1과 혼합되는 경우, 생물학적으로 활성인 small-ET-1의 출현 및/또는 비활성 C-말단 펩타이드의 출현은, ECE-1에 의해 big-ET-1이 개열되는 정도의 지표로서 작용한다.
ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열을 검출하는 임의의 검정 포맷을 사용하여, 항체가 본원에서 사용되는 표현과 같이 "개열을 차단"하는지를 측정할 수 있다. 항체가 ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열을 차단하는지를 측정하는데 사용될 수 있는 비제한적 예시 검정 포맷은 본원에서 실시예 4에 나타낸다. 당해 실시예에서, big-ET-1의 개열은, 엔도텔린-1(즉, smallET-1, big-ET-1의 개열 생성물)의 존재에 대해서만 반응하여 리포터 신호를 생산하는 조작된 세포주를 이용하여 간접적으로 검출된다. 특히, 이러한 검정 포맷은, 루시페라제 리포터와 함께 사람 엔도텔린 수용체 A형(ETaR)을 발현하는 세포주를 사용한다. 개열 반응은, 항체들이 big-ET-1에 첨가되고, 이어서, ECE-1이 첨가되는 제1 설정이고, 이어서, big-ET-1의 효소적 개열에 대해 전도성인 조건 하에 적절한 양의 시간 동안 항온배양하기 위한 반응을 행한다(예를 들면, 37℃에서 밤새). 이어서, 개열 반응물을 ETaR-발현 리포터 세포주에 첨가하고, 리포터 활성의 양(존재하는 경우)을 측정한다. 차단 항체는 big-ET-1의 개열을 저해할 것이고, 따라서, small-ET-1의 형성을 저해할 것이다. 차단 항체를 포함하는 반응물은, 후속적으로, 리포터 세포주에 첨가되는 경우, 감소된 활성을 생성하거나, 리포터 활성을 생성하지 않을 것이다. 이러한 검정 포맷에 사용된 항체의 양을 변화시킴으로써, big-ET-1 개열의 50%를 저해하는데 필요한 항체의 양을 계산하여 IC50 값으로 표현할 수 있다(예를 들면, 실시예4, 표 4 내지 표 5 참조). 본 발명에 따르면, 항-big-ET-1 항체는, 항체가 상기 기술된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정으로 시험되는 경우에 약 1.0E-08M(예를 들면, 약 9.0E-09M, 약 8.5E-09M, 약 8.0E-09M, 약 7.5E-09M, 약 7.0E-09M, 약 6.5E-09M, 약 6.0E-09M, 약 5.5E-09M, 약 5.0E-09M, 약 4.5E-09M, 약 4.0E-09M, 약 3.5E-09M, 3.0E-09M, 약 2.5E-09M, 약 2.0E-09M, 약 1.5E-09M, 약 1.0E-09M, 약 9.0E-10M, 약 8.5E-10M, 약 8.0E-10M, 약 7.5E-10M, 약 7.0E-10M, 약 6.5E-10M, 약 6.0E-10M, 약 5.5E-10M, 약 5.0E-10M, 약 4.5E-10M, 약 4.0E-10M, 약 3.5E-10M, 3.0E-10M, 약 2.5E-10M, 약 2.0E-10M, 약 1.5E-10M, 약 1.0E-10M, 또는 그 이하)의 IC50을 나타내면, "ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열을 차단한다".
ECE-1에 의해 항체가 big-ET-1의 개열을 차단하는지를 측정하는데 사용될 수 있는 추가의, 또는 대안의 예시 검정 포맷은 본원에서 실시예5에 나타낸다. 이러한 검정 포맷에서, 항체가 big-ET-1에 ccja가되고, 이어서, ECE-1이 첨가되는 개열 반응이 설정된다. 반응을 행하여, big-ET-1의 효소적 개열에 대해 전도성인 조건 하에 항온배양하였고, 반응의 개시 후 각종 시점(예를 들면, 0, 15, 30 및 60분)에서 분취물을 취하였다. 분취물은, 매트릭스 보조된 레이저 흡착 이온화-플라이트 시간(MALDI-TOF) 질량 분광측정 분석하여 개열 생성물의 존재 또는 부재를 측정한다. ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열은, 특징적인 분자량을 갖는 펩타이드 생성물을 생산한다. 예를 들면, ECE-1에 의한 사람 big-ET-1의 개열은, 2475Da의 분자량을 갖는 small-ET-1, 및 1809Da의 분자량을 갖는 비활성 C-말단 펩타이드를 생산한다. MALDI-TOF에 의한 이들 단편들 중 어느 하나 또는 둘 다의 출현은, 이러한 검정에서 ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열을 나타낸다. 그러나, big-ET-1과 항-big-ET-1 항체를 합한 후, ECE-1의 첨가가 개열 생성물 중 하나 또는 둘 다를 생산하지 않는 경우(또는 음성 대조군 항체와 비교하여 실질적으로 보다 적은 개열 생성물을 생산하는 경우), 이어서, 항체가 본원에서 사용되는 표현과 같이 "ECE-1에 의한 big-ET-1의 개열을 차단한다"고 결론지어진다.
본 발명은, 또한, 동맥 혈압에서 엔도텔린-1-매개된 증가를 저해하거나 감소시키는 항체를 포함한다. 동맥 혈압에서의 엔도텔린-매개된 증가를 평가하는데 사용될 수 있는 예시 동물 모델은 본원에서 실시예 6에 설명된다. 당해 실시예에서, 마우스에 항-big-ET-1 항체를 투여하고, 이어서, 사람 big-ET-1 펩타이드를 투여한다. 동맥압의 변화는 big-ET-1 투여시도에 따라 실시간으로 측정한다. 생체활성 small-ET-1로의 생체내 big-ET-1의 개열은 평균 동맥 혈압에서의 증가로 반영된다. 차단 항-big-ET-1 항체가 이러한 검정 포맷으로 투여되는 경우, 평균 동맥 혈압은 증가하지 않거나, 아이소타입 대조군 항체의 투여와 비교하여 보다 적은 정도로 증가한다.
본 발명은, 또한, 각종 동물 통증 모델에서 통증 반응(들)을 저해하거나 감소시키는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체의 특징확인(예를 들면, 통각방위성 행동 감소)에 유용한 예시 동물 통증 모델은 본원에서 실시예 9에 설명된다. 본 발명은, 또한, 내장 통증 반응(예를 들면, 마우스 모델에서 산-유도된 내장 통증에 대한 반응)을 약화시키거나 저해하는 항-big-ET-1 항체를 포함한다. 특히, 본 발명은, 동물 모델에서 약 1 또는 10mg/kg의 용량으로 투여되는 경우에 내장 통증 반응(예를 들면, 0.6% 아세트산의 복강내 주사에 대한 반응인 복부 수축)의 적어도 20%의 저해를 나타내는 항-big-ET-1 항체를 포함한다. 소정 예에 있어서, 본 발명의 항체 투여로 인한 통증 반응의 저해 백분율은, 동물 통증 모델에서 시험하는 경우에 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 이상만큼 높을 수 있다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체의 특징확인에 사용될 수 있는 추가의 동물 통증 모델은, 예를 들면, 기계적 통각수용성 통증 반응 모델, 근육 통증 모델, 및 당해 분야에서 이용가능한 다른 유사한 동물 모델을 포함한다. 따라서, 본 발명은, 유해한 기계적 자극 및/또는 산성-염수- 또는 카라기난-유도된 근육 통각과민증에 대한 통증 반응을 약화시키거나 저해시킬 수 있는 항-big-ET-1 항체를 포함한다.
에피토프 맵핑 및 관련 기술
본 발명은, big-ET-1의 ECE-1 개열 부위에 위치하거나 상기 부위 부근에 위치하는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항체를 포함한다. ECE-1은, big-ET-1(서열번호 434)의 Trp-21 및 Val-22의 연결부에서 big-ET-1을 개열시킨다. 따라서, 본 발명은, big-ET-1(서열번호 434)의 Trp-21/Val-22 연결부의 10개 아미노산 내에 위치된 하나 이상의 아미노산들과 상호작용하는 항-big-ET-1 항체를 포함한다. 항체가 결합하는 에피토프는, big-ET-1의 ECE-1 개열 부위에 위치하거나 상기 부위 부근에 위치하는 3개 이상(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 아미노산의 단일 인접 서열로 이루어질 수 있다. 대안으로, 에피토프는, big-ET-1의 ECE-1 개열 부위(의 약 10개 아미노산 내)에 위치하거나 상기 부위 부근에 위치하는 복수의 비인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다.
당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 각종 기술을 이용하여, 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용"하는지를 측정할 수 있다. 예시 기술로는, 예를 들면, Antibodies, Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)에 기술된 것과 같은 일상적인 교차-차단 검정, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석(Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-463), 및 펩타이드 개열 분석이 포함된다. 추가로, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형을 사용할 수 있다(Tomer (2000) Protein Science 9:487-496). 항체가 함께 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 동정하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은, 질량 분광측정에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적인 용어로, 수소/중수소 교환 방법은, 목적하는 단백질을 중수소-표지하고, 이어서, 중수소-표지된 단백질에 항체를 결합시키는 것에 관여한다. 이어서, 단백질/항체 복합체를 물에 이동시켜 수소-중수소 교환을 가능하게 하여 항체에 의해 보호된 잔기(중수소-표지된 상태로 남아있음)들을 제외한 모든 잔기들에서 발생한다. 항체의 해리 후, 표적 단백질을 프로테아제 개열 및 질량 분광측정 분석시켜 항체가 함께 상호작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 예를 들면, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]을 참조한다.
본 발명은, 추가로, 본원에 기술되어 있는 특정 예시 항체들(예를 들면, H2M6486N, H2M6490N, H1M6492N, H1M6494N, H2M6495N, H2M6741N, H4H6311P, H4H6316P, H4H6317P, H4H6323P, H4H6327P2, H4H6328P, H4H6329P, H4H6330P, H4H6332P, H4H6334P, H4H6334P2, H4H6335P, H4H6337P, H4H6338P, H4H6340P, H4H6343P, H4H6345P, H4H6347P, H4H6353P, H4H6490N2, H4H6492N2 등) 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하는 항-big-ET-1 항체들를 포함한다. 유사하게, 본 발명은, 또한, big-ET-1에 결합하기 위해, 본원에 기술되어 있는 특정 예시 항체들(예를 들면, H2M6486N, H2M6490N, H1M6492N, H1M6494N, H2M6495N, H2M6741N, H4H6311P, H4H6316P, H4H6317P, H4H6323P, H4H6327P2, H4H6328P, H4H6329P, H4H6330P, H4H6332P, H4H6334P, H4H6334P2, H4H6335P, H4H6337P, H4H6338P, H4H6340P, H4H6343P, H4H6345P, H4H6347P, H4H6353P, H4H6490N2, H4H6492N2 등) 중 어느 하나와 경쟁하는 항-big-ET-1 항체들을 포함한다.
당해 분야 숙련가는, 당해 분야에 공지되어 있는 일상적인 방법을 이용함으로써, 항체가 참조 항-big-ET-1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 결합하기 위해 참조 항-big-ET-1 항체와 경쟁하는지를 용이하게 측정할 수 있다. 예를 들면, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-big-ET-1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건 하에 big-ET-1 단백질 또는 펩타이드에 결합하도록 한다. 이어서, 시험 항체의 big-ET-1 분자에 결합하는 능력을 평가한다. 시험 항체가 big-ET-1에 결합하고, 이어서, 참조 항-big-ET-1 항체와 포화 결합할 수 있는 경우, 시험 항체가 참조 항-big-ET-1 항체와 상이한 에피토프에 결합한다는 결론지을 수 있다. 한편, 시험 항체가 big-ET-1 분자에 결합하고, 이어서, 참조 항-big-ET-1 항체와 포화 결합할 수 없는 경우, 이어서, 시험 항체는 본 발명의 참조 항-big-ET-1 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 추가의 일상적인 실험(예를 들면, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여, 시험 항체의 결합의 관찰된 결여가 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 기인한 것인지, 또는 입체 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여에 관여하는 것인지를 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험은, ELISA, RIA, Biacore, 유동 세포측정, 또는 당해 분야에서 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 소정 실시형태에 따르면, 예를 들면, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 초과의 한 항체가, 경쟁적 결합 검정으로 측정시, 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90%, 또는 심지어 99%로 다른 항체의 결합을 저해하는 경우, 2개의 항체들은 동일한(또는 중첩되는(overlapping)) 에피토프에 결합한다(예를 들면, Junghans et al. (1990) Cancer Res 50:1495-1502 참조). 대안으로, 2개의 항체들은, 필수적으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 생각된다. 2개의 항체들은, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 서브세트만이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, "중첩 에피토프"를 갖는 것으로 생각된다.
항체가, 결합을 위해 참조 항-big-ET-1 항체와 경쟁하는지를 측정하기 위해, 상기 기술된 결합 방법론을 2개의 방향으로 수행한다: 제1 방향에 있어서, 참조 항체는 포화 조건 하에 big-ET-1 분자에 결합하도록 하고, 이어서, big-ET-1 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에 있어서, 시험 항체는 포화 조건 하에 big-ET-1 분자에 결합하도록 하고, 이어서, big-ET-1 분자에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 두 방향 모두에서, 제1 (포화) 항체만이 big-ET-1 분자에 결합할 수 있는 경우, 이어서, 시험 항체와 참조 항체는 big-Et-1에 결합하기 위해 경쟁한다고 결론지어진다. 당해 분야 숙련가에 의해 이해될 것인 바와 같이, 결합하기 위해 참조 항체와 경쟁하는 항체는, 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩되거나 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
사람 항체의 제조
완전 사람 모노클로날 항체를 포함한 모노클로날 항체의 생성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 임의의 공지되어 있는 방법들을 본 발명과 관련하여 사용하여 사람 big-ET-1에 특이적으로 결합하는 사람 항체를 제조할 수 있다.
VELOCIMMUNETM 기술 또는 임의의 다른 공지되어 있는 모노클로날 항체의 생성 방법을 이용하여, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, big-ET-1에 대한 고 친화성 키메라 항체를 처음으로 단리한다. 하기 실험 섹션에서와 같이, 항체들을 특징확인하고, 친화성, 선택성, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특징들에 대해 선택한다. 마우스 불변 영역은 바람직한 사람 불변 영역으로 대체하여 본 발명의 완전 사람 항체, 예를 들면, 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 생성시킨다. 선택된 불변 영역은 특정 용도에 따라 변할 수 있지만, 고 친화성 항원-결합 및 표적 특이성 특징들은 가변 영역에 존재한다.
생물학적 등가물
본 발명의 항-big-ET-1 항체들 및 항체 단편들은, 기술되어 있는 항체들로부터 변하지만 사람 big-Et-1에 결합하는 능력을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체들 및 항체 단편들은, 모 서열과 비교하는 경우 아미노산의 하나 이상의 부가, 결실, 또는 치환을 포함하지만 기술되어 있는 항체들의 생물학적 활성과 반드시 등가인 생물학적 활성을 나타낸다. 유사하게, 본 발명의 항-big-ET-1 항체-암호화 DNA 서열은, 개시되어 있는 서열과 비교하는 경우 뉴클레오타이드의 하나 이상의 부가, 결실, 또는 치환을 포함하지만 본 발명의 항-big-ET-1 항체 또는 항체 단편과 반드시 생물학적으로 등가인 항-big-ET-1 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 상기에 논의되어 있다.
예를 들면, 2개의 항원-결합 단백질들, 또는 항체들이, 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 용량으로, 단일 용량 또는 다중 용량 투여되는 경우에 흡수 속도 및 정도에서 유의한 차이를 나타내지 않는 약제학적 등가물 또는 약제학적 대체물인 경우, 이들 2개의 항원-결합 단백질들, 또는 항체들은 생물학적으로 등가인 것으로 간주된다. 흡수 정도에서는 등가이지만 흡수 속도에서는 그렇지 않은 경우에 등가물 또는 약제학적 대체물로 간주될 것이고, 또한, 흡수 속도에서의 이러한 차이는 의도적이고 라벨링에 반영되므로 생물학적으로 등가인 것으로 간주될 수 있는, 몇몇의 항체들은, 예를 들면, 만성 사용시에 유효한 신체 약물 농도의 달성에 필수적이지 않고, 연구되는 특정 약물 생성물에 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주된다.
한 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질들은, 이들의 안전성, 순도, 및 효력에 있어서 임상학적으로 의미있는 차이가 존재하지 않는 경우, 생물학적으로 등가이다.
한 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질들은, 환자가 교체되지 않은 연속적 치료요법과 비교하여, 참조 생성물과, 면역원성의 임상학적으로 유의한 변화를 포함하는 부작용 위험의 예측된 증가 또는 감소된 유효성을 갖지 않는 생물학적 생성물 사이에 환자가 1회 이상 교체될 수 있는 경우, 생물학적으로 등가이다.
한 실시형태에서, 2개의 항원-결합 단백질들은, 이들 둘 다가 통상의 메커니즘 또는 병태에 대한 작용 메커니즘 또는 사용 조건에 따라 이러한 메커니즘들이 공지되어 있는 정도로 작용하는 경우, 생물학적으로 등가이다.
생물학적 등가성은 생체내 및 시험관내 방법으로 입증될 수 있다. 생물학적 등가성 측정은, 예를 들면, (a) 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 생물학적 유체 중의 항체 또는 이의 대사물의 농도가 시간의 함수로서 측정되는, 사람 또는 다른 동물에서의 생체내 시험; (b) 사람 생체내 생체이용률 데이터와 상호관련되어 왔고 사람 생체내 생체이용률 데이터가 합리적으로 예측되는 시험관내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로 측정되는 사람 또는 다른 동물에서의 생체내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률, 또는 생물학적 등가성을 확립하는 양호하게 제어된 임상 시험을 포함한다.
본 발명의 항-big-ET-1 항체들의 생물학적으로 등가인 변이체들은, 예를 들면, 생물학적 활성에 필요하지 않은 잔기들 또는 서열들의 다양한 치환, 또는 말단 또는 내부 잔기들 또는 서열들의 결실에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 활성에 필수적인 것은 아닌 시스테인 잔기들은 결실되거나 다른아미노산으로 대체되어, 복원(renaturation)시 불필요하거나 부정확한 분자내 디설파이드 가교의 형성이 예방될 수 있다. 다른 문맥에서, 생물학적으로 등가인 항체들은, 항체들의 글리코실화 특징을 변형시키는 아미노산 변화, 예를 들면, 글리코실화를 삭제하거나 제거하는 돌연변이를 포함하는 항-big-ET-1 항체 변이체를 포함할 수 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
본 발명의 소정 실시형태에 따르면, 항-big-ET-1 항체들은 사람 big-ET-1에 결합하지만, 다른 종 유래의 big-ET-1에는 결합하지 않는다. 본 발명은, 또한, 사람 big-ET-1에, 그리고, 하나 이상의 비-사람 종 유래의 big-ET-1에 결합하는, 항-big-ET-1 항체들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항-big-ET-1 항체들은, 사람 big-ET-1에 결합할 수 있고, 경우에 따라, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 게르빌, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 사이노몰거스, 마모셋, 레서스 또는 침팬지 big-ET-1 중 하나 이상에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다.
면역접합체
본 발명은 세포독소, 화학치료 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위원소와 같은 치료학적 모이어티("면역 접합체")에 접합된 항-big-ET-1 모노클로날 항체를 포함한다. 세포독성제는, 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 면역 접합체를 형성하기 위한 적합한 세포독성제 및 화학치료제의 예는 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, WO 제05/103081호 참조).
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 일특이적, 이특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적인 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 다양한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 하나 이상의 표적 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tutt et al. (1991) J Immunol 147:60-69; Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol 22:238-244]을 참조한다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체는 다른 기능성 분자, 예를 들면, 다른 펩타이드 또는 단백질에 연결되거나 이와 동시발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 분자 실체(entity)에 (예를 들면, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 기타에 의해) 기능적으로 연결되어 제2 결합 특이성을 갖는 이-특이적 또는 다중특이적 항체를 생산할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 이-특이적 항체를 포함하고, 여기서, 면역글로불린의 1개의 암(arm)은 사람 big-ET-1 또는 이의 단편에 대해 특이적이고, 면역글로불린의 다른 암은 제2 치료 표적에 대해 특이적이거나 치료학적 모이어티에 접합된다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이-특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인의 사용을 포함하고, 여기서, 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은, 1개 이상의 아미노산이 서로 상이하고, 여기서, 1개 이상의 아미노산 차이는, 아미노산 차이가 결여되어 있는 이-특이적 항체와 비교하여, 단백질 A에 대한 이특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 실시형태에서, 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 Ig CH3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 번호매김에 의함, EU 번호매김에 의해서는 H435R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의함, EU에 의해서는 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가의 변형은 IgG1 항체의 경우에는 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I임); IgG2 항체의 경우에는 N44S, K52N 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의해서는 N384S, K392N 및 V422I임); 및 IgG4 항체의 경우에는 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I임)를 포함한다. 상기 기술된 이-특이적 항체 포맷에 대한 변이는 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다.
치료학적 제형 및 투여
본 발명은, 본 발명의 항-big-ET-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 수송, 전달, 및 내성 등을 제공하는 기타 제제와 함께 제형화된다. 다수의 적절한 제형은 모든 약사에게 공지되어 있는 처방서[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 발견될 수 있다. 이들 제형으로는, 예를 들면, 산제, 페이스트제, 연고제, 젤리제, 왁스제, 오일제, 지질제, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소낭(예를 들면, LIPOFECTIN™), DNA 접합체, 무수 흡착 페이스트제, 수-중-유 및 유-중-수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스 함유 반고체 혼합물이 포함된다. 또한 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다.
환자에게 투여되는 항체의 용량은, 환자의 연령 및 체격, 표적 질환, 병태, 및 투여 경로 등에 따라 변할 수 있다. 바람직한 용량은 통상적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 성인 환자에서 엔도텔린-1 활성과 관련된 병태 또는 질환을 치료하기 위해 본 발명의 항체를 사용하는 경우, 본 발명의 항체를 일반적으로 약 0.01 내지 약 20mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7mg/kg 체중, 약 0.03 내지 약 5mg/kg 체중, 또는 약 0.05 내지 약 3mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 기간을 조절할 수 있다. 항-big-ET-1 항체를 투여하는데 효과적인 용량 및 스케줄은 경험적으로 결정할 수 있고; 예를 들면, 환자 치료경과(patient progress)를 주기적 평가로 모니터링하고, 이에 따라 용량을 조정할 수 있다. 또한, 용량의 종간 스케일링(scaling)은 당업계에 익히 공지되어 있는 방법[예를 들면, Mordenti et al . (1991) Pharmaceut Res 8:1351-1359]을 사용하여 수행할 수 있다.
각종 전달 시스템, 예를 들면, 리포솜, 미립자, 미세캡슐의 캡슐화, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포내이입 등이 공지되어 있어, 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다[예를 들면, Wu et al. (1987) J Biol Chem 262:4429-4432 참조]. 도입 방법으로는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 당해 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 장내 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표준 니들 및 시린지를 사용하여 피하내 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치(pen delivery device)는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용가능하거나 1회용일 수 있다. 재사용가능한 펜 전달 장치는, 일반적으로, 약제학적 조성물을 함유하는 교체가능한 카트리지를 이용한다. 일단 카트리지 내의 약제학적 조성물이 모두 투여되어 카트리지가 비워지게 되면, 빈 카트리지를 폐기하고 약제학적 조성물을 함유한 새로운 카트리지로 쉽게 대체할 수 있다. 그러면, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 1회용 펜 전달 장치의 경우, 대체가능한 카트리지가 없다. 오히려, 1회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장소에 수용된 약제학적 조성물로 사전충전된다. 일단 저장소의 약제학적 조성물이 비워지게 되면, 전체 장치를 폐기한다.
다수의 재사용가능한 펜 및 오토인젝터(autoinjector) 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 그 예로는 단지 몇 개만을 명명하여, AUTOPEN™(제조원: 영국 우드스톡 소재의 Owen Mumford, Inc.), DISETRONIC™ 펜(제조원: 스위스 베르크도르프 소재의 Disetronic Medical Systems), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(제조원: 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 Eli Lilly and Co.), NOVOPEN™ I, II 및 III(제조원: 덴마크 코펜하겐 소재의 Novo Nordisk), NOVOPEN JUNIOR™(제조원: 덴마크 코펜하겐 소재의 Novo Nordisk), BD™ 펜(제조원: 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 Becton Dickinson), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ 및 OPTICLIK™(제조원: 독일 프랑크푸르트 소재의 sanofi-aventis)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 1회용 펜 전달 장치의 예로는 단지 몇 개만을 명명하여, SOLOSTAR™ 펜(제조원: sanofi-aventis), FLEXPEN™(제조원: Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™(제조원: Eli Lilly), SURECLICK™ 오토인젝터(미국 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재의 Amgen), PENLET™(독일 슈투트가르트 소재의 Haselmeier), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA™ 펜(미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 Abbott Labs)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
소정 상황에서, 약제학적 조성물은 제어된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시형태에서는 펌프를 사용할 수 있다[참조: Langer, supra; Sefton (1987) Crit Ref Biomed Eng 14:201-240]. 다른 실시형태에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있고, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida]을 참조한다. 또 다른 실시형태에서, 제어된 방출 시스템을 조성물의 표적의 부근에 위치시킴으로써 전신 용량의 분획만을 필요로 할 수 있다[예를 들면, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 참조]. 다른 제어된 방출 시스템은 문헌[참조: Langer (1990) Science 249:1527-1533]의 검토에서 논의된다.
주사가능한 제제는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 용량 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사가능한 제제는 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 주사가능한 제제는, 예를 들면, 주사용으로 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 상기 기술된 항체 또는 이의 염을 용해시키거나, 현탁시키거나, 유화시킴으로써 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들면, 생리 식염수, 글루코스 및 기타 보조제 함유 등장액 등이 있고, 이들은 적절한 가용화제, 예를 들면, 알콜(예를 들면, 에탄올), 다가 알콜(예를 들면, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들면, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소첨가된 피마자 오일의 폴리옥시에틸렌(50 mol) 부가물)] 등과 함께 배합하여 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들면, 참깨 오일, 대두 오일 등이 사용되고, 이들은 가용화제, 예를 들면, 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜 등과 함께 배합하여 사용될 수 있다. 이로써 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플 내에 충전된다.
유리하게는, 상기 기술된 경구 또는 비경구용 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량을 조절하기에 적합한 단위 용량의 용량 형태로 제조된다. 단위 용량의 이러한 용량 형태는, 예를 들면, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다. 상술한 항체의 함유량은 일반적으로 단위 용량으로 용량 형태당 약 5 내지 약 500mg이며; 특히 주사제 형태의 경우에는 상술한 항체가 약 5 내지 약 100mg 및 다른 용량 형태의 경우에는 약 10 내지 약 250mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
항체의 치료 용도
본 발명의 항체는, 그 중에서도, 엔도텔린-1 활성과 관련되거나 엔도텔린-1활성에 의해 매개되는 임의의 질환 또는 장애, 또는 big-ET-1의 small-ET-1로의 개열을 차단함으로써 치료가능한 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 완화에 유용하다. 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은, 예를 들면, 섬유성 질환[예를 들면, 섬유증(예를 들면, 폐 섬유증)], 염증성 병태, 비대증(예를 들면, 심근세포 및/또는 혈관구조의 비대), 혈관질환(예를 들면, 혈관 수준을 특징으로 하는 질환 및 장애), 안 질환, 암(예를 들면, 종양 성장 저해) 및 통증을 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체를 이용하여 치료할 수 있는 구체적 예시 질환 및 장애로는, 예를 들면, 폐 고혈압, 동맥 고혈압, 신장 질환, 동종이식편 거부, 당뇨병, 인슐린 내성, 심부전, 죽상 동맥경화증, 뇌졸중, 부정맥, 천식, 겸상 적혈구 빈혈, 뇌혈관 경련, 당뇨병성 신경병증, 강피증, COPD, 및 통각수용성 통증 및 내장 통증(예를 들면, 염증성 장 질환/과민성 장 증후군, 간질성 방광염, 췌장염, 자궁내막증, 만성 골반 통증 증후군으로부터의 통증)이 포함된다. 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편을 이용하여 치료되거나 예방되거나 완화될 수 있는 추가의 통증-관련 질환 및 장애로는, 염증 관련 통증(예를 들면, 염증성 근육 통증), 다발성 근염, 수술 절개 후(예를 들면, 외과 수술 후 통증), 신경병증(예를 들면, 당뇨병성 신경병증), 좌골 신경통, 대상포진 후 신경통, 근막 통증 증후군(예를 들면, 만성 근막 통증), 관절염, 겸상 적혈구 세포, 장 신경 허혈, 파행 통증, 골절, 화상, 골다공증성 골절, 통풍, 편두통, 섬유근육통, 복합 부위 통증 증후군, 및 급성 대상포진 통증이 포함된다.
본 발명의 항-big-ET-1 항체를 이용하여 치료될 수 있는 폐 고혈압의 서브카테고리로는, 예를 들면, 폐 동맥 고혈압, 좌심 질환과 관련된 폐 고혈압, 폐 질환과 관련된 폐 고혈압, 만성 혈전성 질환으로 인한 폐 고혈압 또는 색전성 질환으로 인한 폐 고혈압이 포함된다.
본 발명의 항-big-ET-1 항체를 투여함으로써 치료가능한 예시 안 질환으로는, 노화-관련 황반 변성(예를 들면, "습윤" AMD), 삼출성 AMD, 당뇨성 망막병증(예를 들면, 증식성 당뇨병성 망막병증), 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO)과 같은 망막 정맥 폐색 질환, 홍채 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 녹내장에서의 수술 후 섬유증, 증식성 초자체 망막병증(PVR), 맥락막 혈관신생, 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 초자체 혈관신생, 판누스(pannus), 익상편(pterygium), 황반 부종, 당뇨성 황반 부종(DME), 혈관 망막병증, 망막 변성, 포도막염, 및 눈의 염증성 질환이 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 항-big-ET-1 항체의 투여는, ET-1에 의해 야기된 혈관 수축을 차단함으로써, 성상세포(예를 들면, 축색돌기 손상) 및 망막 신경절 세포(예를 들면, 아폽토시스)에 대한 ET-1의 영향뿐만 아니라 녹내장과 관련된 신경퇴행성 영향 및 시신경 손상을 예방하고/예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명의 항-big-ET-1 항체를 투여함으로써 치료가능한 추가의 예시 섬유성 질환으로는, 특발성 폐 섬유증, 블레오마이신-유도된 폐 섬유증, 석면-유도된 폐 섬유증, 폐색성 세기관지염 증후군, 만성 천식, 급성 폐 손상 및 급성 호흡 곤란과 관련된 섬유증(예를 들면, 세균성 폐렴 유도된 섬유증, 외상 유도된 섬유증, 바이러스성 폐렴 유도된 섬유증, 인공호흡기 유도된 섬유증, 비-폐 패혈증 유도된 섬유증 및 흡인 유도된 섬유증), 규폐증, 방사선-유도된 섬유증, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 안구 섬유증, 피부 섬유증(예를 들면, 강피증), 간 섬유증(예를 들면, 간경변, 알콜-유도된 간 섬유증, 비-알콜성 지방간염(NASH), 담관 손상, 원발성 담즙성 간경변, 감염- 또는 바이러스-유도된 간 섬유증[예를 들면, 만성 HCV 감염], 자가면역 간염), 신장(신) 섬유증, 심장 섬유증, 죽상 동맥경화증, 스텐트 재협착증 및 골수섬유증이 포함된다.
또한, 본 발명의 항-big-ET-1 항체 및 이의 항원-결합 단편은, 암(예를 들면, 전립선암, 유방암, 난소암, 흑색종, 신장암, 결장직장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 방관암, 카포시 육종, 및 신경교종)의 치료, 종양 성장 저해, 종양 회귀 촉진, 전이 저해, 및/또는 병리학적 혈관신생(예를 들면, 종양 성장과 관련된 혈관신생) 저해에 유용하다. 따라서, 본 발명은, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게의 본원에 기술되어 있는 바와 같은 항-big-ET-1 항체의 투여에 의한, 암의 치료, 종양 성장 저해, 종양 회귀 촉진, 전이 전해 및/또는 병리학적 혈관 신생(예를 들면, 종양 성장과 관련된 혈관신생) 저해 방법을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편을 이용하여, 예를 들면, 뇌 및 수막, 인두, 폐 및 기관지, 위장관, 남성 및 여성 생식관, 근육, 골, 피부 및 외지, 결합 조직, 비장, 면역계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 요로, 및 눈과 같은 특정 감각 기관에서 발생하는 원발성 및/또는 전이성 종양을 치료할 수 있다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은, 하기 암들 중 하나 이상을 치료하는데 이용된다: 신장 세포 암종, 췌장 암종, 유방암, 두경부암(예를 들면, 뇌, 구강, 인두, 비인두, 하인두, 비강, 부비강, 후두, 입술 등의 암), 전립선암, 방광암, 악성 신경교종, 골육종, 골모세포종, 골연골종, 결장직장암, 위암(예를 들면, MET 증폭된 위암), 악성 중피종, 성상세포종, 교모세포종, 수모세포종, 망막모세포종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 활막 육종, 갑상선암, 결합 조직 신생물, 카포시 육종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 또는 흑색종.
병용 치료요법
본 발명은, 본 발명의 항-big-ET-1 항체를 1개 이상의 추가의 치료 활성 구성성분과 병용하여 투여함을 포함하는, 치료 투여 용법을 포함한다. 이러한 추가의 치료 활성 구성성분의 비제한적 예로는, 예를 들면, 다른 엔도텔린-1 길항제(예를 들면, 항-엔도텔린-1 항체, 상이한 항-big-ET-1 항체, 또는 엔도텔린-1의 소분자 저해제), 엔도텔린-A 수용체 길항제, 엔도텔린-B 수용체 길항제, 비-선택적 엔도텔린 수용체 길항제, 프로스타사이클린, 프로스타사이클린 유사체, 비-프로스타노이드 이노시톨 포스페이트(프로스타사이클린) 수용체 작용제, 포스포디에스테라제 5형 저해제, 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극제, 엔도텔린-전환 효소-1(ECE-1) 저해제, 네프릴라이신 저해제, 안지오텐신-II 수용체 작용제, 및 NF-카파 B 저해제가 포함된다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체와 병용 투여될 수 있는 예시 제제로는, 예를 들면, 에도텔린 수용체 길항제, 예를 들면, 보센탄(Roche), 앰브리센탄(Abbott), 시탁센탄(Encysive), 클라조센탄(Chugai), Darusentan(Abbott), ZD4054(AstraZeneca), 마시텐탄(Actelion), 아보센탄(Roche), 다글루트릴(Solvay), PS433540(Bristol-Myers Squibb), S0139(Shionogi), SLV334(Solvay), TBC3711(Encysive), 판도센탄(Pfizer), PABSA(Shionogi), YM598(Astellas) 및 YM62899(Astellas); 포스포디에스테라제 5형 저해제, 예를 들면, 실데나필(Pfizer) 및 타달라필(Lilly ICOS); 가용성 구아닐레이트 사이클라제 자극제, 예를 들면, 리오시구아트(Bayer); 및 프로스타사이클린, 프로스타노이드 및 프로스타사이클린 ㅅ수용체 작용제, 예를 들면, 일프로스트(Actelion), 트레프로스티닐(United Therapeutics), 베라프로스트(United Therapeutics), 에포프로스테놀(Actelion), 및 셀렉시파그(Actelion)가 포함된다.
본 발명의 항-big-ET-1 항체는, 예를 들면, VEGF 길항제, 예를 들면, 아프리베르셉트와 같은 "VEGF-트랩" 또는 US 7,087,411에 제시된 바와 같은 다른 VEGF-저해 융합 단백질, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 베바시주마브, 라니비주마브), VEGF 수용체의 소분자 키나제 저해제(예를 들면, 수니티니브, 소라페니브 또는 파조파니브), 또는 항-VEGF 수용체 항체와 공동-제형화되고/되거나 이들과 병용하여 투여될 수 있다. 항-big-ET-1 항체는, 또한, 항-PDGFR-베타 항체(예를 들면, 2A1E2[US 7,060,271]; HuM4Ts.22[US 5,882,644]; 또는 1B3 또는 2C5[US 7,740,850]); 항 PDGF 리간드 길항제(예를 들면, 항-PDGF-BB 항체, 항-PDGF-DD 항체, 항-PDGF-CC 항체, 항-PDGF-AB 항체, 또는 기타 PDGF 리간드 길항제, 예를 들면, 압타머, 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 펩티바디, 나노바디 또는 PDGF 리간드에 대해 지시된 항체 단편)와 병용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항-big-ET-1 항체는, EGFR 길항제(예를 들면, 항-EGFR 항체[예를 들면, 세툭시마브 또는 파니투무마브] 또는 EGFR의 소분자 저해제[예를 들면, 게피티니브 또는 에를로티니브]), EGFR 계열 구성원, 예를 들면, Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4의 길항제(예를 들면, 항-ErbB2, 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 소분자 길항제), EGFRvIII에 대해 특이적인 길항제(예를 들면, EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체), a cMET 작용제(예를 들면, 항-cMET 항체), IGF1R 길항제(예를 들면, 항-IGF1R 항체), 또는 B-raf 저해제(예를 들면, 베무라페니브, 소라페니브, GDC-0879, PLX-4720)와 공동-제형화되고/되거나 이들과 병용하여 투여될 수 있다. 소정 예에서, 본 발명의 항-big-ET-1 항체는, PDGFR-알파 저해제(예를 들면, 항-PDGFR-알파 항체), DLL4 길항제(예를 들면, US 2009/0142354에 개시되어 있는 항-DLL4 항체, 예를 들면, REGN421), Ang2 길항제(예를 들면, US 2011/0027286에 개시되어 있는 항-Ang2 항체, 예를 들면, H1H685P) 등과 병용되고/되거나, 이들과 공동-제형화되고/되거나, 이들과 병용하여 투여된다. 본 발명은, 또한, 본원에 언급된 항-big-ET-1 항체들 중 어느 하나, 및 Ang2, Tie2, VEGF, DLL4, EGFR 또는 상기 언급된 임의의 사이토카인들 중 하나 이상의 저해제를 포함하는, 치료학적 병용물을 포함하고, 여기서, 상기 저해제는 압타머, 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 펩티바디, 나노바디, 또는 항체 단편(예를 들면, Fab 단편; F(ab')2 단편; Fd 단편; Fv 단편; scFv; dAb 단편; 또는 다른 조작된 분자, 예를 들면, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 및 최소 인식 단위)이다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체와 병용하여 유리하게 투여될 수 있는 다른 제제로는, 소분자 사이토카인 저해제를 포함하는 사이토카인 저해제, 및 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18과 같은 사이토카인에 결합하는 항체, 또는 이들 각각의 수용체가 포함된다.
본 발명의 항-big-ET-1 항체는, 또한, 항바이러스제, 항생제, 진통제, 스타틴, 이뇨제, 항-응고제, 디곡신, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 산소, 항산화제, 금속 킬레이트제, IFN-감마, 및/또는 NSAID와 병용하여 투여되고/되거나, 이들과 공동-제형화될 수 있다. 본 발명의 항-big-ET-1 항체는, 또한, 방사선 치료 및/또는 종래 화학치료요법도 포함하는 치료 용법의 일부로서(예를 들면, 암을 치료하거나 종양 성장을 저해하는 방법과 관련하여) 투여될 수 있다.
상기 언급된 추가의 치료 활성 구성성분 중 임의의 것은, 예를 들면, 본원에 언급된 안 질환, 섬유성 질환, 혈관 질환 및/또는 암 중 임의의 것을 포함하는 항-big-ET-1 항체의 투여가 이로운 임의의 질환 또는 장애의 치료를 위해, 본 발명의 항-big-ET-1 항체 중 임의의 것과 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 안 질환(예를 들면, 습윤 AMD, 당뇨병성 망막병증, CRVO, 또는 본원에 기술되어 있는 기타 안 질환 중 임의의 안 질환)의 치료와 관련하여, 본 발명의 항-big-ET-1 항체를, VEGF 길항제, 예를 들면, 아프리베르셉트와 같은 "VEGF-트랩" 또는 US 7,087,411에 제시된 바와 같은 다른 VEGF-저해 융합 단백질, 또는 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 베바시주마브, 또는 라니비주마브)와 공동-제형화하고/하거나 이들과 병용하여 투여할 수 있다.
추가의 치료 활성 구성성분(들)은 본 발명의 항-big-ET-1 항체의 투여 직전에, 이의 투여와 동시에, 또는 이의 투여 직후에 투여될 수 있다(본 개시의 목적을 위해, 이러한 투여 용법은 항-big-ET-1 항체를 추가의 치료 활성 구성성분과 "함께 병용하여" 투여하는 것으로 고려된다). 본 발명의 몇몇 실시형태에서, 추가의 치료 활성 구성성분(들)은 본 발명의 항-big-ET-1 항체의 투여 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 제1 구성성분은, 제1 구성성분이 제2 구성성분을 투여하기 1주 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 전, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 15분 전, 10분 전, 5분 전, 또는 1분 미만 전에 투여되는 경우, 제2 구성성분 "전에" 투여되는 것으로 생각될 수 있다. 다른 실시형태에서, 추가의 치료 활성 구성성분(들)은 본 발명의 항-big-ET-1 항체의 투여 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 제1 구성성분은, 제1 구성성분이 제2 구성성분의 투여 1분 후, 5분 후, 10분 후, 15분 후, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후에 투여되는 경우, 제2 구성성분 "후에" 투여되는 것으로 생각될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 추가의 치료 활성 구성성분(들)은 본 발명의 항-big-ET-1 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "동시" 투여는, 예를 들면, 대상체에게 항-big-ET-1 항체 및 추가의 치료학적 활성 구성성분을, 서로 약 30분 이하 내에 대상체에게 투여되는, 단일 용량 형태로, 또는 개별 용량 형태로 투여하는 것을 포함한다. 개별 용량 형태로 투여되는 경우, 각각의 용량 형태는 동일한 경로를 통해 투여될 수 있고(예를 들면, 항-big-ET-1 항체 및 추가의 치료 활성 구성성분 둘 다는 초자체내, 피하 등으로 투여될 수 있음); 대안으로, 각각의 용량 형태는 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다(예를 들면, 항-big-ET-1 항체는 초자체내로 투여될 수 있고, 추가의 치료 활성 구성성분은 전신 투여될 수 있다). 어떠한 경우에도, 상기 구성성분을 단일 용량 형태로, 동일한 경로에 의한 개별 용량 형태로, 또는 상이한 경로에 의한 개별 용량 형태로 투여하는 것은, 모두 본 개시의 목적을 위한 "동시 투여"로 간주된다. 본 개시의 목적을 위해, 추가의 치료 활성 구성성분의 투여 "전의", 이의 투여와 동시의, 또는 이의 투여 "후의"(이들 용어들은 본원에 상기 정의된 바와 같음) 항-big-ET-1 항체의 투여는, 추가의 치료 활성 구성성분"과 병용하여" 투여하는 것으로 간주된다.
본 발명은, 본 발명의 항-big-ET-1 항체가, 본원의 다른 곳에 기술되는 바와 같은 추가의 치료 활성 구성성분(들) 중 하나 이상과 함께 공동-제형화되는, 약제학적 조성물을 포함한다.
항체의 진단 용도
본 발명의 항-big-ET-1 항체는, 또한, 예를 들면, 진단 목적을 위해 샘플 중의 big-ET-1을 검출하고/하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-big-ET-1 항체 또는 이의 단편은 big-ET-1 또는 엔도텔린-1의 비정상적인 발현(예를 들면, 과발현, 저발현, 발현 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. big-ET-1에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들면, 환자로부터 수득한 샘플을 본 발명의 항-big-ET-1 항체와 접촉시킴을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 항-big-ET-1 항체는 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안으로, 자체로 검출가능하게 표지된 제2 항체와 표지되지 않은 항-big-ET-1 항체를 함께 진단 용도에 사용할 수 있다. 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광성 또는 화학발광성 모이어티; 또는 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 또는 루시페라제와 같은 효소일 수 있다. 샘플 중의 big-ET-1를 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있는 특정의 예시적 검정은 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA), 방사선 면역 검정법(RIA) 및 형광 표지 세포 분류법(FACS)을 포함한다.
본 발명에 따른 big-ET-1 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플은 정상적이거나 병리학적인 조건 하에서 big-ET-1 단백질 또는 이의 단편의 검출가능한 양을 포함하는 환자로부터 수득가능한 임의의 조직 또는 유체 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자(예를 들면, 비정상적인 엔도텔린-1 수준 또는 활성과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있지 않은 환자)로부터 수득한 특정 샘플 중의 big-ET-1 수준을 측정하여 초기에 big-ET-1의 기저선 또는 표준 수준을 확립한다. 이어서, big-ET-1 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된 샘플에서 측정된 big-ET-1 수준에 대하여 big-ET-1의 기저선 수준을 비교할 수 있다.
실시예
하기 실시예들은, 본 발명의 방법들 및 조성물들을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당해 분야 숙련가들에게 제공하기 위해서 제시되고, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하도록 의도되는 것은 아니다. 사용된 수(예를 들면, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 확보하기 위한 노력이 이루어져 왔지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야만 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 ℃이며, 압력은 대기압이거나 대기압 부근이다.
실시예 1. 사람 Big - 엔도텔린 -1( Big - ET -1)에 대한 사람 항체들의 생성
사람 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 VELOIMMUNE® 마우스에게, 사람 big-ET-1 폴리펩타이드(서열번호 434)를 포함하는 면역원을 항원 보강제와 함께 직접 투여하여 면역 반응을 자극하였다. 항체 면역 반응은 big-ET-1-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 바람직한 면역 반응이 달성된 경우, 비장세포를 수거하고, 마우스 골수종 세포와 융합시켜 이들의 생존능을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하였다. 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택하여, big-ET-1-특이적 항체들을 생산하는 세포주를 동정하였다. 이러한 기술을 이용하여, 몇몇의 항-big-ET-1 키메라 항체들(즉, 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 갖는 항체들)을 수득하였고; 이러한 방식으로 생성된 예시 항체들은 하기와 같이 표시하였다: 6486N, 6490N, 6492N, 6494N, 6495N, 6741N, 6490N2, 및 6492N2.
항-big-ET-1 항체들은, 또한, US 2007/0280945A1에 기술되어 있는 바와 같이, 골수종 세포에의 융합 없이 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리되었다. 이러한 방법을 이용하여, 몇몇의 완전 사람 항-big-ET-1 항체들(즉, 사람 가변 도메인 및 사람 불변 도메인을 갖는 항체들)이 수득되었고; 이러한 방식으로 생성된 예시 항체들은 하기와 같이 표시되었다: 6311P, 6316P, 6317P, 6323P, 6327P2, 6328P, 6329P, 6330P, 6332P, 6334P, 6335P, 6337P, 6338P, 6340P, 6343P, 6345P, 6347P, 및 6353P.
이러한 실시예의 방법에 따라 생성된 예시의 항-big-ET-1 항체들의 소정의 구조적 및 기능적 특성들은 하기 제시되는 실시예에서 상세하게 설명된다.
실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
표 1은, 선택된 항-big-ET-1 항체들 및 이들의 상응하는 항체 식별자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 쌍을 나타낸다.
Figure pct00001
항체들은 전형적으로 하기 명명법에 따라 본원에 나타낸다: Fc 접두사(예를 들면, "H4H", "H1M", "H2M"), 이어서, 수적 식별자(예를 들면, 표 1에 나타낸 바와 같은 "6311"), 이어서, "P" 또는 "N" 접미사. 따라서, 이러한 명명법에 따르면, 항체는, 본원에서, 예를 들면, "H4H6311P"L로서 나타낼 수 있다. 본원에서 사용된 항체 명치에 대한 H4H, H1M, 및 H2M 접두사는 항체의 특정 Fc 영역을 나타낸다. 예를 들면, 항체의 "H2M"은 마우스 IgG2 Fc를 갖고, 반면, "H4H" 항체는 사람 IgG4 Fc를 갖는다. 당해 분야 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, H1M 또는 H2M 항체는 H4H 항체로 전환될 수 있고, 그 반대일 수 있지만, 어떠한 경우에서도 표 1에 나타낸 수적 식별자에 의해 나타내어지는 가변 도메인들(CDR들을 포함함)은 동일하게 유지될 것이다.
실시예 3. 사람 모노클로날 항- Big - ET -1 항체들의 표면 플라스몬 공명 유도된 결합 친화성 및 동역학적 상수
사람 모노클로날 항-big-ET-1 항체들의 결합 친화성 및 운동 상수는, mAb 포획 포맷을 이용하여 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다(표 2 내지 표 3). 측정은 T200 비아코어(Biacore) 기기(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ) 상에서 수행하였다. 비아코어 센서 표면을 하이브리도마 포획을 위한 토끼 항-마우스(접두사 H1M 또는 H2M) 또는 사람 IgG 포맷된 항체에 대한 마우스 항-사람(접두사 H4H) Fc 표면으로 유도체화하였다. 다양한 농도의 small-ET-1(서열번호 435), 사람 big-ET-1(서열번호 434) 또는 마우스 big-ET-1(서열번호 437)을 항-big-Et-1 포획된 표면 위에 100μl/분의 유속으로 주사하였다. 펩타이드 결합은 3분 동안 모니터링하였고, 한편, mAb-결합된 펩타이드의 해리는 HBST 분리 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20)에서 4분 동안 모니터링하였다. 운동 연합(ka) 및 해리(kd) 속도 상수들은, Scrubber 2.0 곡선 맞춤(curve fitting) 소프트웨어를 이용한 1:1 결합 모델에 데이터를 프로세싱하고 맞춤으로써 측정하였다. 결합 해리 평형 상수(KD) 및 해리 반감기(t1 /2)를 하기와 같이 운동 속도 상수로부터 계산하였다: KD (M) = kd / ka; 및 t1 /2 (분) = (ln2/(60*kd). 그 결과는 표 2 및 표 3에 나타낸다(NB = 시험된 조건 하에서 결합하지 않음).
Figure pct00002
Figure pct00003
표 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 몇몇의 예시 항체들은 사람 big-ET-1(서열번호 434) 및 마우스 big-ET-1(서열번호 437) 둘 다에 결합하였다. 그러나, 본 실시예에서 시험된 다수의 예시 항체들은, 마우스 big-ET-1보다 사람 big-ET-1에의 우선적 결합을 나타냈다. 예를 들면, 항체 H2M6490N, H1M6492N, H1M6494N, H2M6495N, H4H6311P, H4H6316P, H4H6317P, H4H6328P 및 H4H6335P는 각각 사람 big-ET-1에 대해 높은 친화성 결합을 입증하였지만, 본 실시예에서 사용된 시험 조건 하에서 마우스 big-ET-1에 대해서는 어떠한 결합도 나타내지 않았다. 항체 H2M6495N, H4H6328P 및 H4H6334P는, 각각 50pM 미만의 KD 값으로 사람 big-ET-1에 대해 매우 높은 결합 친화성을 나타냈다.
유의하게, 본 발명의 항체들 중 어느 것도 사람 small-ET-1(서열번호 435)에 결합하지 않았다.
실시예 4. 본 발명의 항- Big - ET -1 항체들은 시험관내에서 Big - ET -1의 ECE1 -매개된 개열을 차단한다
본 발명의 예시 항-big-ET-1 항체들이 마우스 및/또는 사람 big-ET-1의 엔도텔린-전환 효소-1(ECE-1)-매개된 개열을 차단할 수 있는지를 측정하기 위해서, NFAT 루시페라제 리포터 검정을 이용하였다. 간략하게, HEK293 세포주를 생성하여, 루시페라제 수용체 요소[NFAT (4X)-루시페라제]와 마찬가지로 전장 사람 엔도텔린 수용체 A형(ETaR)이 안정하게 발현되었다. 단일 클론을 단리하였고, 10% FBS, DMEM, NEAA, Pen/Strep, 및 500㎍/ml G418 및 100㎍/ml 하이그로마이신 B 중에 유지하였다.
저해의 효력을 측정하기 위해, 항체(100nM 내지 0.002nM)를 10nM 사람 big-ET-1(서열번호 434) 또는 20nM 마우스 big-ET-1(서열번호 437) 중 어느 하나와 함께 항온배양(1시간; 25℃)하고, 이어서, 각각 3nM 사람 또는 5nM 마우스 ECE-1을 첨가하였다. 사람 및 마우스 big-ET-1 차단 실험 둘 다는 밤새 항온배양(37℃; 5% CO2)하도록 하였다. 다음날 아침, 이들 용액을 293/ETaR/NFAT-Luc 세포(20,000세포/웰)에 첨가하였고, 5.5시간(37℃; 5% CO2) 후에 Victor X 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 루시페라제 활성을 검출하였다. 이들 조건 하에 관찰된 루시페라제 활성의 양은, 마우스 또는 사람 big-ET-1 중 어느 하나의 개열로부터 생성된 small-ET-1의 양의 비례하는 표현이다. (Small-ET-1은 마우스와 사람 사이에 동일하다.) 그 결과는 표 4 및 표 5에 나타낸다(NB = 시험된 조건 하에서 결합하지 않음; NT = 시험되지 않음).
Figure pct00004
Figure pct00005
표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 몇몇의 하이브리도마 항체들이 사람 big-ET-1의 ECE-1-매개된 개열을 실질적으로 저해하였다(IC50 값 < 10nM). 추가로, 사람 IgG4 포맷에서 선택된 항체들은 사람 big-ET-1 개열(표 5; 컬럼 2)뿐만 아니라 마우스 big-ET-1 개열(표 5; 컬럼 3)도 차단하는 능력을 나타냈다.
실시예 5. MALDI - TOF 에 의해 평가된 Big - ET -1 개열의 항체 보호
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight(MALDI-TOF) 질량 분광측정법을 사용하여, 선택된 항-big-ET-1 항체들이, 마우스 엔도텔린 전환 효소 1(ECE-1)의 존재시 사람 big-ET-1(서열번호 434) 또는 마우스 big-ET-1(서열번호 437)의 각각의 펩타이드로의 전환을 차단할 수 있었는지를 측정하였다. 사람 big-ET-1은, 생물학적 활성 small-ET-1(서열번호 435; MH+ 2474) 및 비-활성 C-말단 생성물(서열번호 434의 아미노산 22 내지 38; MH+ 1809) 둘 다를 형성하는 Trp-21/Val-22에서 mECE-1에 의해 특이적으로 개열된다. 마우스 big-ET-1은, Trp-21/Val-22에서 small-ET-1(서열번호 435; MH+ 2474) 및 이의 비-활성 C-말단 생성물(서열번호 437의 아미노산 22 내지 39; MH+ 1875)으로 개열된다. 항체의 존재시, 이들 질량들의 출현 또는 부재는 MALDI-TOF에 의해 모니터링될 수 있다. 하기 실시예에서, C-말단 생성물의 존재 또는 부재는, 이들 펩타이드가 small-ET-1(서열번호 435; MH+ 2474)보다 더욱 효율적으로 이온화되어 보다 민감한 판독을 수득하므로 big-ET-1 개열에 대한 지표로서 작용하였다.
간략하게, 사람 또는 마우스 big-ET-1(0.5μM)을, 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중에서 항체(2.5μM)와 함께 1:5의 몰비(big-ET-1:mAb)로 혼합하였다. 1시간 항온배양(25℃) 후, 마우스 ECE-1(R&D Systems)를 40nM로 첨가하였고, 용액을 37℃에 두었다. 질량 분광측정 분석용 분취물들은 0, 15, 30 및 60분째에 분취되었다. 각각의 분취물은 C18 Ziptip(Millipore)을 통해 탈염시켰고, Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF 기기(Bruker Daltonics)를 이용하여 리플렉트론-양성 방식으로 분석하였다.
항체의 존재시 사람 또는 마우스 big-ET-1의 개열로부터의 C-말단 생성물의 검출은 표 6에 요약한다.
Figure pct00006
항체 H2M6490N을 사람 big-ET-1 및 마우스 ECE-1과 함께 항온배양한 경우, C-말단 생성물은 검출되지 않았다(표 6에서 "-"로 나타냄). 대조적으로, 마우스 ECE-1의 존재시, 마우스 Fc 대조군 항체가 사람 big-ET-1의 개열을 방지하지 않으므로, C-말단 생성물은 0시를 제외한 모든 시점에서 확인되었다(표 6에서 "+"로 나타냄). 항체 H4H6334P에 대해 유사한 결과가 얻어졌다. 그러나, H4H6327P2의 경우, 이 항체는, C-말단 생성물이 검출되지 않았으므로, 마우스 ECE-1의 존재시에 사람 및 마우스 big-ET-1 둘 다의 개열을 방지할 수 있음이 분명하였다. 따라서, 본 실시예는, 본 발명의 항-big-ET-1 항체들(예를 들면, H2M6490N)이, 시험관내에서 사람 big-ET-1의 이의 생물학적 활성형 small-ET-1로의 효소적 전환을 차단할 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 6. 항- Big - ET -1 항체는 평균 동맥 혈압의 Small - ET -1- 매개된 증가를 차단한다
본 실시예의 목적은, 예시 항-big-ET-1 항체(H2M6490N)의 동맥압의 small-ET-1-매개된 증가를 차단하는 능력을 평가하는 것이었다. 차단 항-big-ET-1 항체 또는 아이소타입 대조군 중 어느 하나가 사전에 주입된 마우스에 big-ET-1 펩타이드를 투여시도하였다. small-ET-1로의 big-ET-1 내인성 전환으로부터 기인하거나, 또는 항-big-ET-1 항체를 순환시킴으로써 이의 전환이 차단되는, 동맥압의 변화를 측정하였다. 이들 실험 동안 동맥압의 실시간 측정을 가능하게 하기 위해서, 표준 프로토콜을 이용하여 마우스에 카테터를 장착하였다(catheterized).
간략하게, 나이브(naive) Taconic C57BL/6 마우스(8 내지 10주령)를 이소플루란으로 마취시켰고, 경동맥 및 경정맥 위의 피부를 잘라내었다. 미주 신경 또는 다른 혈관들을 손상시키지 않도록 조심하면서 우측 경정맥 및 좌측 경동맥 둘 다를 단리하였다. 표준 기술을 이용하여, 경정맥을 집어 넣었고, 32-게이지 니들(90도로 구부러짐)을 이용하여 염수-충전된 경정맥 카테터의 삽입을 위해 정맥을 천공하였다. 이어서, 좌측 경동맥을 단리하였고, 표준 프로토콜을 이용하여 Millar Micro-Tip® 카테터를 넣었다. 모든 시술 동안, 온도 프로브를 사용하여 동물 체온을 모니터링하였고, 이는 Gaymar 열수 순환 패드를 이용하여 36.5℃ 주위로 유지되었다. 상기 시술은, 모든 big ET-1 투여시도 실험 동안 실시간 혈압 측정(수축기압, 확장기압, 평균 동맥압, 및 체온)이 기록되도록 하였다.
1차 연구에서, 경정맥 포트를 이용하여 150㎍(약 2mg/kg; 1 x 10-9 Moles)의 H2M6490N 또는 아이소타입 대조군 mAb를 i.v. 주사하였고, 이어서, 염수를 볼루스(bolus) 주사하여 카테터를 플러싱(flush)하였다. 이는, 기저선으로 되돌아가 실험에 대해 T=0을 확립한, 약간의 그리고 일시적인 혈압 강하를 야기하였다. 항체 투약 30분 후, 평균 동맥압이 기저선을 초과하여 유의하게 증가하였을 때까지 사람 big-ET-1 펩타이드(서열번호 434)를 15분마다 i.v. 주사하였다. 그 결과를 표 7에 요약한다.
Figure pct00007
표 7은, 아이소타입 대조군이 투여된 마우스에게의 사람 big-ET-1의 주사가, big-ET-1이 생체활성 small-ET-1 펩타이드(서열번호 435)로 내생적으로 개열되는 경우에 기대되는 바와 같이 유의하게 증가된 평균 동맥압으로 반응함을 입증한다. 대조적으로, 예시 항-big-ET-1 차단 항체 H2M6490N이 투여된 마우스는, 사람 big-ET-1 펩타이드가 투여 항체의 몰 당량에 접근했을 때까지 기저선 평균 동맥압을 유지했다.
2차 실험에서, 사람 big-ET-1 펩타이드로의 투여시도 24시간 전에 마우스에 H2M6490N(약 2mg/kg; 1 x 10-9 Moles)을 피하(s.c.) 주사한 것을 제외하고는 동일한 실험 프로토콜을 이용하였다. 2차 실험의 결과는 표 8에 요약한다.
Figure pct00008
표 8에 설명되는 바와 같이, 피하 항체 투여 24시간 후에 마우스가 big-ET-1로 투여시도된 경우에 얻어진 결과는, 정맥내 항체 투약 30분 후에 마우스가 big-ET-1로 투여시도된 경우에 관찰된 결과(표 7)와 유사하였다. 양쪽 실험 조건 하에, 항-big-ET-1 항체 H2M6490N이 사전에 주입된 마우스는, 아이소타입 대조군 항체로 치료된 마우스보다 더 길게 정상 동맥압을 유지하였다.
따라서, 이들 연구는, H2M6490N의 투여가 생체내 동맥압의 엔도텔린-1-매개된 상승을 저해하는데 유효하였음을 나타낸다. 사람 big-ET-1로 투여시도하기 30분 또는 24시간 전의 항체 투여는, 대조군에 비하여 동맥압 반응을 유의하게 감소시켰다.
실시예 7. 항- Big - ET -1 항체들을 이용한 저산소증-유도된 폐 고혈압의 차단 / 예방
본 실시예에서, 항-big-ET-1 항체 H4H6327P2의 마우스에서의 저산소증-유도된 폐 고혈압을 차단하는 능력이 평가되었다. 저산소증 상태 전에 및 저산소증 상태 동안에, 동물들에게 치료제(항-big-ET-1 항체 H4H6327P2 또는 보센탄) 또는 대조군(항체 비히클(50:50 PEG 400(v/v)) 또는 아이소타입 대조군 항체) 제제를 투약하였고, 정상 산소증 상태 하에 유지된 대조군 동물들과 비교하여, 초음파 영상, 및 심실압 및 심장 비대의 측정을 이용하여 평가하였다.
평가 재료 및 방법
초음파 측정은 하기 프로토콜을 이용하여 획득하였다. 마우스를 가열된 플랫폼(THM 100, Indus Instruments) 상에 반듯이 누운 자세로 두어 마취시켰고, Vevo 2100 초음파 시스템(VisualSonics)을 이용하여 폐 누두부(infundibulum)의 2D 영상화(B- 및 M-방식)를 실행하였다. 대동맥 판막의 수준에서 흉골 주위 단축 단면도로부터 영상을 수득하였다. 일단 스캔헤드(scanhead)가 최대 층류에 대해 조정되면 폐 판막엽의 끝에서 간헐파(pulsed-wave) 도플러(Doppler) 측정이 수득되었다. 추가로, 우심실의 M-방식 기록은 단축 B-방식 영상화 면에 획득되어, 심장 순환을 통한 우심실 자유벽 동력학이 수득되었다.
맹검 방식으로 수행된 초음파 데이터 분석은 하기 파라미터들을 분석하였다: 확장기 및 수축기 우심실 자유벽 두께(RVFW, 단축 M-방식), 수축기-말 폐 동맥 직경(단축 B-방식), 및 폐 동맥류(PA 유량, PW 도플러). 이들 측정으로부터, 폐 유량의 시간-속도 적분값, 폐 동맥 단면적(PA CSA), 및 우심실 심박출량(RV CO)을 계산하였다. 평균 및 표준 오차들의 평균은, 각각의 시점에서의 측정값에 대해, 각각의 치료 그룹에 대해 계산하였다. 모든 측정값들은 3회의 심장 주기에 대해 평균하였다. 저산소증 21일째의 우심실압은 하기 프로토콜을 이용하여 기록하였다: 마우스를 가열된 플랫폼(Gaymar 가열 펌프로 가열된 수냉식(water-jacketed) 패드) 상에 반듯이 누운 자세로 두어 마취시켰고, 우측 총경동맥 및 우측 경정맥 위를 절개하여 경동맥 및/또는 미주 신경을 손상시키지 않도록 조심하면서 우측 경정맥을 단리하였다. 단리된 경정맥 아래에, 두개골 혈관을 집어 넣도록 하여 하나의 5-0 실크 봉합사를 두었고, 이어서, 30-게이지 니들을 이용하여 경정맥의 원위 분절에 구멍을 도입하였다. 고-충실도 압력 카테터(SPR-1000, Mikro-Tip®, Millar Instruments, Inc.)를 경정맥에 도입하였고, 우심방을 지나 우심실(RV)로 진행되었다. 카테터는 심박수, 및 확장기 및 수축기 혈압 둘 다의 기록을 가능하게 하였다. 데이터는 PowerLab 4/35 콘솔(ADInstruments)을 이용하여 디지털 방식으로 획득되었다.
우심실 수축기 혈압 분석은 LabChart Pro 소프트웨어(ADInstruments)를 이용하여 압력 추적(압력 안정화를 가능하게 하는 기록의 2분 기간에 따른 추적)의 대략 60초 간격으로 수행하였다. 분석된 파라미터들은 RV 확장기 및 수축기 혈압, 심박수 및 동물 체온이었다. 보고된 RV 수축기 혈압은 최소와 최대 수축기 혈압의 차(개시 기저선 RV 혈압값의 차를 차지함)였다.
RV 수축기 혈압 측정의 완료 후, 마취된 동물을 안락사시켰고, 흉강을 열어 심장을 절개하였다. 좌심실 및 격막(LV + S)로부터 RV를 주의 깊게 잘라내었다. 양쪽의 심장 조각들을 미소 저울을 이용하여 별도로 칭량하여 RV 비대증의 정도를 추정하였다[RV/(LV + S); 풀턴(Fulton) 지수].
실험 절차
평압 저산소 대기(10% O2)를 유지하면서 동물의 취급 및 투약을 허용하는, 변형 챔버(Biospherix, Ltd.)를 이용하여 폐 고혈압을 유도하였다. C57BL/6 수컷 마우스(10 내지 11주령)를 칭량하였고, 표 9에 개요된 바와 같이 23일의 과정에 걸쳐 연속적으로 투약하였다. 보센탄 및 비히클은 경구(PO) 투여하였고; 항-big-ET-1 항체 H4H6327P2 및 아이소타입 대조군 항체는 피하(SC) 투여하였다. 본 연구의 과정 동안 그룹간의 체중들은 일치하였다. 엔도텔린 수용체-A 및 -B의 경구 활성 비-선택적 길항제인 보센탄은 양성 대조군으로서 사용되었고, 한편, 비히클[50:50 PEG 400 (v/v)] 및 무관한 아이소타입-매칭된 항체는 음성 대조군으로서 작용하였다. 모든 절차들은 Regeneron Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)에 의해 승인되었다.
Figure pct00009
비-침습성 초음파 스캐닝을 수행하여, 저산소증 18일째에, 폐 동맥 단면적(PA CSA), 우심실 심박출량(RV CO) 및 우심실 자유벽 두께(RVFW)를 측정하였다. 우심실에서 고-충실도 혈압 카테터(Mikro-Tip®, Millar Instruments)를 이용하여 우심실 확장기 및 수축기 혈압을 획득하였고; 추가로, 저산소증 21일째에 우심실 비대증 측정값(즉, 우심실-대-좌심실 + 격막의 중량비; 풀턴 지수)을 측정하였다.
결과
항-big-ET-1 항체 H4H6327P2로의 치료는, 마우스에서 저산소증-유도된 폐 고혈압의 발달을 약화시켰다. 항체-치료된 동물은 아이소타입 대조군-치료된 마우스에 비하여 측정된 PA CSA에서 보다 유의하게 적은(P ≤ 0.001) 감소를 나타내었고(도 1), 이는, 만성 저산소증에의 노출에 의해 유도된 보다 적은 혈관 수축 및/또는 감소된 폐 동맥 재형성을 나타낸다. 설치류에서 저산소증-유도된 폐 고혈압과 관련된 증상을 감소시키는 것으로 공지되어 있는 보센탄은, 유사한 더 감소된 기저 PA CSA 유지 능력을 나타냈다. 보센탄-치료된 동물들은, 비히클-치료된 그룹과 비교하여 보다 큰 RV CO의 보존을 나타냈다(도 2). 항-big-ET-1 항체로 치료된 동물들은, 보센탄-치료된 코호트 및 아이소타입-치료된 코호트 둘 다와 비교하여 통계학적으로 보다 큰(P = 0.05) RV CO의 보존을 나타냈다. 추가로, 항-big-ET-1 항체로 치료된 동물들은, 초음파(RVFW) 및 풀턴 지수 측정 둘 다에 의해 확인되는 바와 같이 유의하게 적은 RV 비대증을 나타냈다(도 3). 추가로, 감소된 RV 비대증은, 아이소타입 대조군에 비하여 항-big-ET-1 항체 치료된 마우스에서 보다 더 유의하게 얇은 심장의 우심실벽에 의해 입증되었다(도 4).
결론
따라서, 본 연구는, 본 발명의 항-big-ET-1 항체들이, 저산소증-유도된 폐 고혈압과 관련된 증상을 약화시키는데 유효하고, 몇몇의 종말점에서 기준 분자 보센탄을 능가함을 입증한다.
실시예 8. 저산소증-유도된 폐 고혈압의 항- Big - ET -1 항체들로의 치료
본 실시예에서, 항-big-ET-1 항체의 마우스에서 저산소증-유도된 폐 고혈압을 치료하는 능력이 평가되었다. 실험 그룹 동물들은 21일 동안(1일 내지 21일) 저산소증 상태에 두었고, H4H6327P2, 보센탄, 또는 14일째에 시작하여 대조군 아이소타입 항체를 투약하였다. 21일째에, 초음파 영상 및 심실압 및 심장 비대증의 측정을 이용하여 동물들을 평가하였고(실시예 7의 평가 재료 및 방법 참조), 대조군 동물들(정상 산소 조건, 14일 동안의 저산소증, 또는 14일 동안의 저산소증에 이어서 7일 동안 정상 산소증 하에 유지됨)에 대해 비교하였다.
실험 절차
변형 챔버(Biospherix, Ltd.)를 통한 평압 저산소증 대기(10% O2)의 노출을 통해 폐 고혈압을 유도하였다. C57BL/6 마우스(10 내지 11주령)를 칭량하였고, 표 10에 개요된 바와 같이 21일의 과정에 걸쳐 치료하거나 치료 및 투약하였다. 보센탄은 경구(PO) 투여하였고; 항-big-ET-1 항체 H4H6327P2 및 아이소타입 대조군 항체는 피하(SC) 투여하였다. 본 연구의 과정 동안 그룹간의 체중들은 일치하였다. 엔도텔린 수용체-A 및 -B의 경구 활성 비-선택적 길항제인 보센탄은 양성 대조군으로서 사용되었고, 한편, 무관한 아이소타입-매칭된 항체는 음성 대조군으로서 작용하였다. 모든 절차들은 Regeneron Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)에 의해 승인되었다.
Figure pct00010
비-침습성 초음파 스캐닝을 수행하여, 저산소증 21일째에, 폐 동맥 단면적(PA CSA), 우심실 심박출량(RV CO) 및 우심실 자유벽 두께(RVFW)를 측정하였다. 우심실에서 고-충실도 혈압 카테터(Mikro-Tip®, Millar Instruments)를 이용하여 우심실 확장기 및 수축기 혈압을 획득하였고; 추가로, 저산소증 21일째에 우심실 비대증 측정값(즉, 우심실-대-좌심실 + 격막의 중량비; 풀턴 지수)을 측정하였다.
결과
H4H6327P2 또는 보센탄으로의 치료는, 저산소증-유도된 PH과 일반적으로 관련된 보다 적은 혈관 수축 및 혈관 평활근 세포 증식을 포함하는, 원위 폐 동맥 수축 및 재형성을 약화시켰다. 항-big-ET-1 항체 H4H6327P2로의 치료는, 치료되지 않은 코호트 또는 아이소타입-대조군 코호트와 비교하여 만성 저산소증-유도된 소동맥 벽 두께를 유의하게 감소시켰다(도 5). 또한, H4H6327P2 및 보센탄으로의 치료는, 폐 동맥 단면적(PA CSA)의 보전에 의해 입증되는 바와 같이 내강(lumen) 직경 손실을 경감시켰고(도 6), 우심실 자유벽(RVFW) 두께를 약화시켰다(도 7). 또한, 항-Big-ET-1 항체 치료는, 통상적으로, 상승된 폐 동맥 혈관 저항에 기인한 폐 고혈압을 감소시키는 우심실 심박출량(RVCO)을 보존하였고, 보센탄보다 더 적은 정도로 생각되었다(도 9). 그러나, 항-Big-ET-1 항체 치료는, 둘 다 폐 고혈압에 기인한 증가된 혈관 저항과 관련된, 폐 동맥에의 혈류(도 8) 또는 우심실 수축기 혈압(RSVP)(도 10)을 유지하게 위해 일어나는 보상 메커니즘인 우심실 비대증을 유의하게 감소시키지 않았다.
결론
따라서, 본 연구는, 본 발명의 항-big-ET-1 항체들이, 보센탄과 동등하게, 폐 고혈압 유도된 혈관구조 재형성을 약화시키는데 최대 효능을 나타내고, 반면, 보센탄 치료는 심장 기능의 측정값을 회복시키는데 보다 큰 효과를 나타냄을 입증한다.
실시예 9: 항-Big ET-1 항체의 투여를 이용한 통각방위성 행동의 감소
본 실시예에서, 항-big ET-1 항체 H4H6327P2의 마우스에서 통증에 대한 big-ET-1 유도된 방위성 반응을 차단하는 능력이 평가되었다. H4H6372P2는, 21개 아미노산 생물학적 활성 ET-1로의 Big-ET-1의 엔도텔린 전환 효소(ECE) 매개된 개열을 차단한다. 동물에의 ET-1의 외인성 투여는, 명시적인 통증 관련된 행동(통각수용), 예를 들면, 복부 뒤틀림(abdominal writhing), 플린칭(flinching), 바이팅(biting) 또는 핥기(licking)를 유도하는 것으로 기록되었다.
실험 절차
본 연구에서, 12주령 C57BL/6 수컷 마우스는 3개의 실험 코호트로 분리되었다: 30mg/kg의 비-big ET-1 결합 아이소타입 대조군 항체가 투여된 대조군 그룹(n=6)(아이소타입); 3mg/kg의 항 big-ET-1 항체 H4H6327P2가 투여된 저용량 그룹(n=7); 및 30mg/kg의 H4H6327P2가 투여된 고용량 그룹(n=7). 모든 항체들은 피하 투여되었다. 항체 투약 후 대략 48시간째에, 모든 마우스에게, 우측 뒷발의 발바닥면에 포스페이트 완충된 염수 중에 용해된 big hET-1 펩타이드의 2ug(0.2mg/ml) 주사를 투여하였다. 직후에, 마우스를 투명한 실린더에 넣고, 이들의 통각수용 행동을 주사 후 60분 동안 비디오 기록하였다. 코호트 정체성에 대해 맹검된 조사자는 60분의 시험 기간에 걸쳐 우측 뒷발 핥기/바이팅 행동의 총수를 기록하였다. 데이터는 코호트 평균 ± SEM으로서 보고된다(도 11).
결과 및 결론
H4H6327P2로의 사전-치료는, 60분의 시험 기간에 걸쳐 big-hET-1 펩타이드-유도된 통각방위성 행동을 유의하게 감소시켰다(반복 측정 ANOVA에 의해 p=0.0173). 용량-의존 효과는 30mg/kg 용량 그룹(p<0.05, Tukey)에서만 관찰하였다. 본 실시예는, 항-Big-ET-1 항체들의 투여가, ET-1 부산물의 형성 및 후속적 수용체 활성화를 방지함으로써 통증 관련된 행동들을 완화시킬 수 있음을 설명한다.
실시예 10: 항-Big ET-1 항체를 이용한 예방 투약은, 폐 섬유증의 블레오마이신-유도된 모델에서 생리학적 재형성을 약화시키고 폐 기능을 회복시킨다
본 실시예에서, 항-Big-ET-1 항체 H4H6327P2의 블레오마이신 유도된 폐tjadbwmddp 대한 예방 치료로서 작용하는 능력이 평가되었다.
실험 절차
블레오마이신-유도된 폐 손상을 이용하여 10주령 C57BL/6 수컷 마우스에서 폐 섬유증을 모델링하였다. 단일 구강인두 용량(2.0ml/kg 체적 중의 3.2U/kg(2.0mg/kg))을 통해 블레오마이신 설페이트를 투여하였다. 치료되지 않은 대조군은 멸균 0.9% 염수(2.0ml/kg)의 경구 점적(transoral instillation) 투여되었다. 엔도텔린 수용체-A 및 -B의 경구 활성 비-선택적 길항제인 보센탄을 치료에 대한 양성 대조군으로서 사용하였고, 한편, 비히클 및 무관한 아이소타입-매칭된 항체는 음성 대조군으로서 작용하였다. 마우스들은, 표 11에 개요된 바와 같이 투약 용법에 따라 치료 또는 대조군 그룹에 할당되었다.
Figure pct00011
결과
치료 효능의 측정값으로서, 블레오마이신 노출 21일 후 각각의 코호트에서 동물의 우측 폐 중량을 측정하였다. 폐 중량의 증가는, 일반적으로 관찰되는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 생리학적 효과이다(표 12; 그룹 1 대 그룹 2 & 3). 항-Big-ET-1 항체 H4H6327P2로의 치료는, 아이소타입 대조군과 비교하는 경우, 폐 습윤 중량뿐만 아니라 물-중량 증가(부종)의 백분율도 저하시키는 경향이 있다. 그러나, 보센탄으로의 치료만이 습윤 폐 중량에서 통계학적으로 유의한 감소를 나타냈다.
Figure pct00012
결론
폐 기능을 보존하는 것에 대한 항체 또는 보센탄 치료의 효과도 또한 평가되었다. H4H6327P2 및 보센탄 둘 다는, 동맥혈 산소 포화도를 블레오마이신 투여 20일 후에 비히클 또는 아이소타입 대조군 치료된 코호트와 비교하여 기저선 수준에 가깝게 회복시키고, 또한, 블레오마이신 노출 후 폐에서의 콜라겐 축적도 감소시키는 경향이 있다.
재료 및 방법
동물 취급 절차: 각각의 케이지를 치료학적 치료 그룹에 무작위 할당하여 케이지 내의 모든 마우스가 동일한 치료를 받았다. 각 치료 그룹에 대해 개시 평균 체중은 유사하였다. 연구에 걸쳐 매일 체중이 기록되었다. 그룹 체중 평균 및 백분율 변화를 분석하고 그래프작성하였다. 연구의 과정에 걸쳐 25% 초과의 체중 또는 중증의 건강 열화를 나타낸 동물을 안락사시켰다.
블레오마이신의 투여: 블레오마이신 또는 염수의 투여는, 동물을 마취 하(3.5%로의 이소플루란 2리터/분 산소 유속)에 두면서 수행하였다. 진정된 마우스를 50도 틸트 보드 위에 두고, 앞니 주위에 탄성 밴드로 고개를 세웠다. 작은 솜 팁을 사용하여 입으로부터 혀를 꺼내고, 이어서, 겸자를 이용하여 혀를 고정시키고 턱을 열었다. 대량의 흡입 동안, 유체를 입에 피펫팅하였다. 혀 및 턱 위치는, 마우스가 틸트 보드 상에 남아 있는 동안 유지되었다. 유체가 사라지거나 "천명(wheezing)"이 정지하기까지 피펫팅 후 대략 20초가 흘렀다. 치료제 점적 후, 분비된 생체재해(biohazard) 때문에 마우스를 치료 조건에 따라 1회용 케이지에 7일 동안 그룹-하우징시키고(케이지당 5마리의 동물), 이어서, 홈 케이지로 이동시켰다. 1회용 케이지는 홈 케이지와 Thoren rack 급수 시스템의 사용 대신에 물의 케이지 탑 바틀에의 사용에 의해 상이하였다. 모든 마우스를 명-암 사이클 12시간(7am 내지 7pm)으로 콜로니에 하우징하였다.
보센탄의 투여: 보센탄을 위관 영양법에 의해 1주 동안 1일 2회(9:30 am 및 6:30 pm) 투여하였다. 개시 전치료 용량 및 주말 용량은 단일 병용 BID로서 투여하였다. 표 11에 개요된 바와 같이, 보세탄 투약은 20일의 연구 동안 매일 계속하였고, 한편, 항체들 및 비히클은 18일 동안 3일마다 피하 투약하였다.
폐 기능의 측정: Starr Life Sciences, MousOx 소동물 활력 징후 모니터를 이용하여 동맥 산소 포화도를 측정함으로써 폐 기능을 추산하였다. 측정은 14일 및 17일째에 제모에 따른 경부 영역 주위에서 취하였다. MouseOx는, 적혈구 세포에서의 헤모글로빈 분자 상의 조직에 이동된 산소의 수준을 측정함으로써 심폐 건강 및 폐 손상의 정도를 모니터링할 수 있다. 목 칼라 센서(throat collar sensor)를 이용하여 지각이 있는 마우스에서의 경동맥을 통해 동맥 산소 포화도를 측정하였다. 마우스를 손으로 약간 저지하여 케이지 상부 음식물 호퍼에의 접근을 한정시키고 이동을 감소시켰다. 소프트웨어(MouseOx Ver. 6.3.12, InstCal.)는 맥박 확장, 심박수, 산소 포화도, 및 매초 호흡률을 측정한다. 일단 연속 15초 차단이 기록되면, 소프트웨어는 상기 파라미터의 평균을 계산한다. 측정 시간은 마우스 활성에 따라 1분 내지 3분의 범위였다. 각각의 치료 그룹에 대한 평균 동맥 산소 포화도를 계산하였고, 일원 ANOVA를 이용하여 모든 치료 그룹의 Bonferroni 시험-후 비교로 분석하였다.
마지막 절차 / 조직학: 21일째에, 마우스에 마지막 용량의 케타민/자일라진(각각 120mg/kg / 5mg/kg IP)을 투여하였다. 진정제 투여에 따라, 복강을 열어 하대정맥을 통해 시린지에 의해 혈청을 수집하였다. 이어서, 복부 대동맥을 잘라내었다. 방혈 동안, 흉강을 열어 폐를 노출시켰다. 모든 우측 폐엽 위에 폐 기관지 주위에 봉합사를 묶었다. 모든 마우스에 대해, 상엽, 중엽, 하엽, 및 하대정맥 엽으로 이루어진 전체 우측 폐를 제거하여 칭량하였고, 액체 질소 중에서 급속 냉동시켰고, 이어서, 콜라겐 측정을 위해 -80℃ 냉동고에 저장하였다. 콜라겐 추출 전에, 우측 폐엽을 데시케이터에서 건조시키고, 재칭량하였다. 각각의 치료 그룹에 대해 습윤 및 건조 폐 중량 및 습윤 중량 대 건조 중량 비를 계산하였다. 폐를 펩신-아세트산 용액 중에서 균질화시켜 가용성 콜라겐을 추출하였다. Biocolor로부터의 Sircol 콜라겐 검정을 이용하여 우측 폐당 가용성 콜라겐 및 습윤 및 건조 폐 조직의 mg당 콜라겐을 정량하였다.
각각의 치료 그룹에 대해, 좌측 폐엽의 사용은 조직학 및 마이크로어레이 사이에 무작위로 나뉘었다. 조직학적 대상체의 경우, 배측 경부를 절개하였고, 악하선을 분리하였고, 주의 근육 섬유를 잘라냄으로써 기도를 노출시켰다. 입에서 먼 기도 주위에 봉합사를 약하게 묶었다. 이어서, 상기 봉합사 위에 입에서 가까운 기도에 작은 구멍을 잘라냈다. 10% NBF가 충전된 튜브 및 250ml 흡인기에 부착된 22g의 블런트 니들(blunt needle)을 구멍에 삽입하였다. 이어서, 스레디드(threaded) 기도 주위에 봉합사 매듭을 조여 개구를 밀봉하여 니들을 제자리에 고정시켰다. 25cm 높이로, 좌측 폐를 중력에 의해 약 30 내지 60초 동안 팽창시켰다. 팽창 후, 니들을 제거하였고, 봉합사를 단단히 조였다. 기관지, 기도, 흉선, 식도 및 심장에 여전히 부착되어 있는 좌측 폐를 1조각으로서 제거하였고, 포르말린에 저장하였다. 고정화 후, 좌측 폐엽을 단리하였고, 조직학적 프로세싱(시리우스 레드, Masson 트리크롬 및 H&E)을 위해 제거하였다. 마이크로어레이 배정된 마우스는, 실온에서 24시간 동안 팽창시키지 않고 RNA-Later에 위치되고, 이어서, 유전자 서열분석까지 -20℃ 냉동고에 위치된 좌측 폐엽을 가졌다.
본 발명은, 본원에 기술된 특정 실시형태들에 의해 그 범위가 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것 이외의 본 발명의 각종 변형은 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범위 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-BIG-ENDOTHELIN-1 (BIG-ET-1) ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 7300A-WO <150> US 61/601,622 <151> 2012-02-22 <150> 61/677,024 <151> 2012-07-30 <160> 437 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttataaca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagtagtta catatactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagataac 300 tggaactaca gctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala 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atatggtatg atggaagtga taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt atttctgtgc gaaagatgaa 300 tataagacca ggggcggcta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 66 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Glu Tyr Lys Thr Arg Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 ggattcacct 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tctctgggtt ctcactcaac actaatggaa tgggtgtggg ctggatccgt 120 cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt acactcattt attggaatga tgataaacgc 180 tacagcccat ctctgaagac caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacgtttt 300 ggttcgggga cttactgggg ccagggaacc ctggtcactg tctcctca 348 <210> 146 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 146 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Pro Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Asn 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Thr Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Phe Gly Ser Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 147 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial 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ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgttgg cacatactac 180 gcggcctccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtcc gaaagctcga 300 actggaaccc atgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357 <210> 370 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 370 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Val Gly Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Pro Lys Ala Arg Thr Gly Thr His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 371 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 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ggttggccgt attaaaagca gaactgatgg tgggacagtt 180 gactatgttg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaagcc gaggacacag ccgtttatta ctgtagggct 300 gaccttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgttt cctca 345 <210> 418 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 418 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Arg Thr Asp Gly Gly Thr Val Asp Tyr Val Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Ala Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 419 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 419 ggattcactt ttagtaacgc ctgg 24 <210> 420 <211> 8 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tgcaaggtac acactggccg 300 tacacttttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336 <210> 426 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 426 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Phe 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 427 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 427 caaagcctcg tacacagtga tggaatcacc tac 33 <210> 428 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 428 Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr 1 5 10 <210> 429 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 429 aagatttct 9 <210> 430 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 430 Lys Ile Ser 1 <210> 431 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 431 atgcaaggta cacactggcc gtacact 27 <210> 432 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 432 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 433 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 433 Met Asp Tyr Leu Leu Met Ile Phe Ser Leu Leu Phe Val Ala Cys Gln 1 5 10 15 Gly Ala Pro Glu Thr Ala Val Leu Gly Ala Glu Leu Ser Ala Val Gly 20 25 30 Glu Asn Gly Gly Glu Lys Pro Thr Pro Ser Pro Pro Trp Arg Leu Arg 35 40 45 Arg Ser Lys Arg Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val 50 55 60 Tyr Phe Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu His Val 65 70 75 80 Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Ser Lys Arg Ala Leu Glu Asn 85 90 95 Leu Leu Pro Thr Lys Ala Thr Asp Arg Glu Asn Arg Cys Gln Cys Ala 100 105 110 Ser Gln Lys Asp Lys Lys Cys Trp Asn Phe Cys Gln Ala Gly Lys Glu 115 120 125 Leu Arg Ala Glu Asp Ile Met Glu Lys Asp Trp Asn Asn His Lys Lys 130 135 140 Gly Lys Asp Cys Ser Lys Leu Gly Lys Lys Cys Ile Tyr Gln Gln Leu 145 150 155 160 Val Arg Gly Arg Lys Ile Arg Arg Ser Ser Glu Glu His Leu Arg Gln 165 170 175 Thr Arg Ser Glu Thr Met Arg Asn Ser Val Lys Ser Ser Phe His Asp 180 185 190 Pro Lys Leu Lys Gly Lys Pro Ser Arg Glu Arg Tyr Val Thr His Asn 195 200 205 Arg Ala His Trp 210 <210> 434 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 434 Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly 20 25 30 Leu Gly Ser Pro Arg Ser 35 <210> 435 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 435 Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp 20 <210> 436 <211> 754 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 436 Met Met Ser Thr Tyr Lys Arg Ala Thr Leu Asp Glu Glu Asp Leu Val 1 5 10 15 Asp Ser Leu Ser Glu Gly Asp Ala Tyr Pro Asn Gly Leu Gln Val Asn 20 25 30 Phe His Ser Pro Arg Ser Gly Gln Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gln 35 40 45 Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Gly Leu 50 55 60 Val Ala Cys Leu Ala Ala Leu Gly Ile Gln Tyr Gln Thr Arg Ser Pro 65 70 75 80 Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys Val Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu 85 90 95 Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr 100 105 110 Ala Cys Gly Gly Trp Ile Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser 115 120 125 Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gln Ala Ile Ile 130 135 140 Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg 145 150 155 160 Lys Ala Gln Val Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu 165 170 175 Glu Leu Arg Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly 180 185 190 Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp Ala Lys Asp Asn Phe Gln Asp Thr Leu 195 200 205 Gln Val Val Thr Ala His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr 210 215 220 Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gln Val Asp 225 230 235 240 Gln Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr 245 250 255 Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gln Leu 260 265 270 Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala Ile Arg Pro Gln Met 275 280 285 Gln Gln Ile Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro 290 295 300 Gln Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Ala 305 310 315 320 Ala Glu Leu Gln Thr Leu Ala Pro Ala Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu 325 330 335 Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val 340 345 350 Val Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Glu Gln Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr 355 360 365 Thr Asp Arg Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg 370 375 380 Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gln Arg Phe Gln Asp Ala Asp Glu Lys 385 390 395 400 Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp 405 410 415 Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly 420 425 430 Pro Met Phe Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser Ile Ala 435 440 445 Thr Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser 450 455 460 Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys 465 470 475 480 Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp 485 490 495 Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp 500 505 510 Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val 515 520 525 Thr Ala Asp Gln Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gln Trp Ser Met 530 535 540 Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile 545 550 555 560 Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser 565 570 575 Pro Lys Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu 580 585 590 Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gln Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly 595 600 605 Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg 610 615 620 Gln Thr Glu Cys Met Val Glu Gln Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly 625 630 635 640 Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn 645 650 655 Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Trp Val Lys Lys 660 665 670 Asn Gly Ala Glu His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gln 675 680 685 Leu Phe Phe Leu Gly Phe Ala Gln Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro 690 695 700 Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg 705 710 715 720 Phe Arg Val Ile Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His 725 730 735 Phe Arg Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu 740 745 750 Val Trp <210> 437 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 437 Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His 1 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu Arg Val Val Pro Tyr Gly 20 25 30 Leu Gly Gly Ser Ser Arg Ser 35

Claims (25)

  1. 사람 big-ET-1(서열번호 434)에 특이적으로 결합하고 small-ET-1(서열번호 435)에 결합하지 않는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 엔도텔린-전환 효소-1(ECE-1)에 의한 big-ET-1의 개열을 차단하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 사람 big-ET-1에 결합하지만 마우스 big-ET-1에는 결합하지 않는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 사람 big-ET-1 및 마우스 big-ET-1에 결합하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 사람 big-ET-1에 결합하기 위해, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 146/154, 162/170, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 322/330, 338/346, 370/378, 및 386/394로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 참조 항체(reference antibody)와 경쟁하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 146/154, 162/170, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 322/330, 338/346, 370/378, 및 386/394로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 참조 항체와 동일한 사람 big-ET-1 상의 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 146, 162, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 322, 338, 370, 및 386으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)들, 및 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 154, 170, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 330, 346, 378, 및 394로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR들을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 146/154, 162/170, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 322/330, 338/346, 370/378, 및 386/394로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍의 중쇄 및 경쇄 CDR들을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 228-230-232-236-238-240; 244-246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288; 292-294-296-300-302-304; 324-326-328-332-334-336; 340-342-344-348-350-352; 372-374-376-380-382-384; 및 388-390-392-396-398-400으로 이루어진 그룹으로부터 각각 선택되는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인들을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 146/154, 162/170, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 322/330, 338/346, 370/378, 및 386/394로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제7항의 항체 또는 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 폐 고혈압, 신장 질환, 동종이식편 거부, 당뇨병, 암, 심부전, 및 죽상 동맥경화증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료, 예방, 또는 완화를 필요로 하는 환자에게, 제11항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 폐 고혈압, 신장 질환, 동종이식편 거부, 당뇨병, 암, 심부전, 및 죽상 동맥경화증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 또는 완화시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 폐 고혈압인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폐 고혈압이, 폐 동맥 고혈압, 좌심 질환과 관련된 폐 고혈압, 폐 질환과 관련된 폐 고혈압, 또는 만성 혈전성 질환으로 인한 폐 고혈압 또는 색전성 질환으로 인한 폐 고혈압인, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 암인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암이, 전립선암, 유방암, 난소암, 흑생종, 신장암, 결장직장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 방광암, 카포시 육종, 및 신경교종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 환자에게 제2 약제학적 조성물을 투여함을 추가로 포함하고, 여기서, 상기 제2 약제학적 조성물은, 엔도텔린-A 수용체 길항제, 엔도텔린-B 수용체 길항제, 엔도텔린-전환 효소-1(ECE-1) 저해제, 네프릴리신 저해제, 안지오텐신-II 수용체 작용제, 및 NF-카파 B 저해제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성 성분(들)을 포함하는, 방법.
  18. 통증의 치료 또는 약화를 필요로 하는 대상체에게 제11항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 통증을 치료하거나 약화시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 통증이 통각수용성 통증 또는 내장 통증인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 통증이, 염증, 수술 절개 후, 신경병증, 골절, 화상, 골다공증성 골절, 골암, 통풍, 편두통, 및 섬유근육통으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 병태와 관련되어 있는, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 통증이 암-관련 통증 또는 화학치료요법-유도된 통증인, 방법.
  22. 안 질환에 걸린 대상체에게 제11항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 안 질환을 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 안 질환이, 노화-관련 황반 변성(AMD), 삼출성 AMD, 당뇨성 망막병증, 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO), 홍채 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 녹내장에서의 수술 후 섬유증, 증식성 초자체 망막병증(PVR), 맥락막 혈관신생, 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 초자체 혈관신생, 판누스(pannus), 익상편(pterygium), 황반 부종, 당뇨성 황반 부종(DME), 혈관 망막병증, 망막 변성, 포도막염, 및 눈의 염증성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  24. 섬유성 병태에 걸린 대상체에게 제11항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 섬유증을 치료하는 방법,
  25. 제24항에 있어서, 상기 섬유성 병태가 폐 섬유증, 안구 섬유증, 피부 섬유증, 신장 섬유증, 또는 간 섬유증인, 방법.
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