CN105592858A

CN105592858A - 抗激活蛋白a抗体及其用途

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Publication number: CN105592858A
Application number: CN201480049484.7A
Authority: CN
Inventors: 杰斯珀·格罗马达; 埃丝特·拉特雷斯; 安德鲁·J·墨菲; 乔治·D·扬科普洛斯; 洛里·C·莫顿
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2034-07-30
Also published as: US20150037339A1; JP2022130593A; BR112016002164A2; KR102315694B1; US20210163583A1; KR102440044B1; CN105592858B; EP3730151A1; CA2920071A1; AU2020200892A1; CY1123788T1; KR20210129253A; SG11201600731WA; HRP20201729T1; HK1225322A1; US9718881B2; MX371498B; KR20160030581A; DK3027209T3; PT3027209T

Abstract

本发明提供了与激活蛋白A结合的抗体以及使用所述抗体的方法。根据本发明的某些实施方案，所述抗体是与激活蛋白A以高亲和力结合的全人抗体。本发明的抗体可用于治疗以肌肉的量或强度降低为特征的疾病和病症，例如肌肉减少症、恶病质、肌肉损伤、肌肉消耗/萎缩、癌症、纤维化和体重减轻。本发明的抗体还可与GDF8结合蛋白组合以用于治疗以肌肉的量或强度降低为特征的疾病和病症。本发明的抗体还可用于预防、治疗或改善由激活蛋白A引起、促进、恶化和/或加重的病症和疾病，例如肾纤维化。

Description

抗激活蛋白A抗体及其用途

技术领域

本发明涉及对激活蛋白A(ActivinA)具有特异性的抗体及其抗原结合片段，以及所述抗体及其抗原结合片段的使用方法，其包括将激活蛋白A特异性抗体与肌肉生长抑制素(myostatin)抑制剂联合使用的方法。

背景技术

激活蛋白类属于转化生长因子β(transforminggrowthfactor-beta，TGF-β)超家族，并且对细胞增殖、分化和凋亡具有广泛的生物学作用。激活蛋白类是抑制素βA、抑制素βB、抑制素βC和抑制素βE的同源二聚体或异源二聚体，其不同组合产生激活蛋白蛋白组的多个成员。例如，激活蛋白A是抑制素βA的同源二聚体，激活蛋白B是抑制素βB的同源二聚体，而激活蛋白AB是抑制素βA和抑制素βB的异源二聚体，激活蛋白AC是抑制素βA和抑制素βC的异源二聚体(Tsuchida，K.等，CellCommunSignal7：15(2009))。

激活蛋白A与细胞表面上称为激活蛋白II型受体(IIA型和IIB型，也分别称为ActRIIA和ActRIIB)的受体复合物结合并将其激活。这些受体的激活导致激活蛋白I型受体(例如，Alk4或7)磷酸化，其进而导致SMAD2和3蛋白的磷酸化，形成SMAD复合物(与SMAD4)，并且SMAD复合物易位至细胞核，在此SMAD2和SMAD3发挥调控多种基因之转录的功能(Sozzani，S.和Musso，T.，Blood117(19)：5013-5015(2011))。

很多其他配体与ActRIIB结合并将其激活，所述配体包括GDF8(肌肉生长抑制素)、激活蛋白B、激活蛋白AB、抑制素A、抑制素B、GDF3、GDF11、Nodal、BMP2、BMP4、BMP7、BMP9和BMP10。阻断ActRIIB与其配体的相互作用可导致有益的生理作用。例如，GDF8在骨骼肌的发育和维持中起核心作用，充当肌肉的量的负调节物(McPherronAC等(1997).Nature387(6628)：83-90)。在小鼠中施用ActRIIB-Fc(即，通过与IgGFc结构域融合来稳定的IIB型受体ActRIIB的细胞外部分)导致骨骼肌的量显著增加，并且改善肌肉重量和肌肉强度的量度(LeeSJ，等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102(50)：18117-18122)。在Mstn(肌肉生长抑制素)无效小鼠中ActRIIB-Fc的效力减弱但并未消除，证明除肌肉生长抑制素之外，其他ActRIIB配体也可起肌肉生长的负调节物的作用。因此，需要可提供临床益处的ActRIIB信号传导的其他抑制剂。

发明简述

本发明提供了结合抑制素βA及含有抑制素βA的二聚体(例如，激活蛋白A、激活蛋白AB等)的抗体。本发明的抗体尤其可用于抑制激活蛋白A介导的信号传导，从而通过抑制激活蛋白A介导的信号传导产生有益的临床结果，例如，用于治疗由激活蛋白A活性和/或信号传导引起或与其相关的疾病和病症。本发明的抗体还用于与ActRIIA和ActRIIB受体之其他配体的抑制剂(例如GDF8抑制剂)联合使用。

本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或者可仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)₂或scFv片段)，并且可被修饰以影响功能性，例如，以消除剩余的效应物功能(Reddy等，JImmunol164：1925-1933(2000))。

本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，如在25℃下在表面等离子体共振测定中所测量的，其以小于约500nM的结合缔合平衡常数(K_a)和小于约5pM的解离平衡常数(K_D)特异性地结合激活蛋白A。在本发明的一些实施方案中，如25℃下在表面等离子体共振测定中所测量的，所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于约4pM的K_D特异性地结合激活蛋白A。在本发明的一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于约500nM的结合缔合平衡常数(K_a)特异性地结合激活蛋白A。

本发明提供了这样的分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合激活蛋白A并且阻断至少一种激活蛋白A受体与激活蛋白A的结合。在本发明的一些实施方案中，如在25℃下在体内受体/配体结合生物测定中所测量的，所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于约80pM的IC₅₀值阻断激活蛋白A与激活蛋白A受体结合。在本发明的一些实施方案中，如在25℃下在体内受体/配体结合生物测定中所测量的，所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于约60pM的IC₅₀值阻断激活蛋白A与激活蛋白A受体结合。本发明还提供了这样的分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合激活蛋白A并且阻断激活蛋白A对至少一种激活蛋白A受体的激活。在本发明的一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段不显著阻断激活蛋白A与激活蛋白II型受体的结合。在本发明的一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段抑制激活蛋白A与选自以下的激活蛋白A受体结合：激活蛋白IIA型受体(ActRIIA)、激活蛋白IIB型受体(ActRIIB)和激活蛋白I型受体。在本发明的一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段抑制激活蛋白A介导的对SMAD复合物信号传导的激活。

本发明提供了包含重链可变区(heavychainvariableregion，HCVR)的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区具有选自SEQIDNO：2、18、34、50、66、82、98、106、114、122、130、138、154、162、170、178、186、194和202的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。

本发明还提供了包含轻链可变区(lightchainvariableregion，LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段，所述轻链可变区具有选自SEQIDNO：10、26、42、58、74、90、146和210的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。

本发明还提供了包含HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对的抗体或其抗原结合片段，所述序列对选自SEQIDNO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146、170/146、178/146、186/146、194/146和202/210。

本发明还提供了这样的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含重链CDR3(HCDR3)结构域，所述重链CDR3(HCDR3)结构域具有选自SEQIDNO：8、24、40、56、72、88、104、112、120、128、136、144、160、168、176、184、192、200和208的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列；和轻链CDR3(LCDR3)结构域，其具有选自SEQIDNO：16、32、48、64、80、96、152和216的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。

在某些实施方案中，所述抗体或抗体的抗原结合部分包含选自以下的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对：SEQIDNO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/96、112/96、120/96、128/96、136/96、144/152、160/152、168/152、176/152、184/152、192/152、200/152和208/216。

本发明还提供了这样的抗体或其片段，其还包含重链CDR1(HCDR1)结构域，所述重链CDR1(HCDR1)结构域具有选自SEQIDNO：4、20、36、52、68、84、100、108、116、124、132、140、156、164、172、180、188、196和204的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列；重链CDR2(HCDR2)结构域，其具有选自SEQIDNO：6、22、38、54、70、86、102、110、118、126、134、142、158、166、174、182、190、198和206的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列；轻链CDR1(LCDR1)结构域，其具有选自SEQIDNO：12、28、44、60、76、92、148和212的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列；和轻链CDR2(LCDR2)结构域，其具有选自SEQIDNO：14、30、46、62、78、94、150和214的氨基酸序列，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。

本发明的某些非限制性的示例性抗体或抗原结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别具有选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO：4-6-8-12-14-16(例如H4H10423P)；20-22-24-28-30-32(例如H4H10424P)；36-38-40-44-46-48(例如H4H10426P)；52-54-56-60-62-64(例如H4H10429P)；68-70-72-76-78-80(例如H4H10430P)；84-86-88-92-94-96(例如H4H10432P2；100-102-104-92-94-96(例如H4H10433P2)；108-110-112-92-94-96(例如H4H10436P2)；116-118-120-92-94-96(例如H4H10437P2)；124-126-128-92-94-96(例如H4H10438P2)；132-134-136-92-94-96(例如H4H10440P2)；140-142-144-148-150-152(例如H4H10442P2)；156-158-160-148-150-152(H4H10445P2)；164-166-168-148-150-152(H4H10446P2)；172-174-176-148-150-152(H4H10447P2)；180-182-184-148-150-152(H4H10448P2)；188-190-192-148-150-152(H4H10452P2)；196-198-200-148-150-152(H4H10468P2)；和204-206-208-212-214-216(H2aM10965N)。

在一个相关实施方案中，本发明包括特异性结合激活蛋白A的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或片段含有包含在选自以下之重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)序列中的重链和轻链CDR结构域：SEQIDNO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146、170/146、178/146、186/146、194/146和202/210。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中之CDR的方法和技术在本领域中是公知的并且可用于鉴定本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。可用于鉴定CDR的界限的示例性常规方式包括，例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般来说，Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区的位置，而AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折衷。参见，例如Kabat，″SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，″NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991)；Al-Lazikani等，JMolBiol273：927-948(1997)；和Martin等，PNAS(USA)86：9268-9272(1989)。公共数据库也可供用于鉴定抗体中的CDR序列。

本发明还提供了编码抗激活蛋白A抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意HCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意LCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意HCDR1核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意HCDR2核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意HCDR3核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意LCDR1核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意LCDR2核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意LCDR3核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。

本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含三个CDR的组(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任意示例性抗激活蛋白A抗体所定义。

本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包含三个CDR的组(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的任意示例性抗激活蛋白A抗体所定义。

本发明还提供了编码HCVR和LCVR两者的核酸分子，其中所述HCVR包含表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中所述LCVR包含表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意HCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列；和选自表2中列出的任意LCVR核酸序列的多核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本相似序列。在根据本发明这一方面的某些实施方案中，所述核酸分子编码HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR两者均衍生自表1中列出的相同抗激活蛋白A抗体。

本发明还提供了能够表达多肽的重组表达载体，所述多肽包含抗激活蛋白A抗体的重链或轻链可变区。例如，本发明包括含有上述任意核酸分子的重组表达载体，所述核酸分子即编码表1中所示的任意HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。其中已引入了这样的载体的宿主细胞以及如下产生抗体或其部分的方法也包括在本发明的范围内：在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞，并回收如此产生的抗体和抗体片段。

本发明包括具有经修饰的碳水化合物成分的抗激活蛋白A抗体。在一些应用中，除去不期望的糖基化位点的修饰可能是有用的。在一些应用中，改变糖基化模式的修饰可能是有用的，例如，将抗体修饰成缺乏寡糖链上存在的岩藻糖部分以例如提高抗体依赖性细胞毒性(antibodydependentcellularcytotoxicity，ADCC)功能(参见Shield等，JBiolChem277：26733(2002))。在另一些应用中，可进行半乳糖基化的修饰以改变补体依赖性细胞毒性(complementdependentcytotoxicity，CDC)。在一些应用中，抗体可具有经修饰的糖基化模式以使效应物功能最小化。例如，可对抗体进行修饰以获得经另外糖基化或唾液酸化的抗体。

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含特异性结合激活蛋白A的重组人抗体或其片段，和可药用载体。在一个相关方面，本发明以这样的组合物为特征，所述组合物为抗激活蛋白A抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是与抗激活蛋白A抗体有利地组合的任意药剂。可与抗激活蛋白A抗体有利地组合的示例性药剂包括但不限于：抑制激活蛋白A活性的其他药剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)，和/或不直接结合激活蛋白A但仍干扰、阻断或减弱激活蛋白A介导的信号传导的药剂。在一个实施方案中，所述第二治疗剂抑制、干扰、阻断和/或减弱ActRIIA和/或ActRIIB受体之其他配体(例如，GDF8、激活蛋白B、激活蛋白AB、抑制素A、抑制素B、GDF3、GDF11、Nodal、BMP2、BMP4和/或BMP7)的活性。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是抗GDF8拮抗剂(例如，人抗GDF8抗体或其抗原结合片段)。与本发明的抗激活蛋白A抗体一起使用的示例性抗GDF8剂包括人抗GDF8抗体(例如，包含US2011-0293630A1中所示的任意HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列的抗GDF8抗体(例如H4H1657N2，其为这样的抗GDF8抗体，其具有包含SEQIDNO：217之HCVR的重链互补决定区(heavychaincomplementaritydeterminingregion，HCDR)(例如，SEQIDNO：218、219和220中分别所示的CDR1、CDR2和CDR3序列)；和包含SEQIDNO：221之LCVR的轻链互补决定区(lightchaincomplementaritydeterminingregion，LCDR)(例如，SEQIDNO：222、223和224中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列))。涉及本发明之抗激活蛋白A抗体的另外的联合治疗和共制剂在本文中的其他部分公开。

在本发明的另一个方面，提供了抗原结合分子，其包含激活蛋白A特异性结合结构域和GDF8特异性结合结构域。在本发明这一方面的一个实施方案中，所述抗原结合分子是双特异性抗体，其包含特异性地结合激活蛋白A的第一可变结构域和特异性地结合GDF8的第二可变结构域。

在又一个方面，本发明提供了用于使用本发明的抗激活蛋白A抗体或抗体的抗原结合部分抑制激活蛋白A活性的治疗方法，其中所述治疗方法包括施用治疗有效量的包含本发明之抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。所治疗的病症为通过除去、抑制或降低激活蛋白A活性或信号传导而得以改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病症。本发明的抗激活蛋白A抗体或抗体片段可起以下功能：阻断激活蛋白A与激活蛋白II型受体(例如，激活蛋白IIA型受体和/或激活蛋白IIB型受体)之间的相互作用；阻断激活蛋白A与激活蛋白I型受体之间的相互作用；阻断激活蛋白A与II型和I型受体两者之间的相互作用；或者另外地抑制激活蛋白A的信号传导活性。

本发明还包括本发明之抗激活蛋白A抗体或抗体的抗原结合部分在制备用于在患者中治疗与激活蛋白A活性相关或由其引起的疾病或病症之药物中的用途。本发明还提供了用于在对象中提高肌肉的量或强度的方法，其通过向所述对象施用激活蛋白A抗体或其抗原结合片段进行。本发明还提供了用于如下在对象中提高肌肉的量或强度的方法：向所述对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白，或者向所述对象施用包含激活蛋白A特异性结合结构域和GDF8特异性结合结构域的抗原结合分子。

本发明还包括用于治疗、预防和/或改善以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症的方法，其通过向有此需要的对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白(例如，抗激活蛋白A抗体)进行。在一个相关方面，本发明的方法包括如下治疗、预防和/或改善以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症：向有此需要的对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白(例如，抗激活蛋白A抗体和抗GDF8抗体)。本发明的方法还包括通过向有此需要的对象施用抗原结合分子来治疗、预防和/或改善以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症，所述抗原结合分子包含激活蛋白A特异性结合结构域和GDF8特异性结合结构域。可使用本发明方法治疗、预防和/或改善之以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症包括肌肉减少症(sarcopenia)、恶病质(cachexia)(例如特发性恶病质或另一病症(例如，癌症、慢性肾衰竭或慢性阻塞性肺病)的继发性恶病质)、肌肉损伤、肌肉消耗和/或萎缩(例如，由废用(disuse)、固定(immobilization)、卧床休息、损伤、医学治疗、手术介入(例如，髋骨折、髋关节置换和膝关节置换)和机械通气所不可避免的引起或者与其相关)、癌症、肥胖、糖尿病、关节炎、多发性硬化、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病(Parkinson’sdisease)、骨质疏松症、骨关节炎、骨质减少和代谢综合征(例如，糖尿病、肥胖、营养失调(nutritionaldisorder)、器官萎缩、慢性阻塞性肺病和厌食症中的一种或更多种)。

本发明还包括用于治疗、预防或改善由含抑制素βA之分子(例如，含抑制素βA的二聚体，例如激活蛋白A、激活蛋白AB等)的活性引起、促进、恶化或加重的疾病或病症的方法，其通过向有此需要的对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白(即抑制素βA二聚体)，例如抗激活蛋白A抗体或其抗原结合片段进行。在本发明的一个方面，本发明的方法包括通过向有此需要的对象施用抗激活蛋白A抗体来治疗、预防和/或改善肾纤维化的方法。在本发明的一些具体方面，本发明的方法包括通过向有此需要的对象施用抗激活蛋白A抗体来治疗、预防和/或改善由慢性肾病引起的肾纤维化的方法(例如，由以下引起：高血压、糖尿病、肾小球肾炎、遗传性疾病(例如多囊性肾病)、肾畸形、自身免疫病(例如狼疮)，或梗阻(例如肾结石、肿瘤、***增大)，或反复性泌尿***感染)。本发明的另一些方面包括通过向有此需要的对象施用抗激活蛋白A抗体来治疗、预防和/或改善以下疾病的方法：脓毒症、慢性心力衰竭、慢性阻塞性肺病、良性或恶性嗜铬细胞瘤、子宫纤维瘤/平滑肌瘤、先兆子痫、疤痕疙瘩、肥大性瘢痕或肺动脉高压。本发明的另一些方面包括通过向有此需要的对象施用抗激活蛋白A抗体来治疗、预防和/或改善由激活蛋白A活性引起、促进、恶化或加重之恶病质的方法。本发明的另一些方面包括通过向有此需要的对象施用抗激活蛋白A抗体来治疗、预防和/或改善由激活蛋白A活性引起、促进、恶化或加重之体重减轻的方法。

通过查看接下来的详细描述，其他实施方案将变得明显。

附图简述

图1是示出了抗体交叉竞争测定之结果的矩阵，其中，将第一抗激活蛋白A抗体(“抗体样品”)施加至经抗人FC包被的传感器尖端，之后浸入与激活蛋白A预先结合之第二抗激活蛋白抗体(1μM)的溶液中。描绘了各个受试抗体组合的结合响应(数值0.22至1.84)。以具有黑体的白色框呈现的结合响应表示对激活蛋白A的结合无竞争，暗示独特的结合区。

图2：图A示出了与同种型对照抗体相比，21天的抗GDF8抗体处理(H4H1657N2，10mg/kg或30mg/kg)对平均峰强直性张力(peaktetanicforce)的作用。使用单向方差分析(ANOVA)之后进行Tukey检验来分析数据。＊p＜0.05显著性，相对于同种型对照(n＝6，未配对的学生t检验)；n.s.＝与同种型30mg/kg相比无统计学显著性。图B示出了当在一定频率范围(40至100Hz)内通过电流刺激时，与经同种型对照抗体处理3周的小鼠(n＝6)相比，在经H4H1657N2处理的小鼠(10mg/kg)中的胫骨前肌(tibialisanterior，TA)肌肉峰强直性张力提高。数据表示为平均峰力的平均值±SEM。

图3：图A示出了在后肢悬吊诱导之肌萎缩的恢复阶段期间评价H4H1657N2之作用的一个实验设计。图B示出了相对于7天后肢悬吊之后无恢复期的小鼠(HLS)和对照小鼠(非HLS对照)，在7天后肢悬吊后的恢复之后的经H4H1657N2处理和经同种型对照抗体处理的小鼠(HLS+7Rec)的TA和腓肠肌(GA)肌肉重量的百分比变化。值表示为相对于对照非-HLS值的平均百分比变化±SEM。使用单向方差分析(ANOVA)之后进行Tukey检验来分析数据。＊＝p＜0.05显著性，相对于非HLS组。#＝p＜0.05显著性，相对于HLS组。

图4：图A示出了施用抗激活蛋白A抗体H4H10446P2对过表达激活蛋白A之小鼠的体重的作用(相对于同种型对照)。使用双向方差分析(重复测量ANOVA+Boneferroni多重比较检验)之后进行Tukey检验来分析数据。＊＝p＜0.05相对于同种型对照；#＝p＜0.05相对于激活蛋白A+同种型对照。图B示出了抗激活蛋白A抗体H4H10446P2对过表达激活蛋白A之小鼠的胫骨前肌(TA)和腓肠肌(GA)肌肉重量的作用(相对于同种型对照)。使用单向方差分析(ANOVA)之后进行Tukey检验来分析数据。＊＝p＜0.05相对于载体+同种型对照；#＝p＜0.05相对于激活蛋白A+同种型对照。

发明详述

在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为方法和条件可以变化。还应理解本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。

除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。当涉及具体的列举数值使用时，本文中使用的术语“约/大约”意指与所列举的值相比可变化不大于1％的值。例如，本文中使用的表述“约100”包括99和101以及其间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

尽管在本发明的实施或测试中可使用与本文所描述的那些相似或等同的任意方法和材料，然而现在描述一些优选的方法和材料。

抗原特异性结合蛋白

本发明涉及包含抗原特异性结合蛋白的组合物。更特别地，本发明提供了包含激活蛋白A特异性结合蛋白的组合物。

本文中使用的表述“抗原特异性结合蛋白”意指包含至少一个特异性地结合特定抗原之结构域的蛋白质。抗原特异性结合蛋白的示例性类别包括抗体、抗体的抗原结合部分、与特定抗原特异性地相互作用的肽(例如肽体(peptibody))、与特定抗原特异性地相互作用的受体分子，以及包含特异性地结合特定抗原之受体的配体结合部分的蛋白质。

本发明包括特异性地结合激活蛋白A的抗原特异性结合蛋白，即“激活蛋白A特异性结合蛋白”。激活蛋白类是包含β亚基(即，抑制素βA、抑制素βB、抑制素βC和/或抑制素βE)的同源二聚分子和异源二聚分子。βA亚基具有SEQIDNO：226的氨基酸序列，而βB亚基具有SEQIDNO：228的氨基酸序列。激活蛋白A是两个βA亚基的同源二聚体；激活蛋白B是两个βB亚基的同源二聚体；激活蛋白AB是一个βA亚基和一个βB亚基的异源二聚体；并且激活蛋白AC是一个βA亚基和一个βC亚基的异源二聚体。激活蛋白A特异性结合蛋白可以是特异性地结合βA亚基的抗原特异性结合蛋白。由于βA亚基见于激活蛋白A、激活蛋白AB和激活蛋白AC分子中，因此“激活蛋白A特异性结合蛋白”可以是特异性地结合激活蛋白A以及激活蛋白AB和激活蛋白AC的抗原特异性结合蛋白(借助其与βA亚基的相互作用)。因此，根据本发明的一个实施方案，激活蛋白A特异性结合蛋白特异性地结合激活蛋白A；或者激活蛋白A和激活蛋白AB；或者激活蛋白A和激活蛋白AC；或者激活蛋白A、激活蛋白AB和激活蛋白AC，但不结合其他ActRIIB配体，例如激活蛋白B、GDF3、GDF8、BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、BMP10、GDF11、Nodal等。因此，在本发明的一个实施方案中，激活蛋白A特异性结合蛋白与激活蛋白A特异性地结合，但不与激活蛋白B或激活蛋白C显著结合。在另一个实施方案中，激活蛋白A特异性结合蛋白也可与激活蛋白B结合(借助与βB亚基即抑制素βB的交叉反应)。在另一个实施方案中，激活蛋白A特异性结合蛋白是与激活蛋白A特异性结合但不与任何其他ActRIIB配体结合的结合蛋白。在另一个实施方案中，激活蛋白A特异性结合蛋白是与激活蛋白A特异性结合但不与任何骨形态发生蛋白(BoneMorphogeneticProtein，BMP)(例如，BMP2、BMP4、BMP6、BMP9、BMP10)结合的结合蛋白。在另一个实施方案中，激活蛋白A特异性结合蛋白是与激活蛋白A特异性结合但不与任何其他转化生长因子β(TGFβ)超家族成员结合的结合蛋白。

本发明还包括特异性地结合GDF8的抗原特异性结合蛋白，即“GDF8特异性结合蛋白”。术语“GDF8”(也称为“生长和分化因子-8”和“肌肉生长抑制素”)意指具有SEQIDNO：225之氨基酸序列的蛋白质(成熟蛋白)。根据本发明，GDF8特异性结合蛋白特异性地结合GDF8但不结合其他ActRIIB配体，例如GDF3、BMP2、BMP4、BMP7、BMP9、BMP10、GDF11、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、Nodal等。

在本发明的上下文，包含ActRIIB受体之配体结合部分的分子(如ActRIIB-Fc(例如，“ACE-031”))不被认为是“激活蛋白A特异性结合蛋白”或“GDF8特异性结合蛋白”，因为这样的分子结合除GDF8、激活蛋白A和激活蛋白AB之外的多种配体。

除非明确指出来自于非人物种，否则本文中所有涉及的蛋白质、多肽和蛋白质片段均旨在指人形式的相应蛋白质、多肽或蛋白质片段。

具有两个不同抗原特异性结合结构域的抗原结合分子

本发明还包括含有两个不同抗原特异性结合结构域的抗原结合分子。特别地，本发明包括含有激活蛋白A特异性结合结构域和GDF8特异性结合结构域的抗原结合分子。本文中使用的术语“抗原特异性结合结构域”包括含有以下或者由以下组成的多肽：(i)抗体分子的抗原结合片段，(ii)与特定抗原特异性地相互作用的肽(例如，肽体)，和/或(iii)特异性地结合特定抗原之受体的配体结合部分。例如，本发明包括双特异性抗体，其一条臂包含特异性地结合激活蛋白A的第一重链可变区/轻链可变区(HCVR/LCVR)对，并且另一条臂包含特异性地结合GDF8的第二HCVR/LCVR对。

特异性结合

本文中使用的术语“特异性结合”等意指在普通测试条件下抗原特异性结合蛋白或抗原特异性结合结构域与特定抗原以500pM或更小的解离常数(K_D)为特征形成复合物，并且不结合其他不相关抗原。“不相关抗原”为彼此具有低于95％氨基酸同一性的蛋白质、肽或多肽。用于确定两种分子是否彼此特异性结合的方法在本领域中公知，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。例如，如在表面等离子体共振测定中所测量的，在本发明上下文中使用的抗原特异性结合蛋白或抗原特异性结合结构域包括与特定抗原(例如，激活蛋白A和/或AB，或者GDF8)或其一部分以以下K_D结合的分子：小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约90pM、小于约80pM、小于约70pM、小于约60pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约30pM、小于约20pM、小于约10pM、小于约5pM、小于约4pM、小于约2pM、小于约1pM、小于约0.5pM、小于约0.2pM、小于约0.1pM或小于约0.05pM。

如本文中所使用的，如果抗原特异性结合蛋白或抗原特异性结合结构域在表面等离子体共振测定中于25℃下测试与特定分子结合时表现出大于50.0nM的K_D，或者在这样的测定或其等同测定中未能表现出任何结合时，该蛋白质或结合结构域“不与该分子结合”(例如，“不结合GDF11”、“不结合BMP9”、“不结合BMP10”等)。

本文中使用的术语“表面等离子体共振”指允许通过在生物传感器基质内检测蛋白质浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象，例如使用BIAcore^TM***(GEHealthcare的Biacore生命科学分部，Piscataway，NJ)。

本文中使用的术语“K_D”意指特定蛋白质-蛋白质相互作用(例如，抗体-抗原相互作用)的平衡解离常数。除非另外指出，否则本文中公开的K_D值指在25℃下通过表面等离子体共振测定确定的K_D值。

抗体及抗体的抗原结合片段

如上所述，抗原特异性结合蛋白可包含抗体或抗体的抗原结合片段或者由其组成。另外，在包含两个不同抗原特异性结合结构域的抗原结合分子的情况下，所述抗原特异性结合结构域中的一个或两个可包含抗体的抗原结合片段或者由其组成。

本文中使用的“结合激活蛋白的抗体”或“抗激活蛋白A抗体”包括结合激活蛋白A蛋白的可溶性片段并且也可与含激活蛋白βA亚基的激活蛋白异源二聚体结合的抗体及其抗原结合片段。

本文中使用的术语“抗体”意指包含至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原特异性分子或分子复合物，所述互补决定区与特定抗原(例如，激活蛋白A)特异性地结合或相互作用。术语“抗体”包括含有四条多肽链(通过二硫键互连的两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(C_L1)。V_H和V_L区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的超变区，其散布有称为框架区(FR)的较保守区。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR构成，其以如下顺序从氨基端向羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的一些不同实施方案中，抗激活蛋白A抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并排分析确定。

本文中使用的术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术由例如全抗体分子获得，所述技术例如蛋白水解消化或涉及操作和表达编码抗体可变结构域并任选地编码恒定结构域之DNA的重组遗传工程技术。这样的DNA是已知的和/或可容易地从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)得到或者可以被合成。可对DNA测序并以化学方式或通过使用分子生物学技术进行操作以例如将一个或更多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型或者引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体超变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4肽。本文中使用的表述“抗原结合片段”还涵盖其他工程化分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceutical，SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。

抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可具有任意大小或氨基酸组成，并且一般将包含至少一个这样的CDR，其邻近一个或更多个框架序列或者与其在框内。在V_H结构域与V_L结构域缔合的抗原结合片段中，V_H和V_L结构域可以以任意合适的排列彼此相对定位。例如，可变区可以是二聚的并且包含V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以包含单体V_H或V_L结构域。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含至少一个与至少一个恒定结构域共价连接的可变结构域。可见于本发明之抗体的抗原结合片段中的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_E；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在可变结构域和恒定结构域的任意构型(包括上文列出的任意示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或者可通过全或部分铰链区或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其在单个多肽分子中的邻近可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接。另外，本发明之抗体的抗原结合片段可包含上文列出的任意可变结构域和恒定结构域构型的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)，其彼此和/或与一个或更多个单体V_H或v_L结构域非共价缔合(例如通过二硫键)。

对于全抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够与单独抗原或同一抗原上的不同表位特异性结合。可使用本领域中可利用的常规技术将任何多特异性抗体形式(包括本文公开的示例性双特异性抗体形式)改造成在本发明之抗体的抗原结合片段的上下文中使用。

本发明的抗体可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来起作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)是指本发明的抗体在补体存在下裂解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的已结合抗体并从而导致靶细胞裂解。CDC和ADCC可使用本领域中公知且可利用的测定进行测量(参见，例如美国专利No5,500,362和5,821,337，以及Clynes等，PNASUSA95：652-656(1998))。抗体的恒定区在抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力方面具有重要意义。因此，可根据是否期望抗体介导细胞毒性来选择抗体的同种型。

在本发明的某些实施方案中，本发明的抗激活蛋白A抗体是人抗体。本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列之可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可在例如CDR并且尤其是CDR3中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文中使用的术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体，其中人框架序列上已移植有来源于其他哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体可以是重组人抗体。本文中使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体来表达的抗体(在下文进一步描述)、从重组的组合人抗体文库分离的抗体(在下文进一步描述)、从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等Nucl.AcidsRes.20：6287-6295(1992))，或者通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列进行剪接的任意其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，由此重组抗体V_H和V_L区的氨基酸序列为这样的序列：尽管来源于人种系V_H和V_L序列并且与其相关，但可以并非天然存在于体内人抗体种系库内。

人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150至160kDa的稳定4链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体未通过链间二硫键连接并且形成由共价偶联的轻链和重链构成的约75至80kDa的分子(半抗体)。这些形式即使是在亲和纯化之后也极其难以分离。

第二种形式在多种完全IgG同种型中的出现频率归因于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链之铰链区中的单个氨基酸替换可使第二种形式的出现显著降低(Angal等MolecularImmunology30：1051993)至使用人IgG1铰链通常观察到的水平。本发明涵盖在铰链，C_H2或C_H3区中具有一个或更多个突变的抗体，其可以是期望的，例如在生产中提高期望抗体形式的产量。

本发明的抗体可以是分离的抗体。本文中使用的“分离的抗体”意指已被鉴定并且已与其自然环境的至少一种组分分离和/或已从其回收的抗体。例如，出于本发明的目的，已从生物体的至少一种组分分离的抗体或从其取出的抗体，或者从抗体天然存在或天然产生抗体的组织或细胞分离的抗体或从其取出的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞中的原位抗体。分离的抗体是已进行至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。

本发明包括中和和/或阻断抗激活蛋白A抗体。本文中使用的“中和”或“阻断”抗体旨在指其与激活蛋白A结合的抗体：(i)干扰激活蛋白A和激活蛋白A受体(例如，激活蛋白IIA型受体、激活蛋白IIB型受体、激活蛋白I型受体等)之间的相互作用；(ii)干扰激活蛋白-激活蛋白受体复合物的形成；和/或(iii)导致抑制激活蛋白A的至少一种生物功能。由激活蛋白A中和或阻断抗体引起的抑制无需是完全的，只要使用合适的测定可检测到其即可。用于检测激活蛋白A抑制的示例性测定在本文中的工作实施例中进行了描述。

相比于抗体所来源的对应种系序列，本文中公开的抗激活蛋白A抗体可在重链和轻链可变结构/或的框架区和/或CDR区中包含一个或更多个氨基酸替换、***和/或缺失。这样的突变可容易地通过将本文中公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较确定。本发明包括来源于本文中公开的任意氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或更多个框架区和/或CDR区中的一个或更多个氨基酸被突变成抗体所来源的种系序列的对应残基，或者突变成另一人种系序列的对应残基，或者突变成对应种系残基的保守氨基酸替换(本文中将这样的序列改变统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文中公开的重链和轻链可变区序列开始可容易地产生很多包含一个或更多个单独种系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，V_H和/或V_L结构域中的全部框架和/或CDR残基被突变回抗体所来源之原始种系序列中存在的残基。在另一些实施方案中，仅某些残基被突变回原始种系序列，例如仅FR1前8个氨基酸或FR4后8个氨基酸中存在的突变残基，或者仅CDR1、CDR2或CDR3中存在的突变残基。在另一些实施方案中，一个或更多个框架和/或CDR残基被突变成不同种系序列(例如，不同于抗体最初所来源之种系序列的种系序列)的对应残基。另外，本发明的抗体可在框架和/或CDR区中包含两种或更多种种系突变的任意组合，例如，其中某些单独残基被突变成特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基得以保持或者被突变成不同种系序列的对应残基。一旦得到，可容易地测试包含一个或更多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或更多种期望性质，例如结合特异性提高、结合亲和力提高、拮抗或激动生物学特性(根据具体情况)提高或增强、免疫原性降低等。以这种一般方式得到的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。

本发明还包括这样的抗激活蛋白A抗体，其包含本文中公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体，其具有一个或更多个保守替换。例如，本发明包括具有这样的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗激活蛋白A抗体，所述氨基酸序列相对于本文中公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10或更少个、8或更少个、6或更少个、4或更少个等保守氨基酸替换。

术语“表位”指与抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点(称为互补位)相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有一个以上表位。因此，不同的抗体可结合至抗原上的不同区域并且可具有不同的生物学作用。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链不同区段之在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的邻近氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包含抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。

当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本相同”表示当在具有合适的核苷酸***或缺失的情况下与另一核酸(或其互补链)进行最佳比对时，如通过任何公知的序列同一性算法(例如下文所讨论的FASTA、BLAST或Gap)所测量的，在至少约95％并且更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参照核酸分子具有基本同一性的核酸分子可编码与参照核酸分子所编码之多肽具有相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。

当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本相似”意指当例如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位(gap)权重进行最佳比对时，两条肽序列共有至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸替换而不同。“保守氨基酸替换”是这样的替换，其中氨基酸残基被含有具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基)的另一氨基酸残基替换。一般来说，保守氨基酸替换将基本不改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守替换而彼此不同的情况下，可向上调节序列同一性百分比或相似性程度以校正替换的保守性质。用于进行这种调节的方法是本领域技术人员公知的。参见，例如Pearson，W.R.，MethodsMolBiol24：307-331(1994)。含有具有类似化学特性之侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等，Science256：1443-1445(1992)中公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihoodmatrix)中具有正值的任意改变。“适度保守”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任意改变。

多肽的序列相似性(也称为序列同一性)通常使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配给多种替换、缺失及其他修饰(包括保守氨基酸替换)的相似性的量度来匹配相似序列。例如，GCG软件包含程序如Gap和Bestfit，其可与默认参数一起使用来确定密切相关多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或者野生型蛋白质和其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG6.1版。也可利用FASTA使用默认或推荐参数(GCG6.1版中的一个程序)比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询序列与检索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(参见，例如Pearson，W.R.，MethodsMolBiol132：185-219(2000))。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物体之序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如Altschul等，JMolBiol215：403-410(1990)和Altschul等，NucleicAcidsRes25：3389-402(1997)。

抗体的生物学特征

本发明包括以高亲和力结合激活蛋白A的抗激活蛋白A抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括如通过表面等离子体共振(例如使用本文实施例3中限定的测定形式)所测量的，以小于约30nM的K_D结合激活蛋白A(例如，在25℃或37℃下)的抗体和抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，如通过表面等离子体共振(例如使用本文实施例3中限定的测定形式，或基本相似测定)所测量的，本发明的抗体或抗原结合片段以以下KD结合激活蛋白A：小于约25nM、小于约20nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约500pM、小于约250pM、小于约240pM、小于约230pM、小于约220pM、小于约210pM、小于约200pM、小于约190pM、小于约180pM、小于约170pM、小于约160pM、小于约150pM、小于约140pM、小于约130pM、小于约120pM、小于约110pM、小于约100pM、小于约95pM、小于约90pM、小于约85pM、小于约80pM、小于约75pM、小于约70pM、小于约65pM、小于约60pM、小于约55pM、小于约50pM、小于约45pM、小于约40pM、小于约35pM、小于约30pM、小于约25pM、小于约20pM、小于约15pM、小于约10pM、小于约9pM、小于约8pM、小于约7pM、小于约6pM、小于约5pM、小于约4pM或小于约3pM。

本发明还包括抑制激活蛋白A介导的细胞信号传导的抗激活蛋白A抗体及其抗原结合片段。例如，如在基于细胞的阻断生物测定中(例如，使用本文实施例5中限定的测定形式，或基本相似测定)所测量的，本发明包括以小于约4nM的IC₅₀值抑制通过激活蛋白A与激活蛋白I或II型受体结合而激活SMAD复合物信号转导途径的抗激活蛋白A抗体。在某些实施方案中，如在基于细胞的阻断生物测定中(例如，使用本文实施例5中限定的测定形式，或基本相似测定)所测量的，本发明的抗体或抗原结合片段以以下IC₅₀值抑制通过激活蛋白A与激活蛋白I或II型受体结合而激活SMAD复合物信号转导途径：小于约3nM、小于约2nM、小于约1nm、小于约500pM、小于约250pM、小于约240pM、小于约230pM、小于约220pM、小于约210pM、小于约200pM、小于约190pM、小于约180pM、小于约170pM、小于约160pM、小于约150pM、小于约140pM、小于约130pM、小于约120pM、小于约110pM、小于约100pM、小于约95pM、小于约90pM、小于约85pM、小于约80pM、约75pM、小于70pM、小于约65pM、小于约60pM、小于约55pM、小于约50pM、小于约49pM、小于约48pM、小于约47pM、小于约46pM、小于约45pM、小于约44pM、小于约43pM、小于约42pM、小于约41pM、小于约40pM或小于约39pM。在某些实施方案中，如在基于细胞的阻断生物测定中(例如，使用本文实施例5中限定的测定形式，或基本相似测定)所测量的，本发明的抗体或抗原结合片段以小于约50nM、小于约20nM、小于约10nm、小于约5nM或小于约1nM的IC₅₀值通过干扰激活蛋白B与激活蛋白I或II型受体的结合而抑制激活蛋白B的信号传导激活。在某些实施方案中，如在基于细胞的阻断生物测定中(例如，使用本文实施例5中限定的测定形式，或基本相似测定)所测量的，本发明的抗体或抗原结合片段以以下IC₅₀值抑制通过激活蛋白AB与激活蛋白I或II型受体的结合激活SMAD复合物信号转导途径：小于约500pM、小于约450pM、小于约440pM、小于约430pM、小于约420pM、小于约410pM、小于约400pM、小于约390pM、小于约380pM、小于约370pM、小于约360pM、小于约350pM、小于约340pM、小于约320pM、小于约310pM、小于约300pM、小于约290pM、小于约280pM、小于约270pM、小于约260pM、小于约250pM、小于约240pM、小于约230pM、小于约220pM、小于约210pM、小于约200pM、小于约190pM、小于约180pM、小于约170pM、小于约160pM、小于约150pM或小于约140pM。在某些实施方案中，如在基于细胞的阻断生物测定中(例如，使用本文实施例5中限定的测定形式，或基本相似测定)所测量的，本发明的抗体或抗原结合片段以以下IC₅₀值抑制通过激活蛋白AC与激活蛋白I或II型受体的结合激活SMAD复合物信号转导途径：小于约1nM，小于约900pM、小于约800pM、小于约750pM、小于约700pM、小于约650pM、小于约600pM或小于约580pM。

本发明的抗体可具有前述一种或更多种生物学特征，或其任意组合。通过查看包括本文工作实施例在内的本公开内容，本发明抗体的另一些生物学特征对本领域普通技术人员而言将是明显的。

包含Fc变体的抗激活蛋白A抗体

根据本发明的某些实施方案，提供了包含含有一个或更多个突变之Fc结构域的抗激活蛋白A抗体，与中性pH相比，所述突变在例如酸性pH下增强或减弱与FcRn受体的抗体结合。例如，本发明包括在Fc结构域的C_H2或C_H3区中包含突变的抗激活蛋白A抗体，其中在酸性环境中(例如，在pH为约5.5至约6.0的内体中)，所述突变提高Fc结构域对FcRn的亲和力。当施用于动物时，这样的突变可导致抗体的血清半衰期延长。这样的Fc修饰的非限制性实例包括，例如，250位(例如，E或Q)的修饰；250和428位(例如，L或F)的修饰；252位(例如，L/Y/F/W或T)、254位(例如，S或T)和256位(例如，S/R/Q/E/D或T)的修饰；或者428和/或433位(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或434位(例如，A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰；或者250和/或428位的修饰；或者307或308位(例如，308F、V308F)，和434位的修饰。在一个实施方案中，所述修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如，308F或308P)。在又一个实施方案中，所述修饰包括265A(例如，D265A)和/或297A(例如，N297A)修饰。

例如，本发明包括含有这样的Fc结构域的抗激活蛋白A抗体，所述Fc结构域包含选自以下的一个或更多个突变对或突变组：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如，M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如，M428L和N434S)；257I和311I(例如，P257I和Q311I)；257I和434H(例如，P257I和N434H)；376V和434H(例如，D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如，T307A、E380A和N434A)；以及433K和434F(例如，H433K和N434F)。前述Fc结构域突变以及在本文所公开之抗体可变结构域内的其他突变的所有可能组合均在本发明范围的考虑之内。

本发明还包括含有嵌合重链恒定(CH)区的抗激活蛋白A抗体，其中所述嵌合CH区包含来源于一种以上免疫球蛋白同种型之CH区的区段。例如，本发明的抗体可包含这样的嵌合CH区，其包含与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子之CH3结构域的一部分或全部组合的来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子之CH2结构域的一部分或全部。根据某些实施方案，本发明的抗体包含具有嵌合铰链区的嵌合CH区。例如，嵌合铰链可包含与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号来自228至236位的氨基酸残基)组合的来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号来自216至227位的氨基酸残基)。根据某些实施方案，所述嵌合铰链区包含来源于人IgG1或人IgG4上铰链的氨基酸残基和来源于人IgG2下铰链的氨基酸残基。在某些实施方案中，本文中所述的含有嵌合CH区的抗体可表现出改变的Fc效应物功能并且不对抗体的治疗特性和药代动力学特性产生不利影响。(参见，例如美国临时申请No.61/759,578，提交于2013年2月1日)。

表位作图及相关技术

本发明包括与见于激活蛋白A中(例如，激活蛋白II型受体结合位点中)的一个或更多个氨基酸相互作用的抗激活蛋白A抗体。与所述抗体结合的表位可由位于激活蛋白βA亚基中的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续序列组成。或者，所述表位可由位于激活蛋白A二聚体中的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。

可使用本领域普通技术人员已知的多种技术来确定抗体是否与多肽或蛋白质中的“一个或更多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括，例如，常规交叉阻断测定，如Antibodies，Harlow和Lane(ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarb.，NY)所述的测定；丙氨酸扫描突变分析；肽印迹分析(Reineke，MethodsMolBiol248：443-463(2004))；以及肽切割分析。另外，可采用方法例如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰(Tomer，ProteinScience9：487-496(2000))。可用于鉴定多肽中与抗体相互作用的氨基酸的另一方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换方法涉及对目的蛋白质进行氘标记，之后使抗体与经氘标记的蛋白质结合。接着，将蛋白质/抗体复合物转移至水以允许在除受抗体保护的残基(其仍被氘标记)之外的所有残基处发生氢氘交换。在将抗体解离之后，对靶蛋白质进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示经氘标记的残基，其对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见，例如Ehring，AnalyticalBiochemistry267(2)：252-259(1999)；Engen和Smith，Anal.Chem.73：256A-265A(2001)。

本发明还包括与本文中所述的任意特定示例性抗体(例如，H4H10423P、H4H10424P、H4H10426P、H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10433P2、H4H10436P2、H4H10437P2、H4H10438P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10445P2、H4H10446P2、H4H10447P2、H4H10448P2、H4H10452P2、H4H10468P2、H2aM10965N等)结合相同表位的抗激活蛋白A抗体。同样地，本发明还包括与本文中所述的任意特定示例性抗体(例如，H4H10423P、H4H10424P、H4H10426P、H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10433P2、H4H10436P2、H4H10437P2、H4H10438P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10445P2、H4H10446P2、H4H10447P2、H4H10448P2、H4H10452P2、H4H10468P2、H2aM10965N等)竞争结合激活蛋白A的抗激活蛋白A抗体。例如，本发明包括与本文实施例4中限定的一种或更多种“Bin1”抗体(例如，H4H10423P、H4H10446P2、H4H10468P2和H4H10442P2)交叉竞争结合激活蛋白A的抗激活蛋白A抗体。本发明还包括与本文实施例4中限定的一种或更多种“Bin2”抗体(例如，H4H10429、H4H1430P、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2)交叉竞争结合激活蛋白A的抗激活蛋白A抗体。

可通过使用本领域中已知和本文中例示的常规方法容易地确定抗体是否与参照抗激活蛋白A抗体结合相同的表位或者与参照抗激活蛋白A抗体竞争结合。例如，为了确定受试抗体是否与本发明的参照抗激活蛋白A抗体结合相同的表位，允许该参照抗体与激活蛋白A(或含βA亚基的异源二聚体)结合。接下来，评估受试抗体与激活蛋白A结合的能力。如果受试抗体能够在激活蛋白A与参照抗激活蛋白A抗体饱和结合之后，与激活蛋白A结合，则可推断该受试抗体与参照抗激活蛋白A抗体结合不同的表位。另一方面，如果受试抗体不能够在激活蛋白A与参照抗激活蛋白A抗体饱和结合之后，与激活蛋白A结合，则该受试抗体可能与本发明的参照抗激活蛋白A抗体所结合的表位相同的表位结合。然后可进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认所观察到的缺乏受试抗体结合是否确实是由于与参照抗体结合相同的表位，或者是否是空间阻断(或其他现象)导致所缺乏观察的结合。这种分选实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中可利用的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行。根据本发明的某些实施方案，如果例如，如在竞争性结合测定中所测量的(参见，例如Junghans等，CancerRes.50：1495-1502(1990))，1、5、10、20或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体至少50％，但优选75％、90％或甚至99％的结合，则这两种抗体与相同(或重叠)表位结合。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体之结合的基本所有氨基酸突变均降低或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体与相同表位结合。如果降低或消除一种抗体之结合的氨基酸突变的仅一部分降低或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体具有“重叠表位”。

为了确定抗体是否与参照抗激活蛋白A抗体竞争结合(或与参照抗激活蛋白A抗体交叉竞争结合)，在两个方向上进行上述结合方法：在第一方向上，在饱和条件下使参照抗体与激活蛋白A蛋白(或含βA亚基的异源二聚体)结合，之后评估受试抗体与激活蛋白A分子的结合。在第二方向上，在饱和条件下使受试抗体与激活蛋白A结合，之后评估参照抗体与激活蛋白A的结合。如果，在两个方向上仅第一(饱和)抗体能够与激活蛋白A结合，则推断受试抗体和参照抗体竞争与激活蛋白A的结合(参见，例如本文实施例4中所述的测定形式，其中将受试激活蛋白A抗体捕获在传感器尖端上，然后将其浸没在含有预先与激活蛋白A结合之参照激活蛋白A抗体的溶液中)。本领域普通技术人员将认识到，与参照抗体竞争结合的抗体可能未必与参照抗体结合相同的表位，但可能通过结合重叠表位或邻近表位而在空间上阻断参照抗体的结合。

本发明的抗激活蛋白A抗体可与激活蛋白A上在激活蛋白II型受体之结合位点内或附近的表位结合，直接阻断激活蛋白A和激活蛋白II型受体之间的相互作用并且间接阻断激活蛋白A和激活蛋白I型受体之间的相互作用。本发明的抗激活蛋白A抗体可与激活蛋白A上在激活蛋白I型受体之结合位点内或附近的表位结合，并且直接阻断激活蛋白A和激活蛋白I型受体之间的相互作用。在本发明的一个实施方案中，在激活蛋白I型受体结合位点处或附近与激活蛋白A结合的本发明抗激活蛋白A抗体不阻断激活蛋白A和激活蛋白II型受体之间的相互作用。

人抗体的制备

用于产生单克隆抗体(包括全人单克隆抗体)的方法在本领域中是已知的。任何这样的已知方法均可用于在本发明的上下文中制备与人激活蛋白A特异性结合的人抗体。

使用例如VELOCIMMUNE^TM技术或用于产生全人单克隆抗体的任何其他已知方法，最初分离的是具有人可变区和小鼠恒定区之针对人激活蛋白A的高亲和力嵌合抗体。如下文的实验部分中，对所述抗体进行表征并选择期望的特征，包括亲和力、选择性、表位等。如有必要，将小鼠恒定区替换成期望的人恒定区(例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4)以产生全人抗激活蛋白A抗体。尽管所选择的恒定区可根据特定用途而改变，但高亲和力抗原结合和靶标特异性特征仍保留在可变区中。在某些情况下，直接从抗原阳性B细胞分离全人抗激活蛋白A抗体。

生物等效物(Bioequivalent)

本发明的抗激活蛋白A抗体和抗体片段涵盖具有这样的氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列由上述抗体的氨基酸序列变化而来但保留结合人激活蛋白A的能力。与亲本序列相比，这样的变体抗体和抗体片段包含一个或更多个氨基酸的添加、缺失或替换，但表现出与所述抗体的生物学活性基本等效的生物学活性。同样地，本发明的抗激活蛋白A抗体编码DNA序列涵盖这样的序列，与所公开序列相比，其包含一个或更多个核苷酸的添加、缺失或替换，但其编码与本发明的抗激活蛋白A抗体或抗体片段基本生物等效的抗激活蛋白A抗体或抗体片段。这样的变体氨基酸和DNA序列的实例在上文进行了讨论。

如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是这样的药物等效物或药物替代物，则认为它们是生物等效的：当在相似实验条件下以相同摩尔剂量(不管是单剂量或多剂量)施用时，其吸收速率和程度未表现出显著差异。如果一些抗体在其吸收程度方面是等效的但在其吸收速率方面不等效的，则将认为它们是等效物或药物替代物，并且由于以下原因而仍可被认为是生物等效的：吸收速率方面的此类差异是有意的且反映在标签中，不是例如长期使用时达到有效的体内药物浓度所必需的，并且被认为对所研究的特定药物产品不具有医学显著性。

在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度和效力方面不存在临床上有意义的差异，则认为它们是生物等效的。

在一个实施方案中，如果患者可在参照产品和生物产品之间转换一次或更多次，而与无这样的转换的持续治疗相比不良作用(包括免疫原性发生临床上显著的改变或有效性降低)的风险并未预期提高，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。

在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件方面都通过共同的作用机制来起作用，则在所述机制已知程度上它们是生物等效的。

生物等效性可通过体内和体外方法证明。生物等效性测量包括，例如(a)人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其他生物流体中抗体或其代谢物的浓度作为时间的函数；(b)已与人体内生物利用度数据相关联并且对其具有合理预测性的体外测试；(c)人或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理学作用作为时间的函数；以及(d)在建立抗体的安全性、效力或生物利用度或生物等效性的良好控制的临床试验中。

可如下构建本发明抗激活蛋白A抗体的生物等效变体：例如对生物活性不需要的残基或序列进行多种替换，或者缺失生物活性不需要的末端或内部残基或序列。例如，可缺失或者用其他氨基酸替换对生物活性非必需的半胱氨酸残基以防止在复性后形成不必要或不正确的分子内二硫桥。在另一些情景下，生物等效抗体可包括这样的抗激活蛋白A抗体变体，其含有改变该抗体的糖基化特征的氨基酸变化，例如消除或除去糖基化的突变。

物种选择性和物种交叉反应性

根据某些实施方案，本发明提供了与人激活蛋白A结合但不与来自其他物种的激活蛋白A结合的抗激活蛋白A抗体。本发明还包括与人激活蛋白A结合并且与来自一种或更多种非人物种的激活蛋白A结合的抗激活蛋白A抗体。例如，本发明的抗激活蛋白A抗体可与人激活蛋白A结合，并且可与或者不与(根据具体情况)以下一种或更多种激活蛋白A结合：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩激活蛋白A。根据本发明的某些示例性实施方案，提供了特异性地结合人激活蛋白A(例如，激活蛋白A或含βA亚基的异源二聚体)和弥猴类(cynomolgus)猴(例如食蟹猴(Macacafascocularis))激活蛋白A的抗激活蛋白A抗体。

免疫缀合物

本发明涵盖与治疗性部分缀合的抗激活蛋白A单克隆抗体(“免疫缀合物”)，所述治疗性部分例如细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。细胞毒剂包括对细胞有害的任何药剂。用于形成免疫缀合物的合适细胞毒剂和化学治疗剂的实例在本领域中是已知的(参见例如，WO05/103081)。

多特异性抗体

本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可包含对一种以上靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见，例如Tutt等，JImmunol147：60-69(1991)；Kufer等，TrendsBiotechnol22：238-244(2004)。本发明的抗激活蛋白A抗体可与另一功能分子(例如另一肽或蛋白质)连接或共表达。例如，抗体或其片段可与一个或更多个其他分子实体(例如其他抗体或抗体片段)功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合等)以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括这样的双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂对于人激活蛋白A或其片段具有特异性，而免疫球蛋白的另一条臂对第二治疗靶标具有特异性或者与治疗性部分缀合。本发明的一个实施方案包括这样的双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一条臂对于人激活蛋白A或其片段具有特异性，而免疫球蛋白的另一条臂对GDF8具有特异性。

可在本发明的上下文中使用的一个示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)C_H3结构域和第二IgC_H3结构域，其中第一和第二IgC_H3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低双特异性抗体与蛋白A的结合(参见，例如美国专利No.8,586,713)。在一个实施方案中，第一IgC_H3结构域结合蛋白A，并且第二IgC_H3结构域包含降低或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；H435R，通过EU编号)。第二C_H3还可包含Y96F修饰(通过IMGT；Y436F；通过EU)。可见于第二C_H3中的另一些修饰包括：IgG1抗体情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通过IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I，通过EU)；在IgG2抗体情况下的N44S、K52N和V82I(IMGT；N384S、K392N和V422I，通过EU)；以及在IgG4抗体情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、V82I和L105P(通过IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、V422I和L445P，通过EU)。对上述双特异性抗体形式的变化均在本发明范围的考虑之内。

可在本发明的上下文中使用的其他示例性双特异性形式包括但不限于，例如基于scFv的双特异性形式或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合物、双可变结构域(DVD)-Ig、细胞杂交瘤(Quadroma)、结进孔(knob-into-hole)、共同轻链(例如，具有结进孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG，以及Mab²双特异性形式(参见，例如Klein等，mAbs4：6，1-11(2012)，以及本文中引用的参考文献以供查看上述形式)。还可使用肽/核酸缀合物来构建双特异性抗体，例如其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸产生位点特异性的抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有限定组成、价和几何学的多聚复合物。(参见，例如Kazane等，JAmChemSoc.135(1)：340-346(2013))。

治疗制剂和施用

本发明提供了包含本发明抗激活蛋白A抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物可用合适的载体、赋形剂以及提供改善的转移、递送、耐受性等的其他药剂配制。大量的合适制剂可见于所有药物化学家已知的处方集中：Remington′sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，PA。这些制剂包括，例如散剂、糊剂、软膏剂、胶冻剂(jelly)、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子脂质)的囊泡(例如LIPOFECTIN^TM，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油型和油包水型乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶，以及包含碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等“Compendiumofexcipientsforparenteralformulations”PDA，JPharmSciTechnol52：238-311(1998)。

施用于患者的抗体的剂量可根据以下而不同：患者的年龄和尺寸、目标疾病、状况、施用途径等。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。当使用本发明的抗体以在成年患者中治疗与激活蛋白A活性相关的病症或疾病时，可有利地通常以以下单剂量静脉内施用本发明的抗体：约0.01至约20mg/kg体重，更优选约0.02至约7、约0.03至约5或者约0.05至约3mg/kg体重。根据病症的严重程度，可调整治疗的频率和持续时间。用于施用抗激活蛋白A抗体的有效剂量和时间表可凭经验确定；例如可通过周期性评估来检测患者进展并相应地调整剂量。另外，可使用本领域中公知的方法进行剂量的物种间缩放(例如，Mordenti等，PharmaceutRes8：1351(1991))。

多种递送***是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体、微颗粒、微胶囊中，能够表达本发明抗体或其他治疗性蛋白质的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见，例如，Wu等，JBiolChem262：4429-4432(1987))。本发明的抗体及其他治疗活性组分还可通过基因治疗技术来递送。引入方法包括但不限于：皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。所述组合物可通过任何方便途径施用，例如通过输注或推注注射(bolusrejection)、通过经上皮或粘膜皮肤内衬(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。

本发明的药物组合物可用标准针和注射器皮下或静脉内递送。另外，对于皮下递送，笔式递送装置(pendeliverydevice)容易地应用于递送本发明的药物组合物。这样的笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常利用含有药物组合物的可替换笔芯(cartridge)。一旦笔芯中的全部药物组合物均已被施用并且笔芯为空，可容易地将空笔芯丢弃并替换成含有药物组合物的新笔芯。然后，可重新使用所述笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可替换的笔芯。但是，一次性笔式递送装置预填充有药物组合物，其容纳在该装置内的储存器中。一旦容器内没有药物组合物，就将整个装置丢弃。

多种可重复使用的笔式和自动注射器式递送装置应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPEN^TM(OwenMumford，Inc.，Woodstock，UK)，DISETRONIC^TM笔(DisetronicMedicalSystems，Bergdorf，Switzerland)，HUMALOGMIX75/25^TM笔，HUMALOG^TM笔，HUMALIN70/30^TM笔(EliLillyandCo.，Indianapolis，IN)，NOVOPEN^TMI、II和III(NovoNordisk，Copenhagen，Denmark)，NOVOPENJUNIOR^TM(NovoNordisk，Copenhagen，Denmark)，BD^TM笔(BectonDickinson，FranklinLakes，NJ)，OPTIPEN^TM，OPTIPENPRO^TM，OPTIPENSTARLET^TM，以及OPTICLIK^TM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)等。应用于皮下递送本发明药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但不限于SOLOSTAR^TM笔(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(NovoNordisk)，以及KWIKPEN^TM(EliLilly)、SURECLICK^TM自动注射器(Amgen，ThousandOaks，CA)、PENLET^TM(Haselmeier，Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey，L.P.)和HUMIRA^TM笔(AbbottLabs，AbbottParkIL)等。

在某些情况下，可以在受控释放***中递送药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，同上；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987))。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料；参见，MedicalApplicationsofControlledRelease，Langer和Wise(编辑)，1974，CRCPres.，BocaRaton，Florida。在又一个实施方案中，可将受控释放***接近组合物的靶标放置，因此仅需要全身性剂量的一部分(参见，例如Goodson，1984，inMedicalApplicationsofControlledRelease，同上，第2卷，第115-138页)。其他的受控释放***在Langer，Science249：1527-1533(1990)的综述中进行了讨论。

可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射，滴注等的剂型。这些可注射制剂可通过公知的方法制备。例如，可如下制备可注射制剂：例如将上述抗体或其盐在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、混悬或乳化。对于注射用水性介质，例如有生理盐水，包含葡萄糖及其他辅助剂的等渗溶液等，其可与合适的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。对于油性介质，例如有芝麻油、大豆油等，其可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。将如此制备的注射剂优选填充在合适的安瓿中。

有利地，将上述用于经口或胃肠外使用的药物组合物制备成适于匹配活性成分剂量的单位剂量剂型。这样的单位剂量剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。所包含的前述抗体的量一般为每单位剂量剂型约5至约500mg；特别在注射剂的形式下，优选前述抗体以约5至约100mg包含在内和对于其他剂型以约10至约250mg包含在内。

抗体的治疗用途

本发明的抗体特别可用于治疗、预防和/或改善以下任意疾病或病症，所述疾病/或病症与激活蛋白A表达、信号传导或活性相关或者由其介导，或者通过阻断激活蛋白A和激活蛋白A受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、激活蛋白I型受体等)之间的相互作用或另外地抑制激活蛋白A活性和/或信号传导可治疗。例如，本发明提供了通过以下治疗可被治愈、缓解或改善之病症或病痛的方法：通过特异性地结合激活蛋白A但不结合其他ActRIIB配体或者通过特异性地结合激活蛋白A和GDF8但不结合其他ActRIIB配体来在个体中提高肌肉强度/力量和/或肌肉的量和/或肌肉功能，或者有利地改变代谢(碳水化合物、脂质和蛋白质加工)。例如，本发明包括用于在对象中提高肌肉强度/力量和/或肌肉的量和/或肌肉功能的方法，或者用于在对象中治疗以肌肉的量或强度降低为特征之疾病或病症的方法，其通过向所述对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白进行。本发明还包括用于在对象中提高肌肉强度/力量和/或肌肉的量和/或肌肉功能的方法，或者用于在对象中治疗以肌肉的量或强度降低为特征之疾病或病症的方法，其通过向所述对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白进行。本文中公开或提及的任何激活蛋白A特异性结合蛋白和/或GDF8特异性结合蛋白均可在本发明这些方面的上下文中使用。例如，本发明的治疗方法包括向对象施用抗激活蛋白A抗体和/或抗GDF8抗体。

因此，在本文中所述治疗方法的上下文中，抗激活蛋白A抗体可作为单一治疗施用(即，作为仅有的治疗剂)或者与一种或更多种另外的治疗剂(例如，抗GDF8抗体)组合施用，所述另外的治疗剂的另一些实例在本文中的其他部分进行了描述。

在包括向对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白的方法中，可将激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白以例如单一治疗剂量或两个单独剂量同时或基本同时施用于所述对象，所述两个单独剂量同时施用或者在另一剂量的短于约5分钟内施用。或者，可将激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白以例如彼此在时间上相隔超过约5分钟的单独治疗剂量依次施用于所述对象。

本发明还包括用于在对象中提高肌肉强度/力量和/或肌肉的量和/或肌肉功能的方法，或者用于在对象中治疗以肌肉的量或强度降低为特征之疾病或病症的方法，其通过向所述对象施用包含激活蛋白A特异性结合结构域和GDF8特异性结合结构域的抗原结合分子进行。本文中公开或提及的任何抗原结合分子均可在本发明这一方面的上下文中使用。例如，本发明的治疗方法包括向对象施用包含第一可变结构域和第二可变结构域的双特异性抗体，所述第一可变结构域包含特异性地结合激活蛋白A的HCVR/LCVR对，所述第二可变结构域包含特异性地结合GDF8的HCVR/LCVR对。

可将本发明的组合物与一种或更多种另外的治疗剂一起施用于对象，所述另外的治疗剂包括，例如生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和细胞毒剂/细胞生长抑制剂。可在施用本发明的激活蛋白A和GDF8特异性结合蛋白之前、同时或之后施用另外的治疗剂。

可用本发明组合物治疗的示例性疾病、障碍和病症包括但不限于：肌肉减少症；恶病质(特发性恶病质或另一病症(例如，癌症、慢性肾衰竭或慢性阻塞性肺病)的继发性恶病质)；肌肉损伤；肌肉消耗和肌肉萎缩，例如由以下引起或与其相关的肌肉萎缩或消耗：废用(例如肌肉废用)，固定，卧床休息，损伤，医学治疗或手术介入(例如，髋骨折、髋关节置换和膝关节置换，以及其他关节、腱或韧带损伤例如前十字韧带(ACL)和/或内侧副韧带(MCL)撕裂，等)，肌营养不良(例如，强直性肌营养不良、迪谢纳肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良(Facioscapulohumeral)(FSHD，也称为朗-德病(Landouzy-Déjérinedisease)、先天性肌营养不良、眼脑肾肌营养不良、远端型肌营养不良、埃-德肌营养不良等)，糖皮质激素诱导性肌病，卒中康复(例如，卒中轻偏瘫的康复)或机械通气所不可避免的。本发明的组合物还可用于治疗、预防或改善以下疾病，例如癌症、肥胖、糖尿病、关节炎、多发性硬化、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、骨质疏松症、骨关节炎、骨质减少和代谢综合征(包括但不限于糖尿病、肥胖、营养失调、器官萎缩、慢性阻塞性肺病和厌食症)。可使用本发明的组合物预防、治疗和/或改善的其他疾病、障碍和病症包括脓毒症、慢性心力衰竭、良性和恶性嗜铬细胞瘤、子宫纤维瘤/平滑肌瘤、先兆子痫、疤痕疙瘩和肥大性瘢痕，以及肺动脉高压。

提高的结合特异性和活性

本发明包括用于在对象中提高肌肉强度/力量和/或肌肉的量和/或肌肉功能，或者用于在对象中治疗以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症，或者用于治疗由激活蛋白A活性引起、促进或加重的疾病或病症，且不会引起不良作用的方法，所述不良作用与施用结合多种(例如，3种或更多种)ActRIIB配体的分子相关。换言之，使用抗激活蛋白A抗体或其抗原结合蛋白的方法(例如，其中所述抗激活蛋白A抗体仅与激活蛋白A显著结合)可治疗疾病或病症且不会引起用结合多种ActRIIB配体的分子观察到的不期望或不良的作用。例如，称为ACE-031(AcceleronPharma，Inc.，Cambridge，MA)的临床分子是一种多聚体，其由与IgGFc结构域融合的ActRIIB的细胞外部分组成(在本文中也将该分子称为“ActRIIB-Fc”)。ActRIIB-Fc结合激活蛋白A以及其他ActRIIB配体(例如，激活蛋白B、GDF8、GDF11，BMP9、BMP10和TGFβ)并且已知当施用于人患者时引起多种不良作用。显著地，本发明人已出人意料地发现：特异性地抑制激活蛋白A和GDF8(例如，通过施用抗激活蛋白A抗体和抗GDF8抗体)尽管不抑制其他ActRIIB配体(例如激活蛋白B、GDF11、BMP9、BMP10和TGFβ)，但导致肌肉的量提高且不会引起与结合剂(例如ActRIIB-Fc)相关的不良作用，所述提高至少等效于通过施用ActRIIB-Fc所观察到的提高。

联合治疗和制剂

本发明包括包含本文中所述的任意抗激活蛋白A抗体与一种或更多种另外的治疗活性组分之组合的组合物和治疗制剂，以及治疗方法，其包括向有此需要的对象施用这样的组合。本发明还包括包含本文中所述的任意抗激活蛋白A抗体与一种或更多种另外的治疗活性组分之组合的组合物和治疗制剂，以及治疗方法，其包括向有此需要的对象施用这样的组合。例如，还可将本发明的抗激活蛋白A抗体与以下物质组合施用和/或共配制：抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、糖皮质激素、类固醇、氧、抗氧化剂、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAID。还可将本发明的抗激活蛋白A抗体作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案也包括放射治疗和/或常规化学治疗(例如，在治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的情景下)。前述任意另外的治疗活性组分均可与本发明的任意抗激活蛋白A抗体组合施用以用于治疗施用抗激活蛋白A抗体具有益处的任何疾病或病症，例如肌肉减少症、恶病质、肌肉损伤、肌肉消耗和肌肉萎缩。前述任意另外的治疗活性组分还可与GDF8抑制剂(例如，抗GDF8抗体)一起与本发明的任意抗激活蛋白A抗体组合施用。

另外的治疗活性组分可在施用本发明的抗激活蛋白A抗体之前施用于对象。例如，如果在施用第二组分前1周、前72小时、前60小时、前48小时、前36小时、前24小时、前12小时、前6小时、前5小时、前4小时、前3小时、前2小时、前1小时、前30分钟、前15分钟、前10分钟、前5分钟或前短于1分钟施用第一组分，则可认为在所述第二组分“之前”施用所述第一组分。在另一些实施方案中，另外的治疗活性组分可在施用本发明的抗激活蛋白A抗体之后施用于对象。例如，如果在施用第二组分后1分钟、后5分钟、后10分钟、后15分钟、后30分钟、后1小时、后2小时、后3小时、后4小时、后5小时、后6小时、后12小时、后24小时、后36小时、后48小时、后60小时、后72小时施用第一组分，则可认为在所述第二组分“之后”施用所述第一组分。在又一些实施方案中，另外的治疗活性组分可在施用本发明的抗激活蛋白A抗体的同时施用于对象。出于本发明的目的，“同时”施用包括，例如将抗激活蛋白A抗体和另外的治疗活性组分以单个剂型施用于对象，或者以单独剂型在彼此的约30分钟或更短内施用于对象。如果以单独剂型施用，则每个剂型可通过相同途径施用(例如，抗激活蛋白A抗体和另外的治疗活性组分两者均经静脉内、皮下、玻璃体内等施用)；或者，每个剂型可通过不同的途径施用(例如，抗激活蛋白A抗体可局部(例如玻璃体内)施用，而另外的治疗活性组分可全身施用)。在任何情况下，出于本公开内容的目的，以单个剂型施用、以单独剂型通过相同途径施用或者以单独剂型通过不同途径施用均被认为是“同时施用”。出于本公开内容的目的，在施用另外的治疗活性组分“之前”、“同时”或“之后”(如本文上面所定义的那些术语)施用抗激活蛋白A抗体均被认为将抗激活蛋白A抗体与另外的治疗活性组分“组合”施用。

本发明包括这样的药物组合物，其中本发明的抗激活蛋白A抗体与本文其他部分所述的一种或更多种另外的治疗活性组分共配制。

剂量

可施用于对象的活性成分(例如，抗激活蛋白A抗体、与抗激活蛋白A抗体组合给药的抗GDF8抗体，或特异性地结合激活蛋白A和GDF8的双特异性抗体)的量一般为治疗有效量。本文中使用的短语“治疗有效量”意指导致以下一个或更多个参数可检测地提高的抗原特异性结合蛋白和/或抗原结合分子的剂量：体重、肌肉的量(例如，胫骨前肌[TA]肌肉的量、腓肠肌[GA]肌肉的量、四头肌[Quad]肌肉的量等)、肌肉强度/力量，和/或肌肉功能。例如，激活蛋白A特异性结合蛋白和/或GDF8特异性结合蛋白的“治疗有效量”包括例如这样的激活蛋白A特异性结合蛋白和/或GDF8特异性结合蛋白的量：与经对照处理的对象相比，当施用于受试对象时其导致TA或GA肌肉的量提高至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或更多，例如本文实施例7中所举例说明的。

在本发明的抗体(例如，抗激活蛋白A抗体、与抗激活蛋白A抗体组合给药的抗GDF8抗体，或特异性地结合激活蛋白A和GDF8的双特异性抗体)的情况下，治疗有效量可以为约0.05mg至约600mg；例如，约0.05mg、约0.1mg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg、约600mg、约610mg、约620mg、约630mg、约640mg、约650mg、约660mg、约670mg、约680mg、约690mg、约700mg、约710mg、约720mg、约730mg、约740mg、约750mg、约760mg、约770mg、约780mg、约790mg、约800mg、约810mg、约820mg、约830mg、约840mg、约850mg、约860mg、约870mg、约880mg、约890mg、约900mg、约910mg、约920mg、约930mg、约940mg、约950mg、约960mg、约970mg、约980mg、约990mg、或约1000mg的相应抗体。

单个剂量中包含的本发明抗体(例如，抗激活蛋白A抗体、与抗激活蛋白A抗体组合给药的抗GDF8抗体，或特异性地结合激活蛋白A和GDF8的双特异性抗体)的量可以以每千克患者体重的毫克抗体(即，mg/kg)来表示。例如，本发明的抗激活蛋白A抗体、抗GDF8抗体和/或抗激活蛋白A/抗GDF8双特异性抗体可以以约0.0001至约50mg/kg患者体重的剂量(例如，0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10.0mg/kg、10.5mg/kg、11.0mg/kg、11.5mg/kg、12.0mg/kg、12.5mg/kg、13.0mg/kg、13.5mg/kg、14.0mg/kg、14.5mg/kg、15.0mg/kg、15.5mg/kg、16.0mg/kg、16.5mg/kg、17.0mg/kg、17.5mg/kg、18.0mg/kg、18.5mg/kg、19.0mg/kg、19.5mg/kg、20.0mg/kg等)施用于患者。

本发明的组合物可包含等量的激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白。或者，组合物中激活蛋白A特异性结合蛋白的量可小于或大于GDF8特异性结合蛋白的量。本领域普通技术人员使用常规实验将能够确定产生期望治疗效果所必需的本发明组合物中单个组分的合适量。

施用方案

根据本发明的某些实施方案，可在限定的时间进程内向对象施用多个剂量的活性成分(例如，抗激活蛋白A抗体、与抗激活蛋白A抗体组合施用的抗GDF8抗体、包含抗激活蛋白A抗体与本文中所述的任意另外的治疗活性剂(包括，例如抗GDF8抗体)之组合的药物组合物，或特异性地结合激活蛋白A和GDF8的双特异性抗体)。根据本发明这一方面的方法包括将多个剂量的本发明活性成分依次施用于对象。本文中使用的“依次施用”意指将活性成分的每个剂量在相隔预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)的不同时间点(例如在不同天)施用于对象。本发明包括这样的方法，其包括向患者依次施用单独初始剂量的活性成分，之后是一个或更多个第二剂量的活性成分，任选地接着是一个或更多个第三剂量的活性成分。

术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用活性成分(例如，本发明的抗激活蛋白A抗体)或本发明的联合治疗(例如，抗激活蛋白A抗体和抗GDF8抗体)的时间顺序。因此，“初始剂量”为在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”为在初始剂量之后施用的剂量；而“第三剂量”为在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量均可包含相同量的活性成分(例如，抗激活蛋白A抗体)，但一般可在施用频率方面彼此有所不同。然而，在某些实施方案中，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中包含的活性成分(例如，抗激活蛋白A抗体)的量在治疗过程期间彼此不同(例如，适当时向上或向下调整)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时作为“负荷剂量”施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量，之后施用后续剂量，其以较低的频率施用(例如，“维持剂量”)。

本发明的某些示例性实施方案中，在紧接其前的剂量后1至26(例如，1、1¹/₂、2、2¹/₂、3、3¹/₂、4、4¹/₂、5、5¹/₂、6、6¹/₂、7、7¹/₂、8、8¹/₂、9、9¹/₂、10、10¹/₂、11、11¹/₂、12、12¹/₂、13、13¹/₂、14、14¹/₂、15、15¹/₂、16、16¹/₂、17、17¹/₂、18、18¹/₂、19、19¹/₂、20、20¹/₂、21、21¹/₂、22、22¹/₂、23、23¹/₂、24、24¹/₂、25、25¹/₂、26、26¹/₂或更大)周施用每个第二和/或第三剂量。本文中使用的短语“紧接其前的剂量”意指在多个施用的顺序中以无间隔剂量的顺序在施用恰好下一个剂量之前施用于患者的活性成分(例如，抗激活蛋白A抗体)的剂量。

根据本发明这一方面的方法可包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的本发明活性成分(例如，抗激活蛋白A抗体)。例如，在某些实施方案中，仅向患者施用单独第二剂量。在另一些实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8个或更多个)第二剂量。同样地，在某些实施方案中，仅向患者施用单独第三剂量。在另一些实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8个或更多个)第三剂量。

在涉及多个第二剂量的实施方案中，每个第二剂量可以以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，每个第二剂量可在紧接其前的剂量后1至2周或1至2个月施用于患者。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，每个第三剂量可以以与其他第二剂量相同的频率施用。例如，每个第三剂量可在紧接其前的剂量后2至12周施用于患者。在本发明的某些实施方案中，向患者施用第二和/或基三剂量的频率在治疗方案的进程内可变化。还可在临床检查之后根据个体患者的需求由医生在治疗进程期间对施用频率进行调整。

本发明包括这样的施用方案，其中以第一频率(例如，一周一次、每两周一次、每三周一次、一个月一次、每两个月一次等)向患者施用2至6个负荷剂量，之后以较低的频率向所述患者施用两个或更多个维持剂量。例如，根据本发明的这一方面，如果以一个月一次的频率施用负荷剂量，则可以以每6周一次、每两个月一次、每三个月一次等向所述患者施用维持剂量。

抗体的诊断用途

例如出于诊断目的，本发明的抗激活蛋白A抗体还可用于在样品中检测和/或测量激活蛋白A或表达激活蛋白A的细胞。例如，抗激活蛋白A抗体或片段可用于诊断以激活蛋白A的异常表达(例如，过表达、表达不足、缺乏表达等)为特征的病症或疾病。用于激活蛋白A的示例性诊断测定可包括例如：使从患者获得的样品与本发明的抗激活蛋白A抗体接触，其中所述抗激活蛋白A抗体标记有可检测标记物或报道分子。或者，可将未经标记的抗激活蛋白A抗体与自身经可检测标记的二抗组合用于诊断应用。所述可检测标记物或报道分子可以是放射性同位素，例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光或化学发光部分，例如荧光素异硫氰酸盐/酯或罗丹明；或者酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于在样品中检测或测量激活蛋白A的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。

可用于根据本发明的激活蛋白A诊断测定的样品包括可从患者获得的任何组织或流体样品，其在正常或病理条件下包含可检测量的激活蛋白A蛋白或其片段。一般来说，将测量从健康患者(例如，未患有与异常激活蛋白A水平或活性相关之疾病或病症的患者)获得的特定样品中激活蛋白A的水平以初始建立激活蛋白A的基线或标准水平。然后，可将激活蛋白A的这一基线水平与在从怀疑患有激活蛋白A相关疾病或病症之个体获得的样品中测量的激活蛋白A水平进行比较。

实施例

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述，并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已经尽力确保所使用数值(例如，量、温度等)的精确度，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

实施例1.产生针对激活蛋白A的人抗体

将包含激活蛋白A蛋白(抑制素βA二聚体)的免疫原与刺激免疫应答的佐剂一起直接施用于小鼠，其包含编码人免疫球蛋白重链可变区和κ轻链可变区的DNA。通过激活蛋白A特异性的免疫测定来监测抗体免疫应答。当获得期望的免疫应答时，收获脾细胞并将其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保存其生存力并形成杂交瘤细胞系。对杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生激活蛋白A特异性抗体的细胞系。使用该技术，获得数种抗激活蛋白A嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。以此方式获得的一种示例性抗体是H2aM10965N。随后将来自嵌合抗体的人可变结构域克隆到人恒定结构域上以制备本文中所述的全人抗激活蛋白A抗体。

如US2007/0280945A1中所述的，也可直接从抗原阳性B细胞分离抗激活蛋白A抗体而无需与骨髓瘤细胞融合。使用该方法，获得了数种全人抗激活蛋白A抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)；将以此方式产生的示例性抗体命名如下：H4H10423P、H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10436P2和H4H10446P2。

在下文所示的实施例中对根据该实施例之方法产生的示例性抗激活蛋白A抗体的某些生物学性质进行了详细描述。

实施例2.重链和轻链可变区氨基酸序列

表1示出了所选抗激活蛋白A抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对及其对应的抗体标识符。对应的核酸序列标识符示于表2中。

表1：氨基酸序列标识符

表2：核酸序列标识符

抗体通常根据以下命名法在此提及：Fc前缀(例如，“H1M”、“H2aM”、“H4H”)，其后是数字标识符(例如，如表1和2中所示的“10423”、“10424”、或“10426”)，其后是“P”、“P2”或“N”后缀。因此，根据该命名法，在此可将抗体称为例如“H4H10423P”、“H4H10432P2”、“H2aM10965N”等。本文中使用的抗体名称上的H1M、H2M和H4H前缀表示该抗体的具体Fc区同种型。例如，“H2aM”抗体具有小鼠IgG2aFc，而“H4H”抗体具有人IgG4Fc。本领域普通技术人员将认识到，可将具有特定Fc同种型的抗体转换成具有不同Fc同种型的抗体(例如，可将具有小鼠IgG2aFc的抗体转换成具有人IgG4的抗体等)，但是在任何情况下，由表1中所示的数字标识符表示的可变结构域(包括CDR)将保持相同，并且不管Fc结构域的性质，预期结合特性相同或基本相似。

用于以下实施例的对照构建体

出于比较目的，在以下实施例中包括抗激活蛋白A对照分子。本文中命名为对照1的对照抗体是具有US8,309,082中所示之“A1”的重链和轻链可变结构域序列的人抗激活蛋白A抗体。对照2是在美国专利申请No.2012/0237521A1中作为MOR8159公开的抗人激活蛋白IIB型受体抗体(抗ActR2BmAb)。对照3是来自R&DSystems，Minneapolis，MN的鼠抗激活蛋白A单克隆抗体(目录号MAB3381)。对照4是激活蛋白IIB型受体-Fc融合分子(与C端人IgG1Fc融合蛋白产生的可溶性激活蛋白RIIB型受体细胞外结构域(NP_001097的E23-P133，其后是Gly-Ser接头，其后是C端人IgG1Fc融合物))，其序列以SEQIDNO：227提供。

实施例3.如通过表面等离子体共振确定的与人激活蛋白A的抗体结合

使用实时表面等离子体共振生物传感器(BiacoreT200或Biacore4000，GEHealthcareLifeSciences，Piscataway，NJ)测定在25℃和37℃下确定与所选的经纯化抗人激活蛋白A单克隆抗体的抗原结合的结合亲和力和动力学常数。将表示为小鼠Fc(前缀H2aM)或人Fc(前缀H4H)的抗体捕获在其相应的抗Fc传感器表面上(mAb捕获形式)。将抗激活蛋白A抗体捕获在通过与BiacoreCM5传感器芯片进行直接胺偶联产生的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(GEHealthcare，#BR-1008-38)或小鼠抗人IgG单克隆抗体(GEHealthcare，#BR-1008-39)表面上。使用HBS-EP(10mMHEPES、150mMNaCl、3mMEDTA、0.05％表面活性剂P20，pH7.4)或PBS-P(10mM磷酸钠、2.7mMKCl、137mMNaCl、0.02％NaN3、0.05％表面活性剂P20，pH7.4)作为流动缓冲液(runningbuffer)和样品缓冲液两者来进行动力学实验。抗原-抗体缔合速率通过在捕获的抗体表面之上注射不同浓度(4倍稀释，50至0.2nM)的以下物质测量：激活蛋白A(R&DSystems，#338-AC-050/CF)、激活蛋白B(R&DSystems，#659-AB-025/CF)、激活蛋白AB(R&DSystems，#1006-AB-005)、激活蛋白AC(R&DSystems，#4879-AC/CF)或抑制素E(NovusBiologicals，#H00083729-P01)。对抗体-抗原缔合监测240秒，同时对缓冲液中的解离监测600秒。通过使用Scrubber软件2.0c版处理并拟合数据来确定动力学缔合和解离速率常数。然后，由动力学速率常数如下计算结合平衡解离常数(K_D)和解离半衰期(t_1/2)：K_D(M)＝k_d/k_a和t_1/2(分钟)＝[ln2/(60＊k_d)]。不同抗激活蛋白A单克隆抗体的动力学结合参数示于表3至10中(NB＝在使用条件下未观察到结合；NT＝未测试)。

表3：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白A在25℃下的结合特征

对于斜体的k_d值，在这些实验条件下未观察到分析物的解离，因此k_d的值固定在5.0E-05s^-1。

表4：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白A在37℃下的结合特征

表5：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白B在25℃下的结合特征

表6：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白B在37℃下的结合特征

表7：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白AB在25℃下的结合特征

表8：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白AB在37℃下的结合特征

表9：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白AC在25℃下的结合特征

表10：抗激活蛋白A抗体与激活蛋白AC在37℃下的结合特征

如表3和4中所示，本发明的抗激活蛋白A抗体与激活蛋白A在25℃下以小于3.18pM(即，≤3.18E-12)至745pM(即，7.45E-10)的K_D值结合，并且在37℃下以小于2.18pM(即，≤2.18E-12)至1.77nM(1.77E-09)的K_D值结合。如表5和6中所示，几种抗激活蛋白A抗体(即，H4H10432P2、H4H10442P2、H4H10430P2、H4H10446P2和H4H10468P2)证明与激活蛋白B在25℃或37℃下无可测量的结合。一些抗体证明与激活蛋白AB具有可测量的结合，在25℃下的K_D值为约18.5pM(即，1.85E-11)至33.1nM(即，3.31E-08)(表7)，并且在37℃下的K_D值为约44.3pM(即，4.43E-11)至24.2nM(即，2.42E-08)(表8)。一些抗体证明与激活蛋白AC具有可测量的结合，其中在25℃下的K_D值为约99.7pM(即，9.97E-11)至11.8nM(即，1.18E-08)(表9)，并且在37℃下的K_D值为约462pM(即，4.62E-10)至22.5nM(即，2.25E-08)(表10)。另外，本发明的受试抗激活蛋白A抗体证明均与抑制素E无可测量的结合(数据未示出)。

实施例4：如通过表面等离子体共振确定的与TGF-β家族成员的抗体结合

测试激活蛋白AmAb与一组TGF-β家族成员的结合交叉反应性。对于结合实验，使用Biacore4000仪器。将抗体H4H10429P、H4H10430P、H4H10436P2、H4H10442P2、H4H10446P2；对照4(与C端人IgG1Fc标签产生的ActR2B可溶性胞外结构域蛋白(ActR2B-hFc；SEQIDNO：227))；和同种型对照抗体捕获在BiacoreCM4传感器芯片上，其是通过与单克隆小鼠抗人Fc抗体(GE，目录#BR-1008-39)进行胺偶联来首先衍生化的。所有的Biacore结合研究均在HBS-T流动缓冲液(0.01MHEPESpH7.4、0.5MNaCl、3mMEDTA、0.5mg/ml牛血清白蛋白、0.05％v/v表面活性剂P20)中进行。人TGF-β家族成员配体购自R&Dsystems(激活蛋白A，#338-AC；激活蛋白B，#659-AB；激活蛋白AB，#1066-AB；激活蛋白AC，#4879-AC；BPM2，#355-BM；hBMP4，#314-BP；hBMP6，#507-BP；hBMP7，#354-BP；hBMP9，#3209-BP；hBMP10，#2926-BP；hGDF8，#788-G8；hGDF11，#1958-GD)。所有的结合测量均在37℃下进行。对每种抗体或可溶性受体获得60至200个共振单元(resonanceunit，RU)的捕获水平。在捕获的抗体表面之上注射浓度为3.1nM至200nM的TGF-β家族配体。200nM分析物注射的结合值示于表11中。

表11：抗激活蛋白A单克隆抗体与人TGF-β家族配体在37℃下的结合

可将观察到之所捕获激活蛋白A抗体与注射的200nMTGF-β家族配体的结合响应与提供背景水平非特异性结合的量度之阴性对照抗体(同种型对照mAb)的结合响应和ActR2B-hFc的结合响应进行比较，观察到所述ActR2B-hFc与整个受试TGF-β家族成员组结合并且因此用作阳性对照配体结合蛋白(表11)。从该比较发现，几种抗体(例如，H4H10430、H4H10442、H4H20446)与激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白AC结合，但不与激活蛋白B或者BMP或GDF配体明显结合。还发现，一些抗体以更宽的交叉反应性与另外的TGF-β家族配体结合。例如，H4H10429P与激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白AC明显结合，并且也与BMP9和BMP10明显结合。H4H10436P2表现出与激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、激活蛋白AC、BMP2、BMP4、BMP7、BMP9和BMP10明显结合。由这些数据表明，在用激活蛋白A配体免疫小鼠之后可获得对TGF-β家族配体具有不同结合特异性的抗体。

实施例5.抗激活蛋白A抗体的交叉竞争分析

进行交叉竞争测定以评估9种抗体(H4H10446P2、H4H10468P2、H4H10442P2、H4H10423P、H4H10430P、H4H10429P、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2)的组彼此竞争与人激活蛋白A结合的能力。所述测定中还包括两种同种型对照抗体和两种对照激活蛋白A抗体：对照1(具有US8,309,082中所示之“A1”的重链和轻链可变结构域序列的人抗激活蛋白A抗体)和对照3(MAB3381、可从R&DSystems，Inc.，Minneapolis，MN获得)。所有的测定均根据制造商的说明(ForteBioCorp.，MenloPark，CA)在OctetHBST缓冲液(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.05％v/v表面活性剂P20、0.1mg/mLBSA)中以1000rpm的微量滴定板摇动速率于25℃下进行。简言之，如下将提供约1.8nm结合响应的量的抗激活蛋白A抗体捕获在经抗人Fc抗体包被的Octet传感器尖端(Fortebio，#18-0015)上：将尖端浸入每种抗激活蛋白A抗体的10μg/mL溶液中，持续5分钟。通过将尖端在不相关抗体的50ug/mL溶液中孵育5分钟来阻断尖端上剩余的任何抗hFc结合位点。然后，将传感器尖端浸没在含有50nM激活蛋白A(R&DSystems，#338-AC/CF)之溶液的孔中，所述激活蛋白A已与1μM的第二抗激活蛋白A抗体预先结合。在1000rpm下监测第二激活蛋白A抗体/激活蛋白A溶液与经激活蛋白A抗体包被的传感器尖端的结合，持续5分钟。比较mAb/激活蛋白A复合物与经抗激活蛋白A包被的传感器尖端结合的响应，并确定不同抗激活蛋白A单克隆抗体的竞争/非竞争表现。结果示于图1中。

在图1中，竞争性结合响应以黑色或浅灰色阴影示出并且表示对应的抗体对彼此竞争与激活蛋白A结合。具有黑色字体的浅灰色框表示相同抗体之间具有自我竞争的结合响应。具有白色字体的黑色框表示与结合顺序无关在两个方向上均竞争与激活蛋白A结合的抗体。具有黑色字体的深灰色框表示同种型对照(即，非结合)抗体的读数，表示缺少同种型对照抗体与抗激活蛋白A抗体-激活蛋白A复合物的结合(当同种型对照抗体结合至Octet传感器尖端时)，或者缺少同种型对照抗体与激活蛋白A的结合(当在具有激活蛋白A的孔中使用同种型对照抗体作为二抗时)。具有黑色字体的白色框表示抗体之间没有竞争，这表明在激活蛋白A上具有不同结合表位的抗体。

四种抗体H4H10446P2、H4H10468P2、H4H10442P2和H4H10423P彼此双向地竞争与激活蛋白A结合。另外，这四种抗体不与对照1或对照3竞争结合。这四种激活蛋白A抗体中的三种H4H10446P2、H4H10468P2和H4H10442P2不与任何其他激活蛋白A抗体交叉竞争。这四种抗体中的一种(H4H10423P)也与H4H10430P双向地竞争结合激活蛋白A。五种抗体H4H10430P、H4H10429、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2彼此并且与对照1和对照3双向地竞争结合激活蛋白A。这五种抗体中的四种(即，H4H10429、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2)不与任何其他激活蛋白A抗体交叉竞争，而如上文所述，H4H10423P也与H4H10430P交叉竞争。

该实施例的结果表明，本发明的抗激活蛋白A抗体基于表位结合特征可分组为两个不同的“bin”：Bin1包括H4H10423P、H4H10446P2、H4H10468P2和H4H10442P2。Bin2包括H4H10429、H4H1430P、H4H10432P2、H4H10436P2和H4H10440P2。另外，每个bin中的一种抗体(即，H4H10423P和H4H1430P)彼此交叉竞争。该实施例的结果表明，与Bin2的抗体相比，Bin1的抗体结合激活蛋白A上的不同区域。

实施例6.用抗激活蛋白A抗体抑制激活蛋白A介导的受体激活和SMAD复合物信号传导

为了进一步表征本发明的抗激活蛋白A抗体，开发了检测激活蛋白IIA和IIB型受体(分别为ActRIIA和ActRIIB)之激活以及后续激活蛋白I型受体之磷酸化和激活的生物测定。ActRIIA和ActRIIB与激活蛋白之间的相互作用导致诱导多种细胞过程，包括生长调控、癌细胞转移和胚胎干细胞分化(Tsuchida，K.等，CellCommunSignal7：15(2009))。I型受体的磷酸化和激活导致SMAD2和3蛋白的磷酸化，其形成导致基因转录调控的激活的SMAD复合物。

为了检测通过激活蛋白与激活蛋白II型受体的结合激活SMAD复合物信号转导途径，用Smad2/3-萤光素酶报道质粒(CAGAx12-Luc；Dennler，1998)转染人A204横纹肌肉瘤细胞系(ATCC，#HTB-82)以产生A204/CAGAx12-Luc细胞系。将A204/CAGAx12-Luc细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素/谷氨酰胺和250μg/mLG418的McCoy5A(IrvineScientific，#9090)中。对于生物测定，将A204/CAGAx12-Luc细胞以10,000细胞/孔接种到96孔测定板上的低血清培养基、0.5％FBS和OPTIMEM(Invitrogen，#31985-070)中，并在37℃和5％CO₂下孵育过夜。为了确定配体剂量响应，以不合激活蛋白的对照一起开始，将激活蛋白A(R&DSystems，#338-AC)、激活蛋白B(R&DSystems，#659-AB)、激活蛋白AB(R&DSystems，#1066-AB)和激活蛋白AC(R&DSystems，#4879-AC/CF)以1∶3从100nM连续稀释至0.002nM，并添加至细胞。观察到激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB和激活蛋白AC分别以99pM、47pM、19pM和4.4nM的EC₅₀值激活A204/CAGAx12-Luc细胞系。为了测量抑制，将抗体以1∶3从100nM开始连续稀释至0.002nM，从1000nM开始连续稀释至0.02nM，或者从300nM开始连续稀释至0.005nM(包括含有合适同种型对照抗体或不含抗体的对照样品)，并以以下恒定浓度添加至细胞：100pM激活蛋白A、50pM激活蛋白B、30pM激活蛋白AB或4nM激活蛋白AC。该测定中还使用对照4(ActRIIB-hFc；SEQIDNo：227)作为阳性阻断对照。在于37℃和5％CO₂下孵育5.5小时之后，添加OneGlo底物(Promega，#E6051)，然后使用VictorX(PerkinElmer)仪器检测萤光素酶活性。用Prism5软件(GraphPad)使用非线性回归(4-参数逻辑学)分析结果。

如表12中所示，本发明的抗激活蛋白A抗体以39pM至3.5nM的IC₅₀值阻断100pM激活蛋白A，而对照1以83pM的IC₅₀值进行阻断。测试了本发明抗激活蛋白A抗体的亚组对激活蛋白B、AB和AC的阻断。9种受试抗体中的四种以130pM至100nM的IC₅₀值阻断50pM激活蛋白B。测试本发明的五种抗体对激活蛋白B阻断，其仅在高抗体浓度下进行阻断，而对照1未表现出任何可测量的激活蛋白B阻断。受试的本发明八种抗体以100pM至8.2nM的IC₅₀值阻断30pM激活蛋白AB，而对照4以540pM的IC₅₀值进行阻断。一种抗体H4H10423P仅证明对激活蛋白AB具有弱的阻断。8种受试抗体中的七种以580pM至6.5nM的IC₅₀值阻断4nM激活蛋白AC，而对照4以1.1nM的IC₅₀值进行阻断。一种抗体H4H10423P证明对激活蛋白AC无任何阻断。小鼠IgG(mIgG同种型对照)和人IgG(hIgG同种型对照)阴性对照两者均未阻断受体的配体激活。

表12：抗激活蛋白A抗体对激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB和激活蛋白AC的抑制(IC₅₀[M])

还可通过GDF8(R&DSystems，目录#788-G8/CF)和GDF11(R&DSystems，目录#1958-GD-010/CF)来刺激使用A204/CAGAx12-Luc细胞的生物测定。为了测试这些配体与激活蛋白A抗体的功能性抑制，使用上述条件但将激活配体替换成GDF8或GDF11来进行测定，其分别导致188pM和84pM的EC₅₀值。在该测定中，对照4分别以298pM和214pM的IC₅₀值完全阻断通过恒定浓度的0.50nMGDF8或0.40nMGDF11的激活。使用这些相同的恒定浓度配体，当在高至100nM抗体下进行测试时，通过激活蛋白A抗体H4H10446P2和H4H10430P未观察到GDF8或GDF11的抑制。隔天，在恒定浓度的250pMGDF8或250pMGDF11存在下，在该测定中测试激活蛋白A抗体H4H10429P和H4H10436P2的抑制，并且在将细胞与高至150nM的受试激活蛋白A抗体孵育之后未观察到抑制；GDF8和GDF11单独在该测定中分别表现出124pM和166pM的EC50值。这些数据证明，激活蛋白A抗体H4H10446P2、H4H10430P、H4H10429P和H4H10436P2对GDF8或GDF11无功能性抑制。

实施例7.使用激活蛋白A抗体刺激骨骼肌肥大(SkeletalMuscleHypertrophy)

在CB17SCID小鼠中评价通过施用肌肉生长抑制素特异性拮抗剂，抗GDF8抗体H4H1657N2(参见US2011-0293630A1)，或H4H1657N2与不同抗激活蛋白A抗体的组合来诱导的骨骼肌肥大。相对于使用同种型匹配的对照抗体的处理来测量肥大程度。这些研究中还包括使用用C端人IgG1Fc结构域产生的人ActRIIB的细胞外结构域(对照4，SEQIDNo：227)进行处理。先前已表明，对照4在体内诱导肌肉肥大，还与多种TGF-β家族成员配体结合并阻断其活性(Souza，TA等MolEndocrinol22：2689-702(2008)；Lee，SJ等ProcNatlAcadSciU.S.A.102(50)：18117-22(2005))。

与同种型对照、对照4、单独H4H1657N2或对照2(具有US2010/0272734A1中所述的抗体MOR08159的VH/VL的抗激活蛋白RIIB抗体)处理组相比，在八个研究中与H4H1657N2组合或者单独地测试本发明的总共八种抗激活蛋白A抗体和对照1。在所述研究中，将约10周龄的雄性CB17SCID小鼠(Taconic，#CB17SC-M)根据体重平均分成6组，每组5只小鼠。如表13中所述在每个研究中处理小鼠组。

表13：在体内肌肉肥大研究中测试的抗体和对照

对于研究1至5、7和8，如下施用抗体和对照4：在实验的第一周内以每种蛋白质10mg/kg的剂量皮下施用两次(第0和3天)，并且在第二周内以每种蛋白质10mg/kg的剂量皮下施用一次(第7天)。在第三周内皮下施用最后剂量的抗体或对照4(第14天)，对研究#1和#2而言，为8mg/kg；或者对研究#3至#8而言，为10mg/kg(表13)。在第21天，对小鼠实施安乐死并测量每只小鼠的总体重。对于研究6，根据前述研究1至5施用抗体但处理延长至第28天，其中在第21天进行另外的注射。切除每只小鼠的胫骨前肌(TA)和腓肠肌(GA)肌肉并称重。将组织重量以起始体重归一化，并计算相对于同种型对照抗体处理组之平均重量的重量平均百分比变化。总结于表14至21中的结果表示为相对于同种型对照的平均百分比增加±平均值标准误差。

表14：研究1，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表14中所示，在第一研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，对照4在经检查的所有肌肉中均诱导显著的肥大，其中TA重量增加45.80±1.47％并且GA重量增加31.91±1.4％。单独H4H1657N2的处理也诱导TA(19.54±2.67％增加)和GA(26.46±3.63％增加)肌肉重量的肥大，但有效性低于对照4。与经对照4处理的小鼠相比，H4H1657N2+H4H10442P2的组合诱导平均TA(40.76±2.59％)和GA(30.62±2.32％)肌肉重量发生类似的增加。与H4H16757N2/H4H10442P或对照4处理所诱导的增加相比，H4H1657N2/H4H10423P和H4H1657N2/H4H10432P2的组合处理并未诱导平均TA重量发生那么大的增加。

表15：研究2，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表15中所示，在第二研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，对照4在受检查的所有肌肉中均诱导肥大，其中平均TA重量增加43.47±2.37％并且GA平均肌肉重量增加29.24±2.22％。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独H4H1657N2的处理也诱导TA和GA平均肌肉重量增加(分别为16.7±2.73％和18.54±3.48％)，但这些平均增加低于从对照4处理组所观察到的那些。H4H1657N2/H4H10429P和H4H1657N2/H4H10436P2的组合处理均诱导平均TA(分别为34.14±2.55％和29.31±1.59％)和平均GA(分别为26.24±3.11％和26.55±2.41％)增加，所述增加介于从单独的H4H1657N2或对照4所观察到的增加之间。与本研究中其他两个组合或者对照4处理所诱导的增加相比，组合H4H1657N2/H4H10440P2并未诱导TA和GA平均重量发生那么大的增加。

表16：研究3，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表16中所示，在第三研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，对照4在受检查的所有肌肉中均诱导肥大，其中平均TA肌肉重量增加39.90±3.58％并且平均GA肌肉重量增加34.01±2.87％。与经同种型对照处理的小鼠相比，单独H4H1657N2的处理也诱导TA(14.19±3.19％)和GA平均肌肉重量(15.73±0.58％)增加，但这些平均增加低于从对照4处理组所观察到的那些。H4H1657N2/H4H10446P2的组合处理诱导TA(40.01±3.67％)和GA(31.29±2.60％)平均肌肉重量发生与经对照4处理小鼠类似的增加。用H4H1657N2/H4H10430P的组合处理诱导TA(28.30±3.27％)和GA(21.55±2.30％)平均肌肉重量的增加，所述增加介于从单独H4H1657N2和H4H1657N2/H4H10446P2组合处理所观察到的增加之间。

表17：研究4，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表17中所示，在第四研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，H4H1657N2在受检查的肌肉中诱导肥大，其中平均TA肌肉重量增加21.05±2.64％并且平均GA肌肉重量增加22.85±2.28％。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独H4H10430P的处理使肌肉重量略有增加，但值不具有统计学显著性。H4H1657N2和H4H10430P(分别为10mg/kg和2mg/kg)的组合处理诱导TA(39.02±3.55％)和GA(27.57±1.26％)平均肌肉重量的增加，与单独的H4H1657N2或H4H10430P所观察到的增加相比，所述增加在TA肌肉中更大。H4H1657N2和H4H10430P(分别为10mg/kg和10mg/kg)的组合处理诱导TA(40.20±2.48％)和GA(22.46±5.03％)平均肌肉重量的增加，与单独的H4H1657N2或H4H10430P所观察到的增加相比，所述增加在TA肌肉中更大。H4H1657N2和H4H10430P(分别为10mg/kg和25mg/kg)的组合处理诱导TA(44.92±5.70％)和GA(30.22±2.97％)平均肌肉重量的增加，与单独的H4H1657N2或H4H10430P所观察到的增加相比，所述增加在TA肌肉中更大。

表18：研究5，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表18中所示，在第五研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，H4H1657N2在受检查的肌肉中诱导肥大，其中平均TA肌肉重量增加25.4±1.35％并且平均GA肌肉重量增加22.82±1.97％。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独H4H10446P2的处理诱导低水平的肌肉肥大，其中平均TA肌肉重量增加3.70±1.67％并且平均GA肌肉重量增加2.70±1.06％。与单独的H4H1657N2或H4H10446P2所观察到的增加相比，H4H1657N2和H4H10446P2(分别为10mg/kg和2mg/kg)的组合处理诱导TA(51.29±4.20％)和GA(39.24±3.08％)平均肌肉重量发生更大的增加。与单独的H4H1657N2或H4H10446P2所观察到的增加相比，H4H1657N2和H4H10446P2(各自为10mg/kg剂量)的组合处理诱导TA(49.64±4.08％)和GA(35.56±3.39％)平均肌肉重量发生更大的增加。与单独的H4H1657N2或H4H10446P2所观察到的增加相比，H4H1657N2和H4H10446P2(分别为10mg/kg和25mg/kg)的组合处理诱导TA(49.79±5.46％)和GA(35.14±3.49％)平均肌肉重量发生更大的增加。

表19：研究6，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表19中所示，在第六研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，对照4在受检查的所有肌肉中均诱导肥大，其中平均TA重量增加47.34±2.63％并且GA平均肌肉重量增加32.17±3.81％。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独H4H1657N2的处理也诱导TA和GA平均肌肉重量分别增加17.21±2.97％和21.57±1.90％，但这些平均增加低于对照4处理组所观察到的那些。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独对照1的处理诱导低水平的肌肉肥大，其中平均TA肌肉重量增加4.54±2.25％并且平均GA肌肉重量增加2.72+1.30％。与单独的H4H1657N2或对照1所观察到的增加相比，H4H1657N2和对照1(分别为10mg/kg和10mg/kg)的组合处理诱导TA(30.06±5.51％)和GA(30.72±3.64％)平均肌肉重量发生更大的增加。

表20：研究7，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表20中所示，在第七研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，对照4在受检查的所有肌肉中均诱导肥大，其中平均TA重量增加34.43±5.92％并且GA平均肌肉重量增加14.86±3.65％。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独对照2的处理也在受检查的肌肉中诱导肥大，其中平均TA重量增加36.75±3.88％并且GA平均肌肉重量增加26.41±3.16％。H4H1657N2和H4H10430P(分别为10mg/kg和10mg/kg)的组合处理诱导TA(33.13±2.02％)和GA(22.82±1.34％)平均肌肉重量的增加，所述增加介于单独ActRIIB-Fc和单独对照2所观察到的增加之间。H4H1657N2和H4H10446P2(分别为10mg/kg和10mg/kg)的组合处理诱导TA(41.28±2.76％)和GA(29.21±2.62％)平均肌肉重量的增加。

表21：研究8，相比于同种型对照处理的体重和肌肉重量百分比变化

如表21中所示，在第八研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，对照4在受检查的所有肌肉中均诱导肥大，其中平均TA重量增加53.74±5.31％并且GA平均肌肉重量增加39.39±4.56％。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独H4H1657N2的处理也诱导TA和GA平均肌肉重量分别增加18.44±2.30％和21.17±1.72％，但是这些平均增加低于对照4处理组所观察到的那些。在该研究中，与经同种型对照处理的小鼠相比，单独对照2的处理在受检查的肌肉中诱导肥大，其中平均TA重量增加39.90±1.69％并且GA平均肌肉重量增加25.87±2.72％。与经同种型对照处理的小鼠相比，H4H1657N2和H4H10423P(分别为10mg/kg和25mg/kg)的组合处理诱导TA(36.33±3.67％)和GA(28.18±3.11％)平均肌肉重量的增加。H4H1657N2和H4H10430P(分别为10mg/kg和25mg/kg)的组合处理诱导TA(43.83±1.56％)和GA(31.24±1.90％)平均肌肉重量的增加，所述增加介于单独对照4和单独对照2所观察到的增加之间。

这些研究表明，在受试剂量和注射频率下，与用单独的肌肉生长抑制素抑制剂进行处理相比，将抗激活蛋白A抗体与肌肉生长抑制素抑制剂一起施用可以以显著更大的程度进一步增加骨骼肌肥大。

实施例8.使用激活蛋白A抗体阻断激活蛋白A结合

使用Biacore3000仪器确定所选的抗激活蛋白A抗体阻断激活蛋白A与其受体ActRIIB和ActRIIA以及其内源拮抗剂卵泡抑素(Follistatin)之相互作用的能力。对于该实验，将对照4(表达有C端人Fc标签的人ActRIIB(SEQID：227))、表达有C端人Fc标签的人ActRIIA(hActRIIA-Fc；R&DSystems，#340-R2-100)或卵泡抑素-288(R&DSystems，#5836-FS-025)胺偶联至BiacoreCM5传感器表面。将单独或者以60nM终浓度(相对于激活蛋白A，12倍摩尔过量)的激活蛋白A抗体、hActRIIA-Fc、hActRIIB-Fc或同种型对照抗体混合之5nM固定浓度的激活蛋白A(R&DSystems，#338-AC)在室温下孵育1小时。然后，将抗体-激活蛋白A混合物以20uL/分钟的流量注射在经胺偶联的对照4、hActRIIA-Fc或卵泡抑素-288表面之上。在开始注射后150秒时测量结合信号(RU)，并将该信号减去阴性对照参照表面的测量RU值以确定确切的结合信号。在每种抗激活蛋白A抗体存在下，将受体或拮抗剂表面之上游离激活蛋白A结合的百分比计算为所观察的确切结合信号除以抗体存在下来自5nM激活蛋白A的确切结合信号的比。

表22：抗激活蛋白A抗体对激活蛋白A与卵泡抑素结合的阻断

如表22中所示，受试的7种本发明抗激活蛋白A抗体中的6种以及对照1和对照3两者都阻断激活蛋白A与卵泡抑素-288的结合。本发明的一种抗体H4H10423P不阻止激活蛋白A与卵泡抑素-288的结合。对照4和hActRIIA-Fc在更高浓度下阻断激活蛋白A与卵泡抑素-288的结合。表23：抗激活蛋白A抗体对激活蛋白A与hActRIIA-Fc结合的阻断

如表23中所示，受试的7种本发明抗激活蛋白A抗体中的4种以及对照1和对照3两者都阻断hActRIIA-Fc与激活蛋白A的结合。本发明的三种抗体H4H10442P2、H4H10446P2和H4H10423P不阻止激活蛋白A与hActRIIA-Fc结合。对照4和hActRIIA-Fc阻断激活蛋白A与hActRIIA-Fc的结合。

表24：抗激活蛋白A抗体对激活蛋白A与hActRIIB-Fc结合的阻断

如表24中所示，受试的7种本发明抗激活蛋白A抗体中的4种以及对照1和对照3两者都阻断激活蛋白A与hActRIIB-Fc的结合。本发明的两种抗体H4H10442P2和H4H10446P2不阻止激活蛋白A与hActRIIB-Fc的结合。本发明的一种抗体H4H10423P证明在更高的受试抗体浓度下能够部分地阻断激活蛋白A与hActRIIB-Fc的结合。hActRIIB-Fc和hActRIIA-Fc两者均阻断激活蛋白A与hActRIIB-Fc的结合。

实施例9.H4H1657N2对肌肉的量和运动表现的作用

在老龄雄性C57BL/6小鼠(19个月大)中评价抗GDF8抗体H4H1657N2对肌肉的量和运动表现的作用。

将小鼠随机分成四组(n＝6-8/组)，使静坐(sedentary)组或运动(exercise)组接受皮下剂量的H4H1657N2或同种型对照抗体(10mg/kg)，每周两次，持续21天(6次注射)。将运动组的小鼠置于运动方案中，所述运动方案涉及每天一个训练期(trainingsession)，每周五天，持续3个连续周，所述训练期由在具有5°斜度、10m/分钟之Exer6M踏车(ColumbusInstruments，Columbus，OH)上20分钟组成。在三周的处理结束时，使用踏车疲劳测试(treadmillexhaustiontest)在所有四个组中测量耐力。用双向ANOVA之后进行TukeyHSD检测来分析数据。以经归一化的重量报道肌肉重量(即，将肌肉重量以在实验开始时测量的体重进行归一化)。四头肌的结果作为每个组相比于同种型对照抗体组的平均变化％(±平均值的标准误差)提供于表25中。

表25：四头肌的重量变化

与同种型对照的变化％。示出了平均值±SEM。

如表25中所示，H4H1657N2处理导致四头肌的量显著增加(两个H4H1657N2组相对于同种型对照组的显著性p＜0.01)。与同种型对照抗体相比，在运动(分别为17.4％、12.5％)和静坐(分别为14.1％、11.6％)的老龄小鼠中观察到后肢肌肉组体重(TA、GA)的增加。在接受同种型对照抗体的运动和静坐老龄小鼠之间观察到肌肉重量略有增加，但该增加不具有统计学显著性(表25)。

还在19个月大的雄性C57BL/6小鼠中检查了H4H1657N2处理对运动耐力的作用(表26)。

表26：耐力测试

在运动的老龄小鼠中，相比于同种型对照抗体，如通过踏车跑动时间(50.2分钟相对于73.2分钟)和距离(0.93km相对于1.33km)所测量的，H4H1657N2也诱导耐力显著提高(表26)。然而，在静坐小鼠中，相比于同种型对照抗体，H4H1657N2并未显著提高耐力。

如在肌肉重量研究中，通过踏车跑动时间和距离所测量的，H4H1657N2仅在运动小鼠中诱导耐力显著提高，而在静坐小鼠中则不然。这些结果表明，H4H1657N2在与运动训练结合时提高身体表现结果。

实施例10.H4H1657N2对小鼠的骨骼肌的量和等长力(isometricforce)的作用

在9周大的雄性C57BL/6小鼠中体内评估H4H1657N2诱导骨骼肌肥大的能力。

以10或30mg/kg每周两次地施用重复皮下剂量的H4H1657N2或同种型对照抗体，持续3周(n＝6)。与接受以相等剂量施用之同种型对照的小鼠相比，21天的H4H1657N2处理分别产生了体重4.7±2.3％(n.s.)和7.1±1.5％(n.s.)的增加。相比于同种型对照，单个肌肉重量的增加如下(10mg/kg和30mg/kg)：胫骨前肌(19.4±4.9％＊＊和20.6±1.5％＊＊)、腓肠肌(14.9±2.9％＊＊和25.3±1.9％＊＊＊)和四头肌(17.7±3.6％＊和26.2±3.8％＊＊)。(通过单向ANOVA与Tukey事后检验进行所有的统计学分析[＊p＜.05；＊＊p＜.01；＊＊＊p＜.001；n.s.＝无统计学差异])

胫骨前肌(TA)肌肉的量的增加伴随着离体等长力的提高，表明能够同时维持肌肉功能和量。将先前经重复皮下剂量的H4H1657N2或同种型对照抗体处理(以10mg/kg每周施用两次，持续3周，每组n＝6)的小鼠单独麻醉，并维持在异氟烷气体下，同时将TA肌肉切除并置于恒定维持在25℃的经氧化的乳酸林格浴中。将TA的上端牢固地系至所述浴中的经浸没柱子，同时将远端腱系至305C杠杆臂(CambridgeSystems)。如下确定最佳长度：轻微地拉伸TA并随后测试在最小电压下由1Hz刺激产生的力。重复拉伸TA肌肉并进行刺激直至力减小，然后放松至先前的位置。然后，以一系列1HZ刺激递增地提高电压以达到最大力输出。一旦已确定最佳长度和电压，则在递增频率(40至100Hz)下对TA肌肉刺激400毫秒以确定最大强直性张力。在各个强直刺激之间给予TA肌肉2分钟的休息时段。

来自经同种型对照抗体以10mg/kg和30mg/kg剂量处理21天的小鼠的TA肌肉分别产生892.6±37和906.1±37.8的平均峰强直性张力。来自经H4H1657N2处理的小鼠的TA肌肉分别产生1041.3±31.7和1003.3±35.7mN的平均峰强直性张力。这些张力值表示相比于同种型对照，平均峰强直性张力提高16.7％＊(10mg/kg)和10.7％n.s(30mg/kg)(图2A)。在10mg/kg和30mg/kg两个剂量下，H4H1657N2处理对峰强直性张力的整体药物作用均与同种型对照有显著差异(10mg/kg剂量示于图2B中)。(图2A：通过单向ANOVA与Tukey事后检验进行统计学分析[＊p＜.05；n.s.＝无统计学差异]。图2B：通过双向ANOVA与Sidak事后检验进行统计学分析[p＞0.0001])

实施例11.H4H1657N2改善从后肢悬吊(HindLimbSuspension，HLS)诱导之萎缩的恢复

在1岁大的C57BL/6雄性小鼠中评估在从7天后肢悬吊(HLS)的恢复阶段期间H4H1657N2对骨骼肌的量的作用。

在第0天，将18只小鼠通过尾部悬吊以使得两条后腿均不能接触地面，持续7天。将小鼠圈养在自由获取食物和水的专用笼中。同时，将另外一组的6只小鼠置于普通笼中并充当对照(非HLS对照)。在第7天时，将悬吊的小鼠取下并根据在HLS期间损失的体重的百分比随机分成三组(每组n＝6)。在第7天时，取得来自非HLS对照组和一个HLS组(HLS组)的肌肉重量以评估响应于HLS的萎缩的百分比。使剩余的两个HLS组(每组n＝6)在普通笼中恢复8天(即，从实验的第7天至第15天)，并在第7和10天(即，在0天和3天的恢复之后)用10mg/kg剂量的H4H1657N2或同种型对照皮下处理(分别为HLS+7Rec+H4H1657N2和HLS+7rec+同种型对照)。在第15天(即，在8天的恢复之后)，取得肌肉的量以评估在HLS诱导的萎缩之后恢复的百分比。

如图3B中所示，与非HLS对照组相比，7天的HLS导致胫骨前肌(TA)和腓肠肌(GA)两者(HLS组)的量均显著损失(分别为-13.7％＊和-14.8％＊)。在8天的恢复之后，与非HLS对照组相比，HLS+7rec+同种型对照组保持TA和GA肌肉量的损失(-6.3％和-7.5％)，而HLS+7Rec+H4H1657N2组相比于非HLS组表现出量增加(4.7％和5％)。

当将两个恢复组(即，HLS+7Rec+H4H1657N2相对于HLS+7rec+同种型对照)进行比较时，H4H1657N2对TA和GA的量的作用与用同种型对照抗体所观察到的作用没有显著差异。然而，尽管HLS+7rec+同种型对照组的肌肉的量与HLS组或非HLS组对照没有限制差异，但是相比于HLS组，HLS+7Rec+H4H1657N2组具有统计学上更大的TA和GA的量。(通过单向ANOVA与Tukey事后检验进行所有的统计学分析[＊p＜0.05相对于无HLS；；##p＜0.01相对于HLS)

实施例12.抗激活蛋白A抗体和ActRIIB-Fc对BMPI和II型受体激活的抑制

骨形态发生蛋白(BMP)属于TGF-β超家族并且通过激活细胞表面上由BMPI和II型受体构成的受体复合物来参与调控很多生理学过程。受体的激活导致SMAD蛋白的磷酸化和配体响应性基因的转录激活。

开发了在W-20-17细胞中检测BMP信号传导调控的生物测定，所述细胞是先前表明对BMP2具有响应性的小鼠骨髓基质细胞系。将细胞进行改造以稳定地表达萤光素酶报道基因(即，BMP-响应性元件(BRE(2X)-萤光素酶-IRES-GFP))，并根据GFP的高表达进行分选。将得到的稳定细胞系称为W-20-17/BRE-luc并维持在10％FBS、DMEM、青霉素/链霉素和200μg/mlG418中。将这些细胞用于测量BMP激活以及抗激活蛋白A抗体和ActRIIB-hFc(对照4，SEQIDNo：227)对此激活的抑制。

使用W-20-17/BRE-luc细胞系评价四种抗激活蛋白A抗体和ActRIIB-hFc抑制BMP信号传导的能力。对于该生物测定，将W-20-17/BRE-luc细胞以10,000个细胞/孔接种到96孔测定板上，并在37℃和5％CO₂下孵育过夜。次日，将BMP2、BMP4、BMP6、BMP9或BMP10以1∶3从100nM连续稀释至0.002nM并添加至细胞(对于剂量响应，包括无BMP对照)。对于抗激活蛋白A抗体或ActRIIB-hFc对BMP的抑制，将抗体或ActRIIB-hFc以1∶3从1000nM连续稀释至0.02nM(对于ActRIIB-hFc(即，标记有hFc的不相关蛋白，“对照蛋白”)，包括无抗体、对照抗体或阴性对照)，并与指定的100pMBMP2、100pMBMP4、10nMBMP6、800pMBMP9或4nMBMP10一起添加至细胞。用VictorX(PerkinElmer)在37℃和5％CO₂下孵育5.5小时之后检测萤光素酶活性，并用Prism5软件(GraphPad)使用非线性回归(4-参数逻辑回归)分析结果。

如下表27中所示，H4H10446P2和H4H10430P不抑制任何受试BMP，而其他受试激活蛋白A抗体(H4H10429和H4H10436P2)和ActRIIB-hFc均对一些BMP表现出一定程度的抑制。H4H10429P表现出分别以8.1nM和3.5nM的IC₅₀值抑制BMP9和BMP10，但不抑制BMP2、BMP4和BMP6。H4H10436P2在最高抗体浓度下对BMP2和BMP4表现出弱抑制，并且以＞100nM的IC₅₀值抑制BMP10，但是对BMP6和BMP9未表现出任何抑制。ActRIIB-hFc表现出以2nM和1nM的ICC₅₀值抑制BMP9和BMP10，但不抑制BMP2、BMP4和BMP6。观察到，对照分子(即，同种型对照抗体(对照mAb)和标记有hFc的不相关蛋白(对照蛋白))均不抑制任何BMP，而单独的BMP2、BMP4、BMP6、BMP9或BMP10(即，无抗体或hFc标记蛋白)分别以34pM、63pM、4.5nM、260pM和2.5nM的EC₅₀值激活W-20-17/BRE-luc细胞。

表27.在W-20-17/BRE-luc细胞中抗激活蛋白A抗体和ActRIIb-hFc对BMP的抑制

实施例13.用抗激活蛋白A抗体H4H10446P2的处理降低了体内肾纤维化

在肾纤维化的单侧输尿管梗阻(unilateralureteralobstruction，UUO)小鼠模型中确定本发明的特定抗激活蛋白A抗体H4H10446P2对肾纤维化的作用。如下开发UUO模型：使左侧输尿管完全结扎，同时使右侧肾功能保持完整。简言之，在处于***/甲苯噻嗪麻醉之下的小鼠中进行UUO，由此通过侧腹切口接近左侧输尿管，并使用5-0丝线以5mm间距将两根结扎线置于输尿管的近端1/3。以类似方式进行假手术(shamsurgery)，但不在输尿管上放置任何结扎线。在该模型中，在UUO之后于14天内在肾中发生严重纤维化，已经如下对其评估：通过在样品中直接测量羟脯氨酸的量来测量肾胶原蛋白(这称为羟脯氨酸方法)。羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特定组分并且代表大多数哺乳动物组织中胶原蛋白的约14.4％的氨基酸组成(Cochrane等，JAmSocNephrol16：3623-30(2005))。为了通过羟脯氨酸方法测量胶原蛋白含量，首先使用真空室将经冷冻的肾样品干燥过夜。然后，将经干燥的肾组织样品在冰冷的NaCl/NaHCO₃溶液中均质化并随后使用6MHCl进行水解。随后，使用真空离心机干燥样品，然后使用0.1MHCl进行再水合。用300mM氯胺T(Sigma，#857319)氧化再水合样品中的羟脯氨酸，然后添加埃利希试剂(Ehrlich’sreagent)[在60％高氯酸(Sigma，#311413)中的3.5M对二甲基氨基苯甲醛(FW：149.19，Sigma，#39070)]以显色。最后，使用分光光度计在558um下测量样品的吸光度并将这一吸光度与浓度已知的羟脯氨酸标准物(Sigma，#H5534)进行比较以确定肾羟脯氨酸含量。然后，将测量的羟脯氨酸值乘以因子6.94以确定胶原蛋白值。在UUO后14天，实质损伤的结果是干肾重量降低。对16周大的雄性C57BL/6小鼠(Taconicfarms，Inc.)进行假手术(n＝10)或UUO手术(n＝20)。然后，将经历UUO手术的小鼠分成两组。从手术前一天开始并且在手术后的第1、3、6、8、10和13天，使每个UUO组接受H4H10446P2(40mg/kg，n＝10)或不与任何已知小鼠蛋白结合的同种型对照抗体(40mg/kg，n＝10)的皮下注射。在此期间，使用与UUO组相同的方案使经历假手术的小鼠接受载剂(无菌PBS)。在手术后的第14天，将所有小鼠处死。测量肾重量，将肾用液氮快速冷冻并保持在-80℃直至测量胶原蛋白含量。使用羟脯氨酸方法测量肾胶原蛋白含量，然后将其表示为总肾胶原蛋白(μg)或以肾重量归一化的肾胶原蛋白(μg/mg干重)。使用单向ANOVA与Turkey多重比较检验进行统计学分析。在下表28中，包括总结了每个处理组的总肾胶原蛋白、经归一化的肾胶原蛋白和干肾重量的结果表示为平均值±SEM。

表28.每个处理组的总肾胶原蛋白、经归一化的肾胶原蛋白和干肾重量(平均值±SEM)

如表28中所示，与假手术小鼠相比，在UUO小鼠中总肾胶原蛋白和以肾重量归一化的肾胶原蛋白两者均显著增加。与经同种型对照抗体处理的UUO小鼠相比，经H4H10446P2处理的UUO小鼠在总肾胶原蛋白和以肾重量归一化的肾胶原蛋白两者方面均表现出显著降低(纤维化胶原蛋白降低约45％)，表明抗激活蛋白A抗体导致肾中的纤维化降低。与经同种型对照抗体处理的UUO小鼠相比，经H4H10446P2处理的UUO小鼠在干肾重量方面表现出增加，表明在经抗激活蛋白A抗体处理的小鼠中实质得到保护。

实施例14.在过表达激活蛋白A的小鼠中，H4H10446P2对体重和肌肉量的作用

为了评估H4H10446P2在小鼠中中和激活蛋白A的升高水平的效力，通过经流体动力学递送(hydrodynamicdelivery，HDD)编码全长激活蛋白A的DNA构建体在C57BL/6小鼠(10周大)中过表达激活蛋白A。将小鼠随机分成三组(n＝5-6/组)；一组在同种型对照抗体存在下注射盐水/2.5μgDNA构建体对照的混合物，而两组在同种型对照抗体或H4H10446P2存在下注射盐水/2.5μg含激活蛋白A的DNA构建体的混合物。在第0天注射DNA构建体，并且在第0和4天以2.5mg/kg施用抗体(2次注射)，持续7天。以经归一化的重量报道肌肉重量(即，以在实验开始时测量的体重归一化肌肉重量)。体重结果作为与起始体重的平均变化示出。每组胫骨前肌(TA)和腓肠肌(GA)肌肉的结果作为相比于HDD递送之构建体对照+同种型对照抗体组的平均百分比变化(±平均值的标准误差)示于图4中。使用单向或双向ANOVA之后进行TukeyHSD检验分析数据。

如图4中所示，在HDD后7天，在经同种型对照抗体处理的小鼠中，激活蛋白A的递送导致体重(-10.81±2.46％)以及胫骨肌和腓肠肌的量(分别为-13.96±1.85％和-10.34±1.51％)的显著降低(p＜0.01显著性相对于同种型对照)。在7天的处理结束时，在经H4H10446P2处理的小鼠中，激活蛋白A的递送导致体重(-1.49±1.98％)以及胫骨肌和腓肠肌的量(分别为-2.57±1.26％和-1.77±2.42％)的显著衰减。

本发明的范围不受本文中所述的具体实施方案的限制。实际上，根据前述描述以及附图，除本所描述的之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员而言将变得明显。这样的修改旨在落入所附权利要求书的范围内。

Claims

1.分离的抗体或其抗原结合片段，如在25℃下在表面等离子体共振测定中所测量的，其以小于约5pM的结合解离平衡常数(K_D)特异性地结合激活蛋白A。

2.权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中如在25℃下在表面等离子体共振测定中所测量的，所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于约4pM的K_D特异性地结合激活蛋白A。

3.权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于约500nM的结合缔合平衡常数(K_a)特异性地结合激活蛋白A。

4.权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断至少一种激活蛋白A受体与激活蛋白A的结合。

5.权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断激活蛋白A对至少一种激活蛋白A受体的激活。

6.权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不显著阻断激活蛋白A与激活蛋白II型受体的结合。

7.权利要求4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中如在25℃下在体内受体/配体结合生物测定中所测量的，所述抗体或其抗原结合片段以小于约80pM的IC₅₀值阻断激活蛋白A与激活蛋白A受体结合。

8.权利要求7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中如在25℃下在体内受体/配体结合生物测定中所测量的，所述抗体或其抗原结合片段以小于约60pM的IC₅₀值阻断激活蛋白A与激活蛋白A受体结合。

9.权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制激活蛋白A与选自以下的激活蛋白A受体的结合：激活蛋白IIA型受体(ActRIIA)、激活蛋白IIB型受体(ActRIIB)和激活蛋白I型受体。

10.权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制激活蛋白A介导的对SMAD复合物信号传导的激活。

11.权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体竞争结合激活蛋白A，所述参照抗体包含选自以下的重链可变区(HCVR)/轻链可变区(LCVR)序列对：SEQIDNO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146、170/146、178/146、186/146、194/146和202/210。

12.权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与参照抗体结合激活蛋白A上的相同表位，所述参照抗体包含选自以下的HCVR/LCVR序列对：SEQIDNO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146、170/146、178/146、186/146、194/146和202/210。

13.特异性地结合激活蛋白A的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：(a)HCVR的互补决定区(CDR)，所述HCVR具有选自SEQIDNO：2、18、34、50、66、82、98、106、114、122、130、138、154、162、170、178、186、194和202的氨基酸序列；和(b)LCVR的CDR，所述LCVR具有选自SEQIDNO：10、26、42、58、74、90、146和210的氨基酸序列。

14.权利要求13所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自SEQIDNO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146、170/146、178/146、186/146、194/146和202/210。

15.权利要求14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，所述结构域分别选自：SEQIDNO：4-6-8-12-14-16、20-22-24-28-30-32、36-38-40-44-46-48、52-54-56-60-62-64、68-70-72-76-78-80、84-86-88-92-94-96、100-102-104-92-94-96、108-110-112-92-94-96、116-118-120-92-94-96、124-126-128-92-94-96、132-134-136-92-94-96、140-142-144-148-150-152、156-158-160-148-150-152、164-166-168-148-150-152、172-174-176-148-150-152、180-182-184-148-150-152、188-190-192-148-150-152、196-198-200-148-150-152和204-206-208-212-214-216。

16.特异性地结合激活蛋白A的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：(a)HCVR，其具有选自SEQIDNO：2、18、34、50、66、82、98、106、114、122、130、138、154、162、170、178、186、194和202的氨基酸序列；和(b)LCVR，其具有选自SEQIDNO：10、26、42、58、74、90、146和210的氨基酸序列。

17.权利要求16所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自以下的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQIDNO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/90、106/90、114/90、122/90、130/90、138/146、154/146、162/146、170/146、178/146、186/146、194/146和202/210。

18.药物组合物，其包含权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及可药用载体或稀释剂。

19.用于在对象中提高肌肉的量或强度的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求18所述的药物组合物。

20.药物组合物，其包含权利要求1至17中任一项所述的抗体或抗原结合片段、GDF8拮抗剂、以及可药用载体或稀释剂。

21.权利要求20所述的药物组合物，其中GDF8拮抗剂选自GDF8抑制性融合蛋白、抗GDF8抗体和抗GDF8抗体的抗原结合片段。

22.权利要求19所述的方法，其还包括施用GDF8拮抗剂，其中所述GDF8拮抗剂为抗GDF8抗体或其抗原结合片段。

23.权利要求22所述的方法，其中所述GDF8拮抗剂为包含HCVR的重链互补决定区(HCDR)和LCVR的轻链互补决定区(LCDR)的抗GDF8抗体或其抗原结合片段，所述HCVR包含SEQIDNO：217，所述LCVR包含SEQIDNO：221。

24.权利要求22所述的方法，其中所述GDF8拮抗剂为包含以下的抗GDF8抗体或其抗原结合片段：

a)3个HCDR，所述HCDR包含SEQIDNO：218、SEQIDNO：219和SEQIDNO：220，以及

b)3个LCDR，所述LCDR包含SEQIDNO：222、SEQIDNO：223和SEQIDNO：224。

25.用于在对象中提高肌肉的量或强度的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求20所述的药物组合物。

26.用于在对象中提高肌肉的量或强度的方法，所述方法包括向所述对象施用抗原结合分子，所述抗原结合分子包含激活蛋白A特异性结合结构域和GDF8特异性结合结构域。

27.权利要求26所述的方法，其中所述激活蛋白A特异性结合结构域包含HCVR和LCVR。

28.权利要求26所述的方法，其中所述GDF8特异性结合结构域包含HCVR和LCVR。

29.权利要求27所述的方法，其中所述HCVR包含：

(a)HCVR的CDR，所述HCVR具有选自SEQIDNO：2、18、34、50、66、82、98、106、114、122、130、138、154、162、170、178、186、194和202的氨基酸序列；以及

(b)LCVR的CDR，所述LCVR具有选自SEQIDNO：10、26、42、58、74、90、146和210的氨基酸序列。

30.权利要求28所述的方法，其中所述HCVR包含3个重链互补决定区(HCDR)，所述HCDR包含SEQIDNO：218、SEQIDNO：219和SEQIDNO：220，并且其中所述LCVR包含3个轻链互补决定区(LCDR)，所述LCDR包含SEQIDNO：222、SEQIDNO：223和SEQIDNO：224。

31.权利要求26所述的方法，其中所述激活蛋白A特异性结合结构域包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，并且其中所述GDF8特异性结合结构域包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)。

32.权利要求26所述的方法，其中所述抗原结合分子是双特异性抗体。

33.用于治疗、预防或改善以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白。

34.用于治疗、预防或改善以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用激活蛋白A特异性结合蛋白和GDF8特异性结合蛋白。

35.权利要求34所述的方法，其中所述以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症选自肌肉减少症、恶病质、肌肉损伤、肌肉消耗/萎缩、癌症、肥胖、糖尿病、关节炎、多发性硬化、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、骨质疏松症、骨关节炎、骨质减少和代谢综合征。

36.权利要求35所述的方法，其中所述恶病质为特发性或者是另一病症的继发性恶病质。

37.权利要求36所述的方法，其中所述病症是癌症、慢性肾衰竭或慢性阻塞性肺病。

38.权利要求35所述的方法，其中所述肌肉消耗/萎缩由选自以下的状况引起或者与其相关：废用、固定、卧床休息、损伤、医学治疗、手术介入和机械通气所不可避免的。

39.权利要求38所述的方法，其中所述手术介入选自髋骨折、髋关节置换和膝关节置换。

40.权利要求35所述的方法，其中所述代谢综合征包括选自以下的疾病或病症：糖尿病、肥胖、营养失调、器官萎缩、慢性阻塞性肺病和厌食症。

41.用于治疗、预防或改善以肌肉的量或强度降低为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用抗原结合分子，所述抗原结合分子包含激活蛋白A特异性结合结构域和GDF8特异性结合结构域。

42.用于治疗、预防或改善由激活蛋白A活性引起、促进、恶化或加重的疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用激活蛋白A抗体或其抗原结合片段。

43.权利要求42所述的方法，其中所述疾病或病症是肾纤维化。

44.权利要求42所述的方法，其中所述疾病或病症是恶病质。