CN104203239B - 用于治疗脊髓性肌萎缩的化合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于治疗脊髓性肌萎缩的化合物、其组合物及其用途。

Description

用于治疗脊髓性肌萎缩的化合物
本文描述的技术不是在美国政府支持下做出的。
交叉引用
本申请要求2012年1月26日提交的美国临时申请系列号第61/591,102号的优先权的权益，将其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
关于共同研究协议的声明
所公开的主题是所主张发明的有效申请日或有效申请日之前生效的共同研究协议、由一方或多方或以其名义进行研究且完成所主张的发明；
所主张的发明作为在共同研究协议的范围内所进行的活动的结果完成；和
所主张的发明的申请专利公开了或经修正公开了共同研究协议的各方的名称。
引言
本文提供了用于治疗脊髓性肌萎缩的化合物、其组合物及其用途。
背景技术
脊髓性肌萎缩(SMA)在其最广泛意义上描述了一类遗传性和获得性中枢神经***(CNS)疾病，其特征为脊髓和脑干的进行性运动神经元损失，导致肌无力和肌肉萎缩。SMA的最常见形式是由存活运动神经元(SMN)基因的突变引起，且在影响婴儿至成人的广泛严重性范围内显现(Crawford and Pardo，Neurobiol.Dis.，1996，3：97)。
婴儿的SMA是该神经变性病症的最严重形式。症状包括肌无力、肌张力差、叫喊无力、跛行或有倒下的倾向、吮吸或吞咽困难、分泌物累积在肺部或咽喉、进食困难和对呼吸道感染的敏感性增加。腿倾向于比手臂还无力且不能达到发育标志，例如抬头或坐起。一般而言，这些症状出现的越早，寿命越短。当运动神经元细胞恶化时，之后不久就会出现症状。该疾病的严重形式是致命性的，且所有形式都没有已知的治愈方法。SMA的病程与运动神经元细胞退化的速率及所导致的无力严重程度直接相关。患有严重形式的SMA的婴儿经常因支撑呼吸的肌肉虚弱而死于呼吸***疾病。患有较轻形式的SMA的儿童活得长的多，但他们可能需要广泛的医学支持，特别是处于该范围的较严重末端者。SMA病症的临床范围已经被分成以下五组：
(a)0型SMA(子宫内SMA)是该疾病的最严重形式，且在出生之前就开始。通常，0型SMA的第一个症状是胎儿运动减少，这可在妊娠的30至36周之间首先观察到。在出生之后，这些新生儿几乎不运动，且具有吞服和呼吸困难。
(b)1型SMA(婴儿SMA或韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease))通常在0至6个月之间出现症状。该形式的SMA也非常严重。患者决不能坐，并且在没有通风支持的情况下，一般在头2年之内死亡。
(c)2型SMA(中度SMA)具有的发病年龄为7-18个月。患者能够独立地坐，但是决不能独立地站立或行走。该组的预后主要取决于呼吸参与的程度。
(d)3型SMA(青少年SMA或Kugelberg-Welander疾病)通常在18个月之后诊断出。3型SMA个体能够在该疾病过程期间的一些时间点独立地行走，但是在少年或成年期间经常变成坐轮椅。
(e)4型SMA(成人发病的SMA)。无力通常在青年晚期在舌头、手或脚中开始，然后发展至身体其他区域。成人SMA的病程慢得多且对预期寿命的影响很少或没有。
已经通过对染色体5q中的复杂区域进行连锁分析来对SMN基因定位。在人类中，该区域包含50万个碱基对(kb)反向复制，产生SMN gene的两个几乎相同的副本。SMA是由两个染色体中telomeric基因副本(SMN1)的失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失而引起的。然而，所有患者都保持centromeric基因副本(SMN2)，并且SMA患者中SMN2基因的拷贝数通常与疾病严重性反相关；即，患有较不严重的SMA的患者具有更多SMN2副本。然而，SMN2不能完全地抵消SMN1功能的丧失，因为外显子7中转译沉默的C至T突变引起外显子7的可变剪接。因此，大部分的转录物由缺乏外显子7的SMN2(SMN2Δ7)产生，且编码截短的Smn蛋白质，该蛋白质具有减弱的功能且快速降解。
Smn蛋白质被认为在RNA加工和代谢中起作用，具有介导特性种类的RNA-蛋白质复合物(称为snRNP)组件的充分表征的功能。Smn在运动神经元中可具有其他功能，然而，其在预防运动神经元的选择性退化中的作用并不非常确定。
在大多数情况下，SMA是基于临床症状和SMN1基因中不存在外显子7的所有副本来诊断的，如通过基因检测来确定。然而，在约5％的病例中，SMA是由不同于整个SMN1基因缺失或不同于SMN1基因中全部外显子7的缺失的突变引起的，某些已知的和其他的突变还不确定。在这样的情况下，当SMN1基因试验不可行或SMN1基因序列没有显示任何异常时，可以指定其他试验例如肌电图描记法(EMG)或肌活组织检查。
对于SMA患者的医疗护理目前限于支持疗法，包括呼吸、营养和康复护理；还没有已知解决该疾病的根本原因的药物。目前SMA的治疗是由预防和控制慢性运动单元丧失的继发效应组成。1型SMA的主要控制问题是肺部问题的预防和早期治疗，肺部问题是大部分病例中死亡的主要原因。虽然一些患有SMA的婴儿长成成人，但是患有1型SMA的那些婴儿的预期寿命小于两年。
已经研究了SMA的几个小鼠模型。特别地，SMNΔ7模型(Le等人，Hum.Mol.Genet.，2005，14：845)同时携带SMN2基因和SMN2Δ7cDNA的几个副本，且概括1型SMA的许多表型特征。SMNΔ7模型可用于SMN2表达研究以及评估运动功能和存活。C/C-等位基因小鼠模型(Jackson Laboratory种系No.：008714)提供较不严重的SMA疾病模型，该小鼠具有的SMN2全长(SMN2FL)mRNA和Smn蛋白质水平都降低了。C/C-等位基因小鼠表型具有SMN2基因和进行可变剪接的杂交mSmn1-SMN2基因，但是不具有明显的肌无力。C/C-等位基因小鼠模型用于SMN2表达研究。
由于提高了对SMA的遗传学基础和病理生理学的了解，因此已经研究了一些治疗策略，但是仍然无人证实在临床中取得成功。
使用病毒递送载体进行SMN1的基因置换和使用分化的SMN1+/+干细胞进行细胞置换都在SMA的动物模型中证实了功效。需要更多研究以在这些方法可用于人类之前确定安全性和免疫应答且解决对新生儿阶段开始治疗的需求。
也使用作为治疗剂的合成核苷酸实现培养细胞中SMN2的可变剪接的校正：(i)靶向SMN2前-mRNA中的序列元件且使剪切反应的结果移向产生全长SMN2 mRNA的反义寡核苷酸(Passini等人，Sci.Transl.Med.，2011，3：72ra18；和Hua等人，Nature，2011，478：123)和(ii)提供全功能RNA序列的反剪切RNA分子，该全功能RNA序列在剪切期间替换突变体片段且产生全长SMN1 mRNA(Coady和Lorson，J Neurosci.，2010，30：126)。
其他正在研究的方法包括寻找提高Smn水平、增强残余Smn的功能或补偿Smn损失的药物。氨基糖苷类已显示可通过促进对异常终止密码子的翻译通读来增强由SMN2Δ7mRNA产生的稳定化Smn蛋白质的表达，但是对于中枢神经***渗透性较差且在反复剂量施用之后是有毒性的。化疗剂，例如阿柔比星，已经显示出增加细胞培养物中的Smn蛋白质；然而，这些药物的毒性特性阻止其长期用于SMA患者中。在临床研究下用于治疗SMA的某些药物包括转录转录，例如组蛋白脱乙酰酶(“HDAC”)抑制剂(例如，丁酸酯、丙戊酸和羟基脲)，及mRNA稳定剂(得自Repligen的mRNA的脱帽(decapping)抑制剂RG3039)，其旨在提高由SMN2基因转录的总RNA的量。然而，使用HDAC抑制剂或mRNA稳定剂不能解决SMA的根本原因，并且可能引起转录和基因表达的全面增强，给人类带来潜在安全问题。
在一种替代的方法中，已经选择神经保护剂例如奥利索西(olesoxime)用于研究。这样的策略并非旨在增强功能性Smn的产生以用于治疗SMA，而是正在研究保护Smn-缺乏的运动神经元以防止发生神经变性。
设计用于鉴别增强使SMN的外显子7包含到来自SMN2基因转录的RNA中的化合物的***和由此鉴别的某些苯并噁唑和苯并异噁唑化合物已经描述在2009年5月27日提交的国际申请PCT/US2009/003238(公布为国际公开号WO2009/151546和美国公开号US2011/0086833)中。设计用于鉴别增强由SMN2Δ7mRNA产生稳定的Smn蛋白质的化合物的***和由此鉴别的某些异吲哚酮化合物已经描述在2009年8月13日提交的国际申请PCT/US2009/004625(公布为国际公开号WO2010/019236和美国公开号US2011/0172284)中。将上述文件的每篇全文并入本文且用于所有目的。
本文提及的所有其他文献均如同本文完全列出的一样通过引用并入本申请中。
尽管在理解SMA的遗传学基础和病理生理学方面取得了进展，但是仍需要鉴别可改变脊髓性肌萎缩(最具破坏性儿童神经病学疾病之一)的病程的化合物。
发明简述
在一个方面，本文提供了式(I)的化合物：
或其形式，其中w1、w2、w3、w4、w5和w6为如本文定义的。在一种实施方式中，本文提供了药物组合物，其包含式(I)的化合物或其形式，及可药用载体、赋形剂或稀释剂。在一种具体实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式，或其药物组合物，用于治疗脊髓性肌萎缩(SMA)。
SMA是由SMN1基因的缺失或突变导致Smn-缺乏的运动神经元的选择性退化所引起。尽管人类受试者保留SMN2基因的一些副本，但是SMN2表达的少量功能性Smn蛋白质不能完全地补偿从SMN1基因表达的Smn的损失。本文所述的化合物、其组合物及其用途部分是基于本申请人的发现：式(I)的化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2小基因转录的mRNA中。小基因复制SMN2的外显子7的可变剪接反应，其导致大部分SMN2转录物中遗漏外显子7。因此，式(I)的化合物或其形式可用于调节SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。本申请人也发现式(I)的化合物增强SMN1的外显子7包含到从SMN1小基因转录的mRNA中。因此，式(I)的化合物或其形式可用于调节SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中。
在一种具体实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式，其可用于调节SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在另一个特定的实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式，其可用于调节SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中。在仍然另一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式，其可用于调节SMN1和SMN2的外显子7包含到分别从SMN1和SMN2基因转录的mRNA中。
在另一个方面，本文提供了式(I)的化合物或其形式用于治疗SMA的用途。在一种具体实施方式中，本文提供了一种治疗需要其的人类受试者中SMA的方法，其包括向所述受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式。式(I)的化合物或其形式优选地以药物组合物施用至人类受试者。在另一种具体实施方式中，本文提供了式(I)的化合物用于治疗SMA的用途，其中所述化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。不受理论的限制，式(I)的化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中，并且提高由SMN2基因产生的Smn蛋白质的水平，因此，可用于治疗需要其的人类受试者中的SMA。
在另一个方面，本文提供了下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物，例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13，和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ IDNO.3或10)，及那些引物和/或探针的用途。在一种具体实施方式中，本文提供了包含SEQ IDNO.1、2、3、7、8、9、10、11、12或13的分离的核苷酸序列。在另一种具体实施方式中，本文提供了基本上由SEQ ID NO.1、2、3、7、8、9、10、11、12或13组成的分离的核苷酸序列。在另一种具体实施方式中，本文提供了由SEQ ID NO.1、2、3、7、8、9、10、11、12或13组成的分离的核苷酸序列。
在某些实施方式中，从SMN1基因和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量可用作SMA的生物标记物，例如本文公开的。在其他实施方式中，从SMN1基因和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量可用作用化合物治疗患者的生物标记物，例如本文公开的。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。在另一种具体实施方式中，患者不为SMA患者。
在某些实施方式中，从SMN1和/或SMN2基因转录且包括和/或SMN2的外显子7的mRNA的量以及从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量可用作用化合物治疗患者的生物标记物，例如本文公开的。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。在另一种具体实施方式中，患者不为SMA患者。
根据这些实施方式，如下所述的SMN引物和/或SMN探针可用于测定中，例如PCR(例如qPCR)、滚环扩增和RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)以评价和/或定量从SMN1基因和/或SMN2基因转录且包括或不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。
在一种具体实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ IDNO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法(例如，在下文生物学实施例中所述的测定)，以确定化合物(例如，式(I)的化合物或其形式)是否增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。
在一种具体实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ IDNO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法(例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以确定化合物(例如，式(I)的化合物或其形式)是否增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中。
在一种具体实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ IDNO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法((例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以确定化合物(例如，式(I)的化合物或其形式)是否增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中。
在另一种实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法(例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以监测患者样品中从SMN2基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。在另一种具体实施方式中，患者不为SMA患者。
在另一种实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法(例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以监测患者样品中从SMN1基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。在另一种具体实施方式中，患者不为SMA患者。
在另一种实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法(例如，在下文生物学实施例中所述的测定)，以监测患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。在另一种具体实施方式中，患者不为SMA患者。
在另一种实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法(例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以监测患者对化合物(例如，式(I)的化合物或其形式)的反应。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。在另一种具体实施方式中，患者不为SMA患者。
在另一种实施方式中，本文提供了一种测定化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)是否增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中，其包括(a)使从本文所述或2009年8月13日提交的国际申请PCT US2009/004625(公布为国际公开号WO2010/019236)或美国公开号US2011/0172284中的SMN2小基因转录的mRNA与用于例如RT-PCR、RT-qPCR、PCR、终点RT-PCR、qPCR或滚环扩增的可用组分一起在化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)的存在下，与本文所述引物(例如，SEQ ID NO.1和/或2)接触；和(b)检测从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示该化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中；和(2)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示该化合物没有增强SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。
在另一种实施方式中，本文提供了一种测定化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)是否增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中，其包括(a)使从本文所述或2009年8月13日提交的国际申请PCT US2009/004625(公布为国际公开号WO2010/019236)或美国公开号US2011/0172284中的SMN1小基因转录的mRNA与用于例如RT-PCR、RT-qPCR、PCR、终点RT-PCR、qPCR或滚环扩增的可用组分一起在化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)的存在下，与本文所述引物(例如，SEQ ID NO.1和/或2)接触；和(b)检测从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量增加指示该化合物增强SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中；和(2)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示该化合物没有增强SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中。
在另一种实施方式中，本文提供了一种测定化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)是否增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，其包括(a)使从本文所述或2009年8月13日提交的国际申请PCT US2009/004625(公布为国际公开号WO2010/019236)或美国公开号US2011/0172284中的SMN2小基因转录的mRNA与用于例如RT-PCR、RT-qPCR、PCR、终点RT-PCR、qPCR或滚环扩增及可适用时RNA印迹法或DNA印迹法的可用组分一起在化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)的存在下，与本文所述探针(例如，SEQ ID NO.3和/或10)接触；和(b)检测从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示该化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中；和(2)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示该化合物没有增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。
在另一种实施方式中，本文提供了一种测定化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)是否增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中的方法，其包括(a)使从本文所述或2009年8月13日提交的国际申请PCT US2009/004625(公布为国际公开号WO2010/019236)或美国公开号US2011/0172284中的SMN1小基因转录的mRNA与用于例如RT-PCR、RT-qPCR、PCR、终点RT-PCR、qPCR或滚环扩增及可适用时RNA印迹法或DNA印迹法的可用组分一起在化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)的存在下，与本文所述探针(例如，SEQ ID NO.3和/或10)接触；和(b)检测从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量增加指示该化合物增强SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中；和(2)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示该化合物没有增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。
在另一种实施方式中，本文提供了一种测定化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)是否增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，其包括(a)使从本文所述或2009年8月11日提交的国际申请PCT US2009/004625(公布为国际公开号WO202/019216)或美国公开号US2011/0172284中的SMN2小基因转录的mRNA与用于例如RT-PCR、RT-qPCR、PCR、终点RT-PCR、qPCR或滚环扩增及可适用时RNA印迹法或DNA印迹法的可用组分一起在化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)的存在下，与本文所述引物(例如，SEQ IDNO.1或2)和/或探针(例如，SEQ ID NO.3和/或10)接触；和(b)检测从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示该化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中；和(2)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示该化合物没有增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。
在另一种实施方式中，本文提供了一种测定化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)是否增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中的方法，其包括(a)使从本文所述或2009年8月11日提交的国际申请PCT US2009/004625(公布为国际公开号WO202/019216)或美国公开号US2011/0172284中的SMN1小基因转录的mRNA与用于例如RT-PCR、RT-qPCR、PCR、终点RT-PCR、qPCR或滚环扩增及可适用时RNA印迹法或DNA印迹法的可用组分一起在化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)的存在下，与本文所述引物(例如，SEQ IDNO.1或2)和/或探针(例如，SEQ ID NO.3和/或10)接触；和(b)检测从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量增加指示该化合物增强SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中；和(2)相对于在不存在所述化合物下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量，在所述化合物的存在下从小基因转录且包括SMN1的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示该化合物没有增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中。
在另一个方面，本文提供了包含下文生物学实施例中所述引物和/或探针(例如，SMN引物，例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQID NO.3或10)的试剂盒及其用途。
附图说明
图1，在生物学实施例1中提及，是SMN2-A小基因构建物的示意图，该构建物产生两个可变剪接的mRNA转录物：包含外显子7的全长mRNA和缺乏外显子7的Δ7mRNA。***SMN2-A的外显子7中位于核酸残基48之后的腺嘌呤核苷酸由字母“A.”代表。可替代地，核苷酸也可选自胞嘧啶或胸腺嘧啶。由于在核酸残基48之后***核苷酸(A、C或T)，因此全长mRNA在SMN开放读码框中不包含终止密码子，而Δ7mRNA在外显子8中具有由词语“终止”指示的终止密码子。
图2，在生物学实施例1中提及，提供来自SMN2-A小基因构建物SEQ ID NO.21的小基因的DNA序列(图2a)。如图2b所示，可以发现下述子序列：
1-70：5’UTR(deg)；
71-79：外显子6：起始密码子和BamHI位点(atgggatcc)；
80-190：外显子6；
191-5959：内含子6；
5960-6014：外显子7，具有腺嘌呤核苷酸“A”***物(位置6008)；
6015-6458：内含子7；
6459-6481：外显子8的一部分；
6482-8146：BamHI位点(位于5′端的序列)、从密码子2开始的荧光素酶编码序列(没有起始密码子)、NotI位点(位于3′端的序列)，TAA终止密码子；和
8147-8266：3’UTR(deg).
为了产生小基因的SMN1变型，使用位点定向诱变将SMN2-A小基因构建物的外显子7的第六个核苷酸(胸腺嘧啶残基)转变为胞嘧啶。因此，类似于SMN2-A小基因构建物，SMN1小基因构建物具有在外显子7的核酸残基48之后***的单个腺嘌呤残基。SMN1小基因构建物称为SMN1-A。类似地，***SMN1小基因构建物中在外显子7的核酸残基48之后的核苷酸也可以可替代地选自胞嘧啶或胸腺嘧啶。
图3，在生物学实施例2中提及，显示在用递增浓度的化合物65(图3a)和化合物69(图3b)处理24小时时期的细胞中SMN2小基因可变剪接的校正。使用逆转录-定量PCR(RT-qPCR)定量全长SMN2小基因mRNA的水平。将在化合物处理的样品中全长SMN2小基因mRNA的水平标准化为在载体处理的样品中的所述水平，并作为化合物浓度的函数作图。
图4，在生物学实施例3中提及，显示在用递增浓度的化合物65(图4a)和化合物69(图4b)处理24hr时期的1型SMA患者成纤维细胞中SMN2可变剪接的校正。使用RT-qPCR定量全长和Δ7 SMN2 mRNA的水平。将化合物处理的样品中全长和Δ7 SMN2 mRNA的水平标准化为载体处理的样品中的所述水平，并作为化合物浓度的函数作图。
图5，在生物学实施例4中提及，显示在用递增浓度的化合物65(图5a)和化合物69(图5b)处理25hr时期的1型SMA患者成纤维细胞中SMN2可变剪接的校正。使用逆转录-终点PCR(RT-PCR)扩增全长和Δ7 SMN2 mRNA，并使用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。顶部条带和底部条带分别对应于全长和Δ7 SMN2 mRNA。各带的强度与样品中存在的RNA的量成比例。
图6，在生物学实施例5中提及，显示用10mg/kg的化合物65(图6a)和化合物69(图6b)处理10天(每天2次，BID)引起C/C-等位基因SMA小鼠模型的脑和肌肉组织中SMN2可变剪接(在SMN2基因和杂交小鼠Smn1-SMN2基因中)的校正。使用RT-qPCR定量全长和Δ7 SMN2mRNA的水平，将全长和Δ7 SMN2 mRNA的组合量设定为1，并且计算全长和Δ7 SMN2的分数量。
图7，在生物学实施例6中提及，显示用10mg/kg的化合物65(图7)处理10天(BID)引起C/C-等位基因SMA小鼠模型的脑和肌肉组织中SMN2可变剪接(在SMN2基因和杂交小鼠Smn1-SMN2基因中)的校正。使用逆RT-PCR扩增全长和Δ7 SMN2 mRNA。使用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。顶带和底带分别对应于全长和Δ7 SMN2 mRNA。各带的强度与样品中存在的RNA的量成比例。
图8，在生物学实施例7中提及，显示用化合物65(图8a)和化合物69(图8b)处理48小时时期的SMA 1型人成纤维细胞中Smn蛋白质表达的剂量依赖性增加。
图9，在生物学实施例8中提及，显示化合物65(图9a)和化合物69(图9b)处理48小时时期的1型SMA患者成纤维细胞中核斑计数(gems)增加。使用荧光显微镜对斑计数。将化合物处理的样品中斑的数量标准化为载体处理的样品中的所述数量，并作为化合物浓度的函数作图。
图10，在生物学实施例9中提及，显示由化合物65(图10a)和化合物69(图10b)处理72小时时期的1型SMA患者成纤维细胞产生的iPS细胞所产生的运动神经元中的Smn蛋白质表达的增加(黑色图)。使用Smn免疫染色和共焦荧光显微镜定量Smn蛋白质的水平。将化合物处理的样品中Smn蛋白质的水平标准化为载体处理的样品中的所述水平，并作为化合物浓度的函数作图。
图11，在生物学实施例11中提及，显示用10mg/kg的化合物65(图11a，n＝5)和化合物69(图11b，n＝4)处理10天(BID)引起C/C-等位基因SMA小鼠模型的脑、脊髓、肌肉和肝组织中Smn蛋白质表达增加，其中各图中用三个星号(***)代表ANOVA的p＜0.001。
图12，在生物学实施例12中提及，显示用指定剂量化合物65处理7天(每天一次，QD)引起新生的Δ7 SMA小鼠模型的组织(脑，图12a；脊髓，图12b；和肌肉，图12c)中Smn蛋白质表达的剂量依赖性增加，其中各图中用三个星号(***)代表ANOVA的p＜0.001。
图13，在生物学实施例13中提及，显示用化合物65(图13a)处理直至出生后(PND)第140天和用化合物69(图13b)处理直至PND 79引起新生的Δ7 SMA小鼠模型的体重差异。
图14，在生物学实施例14中提及，显示用化合物65(图14a)和化合物69(图14b)处理引起新生的Δ7 SMA小鼠模型中翻正反射提高。
图15，在生物学实施例15中提及，显示用化合物65(图15a)和化合物69(图15b)处理引起新生的Δ7 SMA小鼠模型的存活率提高。
图16，在生物学实施例15中提及，显示分别相对于载体处理的和小鼠和年龄匹配的杂合小鼠，用化合物65处理直至PND 144(图16a)和用化合物69处理直至PND 80和PND 83引起Δ7 SMA小鼠模型的脑和肌肉组织中Smn蛋白质表达增加。
图17，在生物学实施例16中提及，显示用化合物65(图17a)和化合物69(图17b)处理7小时时期的SMA 1型人成纤维细胞中的SMN1小基因FL mRNA出现剂量依赖性增加和SMN1小基因Δ7mRNA出现剂量依赖性降低。使用RT-PCR各自扩增全长和Δ7 SMN1小基因mRNA，并使用琼脂糖凝胶电泳分离得到的PCR产物。顶带和底带分别对应于全长和Δ7 SMN1小基因mRNA。各个带的强度与样品中存在的RNA的量成比例。
具体实施方式
本文提供了式(I)的化合物：
或其形式，其中：
w1为C-Rb或N；
w2和w6为C-R1或C-R2；
w3、w4和w5为C-Ra或N；
其中w2和w6中的一个为C-R1，且另一个为C-R2，条件是，当w2为C-R1时，则w6为C-R2；或，当w2为C-R2时，则w6为C-R1；和
其中其余w1、w3、w4和w5的任一个、两个或三个可以同时为N；
R1为C1-8烷基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、(氨基-C1-8烷基)2-氨基、(氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、氨基-C2-8烯基、C1-8烷基-氨基-C2-8烯基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8烯基、氨基-C2-8炔基、C1-8烷基-氨基-C2-8炔基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8炔基、卤代-C1-8烷基-氨基、(卤代-C1-8烷基)2-氨基、(卤代-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基-氨基、[(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、[(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、杂环基、杂环基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷氧基、杂环基-氨基、(杂环基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-氨基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷基-氨基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂环基-氧基、杂环基-羰基、杂环基-羰基-氧基、芳基-C1-8烷基-氨基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂芳基、杂芳基-C1-8烷基、杂芳基-C1-8烷氧基、杂芳基-氨基、杂芳基-C1-8烷基-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基或(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基；
其中，每种情况下的杂环基和杂芳基任选地被一个、两个或三个R3取代基和一个另外任选的R4取代基取代；和
其中，可替代地，每种情况下的杂环基和杂芳基任选地被一个、两个、三个或四个R3取代基取代；
R2为芳基、芳基-氨基、芳基-氨基-羰基、杂环基、杂芳基或杂芳基-氨基；
其中，每种情况下的芳基、杂环基和杂芳基任选地被一个、两个或三个R6取代基和一个另外的任选的R7取代基取代；
Ra在每种情况下独立地选自氢、卤素或C1-8烷基；
Rb为氢、卤素、C1-8烷基或C1-8烷氧基；
R3在每种情况下独立地选自氰基、卤素、羟基、氧代、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷基-羰基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-羰基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基]2-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、C1-8烷基-羰基-氨基、C1-8烷氧基-羰基-氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基或(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基；
R4为C3-14环烷基、C3-14环烷基-C1-8烷基、C3-14环烷基-氨基、芳基-C1-8烷基、芳基-C1-8烷氧基-羰基、芳基-磺酰氧基-C1-8烷基、杂环基或杂环基-C1-8烷基；其中，每种情况下的C3-14环烷基、芳基和杂环基任选地被一个、两个或三个R5取代基取代；
R5在每种情况下独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；
R6在每种情况下独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-8烷基、C2-8烯基、卤代-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；和
R7为C3-14环烷基、C3-14环烷基-氧基、芳基、杂环基或杂芳基。
实施方式
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w2和w6中的一个为C-R1且另一个为C-R2，条件是，当w2为C-R1时，则w6为C-R2；或者，当w2C-R2时，则w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w3为C-Ra；w4为N；w5为C-Ra；和w2和w6中的一个为C-R1且另一个为C-R2，条件是，当w2为C-R1时，则w6为C-R2；或者，当w2C-R2时，则w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w3为N；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w2和w6中的一个为C-R1且另一个为C-R2，条件是，当w2为C-R1时，则w6为C-R2；或者，当w2C-R2时，则w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为N；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w2和w6中的一个为C-R1且另一个为C-R2，条件是，当w2为C-R1时，则w6为C-R2；或者，当w2C-R2时，则w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为N；和w2和w6中的一个为C-R1且另一个为C-R2，条件是，当w2为C-R1时，则w6为C-R2；或者，当w2C-R2时，则w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R1；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w6为C-R2。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R2；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R1；w3为C-Ra；w4为N；w5为C-Ra；和w6为C-R2。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R2；w3为C-Ra；w4为N；w5为C-Ra；和w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R1；w3为N；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w6为C-R2。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R2；w3为N；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为N；w2为C-R1；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w6为C-R2。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w1为N；w2为C-R2；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为C-Ra；和w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R1；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为N；和w6为C-R2。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w1为C-Rb；w2为C-R2；w3为C-Ra；w4为C-Ra；w5为N；和w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w1为C-Rb。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w1为N。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w2为C-R1，条件是w6为C-R2。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w2为C-R2，条件是w6为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w6为C-R1，条件是w2为C-R2。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w6为C-R2，条件是w2为C-R1。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w3为C-Ra。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w3为N。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w4为C-Ra。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w4为N。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，w5为C-Ra。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，w5为N。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，
R1为C1-8烷基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、(氨基-C1-8烷基)2-氨基、(氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、氨基-C2-8烯基、C1-8烷基-氨基-C2-8烯基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8烯基、氨基-C2-8炔基、C1-8烷基-氨基-C2-8炔基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8炔基、卤代-C1-8烷基-氨基、(卤代-C1-8烷基)2-氨基、(卤代-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基-氨基、[(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、[(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、杂环基、杂环基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷氧基、杂环基-氨基、(杂环基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-氨基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷基-氨基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂环基-氧基、杂环基-羰基、杂环基-羰基-氧基、芳基-C1-8烷基-氨基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂芳基、杂芳基-C1-8烷基、杂芳基-C1-8烷氧基、杂芳基-氨基、杂芳基-C1-8烷基-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基或(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基；其中每种情况下的杂环基和杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，
R1为氨基、(C1-8烷基)2-氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、(氨基-C1-8烷基)2-氨基、(氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、氨基-C2-8烯基、C1-8烷基-氨基-C2-8烯基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8烯基、氨基-C2-8炔基、C1-8烷基-氨基-C2-8炔基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8炔基、卤代-C1-8烷基-氨基、(卤代-C1-8烷基)2-氨基、(卤代-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基-氨基、[(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、[(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、杂环基、杂环基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷氧基、杂环基-氨基、(杂环基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-氨基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷基-氨基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂环基-氧基、杂环基-羰基、杂环基-羰基-氧基、芳基-C1-8烷基-氨基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂芳基、杂芳基-C1-8烷基、杂芳基-C1-8烷氧基、杂芳基-C1-8烷基-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基或(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基；其中每种情况下的杂环基和杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基，选自氮杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，4-二氮杂环庚烷基、1，2，5，6-四氢吡啶基、1，2，3，6-四氢吡啶基、六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(1H)-基、(3aS，6aS)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(1H)-基、(3aR，6aR)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(1H)-基、四氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(2H)-基、(3aS，6aS)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(2H)-基、四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-(1H)-基、(3aR，6aS)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-(1H)-基、八氢-5H-吡咯并[3，2-c]吡啶基、八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶基、(4aR，7aR)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶基、(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶基、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(2H)-酮、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(7R，8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aR)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aS)-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aR)-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、八氢-2H-吡啶并[1，2-a]吡嗪基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、(1R，5S)-3-氮杂双环[3.1.0]己基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、(1R，5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯基、(1R，5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯基、9-氮杂双环[3.3.1]壬基、(1R，5S)-9-氮杂双环[3.3.1]壬基、2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、(1S，4S)-2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、2，5-二氮杂双环[2.2.2]辛基、3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛基、(1R，5S)-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛基、1，4-二氮杂双环[3.2.2]壬基、氮杂螺[3.3]庚基、2，6-二氮杂螺[3.3]庚基、2，7-二氮杂螺[3.5]壬基、5，8-二氮杂螺[3.5]壬基、2，7-二氮杂螺[4.4]壬基或6，9-二氮杂螺[4.5]癸基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基，选自氮杂环丁烷-1-基、四氢呋喃-3-基、吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、哌啶-4-基、哌嗪-1-基、1，4-二氮杂环庚烷-1-基、1，2，5，6-四氢吡啶-5-基、1，2，3，6-四氢吡啶-4-基、四氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-基、(3aS，6aS)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-基、(3aS，6aS)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-5(1H)-基、(3aR，6aR)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-5(1H)-基、四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基、(3aR，6aS)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基、八氢-5H-吡咯并[3，2-c]吡啶-5-基、八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、(4aR，7aR)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、四氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-6(2H)-酮、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(7R，8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(8aR)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(8aS)-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(8aR)-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、八氢-2H-吡啶并[1，2-a]吡嗪-2-基、3-氮杂双环[3.1.0]己-3-基、8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基、(1R，5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基、8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基、(1R，5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯-3-基、9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基、(1R，5S)-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基、2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基、(1S，4S)-2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基、2，5-二氮杂双环[2.2.2]辛-2-基、3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基、(1R，5S)-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛-3-基、1，4-二氮杂双环[3.2.2]壬-4-基、氮杂螺[3.3]庚-2-基、2，6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基、2，7-二氮杂螺[3.5]壬-7-基、5，8-二氮杂螺[3.5]壬-8-基、2，7-二氮杂螺[4.4]壬-2-基或6，9-二氮杂螺[4.5]癸-9-基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为取代的杂环基，选自4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基、(3aS，6aS)-1-甲基六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-5(1H)-基、(3aS，6aS)-5-甲基六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-1(2H)-基、(3aR，6aR)-1-甲基六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-5(1H)-基、(3aR，6aS)-5-甲基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基、(3aR，6aS)-5-(2-羟基乙基)六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基、(3aR，6aS)-5-(丙烷-2-基)六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基、(3aR，6aS)-5-乙基六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-2(1H)-基、(4aR，7aR)-1-甲基八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、(4aR，7aR)-1-乙基八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、(4aR，7aR)-1-(2-羟基乙基)八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、(4aS，7aS)-1-甲基八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、(4aS，7aS)-1-(2-羟基乙基)八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶-6-基、(7R，8aS)-7-羟基六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(8aS)-8a-甲基八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(8aR)-8a-甲基八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基、(1R，5S，6s)-6-(二甲基氨基)-3-氮杂双环[3.1.0]己-3-基、(1R，5S)-8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基、9-甲基-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基、(3-exo)-9-甲基-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基、(1R，5S)-9-甲基-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基、(1S，4S)-5-甲基-2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基或(1S，4S)-5-乙基-2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-C1-8烷基，其中杂环基选自吗啉基、哌啶基、哌嗪基、咪唑基或吡咯烷基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-C1-8烷基，选自吗啉-4-基-甲基、吗啉-4-基-乙基、吗啉-4-基-丙基、哌啶-1-基-甲基、哌嗪-1-基-甲基、哌嗪-1-基-乙基、哌嗪-1-基-丙基、哌嗪-1-基-丁基、咪唑-1-基-甲基、咪唑-1-基-乙基、咪唑-1-基-丙基、咪唑-1-基-丁基、吡咯烷-1-基-甲基、吡咯烷-1-基-乙基、吡咯烷-1-基-丙基或吡咯烷-1-基-丁基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-C1-8烷氧基，其中杂环基选自吡咯烷基、哌啶基或吗啉基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-C1-8烷氧基，选自吡咯烷-2-基-甲氧基、吡咯烷-2-基-乙氧基、吡咯烷-1-基-甲氧基、吡咯烷-1-基-乙氧基、哌啶-1-基-甲氧基、哌啶-1-基-乙氧基、吗啉-4-基-甲氧基或吗啉-4-基-乙氧基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-氨基，其中杂环基选自氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、9-氮杂双环[3.3.1]壬基或(1R，5S)-9-氮杂双环[3.3.1]壬基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-氨基，选自氮杂环丁烷-3-基-氨基、吡咯烷-3-基-氨基、哌啶-4-基-氨基、9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基-氨基、(1R，5S)-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基-氨基、9-甲基-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基-氨基、(3-exo)-9-甲基-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基-氨基或(1R，5S)-9-甲基-9-氮杂双环[3.3.1]壬-3-基-氨基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为(杂环基)(C1-8烷基)氨基，其中杂环基选自吡咯烷基或哌啶基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为(杂环基)(C1-8烷基)氨基，选自(吡咯烷-3-基)(甲基)氨基或(哌啶-4-基)(甲基)氨基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-氨基-C1-8烷基，其中杂环基选自四氢呋喃基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-氨基-C1-8烷基，选自3-(四氢呋喃-3-基-氨基)丙基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基，其中杂环基选自四氢呋喃基、噻吩基或吡啶基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基，选自3-[(四氢呋喃-2-基甲基)氨基]丙基、3-[(硫代苯基-3-基甲基)氨基]丙基、3-[(吡啶-2-基甲基)氨基]丙基或3-[(吡啶-4-基甲基)氨基]丙基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-氧基，其中杂环基选自吡咯烷基或哌啶基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-氧基，选自吡咯烷-3-基-氧基或哌啶-4-基-氧基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-羰基，其中杂环基选自哌嗪基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-羰基，选自哌嗪-1-基-羰基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂环基-羰基-氧基，其中杂环基选自哌嗪基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂环基-羰基-氧基，选自哌嗪-1-基-羰基-氧基；其中每种情况下的杂环基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基，其中芳基选自苯基；和其中每种情况下的芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基，选自3-(苯甲基氨基)丙基；其中每种情况下的芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂芳基，其中杂芳基选自吡啶基；和其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂芳基，选自吡啶-4-基；其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂芳基-C1-8烷基，其中杂芳基，选自1H-咪唑基；和其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂芳基-C1-8烷基，选自1H-咪唑-1-基-甲基；其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基，其中杂芳基选自吡啶基；和其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基，选自(吡啶-3-基甲基)(甲基)氨基；其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R1为杂芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基，其中杂芳基选自噻吩基或吡啶基；和其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R1为杂芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基，选自噻吩-3-基-甲基-氨基-丙基、吡啶-2-基-甲基-氨基-丙基、吡啶-3-基-甲基-氨基-丙基或吡啶-4-基-甲基-氨基-丙基；其中每种情况下的杂芳基任选地被R3和R4取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3选自氰基、卤素、羟基、氧代、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷基-羰基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-羰基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷基-羰基-氨基、C1-8烷氧基-羰基-氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基或(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R3选自氰基、卤素、羟基、氧代、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-羰基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷氧基-羰基-氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基或(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3为C1-8烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基或叔-丁基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R3为C1-8烷基，选自乙基、丙基、异丙基或叔-丁基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3为卤代-C1-8烷基，选自三卤代-甲基、二卤代-甲基、卤代-甲基、三卤代-乙基、二卤代-乙基、卤代-乙基、三卤代-丙基、二卤代-丙基或卤代-丙基；其中卤素选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3为卤代-C1-8烷基，选自三卤代-甲基、二卤代-甲基、卤代-甲基、三卤代-乙基、二卤代-乙基、三卤代-丙基或二卤代-丙基；其中卤素选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3为羟基-C1-8烷基，选自羟基-甲基、羟基-乙基、羟基-丙基、二羟基-丙基、羟基-丁基或二羟基-丁基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R3为羟基-C1-8烷基，选自羟基-甲基、二羟基-丙基、羟基-丁基或二羟基-丁基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3为C1-8烷氧基，选自甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3为卤代-C1-8烷氧基，选自三卤代-甲氧基、二卤代-甲氧基、卤代-甲氧基、三卤代-乙氧基、二卤代-乙氧基、卤代-乙氧基、三卤代-丙氧基、二卤代-丙氧基或卤代-丙氧基；其中卤素选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R3为C1-8烷氧基-羰基-氨基，选自甲氧基-羰基-氨基、乙氧基-羰基-氨基、丙氧基-羰基-氨基、异丙氧基-羰基-氨基、叔-丁氧基-羰基-氨基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R4为C3-14环烷基，选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；其中每种情况下的C3-14环烷基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R4为C3-8环烷基，选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；其中每种情况下的C3-8环烷基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R4为C3-14环烷基-C1-8烷基，其中C3-14环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；和其中每种情况下的C3-14环烷基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R4为C3-8环烷基-C1-8烷基，其中C3-8环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；和其中每种情况下的C3-8环烷基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R4为C3-14环烷基-氨基，其中C3-14环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；和其中每种情况下的C3-14环烷基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R4为C3-8环烷基-氨基，其中C3-8环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；和其中每种情况下的C3-8环烷基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R4为芳基-C1-8烷基、芳基-C1-8烷氧基-羰基或芳基-磺酰氧基-C1-8烷基，其中芳基选自苯基；和其中每种情况下的芳基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R4为芳基-C1-8烷基或芳基-C1-8烷氧基-羰基，其中每种情况下的芳基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R4为杂环基，选自氧杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，3-二噁烷基或吗啉基，其中每种情况下的杂环基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R4为杂环基，选自氧杂环丁烷-3-基、吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、哌嗪-1-基、1，3-二噁烷-5-基或吗啉-4-基，其中每种情况下的杂环基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R4为杂环基-C1-8烷基，其中每种情况下的杂环基选自吡咯烷基或哌啶基；和其中每种情况下的杂环基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R4为杂环基-C1-8烷基，选自吡咯烷-1-基-C1-8烷基或哌啶-1-基-C1-8烷基，其中每种情况下的杂环基任选地被R5取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R5选自卤素、羟基、氰基、硝基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；其中卤素或卤代选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R5为羟基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R5为C1-8烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正-丁基或叔-丁基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R5为C1-8烷基，选自乙基、丙基、异丙基或叔-丁基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R5为卤代-C1-8烷基，选自三卤代-甲基、二卤代-甲基、卤代-甲基、三卤代-乙基、二卤代-乙基、卤代-乙基、三卤代-丙基、二卤代-丙基或卤代-丙基；其中卤素选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R5为C1-8烷氧基，选自甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R5为卤代-C1-8烷氧基，选自三卤代-甲氧基、二卤代-甲氧基、卤代-甲氧基、三卤代-乙氧基、二卤代-乙氧基、卤代-乙氧基、三卤代-丙氧基、二卤代-丙氧基或卤代-丙氧基；其中卤素选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R2为芳基，选自任选地被R6和R7取代基取代的苯基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R2为芳基-氨基，其中芳基选自苯基；和其中每种情况下的芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R2为芳基-氨基，选自苯基-氨基；其中每种情况下的芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R2为芳基-氨基-羰基，其中芳基选自苯基；和其中每种情况下的芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R2为芳基-氨基-羰基，选自苯基-氨基-羰基；其中每种情况下的芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R2为杂环基，选自1，2，3，6-四氢吡啶基、1，3-苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)或2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基(benzodioxinyl)；其中每种情况下的杂环基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R2为杂环基，选自1，2，3，6-四氢吡啶-4-基、1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基或2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基；其中每种情况下的杂环基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R2为杂芳基，选自噻吩基、1H-吡唑基、1H-咪唑基、1，3-噻唑基、1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、1H-吲哚基、2H-吲哚基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、1H-苯并咪唑基、1，3-苯并噻唑基、1，3-苯并噁唑基、9H-嘌呤基、呋喃并[3，2-b]吡啶基、呋喃并[3，2-c]吡啶基、呋喃并[2，3-c]吡啶基、噻吩并[3，2-c]吡啶基、噻吩并[2，3-d]嘧啶基、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶基、1H-吡咯并[2，3-c]吡啶基、吡咯并[1，2-a]嘧啶基、吡咯并[1，2-a]吡嗪基、吡咯并[1，2-b]哒嗪基、吡唑并[1，5-a]吡啶基、吡唑并[1，5-a]吡嗪基、咪唑并[1，2-a]吡啶基、咪唑并[1，2-a]嘧啶基、咪唑并[1，2-c]嘧啶基、咪唑并[1，2-b]哒嗪基、咪唑并[1，2-a]吡嗪基、咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑基、咪唑并[2，1-b][1，3，4]噻二唑基、[1，3]噁唑并[4，5-b]吡啶基或喹喔啉基；其中每种情况下的杂芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R2为杂芳基，选自噻吩-2-基、噻吩-3-基、1H-吡唑-3-基、1H-吡唑-4-基、1H-吡唑-5-基、1H-咪唑-1-基、1H-咪唑-4-基、1，3-噻唑-2-基、1，2，4-噁二唑-3-基、1，3，4-噁二唑-2-基、吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、嘧啶-4-基、1H-吲哚-3-基、1H-吲哚-4-基、1H-吲哚-5-基、1H-吲哚-6-基、1H-吲唑-5-基、2H-吲唑-5-基、吲嗪-2-基、苯并呋喃-2-基、苯并呋喃-5-基、苯并噻吩-2-基、苯并噻吩-3-基、1H-苯并咪唑-2-基、1H-苯并咪唑-6-基、1，3-苯并噁唑-2-基、1，3-苯并噁唑-5-基、1，3-苯并噁唑-6-基、1，3-苯并噻唑-2-基、1，3-苯并噻唑-5-基、1，3-苯并噻唑-6-基、9H-嘌呤-8-基、呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基、呋喃并[3，2-c]吡啶-2-基、呋喃并[2，3-c]吡啶-2-基、噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基、噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-5-基、1H-吡咯并[2，3-c]吡啶-4-基、吡咯并[1，2-a]嘧啶-7-基、吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基、吡咯并[1，2-b]哒嗪-2-基、吡唑并[1，5-a]吡啶-2-基、吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基、咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-基、咪唑并[1，2-a]嘧啶-6-基、咪唑并[1，2-c]嘧啶-2-基、咪唑并[1，2-b]哒嗪-2-基、咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基、咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基、咪唑并[2，1-b][1，3，4]噻二唑-6-基、[1，3]噁唑并[4，5-b]吡啶-2-基或喹喔啉-2-基；其中每种情况下的杂芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R2为取代的杂芳基，选自4-甲基噻吩-2-基、1-甲基-1H-吡唑-3-基、4-甲基-1H-吡唑-3-基、1-苯基-1H-吡唑-3-基、1-苯基-1H-咪唑-4-基、2-甲基-1-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基、4-甲基-1，3-噻唑-2-基、4-(三氟甲基)-1，3-噻唑-2-基、4-苯基-1，3-噻唑-2-基、5-苯基-1，2，4-噁二唑-3-基、3-氟吡啶-4-基、6-氟吡啶-2-基、2-氯吡啶-4-基、4-氯吡啶-3-基、5-氯吡啶-2-基、6-甲基吡啶-3-基、2-(三氟甲基)吡啶-3-基、4-(三氟甲基)吡啶-2-基、6-(三氟甲基)吡啶-2-基、2-甲氧基吡啶-4-基、4-甲氧基吡啶-3-基、6-甲氧基吡啶-2-基、2-乙氧基吡啶-3-基、6-乙氧基吡啶-2-基、6-(丙烷-2-基氧基)吡啶-2-基、6-(二甲基氨基)吡啶-3-基、6-(甲基硫烷基)吡啶-2-基、6-(环丁基氧基)吡啶-2-基、6-(吡咯烷-1-基)吡啶-2-基、2-甲基嘧啶-4-基、2-(丙烷-2-基)嘧啶-4-基、2-环丙基嘧啶-4-基、1-甲基-1H-吲哚-3-基、2-甲基-2H-吲唑-5-基、2-甲基-1-苯并呋喃-5-基、1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基、4-甲基-1H-苯并咪唑-2-基5-氟-1H-苯并咪唑-2-基、4-氟-1，3-苯并噁唑-2-基、5-氟-1，3-苯并噁唑-2-基、4-氯-1，3-苯并噁唑-2-基、4-碘-1，3-苯并噁唑-2-基、2-甲基-1，3-苯并噁唑-6-基、4-甲基-1，3-苯并噁唑-2-基、4-(三氟甲基)-1，3-苯并噁唑-2-基、7-(三氟甲基)-1，3-苯并噁唑-2-基、2-甲基-1，3-苯并噻唑-2-基、2-甲基-1，3-苯并噻唑-5-基、2-甲基-1，3-苯并噻唑-6-基、4-氯-1，3-苯并噻唑-2-基、7-氯-1，3-苯并噻唑-2-基、4-(三氟甲基)-1，3-苯并噻唑-2-基、5-甲基呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基、4，6-二甲基呋喃并[3，2-c]吡啶-2-基、5，7-二甲基呋喃并[2，3-c]吡啶-2-基、4，6-二甲基噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基、2，4-二甲基噻吩并[2，3-d]嘧啶-6-基、1-甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基、3-甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基、1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基、2-甲基吡咯并[1，2-b]哒嗪-2-基、4，6-二甲基吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基、5-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-2-基、4，6-二甲基吡唑并[1，5-a]吡嗪-2-基、2-氯咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基、2-甲基咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基、3-甲基咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基、2-乙基咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基、2-甲基咪唑并[2，1-b][1，3，4]噻二唑-6-基、6-氰基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基(也称为2-咪唑并[1，2-a]吡啶-6-腈)、6-氟咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-氟咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6，8-二氟咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、7-(三氟甲基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-(三氟甲基)咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、7-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-溴咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、2-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、5-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、7-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、7-乙基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-乙基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、7-甲氧基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-甲氧基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6-氟-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-氟-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-氯-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6-甲基-8-硝基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、8-环丙基咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、2-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、2-乙基咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、2，3-二甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、2，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、2-(三氟甲基)咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、8-氯-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、8-氟-2-甲基咪唑并[1，2-a]吡啶-6-基、6-氟咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-基、6-氯咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-基、6-甲基咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-基、7-甲基咪唑并[1，2-a]嘧啶-2-基、2-甲基咪唑并[1，2-a]嘧啶-6-基、6-甲基咪唑并[1，2-b]哒嗪-2-基、2-甲基-3-(1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)咪唑并[1，2-b]哒嗪-6-基、6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基、8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基、6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基、6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基、6-甲基-8-(三氟甲基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基、8-(甲基硫烷基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基、2-甲基咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基、3-甲基咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基或2-甲基咪唑并[2，1-b][1，3，4]噻二唑-6-基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R2为杂芳基-氨基，其中杂芳基选自吡啶基或嘧啶基；和其中每种情况下的杂芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R2为杂芳基-氨基，选自吡啶-2-基-氨基、吡啶-3-基-氨基或嘧啶-2-基-氨基；其中每种情况下的杂芳基任选地被R6和R7取代基取代。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R6选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；其中卤素或卤代选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R6为C1-8烷基，选自甲基、乙基、丙基、异丙基或叔-丁基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R6为C1-8烷基，选自乙基、丙基、异丙基或叔-丁基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R6为C2-8链烯基，选自乙烯基烯丙基或buta-1，3-二烯基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R6为C2-8链烯基，选自乙烯基或烯丙基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R6为卤代-C1-8烷基，选自三卤代-甲基、二卤代-甲基、卤代-甲基、三卤代-乙基、二卤代-乙基、卤代-乙基、三卤代-丙基、二卤代-丙基或卤代-丙基；其中卤素选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R6为羟基-C1-8烷基，选自羟基-甲基、羟基-乙基、羟基-丙基、二羟基-丙基、羟基-丁基或二羟基-丁基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R6为羟基-C1-8烷基，选自羟基-甲基、二羟基-丙基、羟基-丁基或二羟基-丁基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R6为C1-8烷氧基，选自甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R6为卤代-C1-8烷氧基，选自三卤代-甲氧基、二卤代-甲氧基、卤代-甲氧基、三卤代-乙氧基、二卤代-乙氧基、卤代-乙氧基、三卤代-丙氧基、二卤代-丙氧基或卤代-丙氧基；其中卤素选自氟、氯、溴或碘。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R7为C3-14环烷基、C3-14环烷基-氧基、芳基、杂环基或杂芳基；其中C3-14环烷基选自环丙基或环丁氧基(cyclobutoxy)；其中芳基选自苯基；其中杂环基选自氧杂环丁烷基、吡咯烷基或1，2，3，6-四氢吡啶基；和其中杂芳基选自噻吩基或吡啶基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R7为C3-14环烷基或C3-14环烷基-氧基，其中每种情况下的C3-14环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R7为C3-8环烷基或C3-8环烷基-氧基，其中每种情况下的C3-8环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R7为芳基，选自苯基。。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R7为杂环基，选自氧杂环丁烷基、吡咯烷基或1，2，3，6-四氢吡啶基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R7为杂环基，选自氧杂环丁烷-3-基、吡咯烷-1-基或1，2，3，6-四氢吡啶-4-基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，R7为杂芳基，选自噻吩基或吡啶基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R7为杂芳基，选自吡啶基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R7为杂芳基，选自噻吩-2-基或吡啶-2-基。
在式(I)的化合物的另一种实施方式中，R7为杂芳基，选自吡啶-2-基。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，所述化合物选自式(Ia)：
或其形式。
在式(Ia)的化合物的另一种实施方式中，所述化合物选自式(Ia1)或式(Ia2)：
或其形式。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，所述化合物选自式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)：
或其形式。
在式(II)、式(III)、式(IV)和式(V)的化合物的另一种实施方式中，所述化合物分别选自式(IIa)、式(IIIa)、式(IVa)和式(Va)：
或其形式。
在式(IIa)的化合物的另一种实施方式中，所述化合物选自式(IIa1)或式(IIa2)：
或其形式。
在式(IIa)的化合物的另一种实施方式中，所述化合物选自式(IIIa1)或式(IIIa2)：
或其形式。
在式(IVa)的化合物的另一种实施方式中，所述化合物选自式(IVa1)或式(IVa2)：：
或其形式。
在式(Va)的化合物的另一种实施方式中，所述化合物选自式(Va1)或式(Va2)：
或其形式。
在式(I)的化合物的一种实施方式中，所述化合物选自：
或其形式。
术语
除非另外特别地定义，否则本领域普通技术人员应当理解，上文和整个本文说明书中使用的化学术语具有下述指定的含义。
如本文使用的术语“C1-8烷基”一般指在直链或支链构型中具有1至8个碳原子的饱和烃基团，包括、但不限于甲基、乙基、正-丙基(也称为丙基或丙烷基)、异丙基、正丁基(也称为丁基或丁烷基)、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、正-戊基(也称为戊基或戊烷基)、正己基(也称为己基或己烷基)、正-庚基(也称为庚基或庚烷基)、正-辛基等。在某些实施方式中，C1-8烷基包括但不限于C1-6烷基、C1-4烷基等。C1-8烷基基团任选地被如本文所述的取代基种类所取代(在可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“C2-8链烯基”一般指在直链支链构型中具有2至8个碳原子和其中的一个或多个碳-碳双键的部分不饱和烃基团，包括，但不限于乙烯基(ethenyl)(也称为乙烯基(vinyl))、烯丙基、丙烯基等。在某些实施方式中，C2-8链烯基包括，但不限于C2-6链烯基、C2-4链烯基等。C2-8链烯基基团任选地被如本文所述的取代基种类所取代(在可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“C2-8炔基″一般指在直链支链构型中具有2至8个碳原子和其中的一个或多个碳-碳三键的部分不饱和烃基团，包括，但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基等。在某些实施方式中，C2-8炔基包括，但不限于C2-6炔基、C2-4炔基等。C2-8炔基基团任选地被如本文所述的取代基种类所取代(在可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“C1-8烷氧基”一般指在直链或支链构型中具有1至8个碳原子的饱和烃基团，其具有式：-O-C1-8烷基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、正-丁氧基、异丁氧基、仲-丁氧基、叔-丁氧基、正-戊氧基、正-己氧基等。在某些实施方式中，C1-8烷氧基包括，但不限于C1-6烷氧基、C1-4烷氧基等。C1-8烷氧基基团任选地被如本文所述的取代基种类所取代(当可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“C3-14环烷基”一般指饱和的或部分不饱和的单环、二环或多环烃基团，包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、1H-茚满基、茚基、四氢-萘基等。在某些实施方式中，C3-14环烷基包括，但不限于C3-8环烷基、C5-8环烷基、C3-10环烷基等。C3-14环烷基基团任选地被如本文所述的取代基种类所取代(当可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“芳基”一般指单环、二环或多环芳碳原子环结构基团，包括但不限于苯基、萘基、蒽基、芴基、薁基、菲基等。芳基任选地被如本文所述的取代基种类所取代(当可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“杂芳基”一般指单环、二环或多环芳碳原子环结构基团，其中在结构稳定性允许的情况下，一个或多个碳原子环成员已经被一个或多个杂原子(例如O、S或N原子)取代，包括但不限于，呋喃基(furanyl)(呋喃基(furyl))、噻吩基(也称为硫代苯基)、吡咯基、2H-吡咯基、3H-吡咯基、吡唑基、1H-吡唑基、咪唑基、1H-咪唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁唑基、1，3-噻唑基、***基(例如1H-1，2，3-***基等)、噁二唑基(例如1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基等)、噻二唑基、四唑基(例如1H-四唑基、2H-四唑基等)、吡啶基(也称为吡啶基)、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、吲哚基、1H-吲哚基、吲唑基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲嗪基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(也称为苯并硫代苯基)、苯并咪唑基、1H-苯并咪唑基、1，3-苯并噻唑基、1，3-苯并噁唑基(benzotxazolyl)(也称为1，3-苯并噁唑基(benzooxazolyl))、嘌呤基、9H-嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、1，3-二嗪基、1，2-二嗪基、1，2-二唑基、1，4-二氮杂萘基、吖啶基、呋喃并[3，2-b]吡啶基、呋喃并[3，2-c]吡啶基、呋喃并[2，3-c]吡啶基、6H-噻吩并[2，3-b]吡咯基、噻吩并[3，2-c]吡啶基、噻吩并[2，3-d]嘧啶基、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶基、1H-吡咯并[2，3-c]吡啶基、1H-吡咯并[3，2-b]吡啶基、吡咯并[1，2-a]吡嗪基、吡咯并[1，2-b]哒嗪基、吡唑并[1，5-a]吡啶基、吡唑并[1，5-a]吡嗪基、咪唑并[1，2-a]吡啶基、3H-咪唑并[4，5-b]吡啶基、咪唑并[1，2-a]嘧啶基、咪唑并[1，2-c]嘧啶基、咪唑并[1，2-b]哒嗪基、咪唑并[1，2-a]吡嗪基、咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑基、咪唑并[2，1-b][1，3，4]噻二唑基、[1，2，4]***[1，5-a]吡啶基、[1，2，4]***[4，3-a]吡啶基等。在可用化合价允许的情况下，杂芳基基团在碳或氮原子环成员上任选地被如本文所述的取代基种类取代。
如本文使用的术语“杂环基”一般是指饱和的或部分不饱和的单环、二环或多环碳原子环结构基团，其中在结构稳定性允许的情况下，一个或多个碳原子环成员已经被杂原子例如O、S或N原子取代，包括但不限于环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、异噻唑啉基、异噻唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、***啉基、***烷基、噁二唑啉基、噁二唑烷基、噻二唑啉基、噻二唑烷基、四唑啉基、四唑烷基、吡喃基、二氢-2H-吡喃基、噻喃基、1，3-二噁烷基、1，2，5，6-四氢吡啶基、1，2，3，6-四氢吡啶基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1，4-二氮杂环庚烷基、1，3-苯并二氧杂环戊烯基(也称为苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯基)、1，4-苯并二噁烷基、2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基(也称为2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧杂环己烯基)、六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(1H)-基、(3aS，6aS)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(1H)-基、(3aR，6aR)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(1H)-基、四氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(2H)-基、(3aS，6aS)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(2H)-基、(3aR，6aR)-六氢吡咯并[3，4-b]吡咯-(2H)-基、四氢吡咯并[3，4-c]吡咯-(1H)-基、(3aR，6aS)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-(1H)-基、(3aR，6aR)-六氢吡咯并[3，4-c]吡咯-(1H)-基、八氢-5H-吡咯并[3，2-c]吡啶基、八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶基、(4aR，7aR)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶基、(4aS，7aS)-八氢-6H-吡咯并[3，4-b]吡啶基、六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(7R，8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aR)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aS)-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、(8aR)-八氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(1H)-基、四氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-(2H)-酮、八氢-2H-吡啶并[1，2-a]吡嗪基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、(1R，5S)-3-氮杂双环[3.1.0]己基、8-氮杂双环[3.2.1]辛基、(1R，5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛基、8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯基、(1R，5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛-2-烯基、9-氮杂双环[3.3.1]壬基、(1R，5S)-9-氮杂双环[3.3.1]壬基、2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、(1S，4S)-2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、2，5-二氮杂双环[2.2.2]辛基、3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛基、(1R，5S)-3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛基、1，4-二氮杂双环[3.2.2]壬基、氮杂螺[3.3]庚基、2，6-二氮杂螺[3.3]庚基、2，7-二氮杂螺[3.5]壬基、5，8-二氮杂螺[3.5]壬基、2，7-二氮杂螺[4.4]壬基、6，9-二氮杂螺[4.5]癸基等。在可用化合价允许的情况下，杂环基基团在碳或氮原子环成员上任选地被如本文所述的取代基种类取代。
如本文使用的术语“C1-8烷氧基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-O-C1-8烷基。
如本文使用的术语“C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-O-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-O-C1-8烷基)2.
如本文使用的术语“C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-O-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-N(C1-8烷基-O-C1-8烷基)2.
如本文使用的术语“(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-O-C1-8烷基).
如本文使用的术语“C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-O-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基-O-C1-8烷基)2.
如本文使用的术语“(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-O-C1-8烷基).
如本文使用的术语“C1-8烷氧基-羰基”指下式的基团：-C(O)-O-C1-8烷基。
如本文使用的术语“C1-8烷氧基-羰基-C2-8链烯基”指下式的基团：-C2-8链烯基-C(O)-O-C1-8烷基。
如本文使用的术语“C1-8烷氧基-羰基-氨基”指下式的基团：-NH-C(O)-O-C1-8烷基。
如本文使用的术语“C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)2.
如本文使用的术语“C1-8烷基-氨基-C2-8链烯基”指下式的基团：-C2-8链烯基-NH-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷基)2-氨基-C2-8链烯基”指下式的基团：-C2-8链烯基-N(C1-8烷基)2。
如本文使用的术语“C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-NH-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-N(C1-8烷基)2。
如本文使用的术语“C1-8烷基-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基)2。
如本文使用的术语“C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-NH-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-N(C1-8烷基)2。
如本文使用的术语“(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-NH-C1-8烷基)2。
如本文使用的术语“[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基]2-氨基”指下式的基团：-N[C1-8烷基-N(C1-8烷基)2]2。
如本文使用的术语“(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-NH-C1-8烷基)。
如本文使用的术语“[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)[C1-8烷基-N(C1-8烷基)2]。
如本文使用的术语“C1-8烷基-氨基-C2-8炔基”指下式的基团：-C2-8炔基-NH-C1-8烷基。
如本文使用的术语“(C1-8烷基)2-氨基-C2-8炔基”指下式的基团：-C2-8炔基-N(C1-8烷基)2。
如本文使用的术语“C1-8烷基-羰基”指下式的基团：-C(O)-C1-8烷基。
如本文使用的术语“C1-8烷基-羰基-氨基”指下式的基团：-NH-C(O)-C1-8烷基。
如本文使用的术语“C1-8烷基-硫代”指下式的基团：-S-C1-8烷基。
如本文使用的术语“氨基-C2-8链烯基”指下式的基团：-C2-8链烯基-NH2。
如本文使用的术语“氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-NH2。
如本文使用的术语“氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH2。
如本文使用的术语“氨基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-NH2。
如本文使用的术语“(氨基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-NH2)2。
如本文使用的术语“(氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-NH2)。
如本文使用的术语“氨基-C2-8炔基”指下式的基团：-C2-8炔基-NH2。
如本文使用的术语“芳基-C1-8烷氧基-羰基”指下式的基团：-C(O)-O-C1-8烷基-芳基。
如本文使用的术语“芳基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-芳基。
如本文使用的术语“芳基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-芳基。
如本文使用的术语“(芳基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-芳基)2。
如本文使用的术语“(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-芳基)。
如本文使用的术语“芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-芳基。
如本文使用的术语“(芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基-芳基)2。
如本文使用的术语“(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-芳基)。
如本文使用的术语“芳基-氨基”指下式的基团：-NH-芳基。
如本文使用的术语“芳基-氨基-羰基”指下式的基团：-C(O)-NH-芳基。
如本文使用的术语“芳基-磺酰氧基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-O-SO2-芳基。
如本文使用的术语“苯甲酰氧基-羰基”指下式的基团：-C(O)O-CH2-苯基。
如本文使用的术语“C3-14环烷基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-C3-14环烷基。
如本文使用的术语“C3-14环烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C3-14环烷基。
如本文使用的术语“C3-14环烷基-氧基”指下式的基团：-O-C3-14环烷基。
如本文使用的术语“卤代”或“卤素”一般指卤素原子基团，包括氟、氯、溴和碘。
如本文使用的术语“卤代-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-卤代，其中C1-8烷基部分或完全地被一个或多个卤素原子取代(在可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“卤代-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-卤代，其中C1-8烷基部分或完全地被一个或多个卤素原子取代(在可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“卤代-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-卤代。
如本文使用的术语“(卤代-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-卤代)。
如本文使用的术语“(卤代-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-卤代)2。
如本文使用的术语“杂芳基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-杂芳基。
如本文使用的术语“杂芳基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-杂芳基。
如本文使用的术语“杂芳基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-杂芳基。
如本文使用的术语“(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-杂芳基)2。
如本文使用的术语“(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-杂芳基).
如本文使用的术语“杂芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-杂芳基。
如本文使用的术语“(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基-杂芳基)2。
如本文使用的术语“(杂芳基-C1-8烷基(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-杂芳基)。
如本文使用的术语“杂芳基-氨基”指下式的基团：-NH-杂芳基。
如本文使用的术语“杂环基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-杂环基。
如本文使用的术语“杂环基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-杂环基。
如本文使用的术语“杂环基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-杂环基。
如本文使用的术语“(杂环基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-杂环基)2.
如本文使用的术语“(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-杂环基)。
如本文使用的术语“杂环基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-杂环基。
如本文使用的术语“(杂环基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基-杂环基)2。
如本文使用的术语“(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-杂环基)。
如本文使用的术语“杂环基-氨基”指下式的基团：-NH-杂环基。
如本文使用的术语“(杂环基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(杂环基)。
如本文使用的术语“杂环基-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH-杂环基。
如本文使用的术语“杂环基-羰基”指下式的基团：-C(O)-杂环基。
如本文使用的术语“杂环基-羰基-氧基”指下式的基团：-O-C(O)-杂环基。
如本文使用的术语“杂环基-氧基”指下式的基团：-O-杂环基。
如本文使用的术语“羟基”指下式的基团：-OH。
如本文使用的术语“羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-O-C1-8烷基-OH。
如本文使用的术语“羟基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-OH，其中C1-8烷基部分或完全地被一个或多个羟基基团取代(在可用化合价允许的情况下)。
如本文使用的术语“羟基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-OH。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-OH)2。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-OH)。
如本文使用的术语“羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-OH。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基-OH)2。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基”指下式的基团：-C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-OH)。
如本文使用的术语“羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-OH。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-N(C1-8烷基-OH)2。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基”指下式的基团：-O-C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-OH)。
如本文使用的术语“羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-NH-C1-8烷基-OH。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基-NH-C1-8烷基-OH)2。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-N(C1-8烷基-OH)2。
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-NH-C1-8烷基-OH)。
如本文使用的术语“[(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)[C1-8烷基-N(C1-8烷基-OH)2]
如本文使用的术语“(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基-氨基”指下式的基团：-NH-C1-8烷基-N(C1-8烷基，C1-8烷基-OH)。
如本文使用的术语“[(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基”指下式的基团：-N(C1-8烷基)[C1-8烷基-N(C1-8烷基)(C1-8烷基-OH)]。
如本文使用的术语“取代基”指位于核分子的原子上的位置变量，其连接于指定原子位置，替代指定原子上的一个或多个氢原子，条件是连接的原子不超过可用化合价或共用化合价，使得取代产生稳定的化合物。因此，只有当这样的组合产生稳定的化合物时，取代基和/或变量的组合才是可允许的。还应当注意，假定如本文所述或所示化合价水平看起来不饱和的任何碳以及杂原子具有足以满足所述或所示化合价的氢原子数量。
为了本说明书的目的，在式(I)的化合物的一个或多个取代基变量涵盖并入式(I)的化合物的官能团的情况下，出现在所公开化合物的任何位置的每个官能团可以独立地选择，并且根据需要独立地和/或任选地被取代。
如本文使用的，术语“独立地选择”或“各自选择”指在核分子的结构上可连接取代基列表中官能性变量，其中在每次出现时的取代模式与在其他任一次出现时的模式无关。进一步地，应当理解，在本文提供的化合物的核结构上使用一般取代基包括用特定种类之内所包括的特定取代基取代一般取代基，例如可以用苯基或萘基(naphthalenyl)(也称为萘基(naphthyl))等独立地替代芳基，使得所得到的化合物预期包括在本文所述化合物的范围之内。
如本文使用的术语“每种情况下的”当用于短语例如“芳基、芳基-C1-8烷基、杂环基和杂环基-C1-8烷基，其中每种情况下的芳基和杂环基任选地被一个或两个取代基取代”时，其预期包括每个芳基和杂环基环上及在芳基-C1-8烷基和杂环基-C1-8烷基的芳基和杂环基部分上的任选、独立地取代。
如本文使用的术语“任选地被取代”指指定的取代基变量、基团(groups)、基团(radicals)或部分代表种类的范围，且根据需要可以独立地选择以替代核分子上指定连接的原子上的一个或多个氢原子。
如本文使用的术语“稳定的化合物”或“稳定的结构”指足够稳固以使从反应混合物和其制剂分离有用的纯度而成为有效治疗剂的化合物。
本文提供的化合物名称是使用ACD Labs提供的ACD Labs Index Name软件和/或提供的ChemDraw Ultra软件。当本文所述化合物名称与所绘结构不一致时，则为了定义指定化合物，以所示结构为准，而不是使用所述名称为准。本文所定义取代基基团的命名法可能与其所来源的化学名称稍不同，本领域技术人员应当认识到取代基基团的定义预期包括如化学名称中存在的基团。
除非本文另有说明，否则术语“SMN”指人类SMN1基因、DNA或RNA、和/或人类SMN2基因、DNA或RNA。在一种具体实施方式中，术语“SMN1”指人类SMN1基因、DNA或RNA。在另一种具体实施方式中，术语“SMN2”指人类SMN2基因、DNA或RNA。
人类SMN1和SMN2基因的核酸序列是本领域已知的。关于人类SMN1的核酸序列，参见例如GenBank登记号DQ894095、NM_000344、NM_022874和BC062723。关于人类SMN2的核酸序列，参见例如NM_022875、NM_022876、NM_022877、NM_017411、DQ894734(LifeTechnologies、Inc.(formerly Invitrogen)、Carlsbad、Calif.)、BC000908、BC070242、CR595484、CR598529、CR609539、U21914和BC015308。
SMN1基因可以发现于人类染色体5的正链(forward strand)(从约核苷酸70,220,768至约核苷酸70,249,769)上。SMN1的外显子6、7和8和内含子6和7在人类染色体5上的大致位置如下：
70,241,893至70,242,003外显子6；
70,242,004至70,247,767内含子6；
70,247,768至70,247,821外显子7；
70,247,822至70,248,265内含子7；和
70,248,266至70,248,839外显子8。
SMN2基因可以发现于人类染色体5的正链(约核苷酸69,345,350至约核苷酸69,374,349)。
SMN2的外显子6、7和8和内含子6和7在人类染色体5上的大致位置如下：
69,366,468至69,366,578外显子6；
69,366,579至69,372,347内含子6；
69,372,348至69,372,401外显子7；
69,372,402至69,372,845内含子7；和
69,372,846至69,373,419外显子8。
在特定实施方式中，在本文所述SMN1小基因核酸构建物中使用对于SMN1的外显子6、7和8和内含子6和7所述核苷酸序列。在其他特定实施方式中，在本文所述SMN2小基因核酸构建物中使用上述提供的实例中SMN2的外显子6、7和8和内含子6和7的核苷酸序列。
除非本文另有说明，否则术语“Smn”或“Smn蛋白质”指由SMN1基因和/或SMN2基因的外显子1至7所编码的氨基酸残基的人类Smn蛋白质。在一种具体实施方式中，Smn蛋白质在体外和/或体内是稳定的及功能性的，如利用本领域技术人员已知的方法所评估的。在另一种具体实施方式中，Smn蛋白质是人类SMN1基因和/或SMN2基因编码的全长蛋白质。在另一种具体实施方式中，Smn蛋白质具有在以GenBank登录号NP_000335、AAC50473.1、AAA66242.1或NP_059107发现的氨基酸序列。
除非本文另有说明，否则如本文使用的术语“增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中”及类似术语指如通过本领域技术人员已知的方法评估的，在体外和/或体内将SMN2的外显子7的全部、完整的、非截短序列包含到从SMN2基因转录的成熟mRNA中(即，使得产生全长SMN2mRNA)，使得在体外和/或体内由SMN2基因产生Smn蛋白质的水平增加，如通过本领域技术人员已知的方法评估的；或者，使得在体外和/或体内由SMN2基因产生稳定的和功能性Smn蛋白质的表达增加，如通过本领域技术人员已知的方法评估的；或者，使得小基因编码的融合蛋白的表达在体外和/或体内增加，如通过本领域技术人员已知的方法评估的；或者，使得需要其的受试者(例如，SMA的动物模型或人类患者或SMA患者)中由SMN2基因产生的Smn蛋白质的表达增加。
除非本文另有说明，否则如本文使用的术语“增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中”及类似术语指如通过本领域技术人员已知的方法评估的，在体外和/或体内将SMN1的外显子7的全部、完整的、非截短序列包含到从SMN1基因转录的成熟mRNA中(即，使得产生全长SMN1mRNA)，使得在体外和/或体内从SMN1基因产生Smn蛋白质的水平增加，通过本领域技术人员已知的方法评估的；或者，使得在体外和/或体内由SMN1基因产生稳定的和功能性Smn蛋白质的表达增加，如通过本领域技术人员已知的方法评估的；或者，使得小基因编码的融合蛋白的表达在体外和/或体内增加，如通过本领域技术人员已知的方法评估的；或者，使得需要其的受试者(例如，SMA的动物模型或人类患者或SMA患者)中由SMN1基因产生的Smn蛋白质的表达增加。
如本文在mRNA的量的上下文中使用的术语“实质性改变”指mRNA的量的变化没有超过统计学显著的量，例如，p值小于选自0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001的值。
如本文使用的术语“受试者”和“患者”可互换地用于指具有自主运动的感觉和力量的动物或任何活生物，其存在需要氧和有机食物。非限制性实例包括人类、马、猪科、牛类、鼠属、鼠科、犬科和猫科物种的成员。在某些实施方式中，受试者为哺乳动物或温血脊椎动物。在某些实施方式中，受试者为非人类动物。在特定实施方式中，受试者为人类。在一种具体实施方式中，受试者为人类SMA患者。
如本文使用的术语“老年人”指65岁或以上的人。
如本文使用的术语“成年人”指18岁或以上的人。
如本文使用的术语“儿童”指1岁至18岁的人。
如本文使用的术语“婴儿”指新生儿至1岁的人。
如本文使用的术语“幼儿”指1岁至3岁的人。
化合物形式
如本文使用的术语“式(Ia)的化合物”、“式(Ia1)的化合物”、“式(Ia2)的化合物”、“式(II)的化合物“、“式(IIa)的化合物”、“式(IIa1)的化合物”、“式(IIa2)的化合物”、“式(III)的化合物”、“式(IIIa)的化合物”、“式(IIIa1)的化合物”、“式(IIIa2)的化合物”、“式(IV)的化合物”、“式(IVa)的化合物”、“式(IVa1)的化合物”、“式(IVa2)的化合物”、“式(V)的化合物”、“式(Va)的化合物”、“式(Va1)的化合物”和“式(Va2)的化合物”各自指式(I)的化合物或其形式的亚类，且如本文定义的。
不通于式(I)的化合物的不同亚类的重复实施方式，在某些实施方式中，术语“式(I)的化合物或其形式”用于包含性地分别或合起来指式(Ia)的化合物或其形式、式(Ia1)的化合物或其形式、式(Ia2)的化合物或其形式、式(II)的化合物或其形式、式(IIa)的化合物或其形式、式(IIa1)的化合物或其形式、式(IIa2)的化合物或其形式、式(III)的化合物或其形式、式(IIIa)的化合物或其形式、式(IIIa1)的化合物或其形式、式(IIIa2)的化合物或其形式、式(IV)的化合物或其形式、式(IVa)的化合物或其形式、式(IVa1)的化合物或其形式、式(IVa2)的化合物或其形式、“式(V)的化合物或其形式”、“式(Va)的化合物或其形式”、“式(Va1)的化合物或其形式”和“式(Va2)的化合物或其形式”。
因此，提及“式(I)的化合物”的实施方式预期包括下式的化合物：式(Ia)、式(Ia1)、式(Ia2)、式(II)、式(IIa)、式(IIa1)、式(IIa2)、式(III)、式(IIIa)、式(IIIa1)、式(IIIa2)、式(IV)、式(IVa)、式(IVa1)、式(IVa2)、式(V)、式(Va)、式(Va1)和式(Va2).
如本文使用的术语“形式”指式(I)的化合物选自其游离酸、游离碱、盐、同位素体、立体异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或互变异构体。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式选自其盐、同位素体、立体异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或互变异构体。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式选自其游离酸、同位素体、立体异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或互变异构体。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式选自其游离碱、同位素体、立体异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或互变异构体。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式为其游离酸、游离碱或盐。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式为其同位素体。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式为其立体异构体、外消旋体、对映异构体或非对映异构体。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式为其互变异构体。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物的形式为可药用形式。
在本文所述某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式是分离后使用。
如本文使用的术语“分离的”指根据本文描述的或本领域技术人员熟知的一种或多种分离或纯化方法(例如，色谱、重结晶等)从合成过程(例如，从反应混合物)或天然来源或其组合分离和/或纯化至足以通过本文描述的或本领域技术人员熟知的标准分析技术表征的纯度之后式(I)的化合物或其形式的物理状态。
如本文使用的术语“保护的”指式(I)的化合物上的官能团呈修饰的形式，以便当该化合物进行反应时防止在保护位点发生不期望的副反应。合适的保护基是本领域普通技术人员参考以下标准教科书可识别的：例如例如T.W.Greene et al，Protective Groupsin Organic Synthesis(1991)，Wiley，New York。
本文也涵盖式(I)的化合物或其形式的前药。
如本文使用的术语“前药”指式(I)的化合物上的官能团呈在体内转化可产生活性或更强活性的式(I)的化合物或其形式的形式(例如，充当活性或非活性药物前体)。转化可以通过不同的机制(例如，代谢性和/或非代谢性化学过程)发生，例如例如通过在血液、肝脏和/或其他器官和组织中的水解和/或代谢。前药用途的论述提供于V.J.Stella等人，“Biotechnology：Pharmaceutical Aspects，Prodrugs：Challenges and Rewards，”American Association of Pharmaceutical Scientists and Springer Press，2007中。
在一个实例中，当式(I)的化合物或其形式包含羧酸官能团时，前药可以包括通过用官能团例如烷基等替代酸基的氢原子形成的酯。在另一个实例中，当式(I)的化合物或其形式包含醇官能团时，前药可以通过用官能团例如烷基或取代的羰基等替代醇基的氢原子形成。在另一个实例中，当式(I)的化合物或其形式包含胺官能团时，前药可以通过用官能团例如烷基或取代的羰基一个或多个胺氢原子形成。在另一个实例中，当式(I)的化合物或其形式包含氢取代基时，前药可以通过用烷基取代基替代一个或多个氢原子形成。
式(I)的化合物或其形式的可药用前药包括用一种或多种下述基团取代的那些化合物：羧酸酯、磺酸酯、-氨基酸酯、膦酸酯、单磷酸酯、二磷酸酯、或三磷酸酯或烷基取代基(当合适时)。如本文所述，本领域普通技术人员应当理解一种或多种这样的取代基可用于提供用作前药的式(I)的化合物或其形式。
式(I)的化合物可以形成预期包括在本说明书的范围内的盐。除非另有说明，否则本文提及式(I)的化合物理解为包括提及其盐。如本文使用的术语“盐”指与无机酸和/或有机酸形成的酸性盐，以及与无机碱和/或有机碱形成的碱性盐。另外，当式(I)的化合物同时包含碱性部分，例如但不限于吡啶或咪唑，和酸性部分例如但不限于羧酸时，可以形成两性离子(″内盐″)且其包括在如本文使用的术语“盐”之内。
如本文使用的术语“可药用盐”指本文所述化合物的那些盐，其安全有效地(即，无毒、生理学可接受的)用于哺乳动物且具有生物活性，但是其他盐也是有用的。式(I)的化合物的盐可如下形成，例如使式(I)的化合物与一定量(例如一当量或化学计量的量)的酸或碱在介质(例如其中盐沉淀的介质或水介质中)反应，接着冷冻干燥。
可药用盐包括本文所述化合物中存在的酸性或碱性基团的一种或多种盐。酸加成盐的实施方式包括且不限于乙酸盐、酸式磷酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、氯化物、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、龙胆酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐(glucaronate)、谷氨酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、二盐酸盐、氢碘酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐、丙酸盐、糖酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫代氰酸盐、甲苯磺酸盐(也称为甲苯磺酸盐)、三氟醋酸盐等。酸加成盐的一种或多种实施方式包括氯化物、盐酸盐、二盐酸盐、三盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、双醋酸盐或三氟醋酸盐。更特别的实施方式包括氯化物、盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐或三氟醋酸盐。
另外，通常考虑适用于从碱性药物化合物形成药学有用的盐的酸论述于例如P.Stahl et al，Camille G.(eds.)Handbook of Pharmaceutical Salts.Properties，Selection and Use.(2002)Zurich：Wiley-VCH；S.Berge等人，Journal ofPharmaceutical Sciences(1977)66(1)1-19；P.Gould，International J.ofPharmaceutics(1986)33，201-217；Anderson et al，The Practice of MedicinalChemistry(1996)，Academic Press，New York；和The Orange Book(参见Food&DrugAdministration网站，Washington，D.C.)中。将这些内容通过引用并入本文中。
合适的碱性盐包括，但不限于铝盐、铵盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、锌盐和二乙醇胺盐。本文所述某些化合物也可以与有机碱(例如，有机胺，例如但不限于二环己胺、叔丁基胺等)形成可药用盐，且与不同氨基酸(例如但不限于精氨酸、赖氨酸等)形成可药用盐。含碱性氮的基团可以用如下这样的试剂季铵化：例如低级烷基卤化物(例如、甲基、乙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸酯(例如，二甲基、二乙基和二丁基硫酸酯)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基和十八烷酰基氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤化物(例如，苯甲基和苯乙基溴化物)等。
所有这样的酸性盐和碱性盐预期都为本文说明书的范围内的可药用盐，并且所有这样的酸性盐和碱性盐都被认为等效于用于本文所述目的的相应化合物的游离形式。
式I的化合物及其形式可以进一步以互变异构形式存在。所有这样的互变异构形式在本文中都预期作为本发明说明书的一部分。
式(I)的化合物可以包含不对称或手性中心，因此，可以以不同的立体异构形式存在。本说明书预期包括式(I)的化合物的所有立体异构形式以及其混合物，包括外消旋混合物。
本文所述式(I)的化合物可以包括一个或多个手性中心，因此可以呈外消旋混合物(R/S)或基本上纯的对映异构体和非对映异构体存在。所述化合物也可以呈基本上纯的(R)或(S)对映异构体(当存在一个手性中心时)存在。在一种实施方式中，本文所述式(I)的化合物为(S)异构体，并且可以呈基本上仅包含(S)异构体的对映异构体纯的组合物存在。在另一种实施方式中，本文所述式(I)的化合物为(R)异构体，且可以呈基本上仅包含(R)异构体的对映异构体纯的组合物存在。如本领域技术人员将认识到的，当存在多于一个手性中心时，本文所述式(I)的化合物也可包括以(R，R)、(R，S)、(S，R)或(S，S)异构体描述的部分，如根据IUPAC命名建议(iUPAC Nomenclature Recommendations)所定义的。
如本文使用的术语“基本上纯的”指化合物基本上由如下量的单一异构体组成：大于或等于90％的量、大于或等于92％％的量、大于或等于95％％的量、大于或等于98％％的量、大于或等于99％％的量、或大于或等于100％的量的单一异构体。
在一个方面，式(I)的化合物为基本上纯的(S)对映异构体，其存在量为大于或等于90％、大于或等于92％、大于或等于95％、大于或等于98％、大于或等于99％、或等于100％。
在一个方面，式(I)的化合物为基本上纯的(R)对映异构体，其存在量为大于或等于90％、大于或等于92％、大于或等于95％、大于或等于98％、大于或等于99％、或等于100％。
如本文使用的“外消旋体”为不为“对映异构体纯的”异构体形式(isometricforms)的任何混合物，包括例如且不限于下述比例的混合物：约50/50、约60/40、约70/30、约80/20、约85/15或约90/10。
另外，本说明书涵盖所有几何异构体和位置异构体。例如，如果式(I)的化合物引入双键或稠环，则顺式-和反式-形式、以及混合物都涵盖在本文说明书的范围之内。
非对映异构体混合物可以基于其物理化学差异，通过本领域技术人员熟知的方法例如例如色谱和/或分步结晶分离成其单独的非对映异构体。可以通过使用手性HPLC柱或本领域技术人员已知的其他色谱方法分离对映异构体。
可如下分离对映异构体：通过与合适的光学活性化合物(例如手性助剂，例如手性醇或马绍耳(Mosher′s)酰基氯)反应将对映异构体混合物转化为非对映异构体混合物，分离非对映异构体，并且将单独非对映异构体转化(例如水解)为相应的纯对映异构体。而且，一些式(I)的化合物可以是阻转异构体(例如，取代的二芳基)，且被认为是该说明书的一部分。
本发明化合物(包括其盐、溶剂化物、酯和前药及已转化的前药)的所有立体异构体形式(例如，几何学异构体、光学异构体、位置异构体等)，其可以由于各个取代基上的不对称碳而存在，包括对映异构体形式(其甚至可以在不存在不对称碳下存在)、旋转异构形式、阻转异构体、非对映异构体形式和区域异构体形式预期都在本说明书的范围之内。例如，如果式(I)的化合物引入双键或稠环，则顺式-和反式-形式、以及其混合物都涵盖在本文说明书的范围之内。而且，例如，所述化合物的所有酮-烯醇和亚胺-烯胺互变异构形式都包括在本说明书中。本文所述式(I)的化合物的单独的立体异构体可以例如基本上不含其他异构体，或者以外消旋混合物存在，如上所述。
使用术语“盐”、“前药”和“转化的前药”预期同样适用于本发明化合物的所有预期的同位素体、立体异构体、外消旋体或互变异构体的盐、前药和转化的前药。
术语“同位素体”指同位素-富集的化合物，其与本文所列举的化合物相同，但是一个或多个原子已经被具有原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子所替代。可并入本文所述化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟及氯的同位素，例如分别为H2、H3、C13、C14、N15、O18、O17、P31、P32、S35、F18、Cl35和Cl36，其中每个都在本说明书的范围之内。
本文所述的某些同位素-富集的化合物(例如，用H3和C14标记的那些)用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化的(即，H3)和碳-14(即，C14)同位素因其容易制备和检测能力是特别优选的。此外，用较重同位素(例如氘(即，“氘富集的”)取代可提供某些由更高的代谢稳定性所产生的治疗优点(例如，体内半衰期增加或剂量需求降低)，且因此在一些情况下可以是优选的。式(I)的同位素-富集的化合物通常可以使用本领域普通技术人员已知的方法，通过用合适的同位素-富集的试剂代替非同位素-富集的试剂来制备。
当化合物富集氘时，分子的氘代原子上氘与氢的比例基本上超过天然存在的氘与氢的比例。
本文所述实施方式可以包括式(I)的化合物的同位素体形式，其中同位素体在式(I)的化合物的一个或多个原子成员上被一个或多个氘原子代替一个或多个氢原子所取代。
本文所述一种实施方式可以包括式(I)的化合物和其形式，其中碳原子可以具有1至3个任选地被氘替代的氢原子。
本文所述的一种或多种化合物可以以非溶剂化形式以及与可药用溶剂例如水、乙醇等形成的溶剂化形式存在，并且本文说明书预期同时涵盖溶剂化形式和非溶剂化形式。
如本文使用的术语“溶剂化物”指本文所述化合物与一种或多种溶剂分子的物理结合。该物理结合包括不同程度的离子键合和共价键合，包括氢键键合。在某些情况下，能够分离出溶剂化物，例如当一个或多个溶剂分子并入结晶固体的晶格中时。如本文使用的“溶剂化物”同时涵盖溶液相和可分离的溶剂化物。合适的溶剂化物的非限制性实例包括乙醇化物、甲醇化物等。
一种或多种本文所述化合物可以任选地转化为溶剂化物。溶剂化物的制备通常是已知的。一种典型的、非限制性方法包括在高于环境温度下，将化合物溶于期望量的期望溶剂(有机溶剂或水或其混合物)中，并以足以形成晶体的速率冷却该溶液，然后通过标准方法分离。分析技术例如例如红外光谱，显示在呈溶剂化物(或水合物)的晶体中存在溶剂(或水)。
如本文使用的术语“水合物”指其中溶剂分子为水的溶剂化物。
式(I)的化合物、以及式(I)的化合物的盐、溶剂化物、酯和前药的多晶型结晶形式和非晶形形式进一步预期包括在本文所述化合物的范围之内。
化合物用途
本文描述了增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的式(I)的化合物或其形式。使用本文所述的测定(参见，生物学实施例部分，如下)，这样的式(I)的化合物或其形式已经显示出增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。因此，式(I)的化合物或其形式用作将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的增强剂。
本文描述了用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中的式(I)的化合物或其形式。这样的式(I)的化合物可以增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中(使用利用SMN1小基因测定)。因此，式(I)的化合物或其形式可以用作将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中的增强剂。
在一个方面，本文提供了用于调节将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的RNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触。在一种具体实施方式中，本文提供了用于调节将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的RNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触，所述式(I)的化合物或其形式调节本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的SMN2小基因的表达，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种实施方式中，小基因为在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号的实施例中描述的小基因。在另一种实施方式中，小基因为如下生物学实施例1中描述的小基因。人类细胞可以与式(I)的化合物或其形式在体外和/或体内接触，例如在非人类动物或在人类中。在一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在另一种实施方式中，人类细胞为来自人类SMA患者的人类细胞。在某些实施方式中，人类细胞来自细胞系，例如GM03813、GM00232、GM09677和/或GM23240(可得自Coriell Institute)。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在一种具体实施方式中，本文提供了用于调节将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触。在另一种实施方式中，本文提供了用于增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触，所述式(I)的化合物或其形式增强本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的SMN2小基因的表达，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种实施方式中，小基因为在国际公开第WO2009/151546或美国专利申请公开第2011/0086833号的实施例中描述的小基因。在另一种实施方式中，小基因为如下生物学实施例1中描述的小基因。人类细胞可以与式(I)的化合物或其形式在体外和/或体内接触，例如在非人类动物或在人类中。在一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在另一种实施方式中，人类细胞为来自人类SMA患者的人类细胞。在某些实施方式中，人类细胞来自细胞系，例如GM03813、GM00232、GM09677和/或GM23240(可得自Coriell Institute)。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的RNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触。在一种具体实施方式中，本文提供了用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的RNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触。在另一种具体实施方式中，本文提供了用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的RNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触，所述式(I)的化合物或其形式增加本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的SMN1小基因表达，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种实施方式中，小基因为在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号的实施例中描述的小基因。人类细胞可以与式(I)的化合物或其形式在体外和/或体内接触，例如在非人类动物或在人类中。在一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在一种具体实施方式中，本文提供了用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1和SMN2基因转录的RNA中的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触。人类细胞可以与式(I)的化合物或其形式在体外和/或体内接触，例如在非人类动物或在人类中。在一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了一种用于调节将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的RNA中的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式。在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于调节将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的RNA中的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式，所述式(I)的化合物或其形式增强本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的SMN2小基因的表达，将其中全部内容通过引用并入本文。在一种实施方式中，小基因为在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号的实施例中描述的小基因。在另一种实施方式中，小基因为如下生物学实施例1中描述的小基因。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增加将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式。在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式，所述式(I)的化合物或其形式增强本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的SMN2小基因的表达，将其全部内容通过引用并入本文。在一种实施方式中，小基因为在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号的实施例中描述的小基因。在另一种实施方式中，小基因为如下生物学实施例1中描述的小基因。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了一种用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的RNA中的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式。在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的RNA中的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式，所述式(I)的化合物或其形式增强本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的SMN1小基因的表达，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种实施方式中，小基因为在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号的实施例中描述的小基因。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1和SMN2基因转录的RNA中的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了一种增加Smn蛋白质的量的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物或其形式接触。在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增加Smn蛋白质的量的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物接触，所述式(I)的化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增加Smn蛋白质的量的方法，包括使人类细胞与式(I)的化合物接触。所述式(I)的化合物增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中。人类细胞可以与式(I)的化合物或其形式在体外和/或体内接触，例如在非人类动物或在人类中。在一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中。在另一种具体实施方式中，人类细胞来自或在人类SMA患者中，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在另一种实施方式中，人类细胞为来自人类SMA患者的人类细胞。在某些实施方式中，人类细胞来自细胞系，如GM03813、GM00232、GM09677和/或GM23240(可得自Coriell Institute)。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了一种用于增加Smn蛋白质的量的方法，其包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物或其形式。在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增加Smn蛋白质的量的方法，包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物，在例如基于细胞或无细胞测定中，例如在如下生物学实施例中描述的，所述式(I)的化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于增加Smn蛋白质的量的方法，包括向非人类SMA动物模型施用式(I)的化合物，在例如基于细胞或无细胞测定中，所述式(I)的化合物增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中。
在一种实施方式中，式(I)的化合物增强本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的小基因的表达，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种具体实施方式中，式(I)的化合物增强本文中或国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号的实施例中描述的小基因的表达。在另一种具体实施方式中，式(I)的化合物增强如下生物学实施例1中描述的小基因的表达。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式在制备用于增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA的药物中的用途。在另一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式在制备用于增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA，从而在需要其的人类受试者中增强Smn蛋白质表达的药物中的用途。在一种具体实施方式中，在本文所述测定(参见，例如如下生物学实施例中)，式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式在制备用于增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA的药物中的用途。在另一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式在制备用于增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA，从而在需要其的人类受试者中增强Smn蛋白质表达的药物中的用途。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了在需要其的人类受试者中增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式。在一种具体实施方式中，本文提供了一种在需要其的人类受试者中增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量式(I)的化合物或其形式，如在本文所述测定(参见，例如如下生物学实施例中)中测定的，该式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在特定实施方式中，有效量的式(I)的化合物或其形式是以包含可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物施用于人类受试者。在特定实施方式中，在本文所述测定(参见，例如如下生物学实施例中)，式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在一种具体实施方式中，人类受试者为人类SMA患者。在另一种具体实施方式中，人类受试者为人类SMA患者，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了在需要其的人类受试者中增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中的方法，包括向所述人类受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式。在特定实施方式中，在国际公开第WO2009/151546号或号专利申请公开第2011/0086833号中描述的测定中，式(I)的化合物或其形式增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中。在特定实施方式中，有效量的式(I)的化合物或其形式是以包含可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物施用于人类受试者。在一种具体实施方式中，人类受试者为人类SMA患者。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了一种在需要其的人类受试者中增强将SMN1和SMN2的外显子7包含到从SMN1和SMN2基因转录的mRNA中的方法，其包括向该人类受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式。在特定实施方式中，在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号(参见，例如这些公开中的实施例)中描述的测定中，式(I)的化合物或其形式增强将SMN1的外显子7包含到从SMN1基因转录的mRNA中，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在特定实施方式中，有效量的式(I)的化合物或其形式是以包含可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物施用于人类受试者。在一种具体实施方式中，人类受试者为人类SMA患者。在另一种具体实施方式中，人类受试者为人类SMA患者，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了在需要其的人类受试者中增强Smn蛋白质的表达的方法，包括向所述人类受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式。在一种具体实施方式中，本文提供了一种在需要其的人类受试者中增强Smn蛋白质表达的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式，该式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在另一种具体实施方式中，本文提供了一种在需要其的人类受试者中增强Smn蛋白质表达的方法，其包括向所述人类受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式，该式(I)的化合物或其形式增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中。在特定实施方式中，有效量的式(I)的化合物或其形式是以包含可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物施用于人类受试者。在特定实施方式中，在本文中(参见，例如如下生物学实施例)或在国际公开第WO2009/151546或美国专利申请公开第WO2009/0086833号(参见，例如这些公开中的实施例)中描述的测定中，式(I)的化合物或其形式增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。
在一种具体实施方式中，人类受试者为人类SMA患者。在另一种具体实施方式中，人类受试者为人类SMA患者，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因的teleomeric副本的失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式在制备在需要其的人类受试者中增强Smn蛋白质的表达的药物中的用途。在特定实施方式中，式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中，如在本文所述测定(参见，例如如下生物学实施例中)中测定的。在另一种实施方式中，在本文中(参见，例如如下生物学实施例)或在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第WO2009/0086833号(参见，例如这些公开中的实施例)中描述的测定中测定的，式(I)的化合物或其形式增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一个方面，本文提供了用于治疗脊髓性肌萎缩(SMA)的方法，包括向受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式。在一种具体实施方式中，本文提供了一种治疗需要其的人类受试者中的SMA的方法，其包括向所述受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式。在另一种具体实施方式中，本文提供了一种治疗需要其的人类受试者中的SMA的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的式(I)的化合物或其形式、及可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在一种实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一种实施方式中，本文提供了一种治疗需要其的人类受试者中的SMA的方法，其包括向所述受试者施用有效量的式(I)的化合物或其形式，所述式(I)的化合物或其形式增强将smn2的外显子7包含到从smn2基因转录的mRNA中。。在一种具体实施方式中，本文提供了一种治疗需要其的人类受试者中的SMA的方法，包括向所述受试者施用包含有效量的式(I)的化合物或其形式、及可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物，所述式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在另一种具体实施方式中，本文提供了一种治疗需要其的人类受试者中的SMA的方法，包括向所述受试者施用包含有效量的式(I)的化合物或其形式、及可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物，所述式(I)的化合物或其形式增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中。在特定实施方式中，在本文描述的测定中(参见，例如如下生物学实施例)，式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在另一种实施方式中，在本文中(参见，例如如下生物学实施例)或在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第WO2009/0086833号(参见，例如这些公开中的实施例)中描述的测定中测定的，式(I)的化合物或其形式增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式。
在另一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式在制备治疗需要其的人类受试者中的SMA的药物中的用途。在特定实施方式中，如在本文描述的测定中测定的(参见，例如如下生物学实施例)，式(I)的化合物或其形式增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中。在另一种实施方式中，在本文中(参见，例如如下生物学实施例)或在国际公开第WO2009/151546号或美国专利申请公开第WO2009/0086833号(参见，例如这些公开中的实施例)中描述的测定中测定的，式(I)的化合物或其形式增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在一种具体实施方式中，化合物为式(I)的化合物或其形式.
在本文提供的用途或方法的一种实施方式中，式(I)的化合物或其形式与一种或多种另外的药剂组合使用。可以在向受试者施用另外的药剂或与细胞接触之前、同时或之后，将式(I)的化合物或其形式向受试者施用或与细胞接触。式(I)的化合物或其形式和另外的药剂可以在单一组合物或不同的组合物中向受试者施用或与细胞接触。在一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式与SMN1的基因置换(例如，使用病毒递送载体)组合使用。在另一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式与使用分化的SMN1+/+和/或SMN2+/+干细胞的细胞置换组合使用。在另一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式与使用分化的SMN1+/+干细胞的细胞置换组合使用。在另一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式与使用分化的SMN2+/+干细胞的细胞置换组合使用。在另一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式与阿柔比星组合使用。在另一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式与转录活化剂例如组蛋白脱乙酰酶(“HDAC”)抑制剂(例如，丁酸盐、丙戊酸和羟基脲)和mRNA稳定剂(例如，得自Repligen的mRNA去帽抑制剂)组合使用。
在一种实施方式中，本文提供了式(I)的化合物或其形式与支持疗法(包括呼吸性、营养性或康复性护理)组合的用途。
在一些实施方式中，用式(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA具有治疗效果和/或有益效果。在一种具体实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA产生一个、两个或多个下述效果：(i)降低或改善SMA的严重程度；(ii)延迟SMA发病；(iii)抑制SMA的进展；(iv)减少受试者的住院治疗；(v)减少的住院治疗时长；(vi)提高受试者的存活率；(vii)改善受试者的生活质量；(viii)减少与SMA有关的症状数量；(ix)降低或改善与SMA有关的症状的严重程度；(x)与SMA有关的症状的持续时间；(xi)预防与SMA有关的症状的复发；(xii)抑制SMA的症状的发展或发作；和/或(xiii)抑制与SMA有关的症状的进展。
SMA的症状包括肌无力、肌张力差、无力叫喊、无力咳嗽、跛行或有倒下的倾向、吮吸或吞咽困难、呼吸困难、分泌物蓄积在肺或咽喉中、握拳伴手出汗、舌头颤动/振动、头经常向一侧倾斜(即使当躺下时)、腿倾向于弱于臂、腿频繁呈现“蛙腿”姿势、进食困难、对呼吸道感染的敏感性增加、肠/膀胱虚弱、低于正常体重、不能在无支撑下坐、不能行走、不能爬行和张力减退、无反射、和与前角细胞损失有关的多发性先天性挛缩(关节弯曲)。
在一种具体实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA产生一个、两个或多个下述效果：(i)肌肉力量损失减少；(ii)肌肉力量增强；(iii)肌肉萎缩减轻；(iv)运动功能损失减少；(v)运动神经元增加；(vii)运动神经元的损失减少；(viii)防止缺乏运动神经元的SMN退化；(ix)运动功能增强；(x)肺功能增强；和/或(xi)肺功能损失减少。
在另一种实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA使人类婴儿或人类学步的小孩产生坐起的功能能力或有助于保持该功能能力。在另一种实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA使人类婴儿、人类学步的小孩、人类儿童或成年人产生独立站起的功能能力或有助于保持该功能能力。在另一种实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA使人类婴儿、人类学步的小孩、人类儿童或成年人产生独立行走的功能能力或有助于保持该功能能力。在另一种实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA使人类婴儿、人类学步的小孩、人类儿童或成年人产生独立奔跑的功能能力或有助于保持该功能能力。在另一种实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA使人类婴儿、人类学步的小孩、人类儿童或成年人产生独立呼吸的功能能力或有助于保持该功能能力。在另一种实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA使人类婴儿、人类学步的小孩、人类儿童或成年人产生在睡眠期间独立翻身的功能能力或有助于保持该功能能力。在另一种实施方式中，用(I)的化合物或其形式(单独或与另外的药剂组合)治疗SMA使人类婴儿、人类学步的小孩、人类儿童或成年人产生独立吞咽的功能能力或有助于保持该功能能力。
在一些实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法，以确定式(I)的化合物或其形式是否增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中。在某些实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、8、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法，或如下所述药物或测定试剂盒，以监测患者对式(I)的化合物或其形式的反应。
在一种具体实施方式中，根据本文所述方法使用式(I)的化合物：
或其形式，其中：
w1为C-Rb或N；
w2和w6为C-R1或C-R2；
w3、w4和w5为C-Ra或N；
其中w2和w6中的一个为C-R1，另一个为C-R2，条件是，当w2为C-R1时，则w6为C-R2；或者，当w2C-R2时，则w6为C-R1；和
其中其余w1、w3、w4和w5的任一个、两个或三个可以同时为N；
R1为C1-8烷基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、(氨基-C1-8烷基)2-氨基、(氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、氨基-C2-8烯基、C1-8烷基-氨基-C2-8烯基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8烯基、氨基-C2-8炔基、C1-8烷基-氨基-C2-8炔基、(C1-8烷基)2-氨基-C2-8炔基、卤代-C1-8烷基-氨基、(卤代-C1-8烷基)2-氨基、(卤代-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷氧基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷氧基、羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基-氨基、[(羟基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、[(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、杂环基、杂环基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷氧基、杂环基-氨基、(杂环基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-氨基-C1-8烷基、杂环基-C1-8烷基-氨基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂环基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(杂环基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂环基-氧基、杂环基-羰基、杂环基-羰基-氧基、芳基-C1-8烷基-氨基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、(芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基、杂芳基、杂芳基-C1-8烷基、杂芳基-C1-8烷氧基、杂芳基-氨基、杂芳基-C1-8烷基-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基、(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、杂芳基-C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(杂芳基-C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基或(杂芳基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基-C1-8烷基；
其中每种情况下的杂环基和杂芳基任选地被一个、两个或三个R3取代基和一个另外任选的R4取代基取代；和
其中，可替代地，每种情况下的杂环基和杂芳基任选地被一个、两个、三个或四个R3取代基取代；
R2为芳基、芳基-氨基、芳基-氨基-羰基、杂环基、杂芳基或杂芳基-氨基；
其中，每种情况下的芳基、杂环基和杂芳基任选地被一个、两个或三个R6取代基和一个另外的任选的R7取代基取代；
Ra在每种情况下独立地选自氢、卤素或C1-8烷基；
Rb为氢、卤素、C1-8烷基或C1-8烷氧基；
R3在每种情况下独立地选自氰基、卤素、羟基、氧代、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷基-羰基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-羰基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基]2-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、C1-8烷基-羰基-氨基、C1-8烷氧基-羰基-氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基或(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基；
R4为C3-14环烷基、C3-14环烷基-C1-8烷基、C3-14环烷基-氨基、芳基-C1-8烷基、芳基-C1-8烷氧基-羰基、芳基-磺酰氧基-C1-8烷基、杂环基或杂环基-C1-8烷基；其中每种情况下的C3-14环烷基、芳基和杂环基任选地被一个、两个或三个R5取代基取代；
R5在每种情况下独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；
R6在每种情况下独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-8烷基、C2-8烯基、卤代-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；和
R7为C3-14环烷基、C3-14环烷基-氧基、芳基、杂环基或杂芳基。
在本文所述用途的一种实施方式中，式(I)的化合物为选自式(Ia)的化合物：
或其形式。
在本文所述用途的另一种实施方式中，式(I)的化合物为选自式(Ia1)或式(Ia2)的化合物：
或其形式。
在本文所述用途的一种实施方式中，式(I)的化合物为选自式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)的化合物：
或其形式。
在本文所述用途的另一种实施方式中，式(II)、式(III)、式(IV)和式(V)的化合物分别为选自式(IIa)、式(IIIa)、式(IVa)和式(Va)的化合物：
或其形式。
在本文所述用途的另一种实施方式中，式(IIa)的化合物为选自式(IIa1)或式(IIa2)的化合物：
或其形式。
在本文所述用途的另一种实施方式中，式(IIIa)的化合物为选自式(IIIa1)或式(IIIa2)的化合物：
或其形式。
在本文所述用途的另一种实施方式中，式(IVa)的化合物为选自式(IVa1)或式(IVa2)的化合物：
或其形式。
在本文所述用途的另一种实施方式中，式(Va)的化合物为选自式(Va1)或式(Va2)的化合物：
或其形式。
患者群体
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患有SMA的受试者。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式施用于易患或易感染SMA的受试者。在一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于人类受试者，其中所述人类受试者为人类SMA患者，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因的失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在一些实施方式中，在施用式(I)的化合物或其形式或其药物组合物之前，对人类受试者进行基因分型(genotyped)，以确定受试者是否具有两种染色体上的SMN1基因的teleomeric副本的失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失。在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患有0型SMA的受试者。在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患有1型SMA的受试者。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患有2型SMA的受试者。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患有3型SMA的受试者。在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患有4型SMA的受试者。
在一些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于将会或可能受益于增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中的受试者。在特定实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于将会或可能受益于增加Smn蛋白质表达的受试者。
在一些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于具有如下年龄范围的人类：约0个月至约6个月、约6至约12个月、约6至约18个月、约18至约36个月、约1至约5岁、约5至约10岁、约10至约15岁、约15至约20岁、约20至约25岁、约25至约30岁、约30至约35岁、约35至约40岁、约40至约45岁、约45至约50岁、约50至约55岁、约55至约60岁、约60至约65岁、约65至约70岁、约70至约75岁、约75至约80岁、约80至约85岁、约85至约90岁、约90至约95岁或约95至约100岁。
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于人类婴儿。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于人类学步的小孩。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于人类儿童。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于成年人。在仍然其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于老年人。
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。在其他实施方式中，将有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。在其他实施方式中，将预防有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。在其他实施方式中，将治疗有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于SMA患者以治疗或改善SMA。在其他实施方式中，将有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于SMA患者以治疗或改善SMA。在其他实施方式中，将预防有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于SMA患者以预防SMA的发展。在其他实施方式中，将治疗有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物组合物施用于SMA患者以治疗或改善SMA。
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于患有SMA的受试者。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式施用于易患或易感染SMA的受试者。在一种具体实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于人类受试者，其中所述人类受试者为人类SMA患者，其中SMA是由于两种染色体上的SMN1基因的失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。在一些实施方式中，在施用式(I)的化合物或其形式或其药物之前，对人类受试者进行基因分型，以确定受试者是否具有两种染色体上的SMN1基因的teleomeric副本的失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失。在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于患有0型SMA的受试者。在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于患有1型SMA的受试者。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于患有2型SMA的受试者。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于患有3型SMA的受试者。在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于患有4型SMA的受试者。
在一些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于将会或可能受益于增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中的受试者。在特定实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于将会或可能受益于增加Smn蛋白质表达的受试者。
在一些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于具有如下年龄范围的人：约0个月至约6个月、约6至约12个月、约6至约18个月、约18至约36个月、约1至约5岁、约5至约10岁、约10至约15岁、约15至约20岁、约20至约25岁、约25至约30岁、约30至约35岁、约35至约40岁、约40至约45岁、约45至约50岁、约50至约55岁、约55至约60岁、约60至约65岁、约65至约70岁、约70至约75岁、约75至约80岁、约80至约85岁、约85至约90岁、约90至约95岁或约95至约100岁。
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于人类婴儿。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于人类学步的小孩。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于人类儿童。在其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于成年人。在仍然其他实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于老年人。
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。在其他实施方式中，有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物施用于施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。在其他实施方式中，预防有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物施用于施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。在其他实施方式中，治疗有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物施用于施用于患者以预防处于发展为SMA的风险中的患者中SMA的发病。
在某些实施方式中，式(I)的化合物或其形式或其药物施用于SMA患者以治疗或改善SMA。在其他实施方式中，有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物施用于SMA患者以治疗或改善SMA。在其他实施方式中，预防有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物施用于SMA患者以预防SMA的发展。在其他实施方式中，治疗有效量的式(I)的化合物或其形式或其药物施用于SMA患者以治疗或改善SMA。
施用方式
当施用于患者时，式(I)的化合物或其形式is优选地作为组合物的组分施用，该组合物任选地包含可药用载体、赋形剂或稀释剂。该组合物可以口服施用，或者通过任何其他方便的途径，例如输注或快速推注，经由上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜)吸收，并且可以与另外的生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。各种递送***是已知的，例如包囊在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊中，并且可以用于施用所述化合物。
施用方法包括但不限于肠胃外、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、经口、舌下、鼻内、脑内、***内、透皮、直肠、通过吸入或局部施用，特别是施用于耳、鼻、眼或皮肤。施用方式由执业医师确定。大多数情况下，施用将引起化合物释放到血流中。在一种具体实施方式中，化合物是口服施用。
剂量和剂型
将有效地治疗SMA的式(I)的化合物或其形式的量取决于例如给药途径、SMA类型、受试者的一般健康状况、受试者的种族、年龄、体重和性别、饮食、时间和SMA的严重程度，并且应当根据执业医师的判断和各个患者或受试者的情形决定。
在特定实施方式中，在施用式(I)的化合物或其形式或其组合物或药物内容中的“有效量”、“预防有效量”或“治疗有效量”指具有治疗效果和/或有益效果的式(I)的化合物的量。在一些特定实施方式中，在施用式(I)的化合物或其形式或其组合物或药物内容中的“有效量”、“预防有效量”或“治疗有效量”产生一种、两种或多种下述作用：(i)降低或改善SMA的严重程度；(ii)延迟SMA发病；(iii)抑制SMA的进展；(iv)减少受试者的住院治疗；(v)减少的住院治疗时长；(vi)提高受试者的存活率；(vii)改善受试者的生活质量；(viii)减少与SMA有关的症状数量；(ix)降低或改善与SMA有关的症状的严重程度；(x)与SMA有关的症状的持续时间；(xi)预防与SMA有关的症状的复发；(xii)抑制SMA的症状的发展或发作；和/或(xiii)抑制与SMA有关的症状的进展。在一些实施方式中，有效量的式(I)的化合物或其形式为有效地增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的SMN2mRNA中且提高从SMN2基因产生的Smn蛋白质的水平的量，并且因而在需要其的受试者中产生期望的有益效果。在某些情况下，可以通过分析或定量如下来确定预期效果：(1)SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中；或(2)由SMN2基因产生Smn蛋白质的水平。式(I)的化合物或其形式的有效量的非限制性实例为本文描述的。
例如，有效量可以为治疗需要其的人类受试者中的SMA所需的量、或在需要其的人类受试者中增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中所需的量、或在需要其的人类受试者中提高由SMN2基因产生的Smn蛋白质的水平的量。在一种具体实施方式中，人类受试者为SMA患者。
一般而言，对于体重范围为约1kg至约200kg的患者或受试者，有效量的范围为约0.001mg/kg/天至约500mg/kg/天。预期典型的成年人受试者具有的中值体重范围为约70kg至约100kg。
在本说明书的范围之内，用于制备药物、制备药物试剂盒或在治疗需要其的人类受试者中的SMA的方法中使用的式(I)的化合物或其形式的“有效量”预期包括在约0.001mg至约35,000mg范围内的量。在一种具体实施方式中，人类受试者为SMA患者。
本文所述组合物配制为经由本领域已知的任何药物递送途径施用于受试者。非限制性的实例包括口服、眼、直肠、含服、局部、鼻、眼部、皮下、肌内、静脉内(快速推注和输注)、脑内、透皮和肺部施用途径。
药物组合物
本文所述实施方式包括式(I)的化合物或其形式在药物组合物中的用途。在一种具体实施方式中，本文描述式(I)的化合物或其形式在治疗需要其的人类受试者中的SMA的药物组合物中的用途，其包括施用有效量的式(I)的化合物或其形式in与可药用赋形剂的混合物。在一种具体实施方式中，人类受试者为SMA患者。
式(I)的化合物或其形式可以任选地呈包含所述化合物或其形式和任选的载体、赋形剂或稀释剂的组合物形式。本文提供的其他实施方式包括包含有效量的式(I)的化合物或其形式和可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在一种具体实施方式中，药物组合物适于兽医和/或人类施用。本文提供的药物组合物可以呈允许该组合物施用于受试者的任何形式。
在一种具体实施方式和在上下文中，术语“可药用”指联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他通常公认的药典列出用于动物，更特别是人类的载体、赋形剂或稀释剂。术语“载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、助剂(例如弗氏佐剂(完成和不完全))、赋形剂或载体。这样的药物载体可以为无菌液体，例如水和油，指石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水是用于静脉内施用药物组合物的特定载体。盐水溶液及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别地用于可注射的溶液。
典型的组合物和剂型包括一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是药物领域技术人员熟知的，合适的赋形剂的非限制性实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。特定的赋形剂是否适于掺入药物组合物或剂型中取决于本领域众所周知的多种因素，包括，但不限于将该剂型施用于患者的方式和剂型中的特定活性成分。本文进一步提供包含如本文所述的式(I)的化合物或其形式的无水药物组合物和剂型。所述组合物和单一单位剂型可以采取以下形式：溶液或糖浆(任选地含有矫味剂)、悬浮液(任选地含有矫味剂)、乳剂、片剂(例如，咀嚼片)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂(任选地用于重构)、遮味或缓释制剂等。
适用于口服施用的本文提供的药物组合物可以制成独立剂型，例如，但不限于片剂、囊片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和液体。这样的剂型包含预定量的活性成分，且可以用本领域那些技术人员熟知的制药方法来制备。
可以用于本文提供的口服剂型的赋形剂的实例包括，但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。
生物标记物
在一些实施方式中，在某些实施方式中，从SMN1基因和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量可用作SMA的生物标记物。在一些实施方式中，在某些实施方式中，从SMN1基因和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量可用作SMA的生物标记物。在其他实施方式中，从SMN1基因和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量用作用例如本文公开的化合物治疗SMA患者的生物标记物。在其他实施方式中，从SMN1基因和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量用作用例如本文公开的化合物治疗SMA患者的生物标记物。在某些实施方式中，从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的变化和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的相应变化为用例如本文公开的治疗的患者的生物标记物。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在一种具体实施方式中，在施用化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)之后，从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的相应降低指示该化合物可以有效地治疗SMA。在另一种具体实施方式中，在施用化合物(例如，本文公开的式(I)的化合物)之后，从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的降低和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的相应增加指示该化合物不能有效地治疗SMA。根据这些实施方式，如下所述的SMN引物和/或SMN探针可用于测定中，例如PCR(例如qPCR)和RT-PCR(例如，RT-qPCR或终点RT-PCR)以评价和/或定量从SMN1基因和/或SMN2基因转录且包括或不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。
在一种实施方式中，本文提供了用于扩增编码人类SMN1和/或SMN2或由人类SMN1和/或SMN2编码的核苷酸的SMN引物和/或SMN探针(例如，具有核苷酸序列SEQ ID NO.1、7、8、11或13的正向引物；和/或具有核苷酸序列SEQ ID NO.9或12的反向引物；和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)。这些引物可用作例如RT-PCR(例如如本文所述的或如本领域技术人员已知的RT-PCR、终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中的引物，和用作杂交测定例如RNA印迹法和/或DNA印迹法测定中的探针。如本文生物学实施例中使用的，终点RT-PCR是如下进行的逆转录-聚合酶链反应：进行一定次数的扩增循环(或直到起始原料耗尽)，接着使用例如凝胶电泳分离、荧光染料染色、荧光定量等来定量每种DNA产物。
SEQ ID NO.1杂交于包含对应于SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸22至40的核苷酸的DNA或RNA，SEQ ID NO.2杂交于包含对应于萤火虫荧光素酶编码序列的核苷酸4至26的核苷酸的DNA或RNA；SEQ ID NO.7杂交于包含对应于SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸32至54的核苷酸和SMN1和/或SMN2的外显子8的核苷酸1至4的核酸序列(例如，DNA的有义链)，SEQ ID NO.8杂交于包含依次对应于SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸87至111及SMN1和/或SMN2的外显子8的核苷酸1至3的核苷酸的核酸序列(例如，DNA的有义链)，SEQ ID NO.9杂交于包含对应于SMN1和/或SMN2的外显子8的核苷酸39至62的核苷酸的核酸序列(例如，DNA或RNA的反义链)，SEQ ID NO.11杂交于包含对应于SMN1和/或SMN2的外显子6的核苷酸43至63的核苷酸的核酸序列(例如，DNA的有义链)，SEQ ID NO.12杂交于包含依次对应于SMN1和/或SMN2的外显子8的核苷酸51至73的核苷酸的核酸序列(例如，DNA的反义链)，SEQ IDNO.13杂交于包含对应于SMN1和/或SMN2的外显子6的核苷酸22至46的核苷酸的核酸序列(例如，DNA或RNA的有义链)。
因此，对应于SEQ ID NO.9、11、12和/或13的寡核苷酸可用于扩增反应中以扩增编码人类SMN1和/或SMN2或由人类SMN1和/或SMN2编码的且缺乏人类SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸，及扩增编码人类SMN1和/或SMN2或由人类SMN1和/或SMN2编码的且包括人类SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸。相反，对应于SEQ ID NO.8的寡核苷酸连同下游反向引物(例如，SEQ ID NO.9或12)可用于扩增编码人类SMN1和/或SMN2或由人类SMN1和/或SMN2编码的且缺乏人类SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸，并且对应于SEQ ID NO.1和7的寡核苷酸连同下游反向引物(例如，SEQ ID NO.9或12)可用于扩增编码人类SMN1和/或SMN2或由人类SMN1和/或SMN2编码的且包括人类SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸。
SEQ ID NO.3杂交于包含依次对应于人类SMN1和/或SMN2的外显子7的核苷酸50至54及人类SMN1和/或SMN2的外显子8的核苷酸1至21的核苷酸的核酸序列(例如，DNA的有义链)，且SEQ ID NO.10杂交于包含对应于人类SMN1和/或SMN2的外显子8的核苷酸7至36的核苷酸的核酸序列(例如，DNA的有义链)。SEQ ID NO.3用作探针以检测从小基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA(本文描述的或在国际公开第WO 2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中描述的，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文)，和检测从人类SMN1和/或SMN2转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA。另外，SEQ ID NO.10用作探针以检测从小基因转录且包括或不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA，和检测从人类SMN1和/或SMN2转录的mRNA(本文描述的或在国际公开第WO 2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833中描述的，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文)。
在一种具体实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针例如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增及可适用时RNA印迹法或DNA印迹法(例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以确定化合物(例如，式(I)的化合物或其形式)是否增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从smn1和/或SMN2基因转录的mRNA中。
在另一种实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增及可适用时RNA印迹法或DNA印迹法(例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以监测患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在另一种实施方式中，下文生物学实施例中所述的引物和/或探针(例如，SMN引物例如SEQ ID NO.1、7、11或13和/或SEQ ID NO.2、9或12，和/或SMN探针如SEQ ID NO.3或10)用于测定中，例如RT-PCR、RT-qPCR、终点RT-PCR、PCR、qPCR、滚环扩增及可适用时RNA印迹法或DNA印迹法(例如，例如在下文生物学实施例中所述的测定)，以监测患者对化合物(例如，式(I)的化合物或其形式)的反应。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
来自患者的样品(例如，血液样品、PBMC或组织样品例如皮肤或肌肉组织样品)可以使用本领域技术人员已知的技术获得，并且下文生物学实施例中所述的引物和/或探针可用于测定中(例如PCR、RT-PCR、RT-qPCR、qPCR、终点RT-PCR、滚环扩增、RNA印迹法或DNA印迹法)以测定从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA的量(例如，从SMN2基因转录的包括SMN2的外显子7的mRNA的量)。来源于患者的样品指在使用本领域技术人员已知的技术从患者获得之后加工和/或操作的样品。例如，来自患者的样品可以使用本领域技术人员已知的技术加工以例如提取RNA。来自患者的样品可以加工以例如提取RNA和将RNA逆转录以产生cDNA。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和SMN2基因转录的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和SMN2基因转录的mRNA的量。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
从人类SMN1和SMN2基因转录且包括SMN1和SMN2的外显子7的mRNA的量与从人类SMN1和SMN2基因转录且不包括SMN1和SMN2的外显子7的mRNA的量可以通过例如从包括SMN1和SMN2的外显子7的SMN1和SMN2 mRNA和从不包括SMN1和SMN2的外显子7的SMN1和SMN2mRNA产生的RNA或DNA片段的尺寸彼此区别。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在另一种特定实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)与例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增及可适用的RNA印迹法或DNA印迹法的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和SMN2基因转录的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)与例如用于RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增及可适用的RNA印迹法或DNA印迹法的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和SMN2基因转录的mRNA的量。
从人类SMN1和SMN2基因转录且包括SMN1和SMN2的外显子7的mRNA的量与从人类SMN1和SMN2基因转录且不包括SMN1和SMN2的外显子7的mRNA的量可以通过例如从包括SMN1和SMN2的外显子7的SMN1和SMN2 mRNA和从不包括SMN1和SMN2的外显子7的SMN1和SMN2mRNA产生的RNA或DNA片段的尺寸彼此区别。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与例如用于RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)、滚环扩增或的RNA印迹法或DNA印迹法的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或本文所述SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和SMN2基因转录的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或本文所述SMN探针(例如，SEQ IDNO.3或10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或可适用时的滚环扩增的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和SMN2基因转录的mRNA的量。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
从人类SMN1和SMN2基因转录且包括SMN1和SMN2的外显子7的mRNA的量与从人类SMN1和SMN2基因转录且不包括SMN1和SMN2的外显子7的mRNA的量可以通过例如从包括SMN1和SMN2的外显子7的SMN1和SMN2 mRNA和从不包括SMN1和SMN2的外显子7的SMN1和SMN2mRNA产生的RNA或DNA片段的尺寸彼此区别。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或本文所述SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量。在一些实施方式中，样品来自或来源于施用化合物如本文所述式(I)的化合物或其形式的患者。在一种具体实施方式中，患者为SMA患者。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述化合物)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQID NO.3或10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和()相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，其包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ IDNO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于评估SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ IDNO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示SMN1患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于从施用所述化合物之前的患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上评估患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、3小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.1、7、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ IDNO.3或10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、3小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.8、11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ IDNO.3或10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用SMN探针(例如SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ ID NO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触SMA患者样品(例如，血液样品或组织样品)或来源于SMA患者的样品(例如，已经加工以提取RNA的血液样品或组织样品)，其中所述样品来自或来源于施用化合物(例如，本文所述式(I)的化合物或其形式)的SMA患者；和(b)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种用于监测SMA患者对化合物的反应的方法，包括：(a)向SMA患者施用化合物；(b)用如下所述正向SMN引物(例如，SEQ ID NO.11或13)和/或本文所述反向SMN引物(例如，SEQ ID NO.9或12)和/或SMN探针(例如，SEQ IDNO.10)与用于例如RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如，qPCR)或滚环扩增的可用组分一起接触得自或来源于患者的样品(例如，血液样品或组织样品)；和(c)检测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，其中(1)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量增加，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量降低，指示患者对该化合物有反应且该化合物对患者可能为或为有益的和/或具有治疗价值；和(2)(i)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，和(ii)相对于施用所述化合物或一定剂量数的所述化合物之前或某一更早日期来自患者的类似样品(例如，来自相同类型的组织样品)中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，患者样品中从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量没有变化或没有实质性变化，指示患者对该化合物无反应且该化合物对患者是无益的和/或不具有治疗价值。在一些实施方式中，在施用化合物例如本文所述式(I)的化合物或其形式之后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、14天、28天、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月或以上监测患者的反应。在某些实施方式中，在患者接受1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或以上剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在施用1-5、5-10、10-15、15-20、20-30、30-40、40-50或50-100剂量的化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)之后，监测患者的反应。在某些实施方式中，在连续施用化合物(例如本文所述式(I)的化合物或其形式)的数日、数周、数月或数年的期间或之后，监测患者的反应。
在特定实施方式中，患者中的SMA是由于两种染色体上的SMN1基因失活性突变或缺失导致SMN1基因功能损失引起的。
试剂盒
在一个方面，本文提供了药物或测定试剂盒，其包含装在一个或多个容器中的本文所述SMN引物或探针，及使用说明书。在一种实施方式中，改药物或测定试剂盒包括装在一个容器中的一种或多种SMN反向引物(例如，SEQ ID NO.2、9和/或12)和/或一种或多种SMN正向引物(SEQ ID NO.1、7、8、11和/或13)，及使用说明书。在另一种实施方式中，改药物或测定试剂盒包括装在一个容器中的SMN反向引物(例如，SEQ ID NO.2、9和/或12)、SMN正向引物(SEQ ID NO.1、7、8、11和/或13)，及使用说明书。
在一种实施方式中，药物或测定试剂盒在单独的容器中包括装在一个容器中的SMN反向引物(例如，SEQ ID NO.2、9和/或12)、装在另一个容器中的SMN正向引物(SEQ IDNO.1、7、8、11和/或13)，及使用说明书。
在一些实施方式中，在这样的试剂盒中包括PCR(例如，qPCR)、RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)或滚环扩增所需的可用组分，例如聚合酶、三磷酸脱氧核苷等。在某些实施方式中，在这样的试剂盒中包括杂交所需的组分。包含这样的引物的药物或测定试剂盒可用于PCR和RT-PCR中，例如：(i)评估治疗剂(例如式(I)的化合物或其形式)是否增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，(ii)监测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，和/或(iii)监测受试者对治疗剂(例如，式(I)的化合物或其形式)的反应。在其他实施方式中，受试者为人类受试者。在其他实施方式中，人类受试者为人类患者。在一些其他实施方式中，人类患者为人类SMA患者。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中具有SEQ ID NO.1所示序列的正向引物和在另一个容器中具有SEQ ID NO.2所示序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由人类SMN1小基因或人类SMN2小基因编码的核苷酸序列，例如本文所述那些或在国际公开第WO 2009/151546号或美国专利申请公开第2011/0086833号中所述那些，将其中每篇的全部内容通过引用并入本文。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.7所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.9所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在另一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.8所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.9所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.7所示核苷酸核苷酸序列的正向引物、在另一个容器中的具有SEQ ID NO.8所示核苷酸核苷酸序列的正向引物、和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.11所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中具有SEQ ID NO.12所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.11所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.9所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.13所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.12所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.13所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.9所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.1所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.9所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在一种具体实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的具有SEQ IDNO.1所示核苷酸核苷酸序列的正向引物和在另一个容器中的具有SEQ ID NO.12所示核苷酸核苷酸序列的反向引物。在一些实施方式中，这些引物用在RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)、PCR(例如qPCR)或滚环扩增中，用于扩增由内源性人类SMN1和SMN2基因编码的核苷酸序列。在其他实施方式中，这些引物作为探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。
在另一种实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的本文所述SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)。在其他实施方式中，所述探针用于例如杂交测定中，例如DNA印迹法或RNA印迹法。在一种具体实施方式中，所述探针用于RT-qPCR或qPCR中。在一些实施方式中，在这样的试剂盒中包括PCR(例如，qPCR)、RT-PCR(例如，终点RT-PCR和/或RT-qPCR)或滚环扩增所需的可用组分，例如聚合酶、三磷酸脱氧核苷、引物等。在某些实施方式中，在这样的试剂盒中包括杂交所需的组分。
在一种实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的SMN反向引物(例如，SEQ ID NO.2、9和/或12)、在另一个容器中的SMN正向引物(SEQ ID NO.1、7、8、11和/或13)、和在另一个容器中的SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)，及使用说明书。在另一种实施方式中，药物或测定试剂盒包括在一个容器中的一种或多种SMN反向引物(例如，SEQ ID NO.2、9和/或12)、在另一个容器中的一种或多种SMN正向引物(SEQ ID NO.1、7、8、11和/或10)、和在另一个容器中的一种或多种SMN探针(例如，SEQ ID NO.3或10)，及使用说明书。
在一些实施方式中，在这样的试剂盒中包括运行PCR、RT-PCR或滚环扩增所需的组分，例如聚合酶、三磷酸脱氧核苷等。包含这样的探针和/或引物的药物或测定试剂盒可用于PCR和RT-PCR中，例如：(i)评估治疗剂(例如式(I)的化合物或其形式)是否增强将SMN1和/或SMN2的外显子7包含到从SMN1和/或SMN2基因转录的mRNA中，(ii)监测从SMN1和/或SMN2基因转录且包括外显子7的mRNA的量和从SMN1和/或SMN2基因转录且不包括SMN1和/或SMN2的外显子7的mRNA的量，和/或(iii)监测受试者对治疗剂(例如，式(I)的化合物或其形式)的反应。在其他实施方式中，受试者为人类受试者。在其他实施方式中，人类受试者为人类患者。在一些其他实施方式中，人类患者为人类SMA患者。
在另一个方面，本文提供了药物试剂盒，其包括在容器中的式(I)的化合物或其形式和该化合物或其形式的使用说明书。在一种具体实施方式中，本文提供了一种药物试剂盒，其包含式(I)的化合物其形式和可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物，及使用说明书。在另一种具体实施方式中，本文提供了一种药物试剂盒，其包含有效量的式(I)的化合物其形式和可药用载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物，及使用说明书。在一种实施方式中，使用说明书说明下述的一个、两个或三个：向受试者施用式(I)的化合物或其形式的剂量、施用途径、施用频率和副作用。在其他实施方式中，受试者为人类受试者。在其他实施方式中，人类受试者为人类患者。在一些其他实施方式中，人类患者为人类SMA患者。
一般合成方法
如本文公开的，用于制备如本文所述式(I)的化合物或其形式的一般方法是经由标准、众所周知的合成方法获得。许多起始原料是市售可获得的，或者当不可获得时，可以使用本领域技术人员已知的技术，使用如下所述途径制备。本文提供的合成方案包括多个反应步骤，每个反应步骤都预期独立且可以在有或者没有任何前述或后续步骤的情况下进行。换句话说，独立地涵盖本文提供的合成方案的每个独立反应步骤。
方案A
式(I)的化合物可以如下方案A所述制备，其中R2为单环或二环芳基、杂环基或杂芳基环***。
在有机溶剂(如乙腈等)中，在合适的金属催化剂、或两种不同的合适的金属催化剂(例如双(三苯基膦)氯化钯(II)和碘化铜(I)等)的组合，与至少一当量的碱：无机碱或有机碱(例如三乙胺等)的存在下，使化合物A1(其中X代表各种反应基团，其可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术，使合适的起始原料与化合物A1、化合物A3或化合物A4反应提供大量R1官能团取代基，并且其中L为离去基团，例如卤素或三氟甲基磺酰氧基等)与化合物A2反应，进行Sonogashira偶联，得到化合物A3。该反应可以在环境温度或高温下进行。可选地，该反应也可以在高温下使用微波辐照进行。在环境温度或高温下，使化合物A3与路易斯酸(例如三氟乙酸或对甲苯磺酸等)在有或没有有机溶剂(例如甲苯或乙醇等)下反应，进行环化，得到化合物A4。
方案B
式(I)的化合物也可以如下方案B所述制备，其中R2为单环或二环芳基、杂环基或杂芳基环***。
在有机溶剂(例如乙腈等)中，在合适的金属催化剂、或两种不同的合适的金属催化剂(例如双(三苯基膦)氯化钯(II)和碘化铜(I)等)的组合，与至少一当量的碱(无机碱或有机碱(例如三乙胺等))的存在下，使化合物A1与三甲基甲硅烷基乙炔反应，进行Sonogashira偶联。该反应可以在环境温度或高温下进行。可选地，该反应也可以在高温下使用微波辐照进行。将得到的三甲基甲硅烷基乙炔中间体在甲醇中用无机碱(例如碳酸钾等)处理，得到化合物B1。使用在方案A中所述条件，使化合物B1与化合物B2反应，进行Sonogashira偶联，得到化合物A3，然后通过用如方案A所述的酸处理将其转化成化合物A4。
方案C
式(I)的化合物可以如下方案C所述制备，其中R2为单环或二环杂环基或杂芳基环***。
在约50℃至约150℃范围的高温下，在有机溶剂(例如N，N-二甲基甲酰胺等)中，在合适的钯催化剂(例如四(三苯基膦)钯(0)等)、合适的金属辅助催化剂(例如氯化锌等)和有机碱(例如三乙胺等)的存在下，使化合物C1(其中X代表各种反应基团，其可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术，使合适的起始原料与化合物C1、化合物C2、化合物C3、化合物C4或化合物C6反应提供大量R1官能团取代基，并且其中L为离去基团，例如卤素或三氟甲基磺酰氧基等)与丁-3-炔-2-醇反应，进行Sonogashira偶联，接着环化，得到化合物C2。在环境温度或高温下，使化合物C2与合适的氧化剂(例如二氧化锰等)在合适的溶剂(例如二氯甲烷等)中反应，得到化合物C3。化合物C3的α-甲基与合适的、选择性溴化剂(例如Br2或NBS等)反应，得到化合物C4。化合物C4与化合物C5(其中，术语“Het”是指包含脒样部分的任选取代的杂环基或杂芳基环***，例如2-氨基吡啶、2-氨基嘧啶、2-氨基吡嗪、3-氨基哒嗪、2-氨基噻唑、4-氨基噻唑、4-氨基嘧啶等)，得到化合物C6。
方案D
式(I)的化合物可以如下方案D所述制备，其中R2为单环或二环杂环基或杂芳基环***。
在合适的溶剂(例如乙腈等)中，在有机碱(例如三乙胺等)的存在下，如方案C所述制备的化合物C4(其中X代表各种反应基团，其可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术，使合适的起始原料与化合物C4或化合物D2反应提供大量R1官能团取代基)与化合物D1(其中术语“Het”指包含酮亚胺-样部分的任选取代的杂环基或杂芳基环***，例如但不限于2-甲基吡啶、2-甲基嘧啶、2-甲基吡嗪、3-甲基哒嗪、2-甲基噻唑、4-甲基噻唑、4-甲基嘧啶等)反应，进行串联烷基化去氢化(dehydrative)环化，得到化合物D2。
具体合成实施例
为了更详细地描述且有助于理解，提供下述非限制性实例以更完整地说明本文所述化合物的范围，且不应理解为特别地限制其范围。本领域技术人员视界之内能够确定的目前已知或以后研发的本文所述化合物的这样的变化被认为落入如本文所述和下文所主张的化合物范围之内。这些实施例说明了某些化合物的制备。本领域技术人员应当理解在这些实施例中描述的技术代表如本领域普通技术人员所述的、在合成实践中充分起作用的、且因而构成其实施优选方式的技术。然而，根据本发明公开的内容，本领域技术人员应当理解，可以在不背离本说明书的精神和范围的下，对所公开的具体方法做出多种改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
除了所具体描述化合物的下述实施例之外，除非有相反指示，否则本说明书和权利要求书中使用的表示成分数量、反应条件、实验数据等的所有数值都应当理解为由术语“约”修饰。因此，所有这样的数值均代表近似值，其可以根据反应获得或作为可变实验条件的结果寻求的期望性质而改变。因此，在试验可重现性的预期范围之内，在所得数据的上下文中的术语“约”指数据范围，条件是其可以根据平均值的标准偏差而变化。同样，对于所提供的试验结果，得到的数据在不损失有效数字下可以一致地向上或向下舍入以呈现本发明数据。最低限度而不是尝试限制等同原则的应用于权利要求的范围，各个数值参数根据有效数字的数目和本领域技术人员使用的近似技术来解释。
虽然列出本说明书的较宽范围的数值范围和参数为近似值，但是下述实施例中列出的数值尽可能精确地报道。然而任何数值均固有地含有某些误差，这样的误差是由其各自试验测定中所发现的标准偏差必然产生的。
化合物实施例
如上述和在整个本说明书中使用的，除非另有说明，否则下述缩写应当理解为具有下述含义：
实施例1
化合物1的制备
步骤A：在室温同时轻轻地搅拌下，向可商购获得的叔丁基4-(3-(乙氧基羰基)-苯基)哌嗪-1-羧酸酯(13.4g，40.0mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液中分批加入N-溴琥珀酰亚胺(8.5g，48mmol)。在加入之后，将该混合物在室温下搅拌0.5小时。等分试样的LC/MS分析显示起始原料完全消失。用饱和的Na2CO3溶液(100mL)处理该混合物，并搅拌15分钟。分离有机层，并经Na2SO4干燥。在除去溶剂之后，在硅胶柱上，使用在己烷中0-50％乙酸乙酯的梯度对残余物进行色谱层析。得到呈无色油状物的溴化物中间体(14.2g，86％)。MS m/z412.4[M+H]+，414.4[M+2H]+。
步骤B：向250mL的圆底烧瓶中装入PdCl2(PhCN)2(0.51g，1.33mmol)、PBu3HBF4(0.77g，2.66mmol)和CuI(0.20g，1.06mmol)，并且用氩气吹扫三次，接着加入二噁烷(30mL)和二异丙胺(5.6mL，4.03g，40.0mmol)。将该混合物在室温下搅拌30分钟，接着加入在步骤A中得到的溴化物中间体(11.0g，26.6mmol)和TMS-乙炔(4.51mL，3.13g，32.0mmol)。然后，在室温下搅拌反应6天。等分试样的LC/MS分析显示获得＞95％的转化率。通过过滤除去沉淀物，并用乙酸乙酯洗涤。将滤液合并，并在旋转蒸发器(rotovap)上除去挥发物。对残余物进行色谱层析(硅胶，在己烷中0-70％的乙酸乙酯)，得到呈褐色油状物的TMS炔中间体(8.73g，76％)。MS m/z 431.4[M+H]+。
步骤C：在冰-水浴中搅拌在步骤B中得到的TMS炔中间体(3.10g，7.21mmol)、K2CO3(1.49g，10.8mmol)和MeOH(40mL)的混合物。LC/MS显示在2小时之内实现完全转化。然后，加入NH4Cl(20mL)和乙酸乙酯(200mL)的饱和溶液，并分离有机层，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取水层，并将合并的有机层在旋转蒸发器上蒸干。对残余物进行色谱层析(硅胶，在己烷中0-10％的乙酸乙酯)，得到呈褐色油状物的炔中间体(1.65g，64％)。MS m/z 359.3[M+H]+；1HNMR(500MHz，CDCl3-d6)δppm 7.51(1H，d，J＝8.51Hz)，7.44(1H，d，J＝2.84Hz)，6.97-7.03(1H，m)，4.41(2H，q，J＝7.15Hz)，3.57-3.64(4H，m)，3.21-3.27(5H，m)，1.49(9H，s)，1.41(3H，t，J＝7.09Hz)。
步骤D：在氩气下，向在步骤C中得到的炔中间体(1.10g，3.1mmol)、2-碘吡啶(0.69g，3.38mmol)、PdCl2(Ph3P)2(0.11g，0.15mmol)和CuI(0.03g，0.15mmol)的混合物中加入乙腈(6.0mL)和三乙胺(0.62g，6.14mmol)。在50℃下搅拌该混合物4小时。在旋转蒸发器上除去挥发物，并对残余物进行色谱层析(硅胶，在己烷中0-70％的乙酸乙酯)，得到呈褐色油状物的偶联产物叔丁基4-(3-(乙氧基羰基)-4-(吡啶-2-基乙炔基)苯基)哌嗪-1-羧酸酯(1.2g，87％)。MS m/z 436.4[M+H]+。
步骤E：在微波反应器中，于180℃下照射在步骤D中得到的化合物(0.59g，1.4mmol)和对甲苯磺酸(0.05g，0.27mmol)在乙醇(6.0mL)中的混合物3小时。然后，用水(20mL)稀释该混合物，并使用Na2CO3将其碱化为pH 8。收集沉淀物，用水洗涤并干燥。将固体溶于二氯甲烷(10mL)中，在室温下用TFA(2mL)处理0.5小时，然后使用Na2CO3将其碱化为pH8-9。分离二氯甲烷层，并用另外的二氯甲烷(3×5mL)萃取水层。经Na2SO4干燥合并的二氯甲烷溶液，并进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中的MeOH，0-30％)，得到呈黄色固体的标题化合物(0.071g，17％)。熔点：179-181℃；MS m/z 308.2[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.64-8.69(1H，m)，7.95(1H，td，J＝7.80，1.73Hz)，7.85(1H，dt，J＝7.96，1.06Hz)，7.68-7.74(2H，m)，7.57(1H，dd，J＝8.83，2.84Hz)，7.51(1H，d，J＝2.52Hz)，7.42(1H，ddd，J＝7.57，4.73，1.26Hz)，3.21-3.26(4H，m)，2.84-2.89(4H，m)。
实施例2
化合物2的制备
步骤A：在110℃下，在氩气下，搅拌如实施例1步骤A中所述制备的叔丁基4-(4-溴-3-(乙氧基羰基)苯基)哌嗪-1-羧酸酯(22.63g，54.8mmol)、CuI(0.52g，2.75mmol)、NaI(16.44g，109.6mmol)和N1，N2-二甲基环己烷-1，2-二胺(0.87mL，5.5mmol)在二噁烷(100mL)中的混合物18小时。通过过滤除去固体，并将滤液在旋转蒸发器上浓缩至干。对残余物进行色谱层析(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-30％)，得到呈褐色油状物的碘化物中间体(26.2g，102％)。MS m/z 461.2[M+H]+。
步骤B：通过使用在实施例1步骤D中所述的Sonagashira偶联方法，从上述步骤A制备的碘化物和3乙炔基-噻吩(87％)制备4-(3-(乙氧基羰基)-4-(硫代苯-3-基乙炔基)苯基)-哌嗪-1-羧酸叔-丁酯。MS m/z 441.2[M+H]+。
步骤C：在100℃下，搅拌在步骤B中制备的化合物(192mg，0.44mmol)与TFA(1.0mL)6小时。在冷却之后，用水(5mL)稀释该混合物，并用NaHCO3中和。收集沉淀物，并用水、二氯甲烷和丙酮洗涤，得到呈褐色粉末的标题化合物(47mg，34％)。熔点：240℃(分解)；MS m/z313.2[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm7.95(1H，dd，J＝2.99，1.42Hz)，7.71(1H，dd，J＝5.04，2.84Hz)，7.54-7.65(4H，m)，7.27(1H，s)，3.45-3.53(4H，m)，3.20-3.28(4H，m)。
实施例3
化合物3的制备
步骤A：在微波反应器中，在氩气下于120℃下，照射使用实施例1步骤C所述的化学方法制备的叔丁基4-(3-(乙氧基羰基)-4-乙炔基苯基)-哌嗪-1-羧酸酯(3.58g，10.0mmol)、3，4-二甲氧基溴苯(2.60g，12.0mmol)、CuI(0.095g，0.5mmol)、PdCl2(Ph3P)2(0.35g，0.5mmol)、Et3N(2.8mL，2.02g，20.0mmol)和乙腈(10.0mL)的混合物0.5小时。然后，将该混合物冷却，并进行色谱层析(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-70％)，得到呈褐色油状物的炔中间体，然后再次进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中的乙酸乙酯，0-10％)，得到无色油状物，在LC/MS分析中为均质的。MS m/z 495.2[M+H]+。
步骤B：在室温下，用三氟乙酸(10.0mL)处理在步骤A中得到的炔中间体1小时。用水(50mL)稀释该溶液，并用NaHCO3中和至pH 8-9。收集黄色沉淀物，用水洗涤并干燥，得到标题化合物(1.26g，总收率34％，2个步骤)。熔点：142-143℃；MS m/z 367.2[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm7.52-7.59(2H，m)，7.46(1H，d，J＝1.58Hz)，7.42(1H，dd，J＝8.51，2.21Hz)，7.38(1H，d，J＝2.21Hz)，7.32(1H，s)，7.08(1H，d，J＝8.83Hz)，3.86(3H，s)，3.81(3H，s)，3.15-3.22(4H，m)，2.82-2.89(4H，m)。
实施例4
化合物31的制备
步骤A：在微波反应器中，在氩气下于120℃下，照射2-溴-5-氟苯甲酸甲酯(699mg，3.0mmol)、1-乙炔基-4-甲氧基苯(475mg，3.6mmol)、CuI(28.5mg，0.15mmol)、PdCl2(Ph3P)2(105mg，0.15mmol)、Et3N(0.83mL，606mg，6.0mmol)和乙腈(3.0mL)的混合物0.5小时。然后，将该混合物冷却并进行色谱层析(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-10％)，得到呈褐色油状物的炔中间体，直接用于下一步中。MS m/z 285.1[M+H]+。
步骤B：在100℃下，用三氟乙酸(6.0mL)处理在步骤A中得到的炔中间体1小时。在真空下除去挥发物，用水处理残余物，并用NaHCO3中和。收集沉淀物，并进行色谱层析(硅胶，二氯甲烷)，得到异香豆素中间体(581mg，72％，2个步骤)。MS m/z 271.1[M+H]+。
步骤C：在180℃下，搅拌在步骤B中得到的化合物(108mg，0.4mmol)和(S)-2-甲基哌嗪(120mg，1.2mmol)在NMP(1.0mL)中的混合物24小时。在冷却之后，将该混合物负载到硅胶柱上，并进行色谱层析(在二氯甲烷中的MeOH，0-20％)，得到呈黄色粉末的标题化合物(24mg，17％)。熔点：129-131℃；MS m/z 351.3[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm7.80(2H，d，J＝9.14Hz)，7.51-7.59(2H，m)，7.46(1H，d，J＝2.21Hz)，7.26(1H，s)，7.06(2H，d，J＝8.83Hz)，3.82(3H，s)，3.64-3.73(2H，m)，2.97-3.03(1H，m)，2.76-2.85(2H，m)，2.61-2.70(1H，m)，2.31(1H，t，J＝11.03Hz)，1.06(3H，d，J＝6.31Hz)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例4通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例5
化合物30的制备
步骤A：在室温下，在氩气下，搅拌5-溴-2-碘苯甲酸甲酯(18.4g，54.0mmol)、TMS乙炔(8.5mL，5.88g，60.0mmol)、CuI(0.51g，2.7mmol)、PdCl2(Ph3P)2(1.9g，2.7mmol)、Et3N(15.0mL，10.9g，108.0mmol)和乙腈(100mL)的混合物4小时。在真空中除去挥发物之后，对残余物进行色谱层析(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-20％)，得到呈无色油状物的TMS炔中间体(15.7g，94％)。
步骤B：将在步骤A中得到的炔中间体(9.33g，30.0mmol)与(S)-2-甲基哌嗪(3.60g，36.0mmol)、Pd2dba3(0.27g，0.6mmol)、JohnPhos(0.18g，0.6mmol)和Cs2CO3(13.7g，42.0mmol)混合。用氩气吹扫反应体系三次，并且加入溶剂DME(60mL)。然后，在80℃下搅拌该悬浮液4小时.。反应混合物的等分试样的LC/MS分析显示起始溴化物完全消耗。在旋转蒸发器上除去溶剂之后，对残余物进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中乙酸乙酯，0-50％)，得到呈褐色油状物的5-(3-甲基哌嗪-1-基)-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酸(S)-甲酯(7.56g，79％)。MS m/z 331.1[M+H]+。
步骤C：用二碳酸二叔丁酯(7.5g，34.4mmol)和少量在二氯甲烷中的DMAP结晶(100mL)处理在步骤B中得到的化合物(7.56g，22.9mmol)。在室温下搅拌2小时之后，反应混合物的等分试样的LC/MS分析显示起始原料完全消失。在旋转蒸发器上除去溶剂，并对残余物进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中的乙酸乙酯，0-10％)，得到呈无色油状物的(S)-叔丁基4-(3-(甲氧基羰基)-4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)-2-甲基哌嗪-1-羧酸酯(6.49g，66％)。MS m/z 431.1[M+H]+。
步骤D：在冰-水浴上，用在MeOH(40mL)中的K2CO3(碳酸钾)(3.12g，22.6mmol)处理在步骤C中得到的化合物(6.49g，15.1mmol)2小时。在旋转蒸发器上除去挥发物，用饱和的NH4Cl(100mL)处理残余物，并用乙酸乙酯(3×150mL)萃取。然后，将合并的萃取物浓缩至干，并进行色谱层析(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-80％)，得到呈淡褐色油状物的(S)-叔丁基4-(4-乙炔基-3-(甲氧基羰基)苯基)-2-甲基哌嗪-1-羧酸酯(5.39g，100％)。MS m/z359.3[M+H]+。
步骤E：在微波反应器中，在氩气下于120℃下，照射在步骤D中制备的中间体(S)-叔丁基4-(4-乙炔基-3-(甲氧基羰基)苯基)-2-甲基哌嗪-1-羧酸酯(716mg，2.0mmol)、4-碘-1，2-二甲氧基苯(634mg，2.4mmol)、CuI(19.0mg，0.1mmol)、PdCl2(Ph3P)2(70mg，0.1mmol)、Et3N(0.56mL，202mg，4.0mmol)和乙腈(2.0mL)的混合物20分钟。然后，将该混合物冷却并进行色谱层析两次(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-50％，然后在二氯甲烷中的乙酸乙酯，7.5％)，得到呈黄色油状物的炔中间体(367mg，37％)。MS m/z 495.3[M+H]+。
步骤F：在室温下，用TFA(5.0mL)处理在步骤E中得到的化合物(367mg，0.74mmol)2小时。反应混合物的等分试样的LC/MS分析显示实现完全转化。将其用水(40mL)稀释，用NaHCO3中和并用二氯甲烷(3×20mL)萃取。将合并的萃取物干燥并蒸干。将黄色残余物与***一起研磨，并干燥。获得呈黄色粉末的标题化合物(228mg，81％)。熔点：155-157℃；MS m/z 381.5[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δppm 7.51-7.58(2H，m)，7.46(1H，d，J＝2.52Hz)，7.42(1H，dd，J＝8.51，1.89Hz)，7.38(1H，d，J＝1.89Hz)，7.32(1H，s)，7.07(1H，d，J＝8.83Hz)，3.86(3H，s)，3.81(3H，s)，3.64-3.71(2H，m)，2.96-3.02(1H，m)，2.75-2.84(2H，m)，2.65(1H，m，J＝3.15Hz)，2.30(1H，dd，J＝11.35，10.40Hz)，1.05(3H，d，J＝6.31Hz)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例5通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例6
化合物65的制备
步骤A：在100℃下，在氩气下，搅拌5-氟-2-碘苯甲酸(9.04g，34.0mmol)、丁-3-炔-2-醇(5.7mL，5.46g，78.0mmol)、ZnCl2(4.62g，34.0mmol)、Pd(Ph3P)4(1.96g，1.7mmol)、Et3N(14.2mL，10.3g，102.0mmol)和DMF(50mL)的混合物2小时。在真空下除去挥发物之后，对残余物进行色谱层析(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-50％)，得到呈褐色油状物的中间体7-氟-3-(1-羟基乙基)-1H-异色烯-1-酮(5.93g，84％)。MS m/z 209.2[M+H]+；1H NMR(500MHz，CDCl3-d)：δppm 7.91-7.96(1H，m)，7.43-7.47(2H，m)，6.55-6.59(1H，m)，4.67(1H，q，J＝6.52Hz)，1.57(3H，d，J＝6.62Hz)。
步骤B：将在步骤A中得到的中间体(5.93g，28.5mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，在室温下用MnO2(24.8g，285mmol)处理48小时。在旋转蒸发器上除去溶剂，将残余物悬浮在二氯甲烷(500mL)中，并搅拌0.5小时。过滤该混合物，并用二氯甲烷(4×100mL)充分洗涤固体。将合并的滤液在旋转蒸发器上蒸干，并进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中的乙酸乙酯，0-20％)，得到呈白色晶体的酮中间体(3.88g，66％)。MS m/z207.1[M+H]+；1H NMR(500MHz，CDCl3-d)：δppm 8.01-8.06(1H，m)，7.68(1H，dd，J＝8.51，5.04Hz)，7.51-7.57(1H，m)，7.40(1H，d，J＝0.63Hz)，2.59(3H，s)。
步骤C：将在步骤B中得到的酮中间体(2.63g，12.8mmol)溶于氯仿(30mL)中，并用溴(0.72mL，2.25g，14.0mmol)处理。在室温下，搅拌该混合物1小时，接着加入己烷(150mL)，并搅拌该混合物15分钟。通过过滤收集沉淀物，并用己烷、水洗涤和干燥。用NaHCO3洗涤滤液，并浓缩。对残余物进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中的乙酸乙酯，0-5％)，得到另外的溴酮中间体中间体(总共3.48g，96％)。MS m/z 283.0[M-H]-，285.0[M-H]-；1H NMR(500MHz，CDCl3-d)：δppm 8.05(1H，dd，J＝8.20，2.84Hz)，7.72(1H，dd，J＝8.51，5.04Hz)，7.54-7.60(1H，m)，7.52(1H，s)，4.47(2H，s)。
步骤D：将在步骤C中得到的溴酮中间体(1.43g，5.0mmol)与3，5-二甲基吡嗪-2-胺(0.67g，5.5mmol)和乙腈(10.0mL)在密封管中混合。在100℃下，搅拌该混合物过夜，并冷却至室温。加入乙酸乙酯(20mL)，并收集沉淀物，用乙酸乙酯洗涤，然后干燥，得到3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-氟-1H-异色烯-1-酮氢溴酸盐(1.81g，93％)。MS m/z310.3[M+H]+。
步骤E：在180℃下，在氩气下，搅拌在步骤D中得到的化合物(390mg，1.0mmol)、N-甲基哌嗪(300mg，3.0mmol)在NMP(2.0mL)中的混合物24小时。在冷却至室温之后，将该混合物负载到硅胶柱上。使用在二氯甲烷中的MeOH(0-30％)进行快速色谱(硅胶)，得到呈黄色粉末的标题化合物(223mg，57％)。熔点：240-241℃；MS m/z 390.1[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.34(1H，s)，8.24-8.27(1H，m)，7.70(1H，d，J＝8.83Hz)，7.57(1H，dd，J＝8.83，2.52Hz)，7.50(1H，d，J＝2.52Hz)，7.42(1H，s)，3.26-3.31(4H，m)，2.74(3H，s)，2.45-2.49(4H，m)，2.38(3H，d，J＝0.95Hz)，2.24(3H，s)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例6通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例7
化合物33的制备
步骤A：将在实施例6的步骤C中得到的溴酮中间体(285mg，1.0mmol)与2-氨基噻唑(110mg，1.1mmol)和乙腈(4.0mL)在密封管中混合。在100℃下，搅拌该混合物0.5小时，并冷却至室温。加入乙酸乙酯(10mL)，并通过过滤收集沉淀物。用乙酸乙酯洗涤沉淀物并干燥，得到在LC/MS分析中均质的中间体2-氨基-3-(2-(7-氟-1-氧代-1H-异色烯-3-基)-2-氧代乙基)噻唑-3-鎓溴化物(355mg，92％)。MS m/z 305.0M+。
步骤B：在180℃下搅拌在步骤A中得到的化合物(193mg，0.5mmol)在NMP(1.0mL)中的混合物1小时，指导反应混合物的等分试样的LC/MS分析显示全部起始原料已经转化为环化中间体。MS m/z 287.0[M+H]+。将该混合物冷却至室温，并在氩气下加入N-甲基哌嗪(150mg，1.5mmol)。然后，在180℃下搅拌得到的混合物24小时。在冷却之后，将该混合物负载到硅胶柱上，并用在二氯甲烷中的MeOH(0-30％)洗脱呈黄色粉末的标题化合物(32mg，17％)。熔点：236-238℃；MS m/z 367.2[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm 8.12(1H，s)，7.93(1H，d，J＝4.41Hz)，7.52-7.63(2H，m)，7.48(1H，s)，7.32(1H，d，J＝4.41Hz)，7.17(1H，s)，3.23-3.30(4H，m)，2.43-2.49(4H，m)，2.23(3H，s)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例7通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例8
化合物61的制备
步骤A：按照在实施例6的步骤D中描述的方法，从市售可获得的3-氯-2-氨基吡啶得到中间体3-(8-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-7-氟-1H-异色烯-1-酮氢溴酸盐(244mg，62％)。MS m/z 315.1[M+H]+。
步骤B：按照在实施例6的步骤E中描述的方法，由3-(8-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-7-氟-1H-异色烯-1-酮氢溴酸盐(99mg，0.25mmol)和N-甲基哌嗪(86mg，0.75mmol)获得呈黄色粉末的标题化合物(19mg，19％)。熔点：240℃(分解)；MS m/z 395.0[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.57(1H，dd，J＝6.94，0.95Hz)，8.46(1H，s)，7.72(1H，d，J＝8.83Hz)，7.58(1H，s)，7.52(1H，dd，J＝7.25，0.95Hz)，7.51(1H，d，J＝2.52Hz)，7.44(1H，s)，6.95(1H，dd，J＝7.41，6.78Hz)，3.28-3.31(4H，m)，2.47(4H，m)，2.24(3H，s)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例8通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例9
化合物66的制备
将根据实施例6的方法制备的(S)-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(3-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮(78mg，0.2mmol)悬浮在二氯乙烷(1.0mL)中，接着加入甲醛(0.4mL，37％，4.9mmol)和NaBH(OAc)3(85mg，0.4mmol)。在室温下，搅拌该混合物1小时，然后用二氯甲烷(5.0mL)稀释，并用NaHCO3中和。分离二氯甲烷层，并用二氯甲烷(3×2.0mL)萃取水层。将萃取物合并，经Na2SO4干燥，并进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中的MeOH，0-20％)，得到呈浅黄色粉末的标题化合物(55mg，68％)。熔点：255-256℃；MS m/z404.1[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.33(1H，s)，8.23-8.26(1H，m)，7.68(1H，d，J＝8.83Hz)，7.56(1H，dd，J＝8.83，2.52Hz)，7.48(1H，d，J＝2.52Hz)，7.40(1H，s)，3.65-3.76(2H，m)，2.82-2.91(2H，m)，2.73(3H，s)，2.37(3H，d，J＝0.95Hz)，2.21-2.28(4H，m)，2.09-2.19(1H，m)，1.08(3H，d，J＝6.31Hz)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例9通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例10
化合物76的制备
将在实施例6的步骤C中得到的溴酮中间体(855mg，3.0mmol)与2，3，5三甲基吡嗪(402mg，3.3mmol)和乙腈(10.0mL)在密封管中混合。在80℃下，搅拌该混合物4小时，并冷却至室温，接着加入三乙胺(1.3mL，9.0mmol)。在室温下搅拌0.5小时之后，在60℃下搅拌该混合物过夜。
在旋转蒸发器上除去溶剂，对残余物进行色谱层析(硅胶，在二氯甲烷中的乙酸乙酯，30％)，得到中间体3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-氟-1H-异色烯-1-酮(782mg，85％)。MS m/z 309.3[M+H]+。
步骤B：按照在实施例6的步骤E中描述的方法，由3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-氟-1H-异色烯-1-酮(77mg，0.25mmol)和N-甲基哌嗪(75mg，0.75mmol)得到呈黄色粉末的标题化合物(44mg，45％)。熔点：219-221℃；MS m/z 389.5[M+H]+；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.03(1H，d，J＝1.58Hz)，7.97(1H，d，J＝0.63Hz)，7.56(1H，d，J＝2.84Hz)，7.47-7.53(2H，m)，7.22(1H，s)，7.16-7.19(1H，m)，3.24-3.30(4H，m)，2.57(3H，s)，2.45-2.49(4H，m)，2.28(3H，d，J＝0.95Hz)，2.24(3H，s)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例10通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例11
化合物85的制备
将在实施例6中得到的化合物65(188mg，0.5mmol)与1-溴-2-乙氧基乙烷(104mg，0.75mmol)、K2CO3(172mg，1.25mmol)和DMF(1.0mL)在密封管中混合。在60℃下，搅拌该混合物过夜，冷却至室温，并经硅胶(在二氯甲烷中的甲醇，0-20％)进行色谱层析，得到呈黄色粉末的标题化合物(100mg，46％)。熔点：192-194℃；MS m/z 434.3[M+H]+。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.36(1H，s)，8.25-8.29(1H，m)，7.71(1H，d，J＝8.83Hz)，7.57(1H，dd，J＝8.83，2.52Hz)，7.50(1H，d，J＝2.52Hz)，7.43(1H，s)，3.48(2H，t，J＝5.83Hz)，3.27-3.31(4H，m)，3.26(3H，s)，2.74(3H，s)，2.56-2.62(4H，m)，2.54(2H，t，J＝5.83Hz)，2.38(3H，d，J＝0.95Hz)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例11通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例12
化合物88的制备
部分1，步骤A向在冰/H2O浴上的2，6-二甲基吡嗪(108g，1.0mol)在DMF(260mL)中的冷却溶液中加入磺酰氯(270mL，3.3mol)，同时强力搅拌。控制加入速率以保持反应温度在40-60℃约2小时。在加入之后，除去冷却浴，并再搅拌该混合物另外0.5小时。等分试样的LC/MS分析显示剩余＜5％的起始原料。然后，将该反应混合物在冰/水浴中冷却，同时保持温度低于35℃，用10M NaOH(1L)小心地淬灭，接着加入Na2CO3(固体)至pH 6。在加入水(800mL)之后，蒸馏该混合物。收集蒸镏物，并分离有机层。用***(100mL×3)萃取水层，将***萃取物与之前分离的有机层合并。将合并的萃取物用水(30mL×3)洗涤，然后用盐水洗涤，并经Na2SO4干燥。在浓缩萃取物之后，蒸馏出残余物，并收集呈无色液体的产物，近似沸点：在154mmHg下127℃(99.1g，69％)。1H NMR(500MHz，CHLOROFORM-d6)δppm 8.05(1H，s)，2.61(3H，d，J＝0.63Hz)，2.50(3H，s)。
部分1，步骤B：在150℃下，在密封压力容器中，搅拌上述制备的2-氯-3，5-二甲基吡嗪(28.5g，0.2mol)、CuO(0.8g，0.01mol)和浓NH3水溶液(28～30％，150mL)3天。在冷却之后，将该混合物浓缩至干，并用乙酸乙酯(500mL)处理残余物，然后搅拌15分钟并过滤。用另外的乙酸乙酯(约1.5L)洗涤沉淀物，直到滤液中不再检测到起始原料。合并滤液并浓缩。在硅胶柱(MeOH/CH2Cl2，0-10％)上对残余物进行色谱层析，得到黄色/带褐色的固体(20.7g，84％)。1H NMR(500MHz，CHLOROFORM-d6)δppm 7.68(1H，s)，2.46(3H，s)，2.42(3H，d，J＝0.63Hz)。
部分2，步骤A：在80℃下，在氩气下，搅拌5-溴-2-碘苯甲酸(12.6g，38.5mmol)、丁-3-炔-2-醇(3.1mL，2.96g，42.4mmol)、ZnCl2(5.2g，38.5mmol)、Pd(Ph3P)4(2.23g，1.9mmol)、Et3N(16.0mL，11.7g，115.5mmol)和DMF(80mL)的混合物2小时。在真空下除去挥发物之后，对残余物进行色谱层析(硅胶，在己烷中的乙酸乙酯，0-100％)，得到呈褐色油状物的中间体7-溴-3-(1-羟基乙基)-1H-异色烯-1-酮(7.5g，72％)。1H NMR(500MHz，CHLOROFORM-d6)δppm 8.38-8.45(1H，m)，7.81(1H，dd，J＝8.35，2.05Hz)，7.32(1H，d，J＝8.51Hz)，6.52-6.59(1H，m)，4.66(1H，qd，J＝6.52，0.95Hz)，1.54-1.60(3H，m)。
部分2，步骤B：在室温下，将部分2的步骤A得到的中间体(7.5g，27.7mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，并用MnO2(48.0g，554mmol)处理20小时。过滤固体，并用二氯甲烷(4×200mL)充分洗涤。将合并的滤液在旋转蒸发器上蒸干，并进行色谱层析(硅胶，乙酸乙酯/CH2Cl2，0-20％)，得到呈白色晶体的产物(4.5g，61％)。1H NMR(500MHz，CHLOROFORM-d6)δppm 8.51(1H，dd，J＝2.84，0.63Hz)，7.92(1H，dd，J＝8.35，2.05Hz)，7.53(1H，d，J＝8.51Hz)，7.36(1H，s)，2.59(3H，s)。
部分2步骤C：将在部分2的步骤B中得到的中间体(23.0g，86.0mmol)溶于氯仿(400mL)中，并用溴(4.64mL，14.5g，90.3mmo)处理。在室温下，搅拌该混合物2小时，接着加入己烷(1000mL)，搅拌得到的混合物15分钟。通过过滤收集沉淀物，并用己烷、水洗涤和干燥。用NaHCO3洗涤滤液，并浓缩。对残余物进行色谱层析(硅胶，乙酸乙酯/CH2Cl2，0-5％)，得到另外的中间体(总共27.0g，91％)。1H NMR(500MHz，CHLOROFORM-d6)δppm 8.48-8.56(1H，m)，7.94(1H，dd，J＝8.35，2.05Hz)，7.56(1H，d，J＝8.20Hz)，7.48(1H，s)，4.46(2H，s)。
部分2步骤D：将在部分2的步骤C中得到的中间体(4.84g，14.0mmol)与在部分1中得到的3，5-二甲基吡嗪-2-胺(1.81g，14.7mmol)和乙腈(30mL)在密封管中混合。在100℃下，搅拌该混合物过夜，并冷却至室温。加入乙酸乙酯(60mL)，并收集沉淀物，然后用乙酸乙酯洗涤并干燥，得到3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-溴-1H-异色烯-1-酮氢溴酸盐(5.04g，80％)。MS m/z 370.2，372.2[M+H]+。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.50-8.54(1H，m)，8.34(1H，s)，8.21(1H，d，J＝1.89Hz)，8.02(1H，dd，J＝8.35，2.05Hz)，7.80(1H，d，J＝8.51Hz)，7.51-7.57(1H，m)，2.79(3H，s)，2.41(3H，d，J＝0.95Hz)。
部分2，步骤E：将在部分2的步骤D中得到的3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-溴-1H-异色烯-1-酮氢溴酸盐(1.13g，2.5mmol)与叔丁基4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸酯(1.55g，5.0mmol)、Pd2dba3(0.12g，0.013mmol)、KF(0.87g，15.0mmol)、t-Bu3PHBF4(0.087g，0.3mmol)和THF(10.0mL)混合。在氩气氛(Argon blanket)下，在60℃下搅拌反应混合物过夜。在冷却之后，用CH2Cl2(10mL)稀释该混合物并过滤。用CH2Cl2洗涤沉淀物，合并滤液并蒸发。在室温下，用在CH2Cl2中的10％TFA(55mL)处理残余物2小时。除去挥发物，并用NaHCO3中和残余物。在被蒸干之后，将残余物悬浮在CH2Cl2中的10％MeOH中，并过滤。对滤液进行色谱层析(硅胶，MeOH/CH2Cl2，0-20％)，得到呈白色粉末的标题化合物(0.92g，99％)。熔点：266℃(dec.)；MS m/z 373.2[M+H]+.1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.45(1H，s)，8.27-8.30(1H，m)，8.18(1H，d，J＝1.00Hz)，8.04(1H，dd，J＝1.00Hz)，7.88(1H，d，J＝8.51Hz)，7.56(1H，s)，6.41-6.49(1H，m)，3.80-3.87(2H，m)，3.38(2H，t，J＝6.15Hz)，2.76-2.81(2H，m)，2.75(3H，s)，2.39(3H，d，J＝0.95Hz)。
如下表1所示，本文公开的另外的化合物可以根据实施例12通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。
实施例13
化合物96的制备
将在实施例12中得到的化合物88(37.2mg，0.1mmol)与10％Pd/C(8.0mg)和EtOH(1.0mL)混合，并在室温下使用氢气球氢化过夜。用CH2Cl2(2.0mL)稀释该混合物，并经硅藻土过滤。收集滤液，并进行色谱层析(硅胶，在CH2Cl2中0-20％的MeOH)，得到呈白色粉末的标题化合物(21.0mg，56％)。熔点：218-220℃；MS m/z 375.2[M+H]+.1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm8.43(1H，s)，8.29(1H，d，J＝0.63Hz)，8.02(1H，d，J＝1.58Hz)，7.85(1H，d，J＝8.20Hz)，7.76(1H，dd，J＝8.20，1.89Hz)，7.54(1H，s)，3.38-3.47(2H，m)，2.96-3.10(3H，m)，2.76(3H，s)，2.40(3H，d，J＝0.95Hz)，1.97-2.08(2H，m)，1.76-1.92(2H，m)。
表1提供式(I)的化合物的游离碱形式的分离化合物，其可以根据所指定实施例的方法，通过替代合适的起始原料、试剂和反应条件来制备。还预期由式(I)的化合物的游离碱形式制备任何盐、同位素体、立体异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或互变异构体，并且进一步包括在本说明书的范围之内。当化合物的游离碱形式不是从盐形式分离时，本领域普通技术人员可以预期进行必需的反应以制备和分离化合物的游离碱形式。
术语“化合物(Cpd)”代表化合物编号，术语“实施例(Ex)”代表“实施例编号”(其中*指示上文提供化合物的相应实施例)，术语“M.P.”代表“熔点(℃)”，术语“MS”代表“质谱峰m/z M+，[M+H]+，[M+2H]+，[M-H]-或[M-2H]-”，术语“D”代表“分解/分解的”，术语“DR”代表“分解范围”，术语“S”代表“软化”，术语“ND”指示值“未确定”，和术语“NI”指示化合物“未分离”。
表1
或其盐、同位素体、立体异构体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或互变异构体。
生物学实施例
为了更详细地描述且有助于理解本说明书，提供下述非限制性生物学实例以更完整地说明本说明书的范围，且不应理解为特别地限制其范围。本领域技术人员视界之内能够确定的目前已知或以后研发的本说明书的这样的变化被认为落入如本说明书和下文所主张的范围之内。这些实施例阐述了本文所述的某些化合物在体外和/或体内的测试，并且证实了所述化合物通过增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中治疗SMA的有用性。式(I)的化合物增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中，并且提高由SMN2基因产生的Smn蛋白质的水平，因此，可用于治疗需要其的人类受试者中的SMA。
实施例1
SMN2小基因构建物
小基因构建物的制备
通过PCR，使用下述引物扩增对应于从外显子的5’端(ATAATTCCCCC)(SEQ IDNO.14)开始且终止于外显子8的核酸残基23(CAGCAC)(SEQ ID NO.15)的SM[N2基因区域的DNA：
正向引物：5’-CGCGGATCCATAATTCCCCCACCACCTC-3’(SEQ ID NO.16)
反向引物：5’-CGCGGATCCGTGCTGCTCTATGCCAGCA-3’(SEQ ID NO.17)
每个引物的5′端设计为在外显子6的5′端(GGATCC)(SEQ ID NO.18)和外显子8的第23个核苷酸后的3′端加入BamHI限制性核酸内切酶识别位点。使用该BamHI限制性核酸内切酶识别位点，将PCR片段克隆到原始pcDNA 3.1/Hygro载体的衍生物中，该载体如在美国专利公开US2005/0048549中公开的修饰。
使用HindIII位点和BamHI限制性位点，将新的UTR加入到修饰的载体中，其包含5′DEG UTR：
5’-TAGCTTCTTACCCGTACTCCACCGTTGGCAGCACGATCGCACGTCCCACGTGAACCATTGGTAAACCCTG-3’(SEQ ID NO.19)与BamHI限制性位点上游的起始密码子一起克隆到修饰的pcDNA3.1/Hygro载体中，和；
使用NotI限制性核酸内切酶识别位点和XhoI限制性核酸内切酶识别位点，将3′DEG UTR：
5’-ATCGAAAGTACAGGACTAGCCTTCCTAGCAACCGCGGGCTGGGAGTCTGAGACATCACTCAAGATATATGCTCGGTAACGTATGCTCTAGCCATCTAACTATTCCCTATGTCTTATAGGG-3’(SEQ ID NO.20)紧邻NotI限制性位点下游的终止密码子一起克隆到修饰的pcDNA3.1/Hygro载体中。另外，使用BamHI和NotI限制性位点，将缺乏起始密码子的荧光虫荧光素酶基因克隆到载体中。
得到的小基因包含(以5’至3’顺序)：5’-DEG UTR、起始密码子、形成BamHI限制性位点的六个另外的核苷酸、外显子6的核酸残基、SMN2的内含子6的核酸残基、SMN2的外显子7的核酸残基、SMN2的内含子7的核酸残基、和SMN2的外显子8的起始23个核酸残基、形成BamHI限制性位点的另外六个核苷酸和缺乏起始密码子的荧光虫荧光素酶基因。
通过定位诱变将单个腺嘌呤残基***SMN2的外显子7的核苷酸48之后。该小基因构建物称为SMN2-A。
来源于含有外显子6至8和***内含子的小基因的SMN2转录物概括其内源性pre-mRNA的剪接(Lorson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1999，96(11)，6307)。产生包含外显子6至8和***内含子及随后的荧光素酶指示基因的SMN2-可变剪接报告基因构建物(reporter construct)。该构建物的显著特征是荧光素酶基因中缺乏起始密码子，通过将核苷酸***外显子7的核酸48之后使外显子7的终止密码子失活(在编码SMN蛋白质的开放读码框中)，以及紧邻外显子6的上游加入起始密码子(ATG)。单个腺嘌呤(SMN2-A)***外显子7的核酸残基48之后。
SMN2小基因被设计为使得当外显子7存在于mRNA中时荧光素酶报告基因(reporter)与紧邻外显子6的上游的ATG起始密码子在框内，并且如果SMN2的外显子7早pre-mRNA的剪接期间除去，则荧光素酶报告基因与紧邻外显子6的上游的ATG起始密码子在框外。另外，在不存在外显子7的情况下，从紧邻外显子6的ATG起始密码子开始的开放读码框在SMN的外显子8的片段中包含终止密码子。因此，在增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中的化合物的存在下，产生包含外显子7的更多转录物和功能性更强的报告基因。该说明的示意图可以发现于图1中。
来自SMN2-A构建物SEQ ID NO.21的小基因的DNA序列提供于图2a中。小基因SMN2-A子序列的图显示在图2b中。
实施例2
培养细胞中SMN2小基因mRNA剪接RT-qPCR测定
使用基于逆转录-定量PCR(RT-qPCR)测定来定量在HEK293H细胞系中含有SMN2外显子7的全长SMN2小基因mRNA的水平，所述HEK293H细胞系用所述小基因稳定地转染且用试验化合物处理。
材料
试验设计。将用上述SMN2-A小基因构建物稳定转染的HEK293H细胞(10，000个细胞/孔)以200μL的细胞培养基(DMEM+10％FBS，含有200μg/ml的潮霉素)接种在96孔平底培养板中，并且立即使培养板漩涡以确保细胞合适地分散，形成均匀的单细胞层。使细胞附着至少4-6小时。将试验化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍，产生7点浓度曲线。将试验化合物的溶液(1μL，在DMSO中200x)加入到含每种细胞的孔中，并且将培养板在细胞培养恒温箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中培养24小时。每种试验化合物浓度制备两次平行测定。然后，将细胞溶解在Cells-To-Ct裂解缓冲液中，并且将溶解产物贮存在-80℃下。
使用表3中提供的下述引物和探针，定量全长SMN2-A小基因和GAPDH mRNA。引物SMN正向A(SEQ ID NO.1)杂交至外显子7中的核苷酸序列(核苷酸22核苷酸40)，引物SMN反向A(SEQ ID NO.2)杂交至荧光虫荧光素酶的编码序列中的核苷酸序列，SMN探针A(SEQ IDNO.3)杂交至外显子7中的核苷酸序列(核苷酸50至核苷酸54)和外显子8中的核苷酸序列(核苷酸1至核苷酸21)。这三种寡核苷酸的组合仅检测SMN1或SMN2小基因(RT-qPCR)，且不能检测内源性SMN1或SMN2基因。
表3
1引物和探针是由PTCTherapeutics，Inc.设计的；2从Life Technologies，Inc.(之前为Invitrogen)市售可获得的。
SMN正向引物和反向引物以0.4μM的最终浓度使用。SMN探针以0.15μM的最终浓度使用。GAPDH引物以0.2μM的最终浓度使用，探针以0.15μM的最终浓度使用。
SMN2-小基因GAPDH混合物(15μL总体积)是通过混合下述制备的：7.5μL的2x RT-PCR缓冲液、0.4μL的25x RT-PCR酶混合物、0.75μL的20x GAPDH引物-探针混合物、4.0075μL的水、2μL的10-倍稀释的细胞溶解产物、0.06μL的100μM SMN正向引物、0.06μL的100μM SMN反向引物、和0.225μL的100μM SMN探针。
PCR是在下述温度下进行指定的时间：步骤1：48℃(15分钟)；步骤2：95℃(10分钟)；步骤3：95℃(15秒)；步骤4：60℃(1分钟)；然后重复步骤3和4，总共40个循环。
各个反应混合物同时包含SMN2-A小基因和GAPDH引物/探针集(多路设计)，从而允许同时测量两种转录物的水平。
两种SMN剪接产物是由SMN2小基因产生的。对应于全长SMN2mRNA的含有外显子7的第一个剪接产物在本文中使用术语“SMN2小基因FL”提及。缺乏外显子7的第二个剪接产物在本文中使用术语“SMN2小基因Δ7”提及。
相对于用载体对照处理的细胞中SMN2小基因FL mRNA的增加是使用修改的ΔΔCt方法(如Livak和Schmittgen，Methods，2001，25：402-8)中所述由实时PCR数据确定。扩增效率(E)是分别由SMN2小基因FL和GAPDH的扩增曲线的斜率计算的。然后，将SMN2小基因FL和GAPDH的丰度计算为(1+E)-Ct，其中Ct为各个扩增子的阈值。将SMN2小基因FL的丰度标准化为GAPDH丰度。然后，用来自试验化合物-处理的样品的标准化的SMN2小基因FL丰度除以来自载体处理的细胞的标准化的SMN2小基因FL丰度，以确定相对于载体对照的SMN2 FL mRNA的水平。
结果。如图3所示，在低浓度下，用化合物65(图3a)和化合物69(图3b)处理的细胞增加了SMN2小基因FL mRNA。相对未处理的细胞，两种试验化合物死外显子7包含完全恢复。
对于本文公开的式(I)的化合物或其形式，表4提供产生全长SMN2 mRNA的EC1.5x，其得自从根据生物学实施例2的方法产生每种试验化合物的7-点浓度数据。术语“产生全长SMN2 mRNA的EC1.5x”定义为试验化合物的浓度，其有效地提高全长SMN2 mRNA的量至相对于载体处理的细胞更大1.5倍的水平。产生全长SMN2 mRNA的EC1.5x在＞3μM至≤30μM之间用一个星号(*)指示，EC1.5x在＞1μM至≤3μM之间用两个星号(**)表示，EC1.5x在＞0.3μM至≤1μM之间用三个星号(***)表示，EC1.5x在＞0.1μM至≤0.3μM之间用四个星号(****)表示，且EC1.5x≤0.1μM用五个星号(*****)表示。
表4
实施例3
培养细胞中内源性SMN2 mRNA RT-qPCR剪接测定
使用基于逆转录-定量PCR(RT-qPCR)测定来定量用试验化合物处理的含有SMN2基因的初级细胞和细胞系中全长和Δ7 SMN2 mRNA的水平。
材料
试验设计。将GM03813 SMA患者细胞(5,000个细胞/孔)以200μL的细胞培养基(DMEM+10％FBS)接种在96孔平底培养板中，并且立即使培养板漩涡以确保细胞合适地分散，形成均匀的单细胞层。使细胞附着至少4-6小时。将试验化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍，产生7点浓度曲线。将试验化合物的溶液(1μL，在DMSO中200x)加入到每个试验孔中，并向每个对照孔中加入1μL的DMSO。将培养板在细胞培养恒温箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中培养24小时。然后，将细胞溶解在Cells-To-Ct裂解缓冲液中，并且将溶解产物贮存在-80℃下。
使用表5中提供的下述引物和探针，定量SMN2-特定剪接产物和GAPDH mRNA。引物SMN FL正向B(ID NO.7)杂交至外显子7中的核苷酸序列(核苷酸32核苷酸54)和外显子8中的核苷酸序列(核苷酸1至核苷酸4)，引物SMNΔ7正向B(SEQ ID NO.8)杂交至外显子6中的核苷酸序列(核苷酸87至核苷酸111)和外显子8中的核苷酸序列(核苷酸1至核苷酸3)，引物SMN反向B(SEQ ID NO.9)杂交至外显子8中的核苷酸序列(核苷酸39至核苷酸62)，探针SMNProbe B(SEQ ID NO.10)杂交至外显子8中的核苷酸序列(核苷酸7至核苷酸36)。这些引物和探针杂交至人类SMN1和SMN2 mRNA共有的核苷酸序列。因为在实施例3中使用的SMA患者细胞仅含有SMN2基因，因此，RT-qPCR仅可以定量SMN2全长和Δ7mRNA。
表5
1引物和探针是由PTC Therapeutics，Inc.设计的；2从Life Technologies，Inc.(之前为Invitrogen)市售可获得的。
SMN正向引物和反向引物以0.4μM的最终浓度使用。SMN探针以0.15μM的最终浓度使用。GAPDH引物以0.1μM的最终浓度使用，且探针以0.075μM的最终浓度使用。使用One-Step RT-PCR试剂盒作为实时PCR混合物。
SMN-GAPDH混合物(10μL总体积)是通过混合如下物质制备的：5μL的2x RT-PCR缓冲液、0.4μL的25x RT-PCR酶混合物、0.25μL的20x GAPDH引物-探针混合物、1.755μL的水、2.5μL的细胞溶解产物、0.04μL的100μM SMN FL或SMNΔ7正向引物、0.04μL的100μM SMN反向引物、和0.015μL的100μM探针。
PCR是在下述温度下进行指定的时间：步骤1：48℃(15分钟)；步骤2：95℃(10分钟)；步骤3：95℃(15秒)；步骤4：60℃(1分钟)；然后重复步骤3和4，总共40个循环。
各个反应混合物同时包含SMN2 FL和GAPDH或SMN2Δ7和GAPDH引物/探针集(多路设计)，从而允许同时测量两种转录物的水平。
内源性SMN2基因产生两种可变剪接的mRNA。含有外显子7的全长SMN2 mRNA在本文中使用术语“SMN2 FL”提及。缺乏外显子7的截短的mRNA在本文中使用术语“SMN2 Δ7”提及。
相对于在用载体对照处理的细胞中的SMN2 FL的增加和SMN2 Δ7 mRNA的减少是使用修正的ΔΔCt方法(如Livak和Schmittgen，Methods，2001，25：402-8)中描述的，从实时PCR数据确定的。扩增效率(E)是分别由SMN2 FL、SMN2 Δ7和GAPDH的扩增曲线的斜率计算的。然后，将SMN2 FL、SMN2 Δ7和GAPDH的丰度计算为(1+E)-Ct，其中Ct为各个扩增子的阈值。将SMN2 FL和SMN2 Δ7的丰度标准化为GAPDH丰度。然后，用来自试验化合物-处理的样品的标准化的SMN2 FL和SMN2 Δ7丰度分别除以来自载体处理的细胞的标准化的SMN2 FL和SMN2 Δ7丰度，以确定相对于载体对照的SMN2 FL和SMN2 Δ7 mRNA的水平。
结果。如图4所示，相对于用载体处理的细胞，用递增浓度的化合物65(图4a)和化合物69(图4b)处理的细胞含有逐渐更多的SMN2 FL mRNA和更少的SMN2 Δ7 mRNA，指示SMN2可变剪接得到校正。
实施例4
培养细胞中内源性SMN2 mRNA终点半定量分析RT-PCR剪接测定
使用终点逆转录-PCR剪接测定显现(visualize)和定量用试验化合物处理的含有SMN2基因的初级细胞和细胞系中全长和Δ7 SMN2 mRNA的水平。
材料
试验设计。将GM03813 SMA患者细胞(5,000个细胞/孔)以200μL的细胞培养基(DMEM+10％FBS)接种在96孔平底培养板中，并且立即使培养板漩涡以确保细胞合适地分散，形成均匀的单细胞层。使细胞附着至少4-6小时。将试验化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍，产生7点浓度曲线。将试验化合物的溶液(1μL，在DMSO中200x)加入到每个试验孔中，并向每个对照孔中加入1μL的DMSO。将培养板在细胞培养恒温箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中培养24小时。然后，将细胞溶解在Cells-To-Ct裂解缓冲液中，并且将溶解产物贮存在-80℃下。
使用表6中提供的下述引物，定量SMN FL和Δ7mRNA。这些引物杂交至人类SMN1和SMN2 mRNA共有的外显子6中的核苷酸序列(SMN正向C，SEQ ID NO.11)(核苷酸43至核苷酸63)和外显子8中的核苷酸序列(SMN反向C，SEQ ID NO.12)(核苷酸51至核苷酸73)。因为在实施例4中使用的SMA患者细胞仅含有SMN2基因，因此RT-PCR仅可以显现和定量全长和SMN2Δ7 mRNA。
表6
1引物由PTC Therapeutics，Inc设计。
为了合成cDNA，将5μL的溶解产物、4μL的5xiScript反应混合物、1μL逆转录酶和10μL水混合，并在25℃下培养5分钟，接着在42℃下培养30分钟，之后在85℃下培养5分钟。将cDNA溶液储存在-20℃下。
为了进行终点PCR，在96孔semiskirted PCR培养板中混合5μL的cDNA、0.2μL的100μM正向引物、0.2μL的100μM反向引物、和22.5μL的聚合酶超级混合物。PCR是在下述温度下进行指定的时间：步骤1：94℃(2分钟)，步骤2：94℃(30秒)，步骤3：55℃(30秒)，步骤4：68℃(1分钟)，然后重复步骤2至4，总共33个周期，然后保持在4℃下。
将10μl的每种PCR样品在2％琼脂糖E-凝胶上电泳分离14分钟，用双链DNA(dsDNA)染色剂(例如，溴化乙锭)染色，并使用凝胶成像器显现。
结果。如图5所示，用递增浓度的化合物65(图5a)和化合物69(图5b)处理的细胞含有逐渐更多的SMN2 FL mRNA和更少的SMN2 Δ7 mRNA，指示SMN2可变剪接得到校正。
实施例5
动物组织中SMN2 mRNA RT-qPCR剪接测定
使用基于逆转录-定量PCR(RT-qPCR)测定定量来自用试验化合物处理的小鼠的组织中全长和Δ7 SMN2 mRNA的水平。
材料
试验设计。通过用再悬浮在0.5％HPMC和0.1％吐温-80中的试验化合物每天经口管饲两次(BID)处理C/C-等位基因SMA小鼠，共处理10天。收集组织样品，并且瞬时冷冻供RNA纯化。
在TissueLyser II中，使用不锈钢珠，在20Hz下，将组织样品(20-40mg)在QIAzol溶解试剂中均质化2分钟。在加入氯仿之后，将匀浆液通过离心分离成水相和有机相。萃取分配到上层水相中的RNA，并加入乙醇以提供合适的结合条件。然后，将样品上样于来自RNeasy微型试剂盒的RNeasy离心柱，其中全部RNA结合到膜。将RNA洗脱在不含RNase的水中，然后储存在-20℃下，接着在7900HT热循环仪上使用TaqMan RT-qPCR分析。将全部RNA稀释10倍，且向TaqMan RT-qPCR混合物中加入2.5μL稀释的样品。
使用表7中提供的下述引物和探针，鉴别SMN2剪接产物。引物SMN FL正向B(SEQ IDNO.7)杂交至外显子7和8中的核苷酸序列，引物SMNΔ7正向B(SEQ ID NO.8)杂交至外显子6和8中的核苷酸序列，引物SMN反向B(SEQ ID NO.9)杂交至外显子8中的核苷酸序列，探针SMN Probe B(SEQ ID NO.10)杂交至外显子8中的核苷酸序列。这些引物和探针杂交至人类SMN1和SMN2mRNA共有的核苷酸序列。因为在实施例5中使用的SMA患者细胞仅含有SMN2基因，因此，RT-qPCR仅可以定量SMN2全长和Δ7 mRNA。
表7
1引物和探针是由PTC Therapeutics，Inc设计。
SMN正向和反向引物以0.4μM的最终浓度使用。SMN探针以0.15μM的最终浓度使用。SMN-GAPDH混合物(10μL总体积)是通过混合如下物质制备的：5μL的2x RT-PCR缓冲液、0.4μL的25x RT-PCR酶混合物、0.5μL的20x GAPDH引物-探针混合物、1.505μL的水、2.5μL的RNA溶液、0.04μL的100μM正向引物、0.04μL的100μM反向引物、和0.015μL的100μM SMN探针。
每个PCR循环是在下述温度下进行指定的时间：步骤1：48℃(15分钟)；步骤2：95℃(10分钟)；步骤3：95℃(15秒)；步骤4：60℃(1分钟)；然后重复步骤3和4，总共40个循环。
各个反应混合物同时包含SMN2 FL和GAPDH或SMN2 Δ7和GAPDH引物/探针集(多路设计)，从而允许同时测量两种转录物的水平。
相对于在用载体对照处理的动物组织中的SMN2FL的增加和SMN2 Δ7 mRNA的减少是使用修改的ΔΔCt方法(如Livak和Schmittgen，Methods，2001，25：402-8)中描述的，从实时PCR数据确定的。扩增效率(E)是分别由SMN2 FL、SMN2 Δ7和GAPDH的扩增曲线的斜率计算的。然后，将SMN2 FL、SMN2 Δ7和GAPDH的丰度计算为(1+E)-Ct，其中Ct为各个扩增子的阈值。将SMN2FL和SMN2 Δ7的丰度标准化为GAPDH丰度。然后，用来自试验化合物-处理的样品的标准化的SMN2 FL和SMN2 Δ7丰度分别除以来自载体处理的细胞的标准化的SMN2 FL和SMN2 Δ7丰度，以确定相对于载体对照的SMN2 FL和SMN2 Δ7mRNA的水平。
结果。如图6所示，相对于用载体处理的组织，用递增浓度的化合物65(图6a)和化合物69(图6b)处理的动物组织含有逐渐更多的SMN2 FL mRNA和更少的SMN2 Δ7 mRNA，指示SMN2可变剪接得到校正。
实施例6
动物组织中内源性SMN2 mRNA终点半定量分析RT-PCR剪接测定
使用终点逆转录-PCR(RT-qPCR)剪接测定定量来自用试验化合物处理的小鼠的组织中全长和Δ7 SMN2 mRNA的水平。
材料
试验设计。通过用再悬浮在0.5％HPMC和0.1％吐温-80中的试验化合物每天经口管饲BID处理C/C-等位基因SMA小鼠，共处理10天。收集组织样品，并且瞬时冷冻供RNA纯化。
在TissueLyser II中，使用不锈钢珠粒，在20Hz下，将组织样品(20-40mg)在QIAzol溶解试剂中均质化2分钟。在加入氯仿之后，将匀浆液通过离心分离成水相和有机相。萃取分配到上层水相中的RNA，并加入乙醇以提供合适的结合条件。然后，将样品施用于来自RNeasy微型试剂盒的RNeasy离心柱，其中全部RNA结合到膜。将RNA洗脱在不含RNase的水中，然后储存在-20℃下。
使用表8中提供的下述扩增引物，鉴别SMN2剪接产物。这些引物和探针杂交至人类SMN1和SMN2 mRNA共有的外显子6中的核苷酸序列(SMN正向D，SEQ ID NO.13)(核苷酸22至核苷酸46)和外显子8中的核苷酸序列(SMN反向C，SEQ ID NO.12)。
表8
1引物由PTC Therapeutics，Inc.设计。
为了合成cDNA，将1μL的RNA溶液(25-50ng)、4μL的5xiScript反应混合物、1μL的逆转录酶、和10μL的水混合，并在25℃下培养5分钟，接着在42℃下培养30分钟，之后在85℃下培养5分钟。将cDNA溶液储存在-20℃下。
为了进行终点PCR，在96孔semiskirted PCR培养板中混合5μL的cDNA、0.2μL的100μM正向引物、0.2μL的100μM反向引物、和22.5μL的聚合酶超级混合物。PCR是在下述温度下进行指定的时间：步骤1：94℃(2分钟)，步骤2：94℃(30秒)，步骤3：55℃(30秒)，步骤4：68℃(1分钟)，然后重复步骤2至4，总共33个周期，然后保持在4℃下。
将10μl的每种PCR样品在2％琼脂糖E-凝胶上电泳分离14分钟，用dsDNA染色剂(例如，溴化乙锭)染色，并使用凝胶成像器显现。
结果。如图7所示，用递增浓度的化合物65处理的组织含有逐渐更多的SMN2 FLmRNA和更少的SMN2 Δ7 mRNA，指示SMN2可变剪接得到校正。
实施例7
培养细胞中的Smn蛋白质测定
使用SMN HTRF(均相时间分辨荧光)测定用于定量用试验化合物处理的SMA患者成纤维细胞中Smn蛋白质的水平。将测定结果显示在表9中。
材料
试验设计。将细胞解冻并培养在DMEM-10％FBS中72小时。将细胞用胰蛋白酶处理，计数并再悬浮于DMEM-10％FBS中至浓度为25,000个细胞/mL。将细胞悬液以5,000个细胞/孔接种在96孔微量滴定板中，并培养3至5小时。为了提供对照信号，96孔培养板中的三(3)个孔不接收细胞，因此，充当空白对照孔。将试验化合物在100％中连续稀释3.16倍以产生7点浓度曲线。将1μL的试验化合物溶液转移到含有细胞的孔中，并且将细胞在细胞培养恒温箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中培养48小时。每种试验化合物浓度配置样品一式三份。在48小时之后，从孔中除去上清液，并且向各孔中加入25μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，并在室温下振荡培养1小时。加入25μl的稀释剂，然后将35μl所得溶解产物转移到384-孔培养板中，其中各孔含有5μl的抗体溶液(抗-SMN d2和抗-SMN kryptate在SMN重构缓冲液中1∶100稀释)。将培养板离心1分钟以使溶液到达孔底，然后，在室温下培养过夜。在EnVision多标记平板读数器(Perkin-Elmer)上测量培养板的各孔在665nm和620nm的荧光。
通过将在665nm的信号除以在620nm的信号来计算各个样品、空白和载体对照孔的标准化荧光信号。标准化信号可解释由于溶解产物的基质效应产生的可能荧光猝灭。如下计算各个样品孔的ΔF值(以％值测量Smn蛋白质丰度)：从各个样品孔的标准化荧光减去空白对照孔的标准化平均荧光，然后将该差值除以空白对照孔的标准化平均荧光且将得到的值乘以100。各个样品孔的ΔF值代表从试验化合物处理的样品的Smn蛋白质丰度。将各个样品孔的ΔF值除以载体对照孔的ΔF值，以计算Smn蛋白质丰度相对于载体对照的增加倍数。
结果。如图8所示，用化合物65(图8a)和化合物69(图8b)处理的SMA 1型患者成纤维细胞显示Smn蛋白质表达的剂量依赖性增强，如通过SMN HTRF测定所测量的。
对于本文公开的式(I)的化合物或其形式，表9提供Smn蛋白质表达的EC1.5x，其得自从根据生物学实施例7的方法产生每种试验化合物的7-点浓度数据。术语“Smn蛋白质表达的EC1.5x”定义为试验化合物的浓度，其使SMA患者成纤维细胞中有效地产生与由DMSO载体对照产生的量相比1.5倍的量的Smn蛋白质。Smn蛋白质表达的EC1.5x在＞3μM至≤10μM之间用一个星号(*)表示，EC1.5x在＞1μM至≤3μM之间用两个星号(**)表示，EC1.5x在＞0.3μM至≤1μM之间用三个星号(***)表示，且EC1.5x≤0.3μM用五个星号(*****)表示。
表9
对于本文公开的式(I)的化合物或其形式，表10提供Smn蛋白质的最大增加倍数(倍数)，其得自从根据生物学实施例7的方法产生每种试验化合物的7-点浓度数据。最大增加倍数≤1.2用一个星号(*)表示，增加倍数在＞1.2且≤1.35之间用两个星号(**)指示，增加倍数在＞1.35且≤1.5之间用用三个星号(***)表示，增加倍数在＞1.5且≤1.65之间用四个星号(****)表示，且增加倍数＞1.65之间用五个星号(*****)表示。
表10
实施例8
Gems计数(SmR-依赖性核斑计数)测定
Smn蛋白质的水平与核灶(也称为gems)的量直接相关，该核灶是在用荧光标记的抗-Smn抗体染色细胞时所产生的(Liu和Dreyfuss，EMBO J.，1996，15：3555)。Gems为多蛋白质复合物，其形成是由Smn蛋白质成核，并且使用gems计数测定来评估细胞中Smn蛋白质的水平。如本文所述，gems计数测定用于定量用试验化合物处理的SMA患者成纤维细胞中Smn蛋白质的水平。
材料
试验设计：将细胞解冻，并在DMEM-10％FBS中培养72小时，然后用胰蛋白酶处理，计数并再悬浮在DMEM-10％FBS中至100,000个细胞/mL。将2mL的细胞悬液铺板在具有无菌盖玻片的6-孔细胞培养板中，并培养3至5小时。将试验化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍以产生7点稀释曲线。将10μL的试验化合物溶液加入到各个含细胞的孔中，并在细胞培养恒温箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中培养48小时。每种试验化合物浓度配置一式两份。使用0.5％最终浓度的含细胞DMSO作为对照。
从含有盖玻片的孔中吸出细胞培养基，并用冷PBS轻轻地洗涤三次。通过在室温下同时在低聚甲醛中培养20分钟固定细胞。接着，用冷PBS洗涤细胞两次，之后在室温下用在PBS中的0.05％Triton X-100培养5分钟，以便渗透细胞。在用冷PBS洗涤固定的细胞三次之后，用10％FBS将其阻断1小时。加入60μL的在阻断缓冲液中以1∶1000稀释的一抗，并在室温下培养该混合物1小时。将细胞用PBS洗涤三次，并加入60μL的在阻断缓冲液中以1∶1500稀释的二抗，然后，在室温下培养该混合物1小时。借助于封固剂将盖玻片固定在载玻片上，并使其干燥过夜。将指甲油应用于盖玻片的侧面且将载玻片避光储存。使用具有63x Plan-Apochromat，NA＝1.4物镜的Zeiss Axovert 135进行免疫荧光检测和计数。计数每≥150核的gems的数目，并使用DMSO和10nM硼替佐米作为对照计算活化的％。对于每种试验化合物，在所有波长下检查细胞以鉴别具有固有荧光的试验化合物。
结果。如图9所示，相对于用DMSO处理的细胞，用化合物65(图9a)和化合物69(图9b)处理的SMA 1型患者的细胞含有逐渐更多的gems。
实施例9
人运动神经元中的Smn蛋白质测定
使用Smn免疫荧光共焦显微镜定量用试验化合物处理的人运动神经元中的Smn蛋白质的水平。
试验设计。用各种浓度的试验化合物处理来源于SMA iPS细胞(Ebert等人，Nature，2009，457：2770；和Rubin等人，BMC Biology，2011，9：42)的人类运动神经元72小时。使用基本上如中描述的Makhortova等人，Nature Chemical Biology，2011，7：544Smn免疫染色和共荧光显微镜焦定量细胞核中Smn蛋白质的水平。将化合物处理的样品中Smn蛋白质的水平标准化为载体处理的样品中的水平，并呈化合物浓度的函数绘图。
结果。如图10所示，用递增浓度的化合物65(图10a)和化合物69(图10b)处理72小时的人类运动神经元在核中含有逐渐更多的Smn蛋白质。
实施例10
动物组织中的Smn蛋白质测定
该Smn蛋白质测定比较来自试验化合物处理的小鼠的组织与来自DMSO载体处理的小鼠的组织，以确定由人类SMN2基因产生的Smn蛋白质的水平增加。
材料
试验设计。称重Safe-Lock管中的组织样品，并基于各种类型的组织的重量与体积比加入一定体积的含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液：脑(50mg/mL)、肌肉(50mg/mL)和脊髓(25mg/mL)。
使用TissueLyzer，通过珠磨使组织均质化。向样品中加入5mm不锈钢珠粒，并在TissueLyzer中在30Hz下用力振摇5分钟。然后，将样品在微量离心机中以14,000×g离心20分钟，并将匀浆液转移到PCR培养板。对于HTRF，将匀浆液在RIPA缓冲液中稀释至约1mg/mL，并且对于使用BCA蛋白质测定的总蛋白测量，稀释至约0.5mg/mL。对于SMN HTRF测定，将35μL的组织匀浆转移到含有5μL的抗体溶液(每种抗SMNd2和抗SMN Kryptate在重构缓冲液中1∶100稀释)的384孔培养板中。为了提供对照信号，在培养板中的三(3)个孔仅含有RIPA裂解缓冲液，因此充当空白对照孔。将培养板离心1分钟以使溶液到达孔底，然后，在室温下培养过夜。在EnVision多标记平板读数器(Perkin-Elmer)上测量培养板的各孔在665nm和620nm的荧光。使用BCA测定，根据制造商的方案测量组织匀浆中的总蛋白质。
通过将在665nm的信号除以在620nm的信号来计算各个样品、空白和载体对照孔的标准化荧光信号。标准化信号可解释由于组织匀浆的基质效应产生的可能荧光猝灭。如下计算各个组织样品孔的ΔF值(以％值测量Smn蛋白质丰度)：从各个样品孔的标准化荧光减去空白对照孔的标准化平均荧光，然后将该差值除以空白对照孔的标准化平均荧光且将得到的值乘以100。将各个组织样品孔的ΔF值除以总该组织样品的总蛋白质量(使用BCA测定来测定)。各个组织样品的Smn蛋白质丰度相对于载体对照的变化是以在试验化合物存在下组织样品的ΔF值与载体对照信号的平均ΔF值的百分比差值除以载体对照信号的平均ΔF值。
实施例11
成年C/C-等位基因SMA小鼠组织中的Smn蛋白质测定
成年C/C-等位基因SMA小鼠的Smn蛋白质测定中使用的组织是如实施例10描述的制备的。该测定评估用试验化合物处理的C/C-等位基因SMA小鼠10天是否使由SMN2基因产生的Smn蛋白质的水平提高。
材料
试验设计。C/C-等位基因SMA小鼠每天以10mg/kg经口BID(在具有0.1％吐温80的0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)中)给予试验化合物或载体，共施用10天。年龄-匹配的杂合小鼠给予载体作为对照。收集组织以便根据实施例10分析蛋白质水平。
结果。如图11所示，相对于载体组，用化合物65(图11a)和化合物69(图11b)以10mg/kg BID处理10天的成年C/C-等位基因SMA小鼠的脑、脊髓、肌肉和肝组织中总蛋白标准化的Smn水平增加。
实施例12
新生Δ7 SMA小鼠组织中的Smn蛋白质
使用新生SMA小鼠组织中Smn蛋白质的测定确定用试验化合物处理是否提高由SMN2基因产生的Smn蛋白质水平。
材料
试验设计。SMA D7纯合敲除小鼠在出生后(PND)第3天至PND 9腹膜内(iP)给予试验化合物或载体(100％DMSO)一天一次(QD)。收集组织进行根据实施例10的蛋白质水平的分析。
结果。如图12所示，用指定剂量的化合物65处理新生SMA D7纯合敲除小鼠7天QD的脑(图12a)、脊髓(图12b)和肌肉(图12c)组织中总蛋白标准化的Smn水平剂量依赖性增加。
实施例13
新生Δ7 SMA小鼠的体重
使用新生SMA小鼠的体重变化来确定用试验化合物处理是否改善体重。
材料
试验设计。腹膜内(iP)给予SMA D7纯合敲除小鼠试验化合物或载体(100％DMSO)QD，从PND 3直到给予方案转变成经口给予BID具有0.1％吐温80的的0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)，所给予剂量高于IP所用剂量的3.16倍。每天记录用试验化合物或载体处理的SMAD7小鼠和年龄匹配的杂合小鼠的体重。
结果。如图13所示，用化合物65(图13a)和化合物69(图13b)IP QD给予从PND 3至PND 23，然后BID经口给予从PND 24直到研究结束处理的新生SMA D7纯合敲除小鼠的体重与载体处理的小鼠相比得到改善。
实施例14
新生Δ7 SMA小鼠的翻正反射
使用新生SMA小鼠的翻正反射的功能性变化来确定用试验化合物处理是否改善翻正反射。
材料
试验设计。腹膜内(iP)QD给予SMA D7纯合敲除小鼠试验化合物或载体(100％DMSO)，从PND 3直到给予方案转变成经口给予BID具有0.1％吐温80的的0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)，所给予剂量高于IP所用剂量的3.16倍。翻正反射时间是小鼠在其背躺下来后翻转站立(flip over onto its feet)所花费的时间。每只小鼠的翻正反射测量5次(每次试验的最长时间为30秒)，每次测量间隔5分钟。在PND 10、14和18测量用试验化合物或载体处理的SMA D7纯合敲除小鼠和年龄-匹配杂合小鼠的翻正反射时间，并绘图。
结果。如图14所示，从PND 3 IP QD给予化合物65(图15a)和化合物69(图15b)处理的新生SMA D7纯合敲除小鼠的翻正反射与载体处理的小鼠相比得到改善。在PND 18，用化合物处理的新生SMA D7纯合敲除小鼠的翻正时间类似于与年龄匹配的杂合小鼠的翻正时间。
实施例15
新生Δ7 SMA小鼠的存活率
使用存活小鼠的数量随时间推移的变化确定用试验化合物处理是否改善存活率。
材料
试验设计。腹膜内(iP)QD给予SMA D7纯合敲除小鼠试验化合物或载体(100％DMSO)，从PND 3直到给予方案转变成以高于IP所用剂量的3.16倍的剂量经口给予BID具有0.1％吐温80的0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)，随后转变成以高于IP所用剂量的6.32倍的剂量经口给予QD具有0.1％吐温80的0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)。每天记录各组中存活小鼠的书目，且作为小鼠总数的百分比绘图。收集SMA D7和年龄匹配的杂合小鼠的组织进行Smn蛋白质水平的测量，并且如实施例10中详述进行加工。将组织中所测量的总蛋白质标准化的Smn蛋白质水平作为年龄-匹配的杂合小鼠组织中的Smn蛋白质水平的百分比绘图，杂合小鼠的Smn水平设定为100％。试验化合物处理的小鼠组织中Smn蛋白质的水平(相对于杂合小鼠组织中)以图中每个条上百分比值表示。
结果。如图15所示，用化合物65(图15a)和化合物69(图15b)IP QD 给予从PND 3至PND 23，然后BID经口给予从PND 24直到研究结束处理的新生SMA D7纯合敲除小鼠的存活率与载体处理的小鼠相比得到改善。
如图16所示，测量用化合物65(图16a)处理后直到PND 144和用化合物69(图16b)从PND 3直到PND 80和83处理的SMA D7纯合敲除小鼠的和肌肉组织中的Smn蛋白质水平，并相对于载体处理的年龄匹配的杂合小鼠绘图。
实施例16
培养细胞中人类SMN1小基因mRNA终点半定量分析RT-PCR剪接测定
使用RT-PCR测定来显现和定量用试验化合物处理的表达人类SMN1小基因构建物的初级细胞和细胞系中人类SMN1小基因全长和Δ7mRNA的水平。
材料
SMN1小基因构建物
小基因构建物的制备
使用生物学实施例1中描述关于制备SMN2小基因构建物的方法，通过使用位点定向诱变，用胞嘧啶替代SMN2-A小基因构建物的外显子7的第六个核苷酸(胸腺嘧啶残基)产生小基因的SMN1型式。因此，类似于SMN2-A小基因构建物，SMN1小基因构建物在外显子7的核苷酸残基48之后插有单一腺嘌呤残基。SMN1小基因构建物称为SMN1-A。
试验设计。在每孔具有15ng的SMN1-A小基因报告基因质粒的96孔培养板中，使用FuGENE-6试剂转染HEK293H细胞(10,000个细胞/孔/199μL)。在转染之后，将细胞培养24小时。将试验化合物在100％DMSO中连续稀释3.16倍，以产生7-点浓度曲线。向每个试验孔中加入试验化合物的溶液(1μL，在DMSO中200x)。向每个对照孔中加入1μL的DMSO。将培养板在细胞培养恒温箱(37℃，5％CO2，100％相对湿度)中培养7小时。然后，将细胞溶解在Cells-To-Ct裂解缓冲液中，并且将溶解产物贮存在-80℃下。
从SMN1小基因产生两种SMN剪接的mRNA。术语“SMN1小基因FL”指含有外显子7、对应于全长SMN1 mRNA的第一个剪接产物。术语“SMN1小基因Δ7”指缺乏外显子7的第二个产物。
使用表11中的引物扩增SMN小基因FL和Δ7mRNA。引物SMN正向C(SEQ ID NO.11)杂交至外显子6中的核苷酸序列(核苷酸43至核苷酸63)、引物SMN反向A(SEQ ID NO.2)杂交至荧光虫荧光素酶的编码序列中的核苷酸序列。这两种寡核苷酸的组合仅检测SMN1或SMN2小基因(RT-PCR)，且不能检测内源性SMN1或SMN2基因。因为实施例16中使用的SMA患者细胞仅用人类SMN1小基因转染，因此RT-PCR可仅显现和定量SMN1小基因全长和SMN1小基因Δ7mRNA。
表11
1引物由PTC Therapeutics，Inc.设计。
为了合成cDNA，将5μL的溶解产物、4μL的5xiScript反应混合物、1μL逆转录酶和10μL水混合，并在25℃下培养5分钟，接着在42℃下培养30分钟，之后在85℃下培养5分钟。将cDNA溶液储存在-20℃下。
为了进行终点PCR，5μL的cDNA、0.2μL的100μM正向引物、0.2μL的100μM反向引物、和22.5μL的在96孔semiskirted PCR培养板中混合聚合酶超级混合物。PCR是在下述温度下进行指定的时间：步骤1：94℃(2)，步骤2：94℃(30秒)，步骤3：55℃(30秒)，步骤4：68℃(1分钟)然后重复步骤2至4，总共33个周期，然后保持在4℃下。
将10μL的每种PCR样品在2％琼脂糖E-凝胶上电泳分离14分钟，用dsDNA染色剂(例如，溴化乙锭)染色，并使用凝胶成像器显现。
结果。如图17所示，用递增浓度的化合物65(图17a)和化合物69(图17b)处理的细胞含有逐渐更多的SMN1小基因FL mRNA和更少的SMN1 Δ7 mRNA，指示SMN1可变剪接得到校正。
不论本文引用的文献是否特别地和分别地指出通过引用并入，本文提及的所有文献都以如同将每篇参考文献在本文中完整地列出一样的程度通过引用并入本申请中用于任何和所有目的。
尽管已经如上详细描述了某些实施方式，但是本领域普通技术人员应当清楚地理解在不背离其教导下在实施方式中进行许多修饰是可能的。所有这样的修饰都预期涵盖在如本文所述的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.式(Ia1)的化合物：
或其可药用盐、立体异构体或外消旋体，其中：
R1为杂环基；
其中杂环基任选地被一个、两个或三个R3取代基和一个另外任选的R4取代基取代；和
其中，可替代地，杂环基任选地被一个、两个、三个或四个R3取代基取代；
R2为芳基或杂芳基；
其中，芳基或杂芳基任选地被一个、两个或三个R6取代基和一个另外的任选的R7取代基取代；
Ra在每种情况下独立地选自氢、卤素或C1-8烷基；
Rb为氢、卤素、C1-8烷基或C1-8烷氧基；
R3在每种情况下独立地选自氰基、卤素、羟基、氧代、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷基-羰基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、C1-8烷氧基-羰基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基、氨基-C1-8烷基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基、氨基-C1-8烷基-氨基、C1-8烷基-氨基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基-氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基]2-氨基、(C1-8烷基-氨基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、[(C1-8烷基)2-氨基-C1-8烷基](C1-8烷基)氨基、C1-8烷氧基-C1-8烷基-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)2-氨基、(C1-8烷氧基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基、C1-8烷基-羰基-氨基、C1-8烷氧基-羰基-氨基、羟基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷氧基-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基-氨基、(羟基-C1-8烷基)2-氨基或(羟基-C1-8烷基)(C1-8烷基)氨基；
R4为C3-14环烷基、C3-14环烷基-C1-8烷基、C3-14环烷基-氨基、芳基-C1-8 烷基、芳基-C1-8烷氧基-羰基、芳基-磺酰氧基-C1-8烷基、杂环基或杂环基-C1-8烷基；其中，每种情况下的C3-14环烷基、芳基和杂环基任选地被一个、两个或三个R5取代基取代；
R5在每种情况下独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-8烷基、卤代-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；
R6在每种情况下独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、C1-8烷基、C2-8烯基、卤代-C1-8烷基、羟基-C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤代-C1-8烷氧基、C1-8烷氧基-C1-8烷基、氨基、C1-8烷基-氨基、(C1-8烷基)2-氨基或C1-8烷基-硫基；和
R7为C3-14环烷基、C3-14环烷基-氧基、芳基、杂环基或杂芳基。
2.权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物选自：
7-(哌嗪-1-基)-3-(吡啶-2-基)-1H-异色烯-1-酮
7-(哌嗪-1-基)-3-(硫代苯-3-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(3，4-二甲氧基苯基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
7-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-(吡啶-2-基)-1H-异色烯-1-酮
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-3-(吡啶-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2，2-二氟-1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2，2-二氟-1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-7-(4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并噻唑-2-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并噻唑-2-基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并噻唑-2-基)-7-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并噻唑-2-基)-7-(4-甲基-1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(3，5-二氟苯基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(3，4-二甲氧基苯基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(3，4-二甲氧基苯基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(3-甲氧基苯基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(3-甲氧基苯基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-3-(3-甲氧基苯基)-1H-异色烯-1-酮
7-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基)-3-(3-甲氧基苯基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲氧基苯基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-3-(2-甲氧基苯基)-1H-异色烯-1-酮
3-(4-甲氧基苯基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(4-甲氧基苯基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-3-(4-甲氧基苯基)-1H-异色烯-1-酮
3-(3，4-二甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(4-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-3-(吡啶-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并噻唑-2-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(3，4-二羟基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(4-乙氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(3-羟基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(4-氟-3-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(5-氟-2-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(3，5-二氟-4-甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(2，4-二甲氧基苯基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(4-乙氧基苯基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-1-苯并呋喃-5-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-[3-(二氟甲氧基)苯基]-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-[4-(二氟甲氧基)苯基]-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(8-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(8-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮3-(8-氯咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-3，4-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(3，4-二甲氧基苯基)-7-[(3S)-3，4-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
7-[(8aR)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基]-3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(8aR)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R)-3，4-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-乙基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[4-(丙烷-2-基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-(4-乙基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-[4-(丙烷-2-基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-[(8aS)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(1，3-二甲基吡咯并[1，2-a]吡嗪-7-基)-7-[(8aR)-六氢吡咯并[1，2-a]吡嗪-2(1H)-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-丙基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
7-(4-叔-丁基哌嗪-1-基)-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
7-(4-环丙基哌嗪-1-基)-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[4-(2-甲基丙基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
7-(4-环丁基哌嗪-1-基)-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1-乙基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[1-(丙烷-2-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[1-(2-甲氧基乙基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基]-1H-异色烯-1-酮
7-(1-环丙基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
7-(1-环丁基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1-丙基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(哌啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[1-(氧杂环丁烷-3-基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[4-(丙烷-2-基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-乙基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-1，3-苯并噻唑-6-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-1，3-苯并噻唑-6-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-1，3-苯并噻唑-6-基)-7-[4-(丙烷-2-基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-1，3-苯并噻唑-5-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-1，3-苯并噻唑-6-基)-7-[4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R)-3，4-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-3，4-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6-氯-8-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1-甲基哌啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1-乙基哌啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1-丙基哌啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[1-(丙烷-2-基)哌啶-4-基]-1H-异色烯-1-酮
7-(1-环丁基哌啶-4-基)-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
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7-[(3S)-4-乙基-3-甲基哌嗪-1-基]-3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
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3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-羟基哌啶-1-基)-1H-异色烯-1-酮
7-[4-(二甲基氨基)哌啶-1-基]-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
7-[(3R)-4-乙基-3-甲基哌嗪-1-基]-3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
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3-(6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R，5S)-3，4，5-三甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
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3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-4-(2-羟基乙基)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-4-乙基-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
7-[(3S)-4-环丁基-3-甲基哌嗪-1-基]-3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
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3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-4-(2-甲氧基乙基)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R，5S)-4-乙基-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R，5S)-3，5-二甲基-4-丙基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(6，8-二甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R，5S)-3，4，5-三甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3S)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R)-3-甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮
7-[(3R，5S)-3，5-二甲基哌嗪-1-基]-3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
7-[(3S)-3，4-二甲基哌嗪-1-基]-3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基)-7-(哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(2-甲基-2H-吲唑-5-基)-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-异色烯-1-酮
3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-[(3R，5S)-3，4，5-三甲基哌嗪-1-基]-1H-异色烯-1-酮，或
3-(8-乙基-6-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-2-基)-7-(1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-异色烯-1-酮；
或其可药用盐、立体异构体、或外消旋体。
3.一种药物组合物，包含有效量的权利要求1的化合物和可药用载体。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中，所述可药用载体为赋形剂或稀释剂。
5.权利要求1的化合物在制备用于治疗脊髓性肌萎缩的药物中的用途。
6.权利要求1的化合物在制备用于通过增强将SMN2的外显子7包含到从SMN2基因转录的mRNA中来治疗脊髓性肌萎缩的药物中的用途，其中，使人类细胞与权利要求1的化合物接触。
7.权利要求1的化合物在制备用于通过增加Smn蛋白的量来治疗脊髓性肌萎缩的药物中的用途，其中，使人类细胞与权利要求1的化合物接触。
8.权利要求6或7所述的用途，其中，所述人类细胞是来自人类脊髓性肌萎缩患者的人类细胞。
9.权利要求1的化合物在制备用于治疗需要其的人类受试者中的脊髓性肌萎缩的药物中的用途，其中，向所述受试者施用有效量的权利要求1的化合物。
10.权利要求3的药物组合物在制备用于治疗需要其的人类受试者中的脊髓性肌萎缩的药物中的用途，其中，向所述受试者施用权利要求3的药物组合物。
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