CN104160025A - 使用可裂解探针复合检测慢性粒细胞性白血病基因的方法 - Google Patents
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Abstract
一个具体的实施例的一种形式提供了用于检测慢性粒细胞性白血病基因表达的量的检测试剂盒,包含特异性地结合至慢性粒细胞性白血病基因的一对引物,以及可裂解探针,其特异性地结合至由该一对引物扩增的慢性粒细胞性白血病扩增产物之内。在另一个具体的实施例中,通过使用根据该一个具体的实施例的检测试剂盒测量样品中慢性粒细胞性白血病基因表达的量。当使用根据该具体的实施例的方法时,可以有效地实时检测甚至是处于低浓度下的慢性粒细胞性白血病基因表达的量,并因此在慢性粒细胞性白血病的诊断和预后方面可以是有用的。
Description
技术领域
本发明涉及慢性粒细胞性白血病基因诊断试剂盒和使用该试剂盒的诊断方法。更具体地,本发明涉及通过使用引物组和可裂解探针使得能够实时地检测基因的试剂盒,以及使用该试剂盒的诊断方法。
背景技术
白血病泛指其中白细胞瘤性(neoplastically)增殖的所有疾病。根据白细胞起源的白细胞,白血病被分为“粒细胞性白血病(髓细胞性白血病,myelogenous leukemia)”和“淋巴性白血病(淋巴细胞性白血病,lymphaticleukemia)”,或根据进展速度,白血病被分为急性白血病和慢性白血病。根据疾病的类型和所侵袭的细胞的特征,白血病的临床类型(临床证型,clinical pattern)不同。淋巴性白血病是由淋巴性血细胞的突变引起的,粒细胞性白血病是由粒细胞性(骨髓性,myelogenous)血细胞的突变引起的,而慢性粒细胞性白血病(CML)是由成熟细胞的突变引起的,换言之,由多能造血干细胞的恶性克隆引起的。急性粒细胞性白血病是由成髓性干细胞(myeloblastic stem cell)从血细胞生成的早期阶段开始分化的缺陷引起的。
在这些不同类型的白血病中,CML是其中成髓性细胞(原始粒细胞,myeloblast cell)在骨髓中增殖并侵袭外周血或其他器官的恶性血恶液质(hematodyscrasia),并且CML在成人中的发病率很高。诊断CML最重要的事情是通过进行染色体检验来检测费城染色体,其获得在95%或更多的患者中的阳性结果。
已经查明CML的多种病因,但CML的最常见病因是染色体易位。特别是,已知9号染色体和22号染色体的易位为CML的主要病因。实践中,在约95%的CML患者中发现了9号染色体和22号染色体的相互(reciprocal)易位。该相互易位由位于9号染色体的q34区域的abl(Abelson癌基因)基因的一部分转移至位于22号染色体的q11.2区域的bcr(断裂点簇区,breakpoint cluster region)基因形成的。此重排被称为BCR-ABL重排。对于由BCR-ABL重排引起的CML,以GlivecTM的商品名市售的药物甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)具有优异的治疗效果。因此,BCR-ABL重排的早期诊断在患者治疗方案的决定和预后中非常重要。
为检测BCR-ABL重排,通常使用使BCR-ABL融合基因的重组程度量化的方法。目前开展了大量研究以开发以更方便的方式使BCR-ABL融合基因的重组程度量化的方法。例如,开发了使用FISH(荧光原位杂交法)的诊断方法(Tkachuk et al.,Science,250(4980):559-562,1990)、使用体细胞DNA的PCR的方法(Dobrovic et al.,Blood,72(6):2063-2065,1998)、使用RT-PRC的方法(Lee et al.,Blood,73(8):2165-2170,1989)以及使用巢式PCR(nested PCR)的方法(Hessner et al.,Genet.Anal.Tech.Appl.,11(4):90-94,1994)。
然而,以上列出的方法中,基于FISH的方法是用于直接检测其中已经发生BCR-ABL重排的单个细胞,并且因此,基于FISH的方法不允许早期检测CML。RT-PCR方法具有较高的灵敏度,但需要细胞遗传学方法,因为它通常难以设计出允许诊断患有非常罕见的CML患者的引物组。出于上述原因,在疑似患有CML的患者的情况下,在诊断的早期进行多种细胞遗传学方法。然而,细胞遗传学方法包括许多限制:只有在骨髓白细胞的细胞周期到达“中期(metaphase)”时才能进行细胞遗传学方法,需要满足各种条件如增殖细胞的提取和培养,并且需要足够的增殖细胞数量等。此外,常规的RT-PCR法是复杂的,因为根据BCR-ABL基因的类型应当进行独立的反应用于分析BCR-ABL基因。因此,通过改进传统的方法,已经研究了在诊断CML中可能是更加有用的检测方法。其结果是,开发了根据本发明的使用可裂解探针的检测试剂盒和使用其的诊断方法。
发明内容
技术问题
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因断裂点的试剂盒,其中,该试剂盒包含引物组和可裂解探针,其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因断裂点。
本发明的另一个实施方式提供了诊断慢性粒细胞性白血病的方法,其中,该方法使用引物组和可裂解探针,其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因断裂点。
技术方案
本发明的一个方面提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的试剂盒,其中,该试剂盒包含至少一个引物组以及可裂解探针,其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒,其中,该试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:1的核酸的引物和含有SEQ ID NO:2的核酸的引物的第一引物组;以及SEQID NO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒,其中,该试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物和含有SEQ ID NO:4的核酸的引物的第二引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒,其中,该试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:5的核酸的引物和含有SEQ ID NO:6的核酸的引物的第三引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒,其中,该试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:7的核酸的引物和含有SEQ ID NO:8的核酸的引物的第四引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了一种用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的检测试剂盒,其中,该试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO:10的核酸的引物的第五引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本文所用的术语“引物”可以与“寡核苷酸”或“多核苷酸”互换地使用。引物是指一种寡核苷酸,其在PCR中可作为DNA合成的起点。引物通常包括约15至约35个核苷酸并与靶序列的互补区杂交。
本文使用的术语“探针”指的是特异性地结合至靶序列的寡核苷酸,并且包括,例如,含有特定区域的多核苷酸,该特定区域被设计为通过序列特异性的方法与特定核酸序列(如靶核酸序列)的互补区域杂交。在本发明的一个实施方式中,寡核苷酸探针包含约15至约60个核苷酸。适当地,寡核苷酸探针包含约18至约30个核苷酸。
本文使用的术语“可裂解探针(可断裂探针,cleavable probe)”是指包括两种类型的核酸的探针,例如,在DNA探针的内部包括一些RNA核苷酸的DNA探针。
可以使用可以互补结合至共同(commonly)存在于以下中的序列的任何序列作为可裂解探针的序列:通过使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8扩增的扩增产物以及通过使用SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10扩增的扩增产物。
可裂解探针可以包括其中约1至10个DNA核苷酸被RNA核苷酸取代、其中约2至8个DNA核苷酸被RNA核苷酸取代或者其中约3至7个DNA核苷酸被RNA核苷酸取代的内部区域,但不限于此。此外,RNA核苷酸可以连续地或不连续地定位在探针内。可裂解探针可以是含有SEQID NO:33的多核苷酸的探针。
此外,可裂解探针在探针的两端或内部可以标记有可检测物质。用于PCR的混合物包含RNA酶(RNase酶,核糖核酸酶),其可特异性地切割RNA-DNA双链的RNA序列部分。在由RNA酶切割后,可裂解探针的所有片段在反应温度下从靶扩增子解离并散布在反应溶液中。由于探针中经标记的供体和受体被分离,可以监测由供体的荧光发射。
本文使用的术语“标记(标签,label)”或“可检测标记”指的是通过共价键或非共价键结合至探针的荧光染料化合物,并且可以是包括荧光供体和荧光受体的荧光共振能量转移(FRET)对。
本文使用的术语“荧光染料(荧光物,fluorochrome)”是指由具有短于所发射的光波长的波长的光激发后发光的荧光化合物。此外,术语“荧光供体”是指发射由本发明中公开的测定法测量的光的荧光染料。此外,荧光供体可以提供由荧光受体吸收的光。本文使用的术语“荧光受体”是指吸收从荧光供体发射的能量的二级荧光染料或猝灭剂。二级荧光染料吸收从荧光供体发射的能量并且随后发射具有长于由荧光供体发射的光的波长的波长的光。猝灭剂吸收从荧光供体发射的能量。
任何发光分子,适当地,荧光染料和/或猝灭剂,都可以在本发明的实施方式中使用。例如,发光分子可以是Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、AlexaFluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor680、7-二乙氨基香豆素-3-羧酸、荧光素、Oregon Green 488、Oregon Green514、四甲基若丹明、若丹明X、德克萨斯红(Texas Red)染料、QSY 7、QSY33、Dabcyl、BODIPY FL、BODIPY 630/650、BODIPY6501665、BODIPYTMR-X、BODIPY TR-X、二烷基氨基香豆素、Cy3(青色素3)、Cy3.5、Cy5.5、Cy5、DTPA(Eu3+)-AMCA以及TTHA(Eu3+)AMCA,但不限于此。适当地,发光分子可以是包括6-FAM和爱荷华黑BQ(Iowa Black BQ)的FRET对,但不限于此。
此外,用于检测c-Met基因的试剂盒可以进一步含有热稳定聚合酶或RNA酶,并且包含在试剂盒中的酶可以是热稳定聚合酶及热稳定RNA酶。
在本文中使用并应用于酶的术语“热稳定的”,是指酶在升高的温度(如55℃或更高)下、或在重复加热和冷却的循环中保持生物活性。热稳定的多核苷酸聚合酶可以尤适用于PCR扩增反应。在本发明的实施方式中,热稳定的多核苷酸聚合酶可以是Taq聚合酶。热稳定的多核苷酸聚合酶可以是选自由AmpliTaq、AmpliTaq Stoffel片段、SuperTaq、SuperTaqplus、LA Taq、LApro Taq以及EX Taq组成的组中的Taq聚合酶。此外,在本文中使用的术语“RNA酶”是指特异性切割RNA的酶。RNA可以是双链RNA,其可以是由RNA和DNA的杂交形成的杂交双链。
此外,试剂盒可以提供为包括具有一种或多种试剂的包装单元(package unit)的试剂盒。试剂盒可以包括选自由以下物品组成的组中的至少一种:缓冲液、操作指南和阳性或阴性对照组。试剂盒可以包括以适当比例混合以完成本文所描述的方法的试剂的容器。该试剂容器适当地包括单位数(unit number)的试剂以省略完成该方法时的衡量(计量,measuring)。在本发明的另一各实施方式中,试剂盒进一步包括用于从生物学样品提取基因组DNA或RNA的试剂。此外,试剂盒试剂可以包括用于逆转录-PCR分析的试剂。
用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的试剂盒可以包含选自由第一引物组至第五引物组组成的组中的一个引物组以鉴定e19a2断裂点,但也可以包含所有五个引物组以提高精确度。
本发明的另一个方面提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含引物组以及可裂解探针,其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:11的核酸的引物和含有SEQ ID NO:12的核酸的引物的第六引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:13的核酸的引物和含有SEQ ID NO:14的核酸的引物的第七引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:15的核酸的引物和含有SEQ ID NO:16的核酸的引物的第八引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:17的核酸的引物和含有SEQ ID NO:18的核酸的引物的第九引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:19的核酸的引物和含有SEQ ID NO:20的核酸的引物的第十引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:21的核酸的引物和含有SEQ ID NO:22的核酸的引物的第十一引物组;以及SEQ ID NO:33的可裂解探针。
用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒可以包含选自由第六引物组至第十一引物组组成的组中的一个引物组以鉴定断裂点,但也可以包含所有六个引物组以提高精确度。
可以使用可以互补结合至共同存在于以下中的序列的任何序列作为可裂解探针的序列:通过使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16扩增的扩增产物、通过使用SEQID NO:17和SEQ ID NO:18扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20扩增的扩增产物以及通过使用SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22扩增的扩增产物。可裂解探针可以是含有SEQ ID NO:33的多核苷酸的探针。
本发明的另一个方面提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含引物组和可裂解探针,其使得能够特异性地扩增BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点。
本发明的一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:23的核酸的引物和含有SEQ ID NO:24的核酸的引物的第十二引物组;以及SEQ IDNO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:25的核酸的引物和含有SEQ ID NO:26的核酸的引物的第十三引物组;以及SEQID NO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:27的核酸的引物和含有SEQ ID NO:28的核酸的引物的第十四引物组;以及SEQID NO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:29的核酸的引物和含有SEQ ID NO:30的核酸的引物的第十五引物组;以及SEQID NO:33的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,试剂盒包含:包括含有SEQ ID NO:31的核酸的引物和含有SEQ ID NO:32的核酸的引物的第十六引物组;以及SEQID NO:33的可裂解探针。
用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒可以包含选自由第十二引物组至第十六引物组所组成的组中的一个引物组,但也可以包含所有五个引物组以提高精确度。
可以使用可以互补结合至共同存在于以下中的序列的任何序列作为可裂解探针的序列:通过使用SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26扩增的扩增产物、通过使用SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28扩增的扩增产物、通过使用SEQID NO:29和SEQ ID NO:30扩增的扩增产物以及通过使用SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32扩增的扩增产物。可裂解探针可以是含有SEQ ID NO:33的多核苷酸的探针。
本发明的另一个方面提供了用于检测CML基因的复合试剂盒(多重试剂盒,multiplex kit),其中,试剂盒包含第一引物组至第十六引物组和可裂解探针。
为了检测CML,可以使用选自由第一引物组至第十六引物组组成的组中的一个引物组。然而,由于易位发生在CML的不同区域,CML具有多种断裂点。因此,为了更精确的检测,用于检测CML基因的试剂盒可以包含包括以下的所有引物组:能够检测e19a2断裂点的引物组,能够检测e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的引物组以及能够检测e1a2断裂点的引物组。换言之,用于检测CML基因的试剂盒可以适当地包括:选自由第一引物组至第五引物组成的组中的一个引物组、选自由第六引物组至第十一引物组组成的组中的一个引物组以及选自由第十二引物组至第十六引物组组成的组中的一个引物组。
此外,能够扩增CML基因的可裂解探针并不限于特定的序列,只要该序列可特异性结合至由引物组所产生的扩增产物即可。可裂解探针可以是含有SEQ ID NO:33的多核苷酸的探针。
引物组可以进一步含有热稳定聚合酶或RNA酶。
本发明的另一个方面提供了通过使用用于检测CML基因的试剂盒检测CML基因的复合方法(多重方法,multiplex method),其中,试剂盒包含第一引物组至第十六引物组和可裂解探针。
本发明的一个实施方式提供了检测CML基因的复合方法,包括:从样品获取DNA;使至少一个引物组、SEQ ID NO:33的可裂解探针和所获得的DNA样品混合以制备混合样品,其中,至少一个引物组选自由以下组成的组中:包括含有SEQ ID NO:1的核酸的引物和含有SEQ ID NO:2的核酸的引物的第一引物组;包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物和含有SEQ ID NO:4的核酸的引物的第二引物组;包括含有SEQ ID NO:5的核酸的引物和含有SEQ ID NO:6的核酸的引物的第三引物组;包括含有SEQ ID NO:7的核酸的引物和含有SEQ ID NO:8的核酸的引物组成第四引物组;包括含有SEQ ID NO:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO:10的核酸的引物的第五引物组;包括含有SEQ ID NO:11的核酸的引物和含有SEQ ID NO:12的核酸的引物的第六引物组;包括含有SEQ ID NO:13的核酸的引物和含有SEQ ID NO:14的核酸的引物的第七引物组;包括含有SEQ ID NO:15的核酸的引物和含有SEQ ID NO:16的核酸的引物的第八引物组;包括含有SEQ ID NO:17的核酸的引物和含有SEQ ID NO:18的核酸的引物的第九引物组;包括含有SEQ ID NO:19的核酸的引物和含有SEQ ID NO:20的核酸的引物的第十引物组;包括含有SEQ ID NO:21的核酸的引物和含有SEQ ID NO:22的核酸的引物的第十一引物组;包括含有SEQ ID NO:23的核酸的引物和含有SEQ ID NO:24的核酸的引物的第十二引物组;包括含有SEQ ID NO:25的核酸的引物和含有SEQ ID NO:26的核酸的引物的第十三引物组;包括含有SEQ ID NO:27的核酸的引物和含有SEQ ID NO:28的核酸的引物的第十四引物组;包括含有SEQ ID NO:29的核酸的引物和含有SEQ ID NO:30的核酸的引物的第十五引物组;包括含有SEQ ID NO:31的核酸的引物和含有SEQ ID NO:32的核酸的引物的第十六引物组;使聚合酶、RNA酶和扩增缓冲液与混合样品混合以扩增DNA;和检测由探针上的标记发出的信号的增加。
检测CML基因的复合方法详细说明如下。
首先,检测CML基因的复合方法可以包括从样品获得DNA。样品可以获自CML患者和想要经历CML发展的诊断的人。此外,样品可以直接地取自特定的人体部位。
随后,检测CML基因的复合方法可以包括使至少一个引物组、SEQID NO:33的可裂解探针以及获得的DNA样品混合以制备混合样品,其中,至少一个引物组选自由以下组成的组中:包括含有SEQ ID NO:1的核酸的引物和含有SEQ ID NO:2的核酸的引物的第一引物组;包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物和含有SEQ ID NO:4的核酸的引物的第二引物组;包括含有SEQ ID NO:5的核酸的引物和含有SEQ ID NO:6的核酸的引物的第三引物组;包括含有SEQ ID NO:7的核酸的引物和含有SEQID NO:8的核酸的引物的第四引物组;包括含有SEQ ID NO:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO:10的核酸的引物的第五引物组;包括含有SEQ IDNO:11的核酸的引物和含有SEQ ID NO:12的核酸的引物的第六引物组;包括含有SEQ ID NO:13的核酸的引物和含有SEQ ID NO:14的核酸的引物的第七引物组;包括含有SEQ ID NO:15的核酸的引物和含有SEQ IDNO:16的核酸的引物的第八引物组;包括含有SEQ ID NO:17的核酸的引物和含有SEQ ID NO:18的核酸的引物的第九引物组;包括含有SEQ IDNO:19的核酸的引物和含有SEQ ID NO:20的核酸的引物的第十引物组;包括含有SEQ ID NO:21的核酸的引物和含有SEQ ID NO:22的核酸的引物的第十一引物组;包括含有SEQ ID NO:23的核酸的引物和含有SEQ IDNO:24的核酸的引物的第十二引物组;包括含有SEQ ID NO:25的核酸的引物和含有SEQ ID NO:26的核酸的引物的第十三引物组;包括含有SEQID NO:27的核酸的引物和含有SEQ ID NO:28的核酸的引物的第十四引物组;包括含有SEQ ID NO:29的核酸的引物和含有SEQ ID NO:30的核酸的引物的第十五引物组;包括含有SEQ ID NO:31的核酸的引物和含有SEQ ID NO:32的核酸的引物的第十六引物组。
可以使用选自由第一引物组至第十六引物组组成的组中的两个或多个引物组。此外,可以同时使用全部十六个引物组。
可裂解探针可以在不同DNA部分的两端标记有可检测物质。可裂解探针可以标记有包括荧光供体和荧光受体的荧光共振能量转移(FRET)对。
随后,检测CML基因的复合方法可以包括使聚合酶、RNA酶和扩增缓冲液与混合样品混合以扩增DNA。可以使用任何热稳定聚合酶或RNA酶。
本文中所使用的术语“扩增缓冲液”是指被添加至扩增反应以控制扩增反应并因此修改扩增反应的至少一个要素的稳定性、活性和/或生命周期(lifecycle)的复合物(混合物、化合物,compound)。扩增缓冲液可以与PCR扩增和RNase H切割活性相容。缓冲液的实例包括包含4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、乙酸盐或磷酸盐的缓冲液,但不限于此。
PCR缓冲液通常可包含约70mM或更低的KCl,约1.5mM或更高的MgCl2,以及约50至200μM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的每种。缓冲液可以进一步包含用于更有效的逆转录酶PCR或优化PCR的添加剂。
添加剂是指为了改变组合物的至少一个要素的稳定性、活性和/或生命周期而添加的化合物。例如,添加剂的实例包括甜菜碱、甲酰胺、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、Na(CO3)2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇(DTT)、焦磷酸酶、无机焦磷酸酶(TAP)、阳离子、以及其他化合物、蛋白质或辅因子等,其可以改变扩增效率,但不限于此。可以选择性地加入添加剂以选择性地促进引物退火。
随后,检测CML基因的复合方法可以包括检测由探针上的标记发射的信号的增加。发射的信号可以是荧光。可以通过使用适当的装置如Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR***或Biorad CFX96real-time PCR热循环仪检测荧光发射的结果,但可以使用在本领域中可用的所有装置。
此外,检测CML基因的复合方法可以包括逆转录PCR,其中,从样品获得RNA并通过使用逆转录酶扩增该RNA以将获得的cDNA作为样品DNA。RNA可以取自CML患者或想要经历CML诊断的人,并随后可以通过使用逆转录酶扩增该RNA以获得cDNA。可以通过本领域中可用的任何方法完成通过使用逆转录酶来逆转录为cDNA。
在逆转录酶PCR中,使用模板特异性DNA引物以产生互补DNA链。然后,在PCR中,产物被改变,并且将第二模板特异性引物结合至cDNA并延伸以形成双链体DNA(duplex DNA)。在接下来的温度循环中扩增所得到的产物。为了保持最高灵敏度,防止RNA在cDNA合成之前被降解是非常重要的。
有益效果
当使用根据本发明实施方式的引物组和探针(其中,该引物组和探针特异性结合至慢性粒细胞性白血病(CML)基因)时,可以检测出含有断裂点(其引起CML)的基因的极少量的表达,并因此可以诊断与CML基因表达相关的CML并且可以容易地确定预后。
附图说明
图1至图5示出通过使用1-5编号的引物组扩增e19a2靶核苷酸序列的实验结果。
图6至图11示出通过使用6-11编号的引物组扩增e14a2靶核苷酸序列的实验结果。
图12至图17示出通过使用6-11编号的引物组扩增e13a2靶核苷酸序列的实验结果。
图18至图23示出通过使用6-11编号的引物组扩增e14a3靶核苷酸序列的实验结果。
图24至图29示出通过使用6-11编号的引物组扩增e13a3靶核苷酸序列的实验结果。
图30至图34示出通过使用12-16编号的引物组扩增e1a2靶核苷酸序列的实验结果。
具体实施方式
实施例
以下,参照下面的实施例对本发明进行更详细地说明。然而,这些实施例仅用于说明目的,并不意在限制本发明的范围。
实施例1:制备用于CML检测的引物组和探针
制备用于CML检测的总共16组的引物组(F:正向引物,R:反向引物)和探针(显示为小写字母的核苷酸为RNA)(由Integrated DNATechnologies,Inc.合成)。
CataCleave探针是以下:5'-ggggaatggtgugaagcccaaacc-3’(SEQ ID NO:33)(加下划线的核苷酸为RNA)。
用于检测R-ABL e19a2的引物组(F:正向引物,R:反向引物)。
表1
用于检测BCR-ABL e13a2(=b2a2)、e14a2(=b3a2)、e13a3(=b2a3)、e14a3(=b3a3)的引物组(F:正向引物,R:反向引物)。
表2
用于检测BCR-ABL e1a2的引物组(F:正向引物,R:反向引物)。
表3
此外,通过在5'端使用6-FAM(其是荧光染料)并3'端使用爱荷华黑RQ(其是猝灭剂)标记CataCleave探针(其是可裂解探针)的两格DNA末端。
实施例2:取样
为了制备阳性BCR-ABL样品,制备了通过基因克隆合成的质粒(6个质粒:每基因型一个质粒)(涉及SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:39)。将编码以下列出的基因序列的多核苷酸***pGEM-3Z(Promega)的EcoR1/BamH1位点以制备阳性样品。
表4
SEQ ID NO | 基因型 |
SEQ ID NO:34 | e14a2 |
SEQ ID NO:35 | e13a2 |
SEQ ID NO:36 | e14a3 |
SEQ ID NO:37 | e13a3 |
SEQ ID NO:38 | e1a2 |
SEQ ID NO:39 | e19a2 |
实施例3:CML基因检测
使用根据实施例1制备引物和探针、扩增缓冲液(32mMHEPES-KOH,pH 7.8;100mM乙酸钾;4mM乙酸镁;0.11%牛血清白蛋白;1%二甲亚砜),dUTP/NTP混合物(80μM的dGTP、dCTP和dATP的每一种以及160μM的dUTP)、2.5单位的Thermus aquaticus DNA聚合酶、1单位的Pyrococcus furiosis RNA酶HII以及0.1的单位的尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase)以在RABI7500***(Applied Biosystem)中根据如下循环方案进行PCR:95℃预变性5分钟;50个循环的95℃变性10秒、65℃退火10秒和72℃扩增40秒;72℃最终延伸5分钟。当温度为65℃时检测FAM发射(参考图1至图34)。
工业实用性
当使用根据本发明的实施方式的引物组和探针时,与用于常规PCR的(检测)浓度(concentration)相比,可以容易地检测到处于非常低浓度的慢性髓细胞性白血病(CML)基因。因此,进行逆转录PCR后,可以使用根据本发明的一个实施方式的引物-探针组以检测CML基因的表达。
Claims (12)
1.一种用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的试剂盒,所述试剂盒包含:
选自由以下组成的组中的至少一个引物组
包括含有SEQ ID NO:1的核酸的引物和含有SEQ ID NO:2的核酸的引物的第一引物组;
包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物和含有SEQ ID NO:4的核酸的引物的第二引物组;
包括含有SEQ ID NO:5的核酸的引物和含有SEQ ID NO:6的核酸的引物的第三引物组;
包括含有SEQ ID NO:7的核酸的引物和含有SEQ ID NO:8的核酸的引物的第四引物组;
包括含有SEQ ID NO:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO:10的核酸的引物的第五引物组;以及
SEQ ID NO:33的可裂解探针。
2.一种用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,所述试剂盒包含:
选自由以下组成的组中的至少一个引物组:
包括含有SEQ ID NO:11的核酸的引物和含有SEQ ID NO:12的核酸的引物的第六引物组;
包括含有SEQ ID NO:13的核酸的引物和含有SEQ ID NO:14的核酸的引物的第七引物组;
包括含有SEQ ID NO:15的核酸的引物和含有SEQ ID NO:16的核酸的引物的第八引物组;
包括含有SEQ ID NO:17的核酸的引物和含有SEQ ID NO:18的核酸的引物的第九引物组;
包括含有SEQ ID NO:19的核酸的引物和含有SEQ ID NO:20的核酸的引物的第十引物组;
包括含有SEQ ID NO:21的核酸的引物和含有SEQ ID NO:22的核酸的引物的第十一引物组;以及
SEQ ID NO:33的可裂解探针。
3.一种用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,所述试剂盒包含:
选自由以下组成的组中的至少一个引物组
包括含有SEQ ID NO:23的核酸的引物和含有SEQ ID NO:24的核酸的引物的第十二引物组;
包括含有SEQ ID NO:25的核酸的引物和含有SEQ ID NO:26的核酸的引物的第十三引物组;
包括含有SEQ ID NO:27的核酸的引物和含有SEQ ID NO:28的核酸的引物的第十四引物组;
包括含有SEQ ID NO:29的核酸的引物和含有SEQ ID NO:30的核酸的引物的第十五引物组;
包括含有SEQ ID NO:31的核酸的引物和含有SEQ ID NO:32的核酸的引物的第十六引物组;以及
SEQ ID NO:33的可裂解探针。
4.根据权利要求1所述的用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的试剂盒,其中,所述可裂解探针含有其中1至10个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸的DNA的内部区域。
5.根据权利要求2所述的用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,所述可裂解探针含有其中1至10个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸的DNA的内部区域。
6.根据权利要求3所述的用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,所述可裂解探针含有其中1至10个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸的DNA的内部区域。
7.根据权利要求4所述的用于检测BCR-ABL融合基因的e19a2断裂点的试剂盒,其中,所述可裂解探针在所述探针的两端标记有可检测物质。
8.根据权利要求5所述的用于检测BCR-ABL融合基因的e13a2、e14a2、e13a3或e14a3断裂点的试剂盒,其中,所述可裂解探针在所述探针的两端标记有可检测物质。
9.根据权利要求6所述的用于检测BCR-ABL融合基因的e1a2断裂点的试剂盒,其中,所述可裂解探针在所述探针的两端标记有可检测物质。
10.一种用于检测慢性粒细胞性白血病(CML)基因的复合试剂盒,所述复合试剂盒包含:
选自由以下组成的组中的至少一个引物组
包括含有SEQ ID NO:1的核酸的引物和含有SEQ ID NO:2的核酸的引物的第一引物组;
包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物和含有SEQ ID NO:4的核酸的引物的第二引物组;
包括含有SEQ ID NO:5的核酸的引物和含有SEQ ID NO:6的核酸的引物的第三引物组;
包括含有SEQ ID NO:7的核酸的引物和含有SEQ ID NO:8的核酸的引物的第四引物组;
包括含有SEQ ID NO:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO:10的核酸的引物的第五引物组;
包括含有SEQ ID NO:11的核酸的引物和含有SEQ ID NO:12的核酸的引物的第六引物组;
包括含有SEQ ID NO:13的核酸的引物和含有SEQ ID NO:14的核酸的引物的第七引物组;
包括含有SEQ ID NO:15的核酸的引物和含有SEQ ID NO:16的核酸的引物的第八引物组;
包括含有SEQ ID NO:17的核酸的引物和含有SEQ ID NO:18的核酸的引物的第九引物组;
包括含有SEQ ID NO:19的核酸的引物和含有SEQ ID NO:20的核酸的引物的第十引物组;
包括含有SEQ ID NO:21的核酸的引物和含有SEQ ID NO:22的核酸的引物的第十一引物组;
包括含有SEQ ID NO:23的核酸的引物和含有SEQ ID NO:24的核酸的引物的第十二引物组;
包括含有SEQ ID NO:25的核酸的引物和含有SEQ ID NO:26的核酸的引物的第十三引物组;
包括含有SEQ ID NO:27的核酸的引物和含有SEQ ID NO:28的核酸的引物的第十四引物组;
包括含有SEQ ID NO:29的核酸的引物和含有SEQ ID NO:30的核酸的引物的第十五引物组;
包括含有SEQ ID NO:31的核酸的引物和含有SEQ ID NO:32的核酸的引物的第十六引物组;以及
SEQ ID NO:33的可裂解探针。
11.根据权利要求10所述的用于检测CML基因的复合试剂盒,其中,所述复合试剂盒进一步包含热稳定聚合酶或RNA酶。
12.一种用于检测CML基因的复合方法,所述方法包括:
从样品获得DNA;
使至少一个引物组、SEQ ID NO:33的可裂解探针和获得的DNA样品混合以制备混合样品;
使聚合酶、RNA酶和扩增缓冲液与所述混合样品混合以扩增DNA;和
检测由所述探针上的标记发射的信号的增加;
其中,所述至少一个引物组选自由以下组成的组中:
包括含有SEQ ID NO:1的核酸的引物和含有SEQ ID NO:2的核酸的引物的第一引物组;
包括含有SEQ ID NO:3的核酸的引物和含有SEQ ID NO:4的核酸的引物的第二引物组;
包括含有SEQ ID NO:5的核酸的引物和含有SEQ ID NO:6的核酸的引物的第三引物组;
包括含有SEQ ID NO:7的核酸的引物和含有SEQ ID NO:8的核酸的引物的第四引物组;
包括含有SEQ ID NO:9的核酸的引物和含有SEQ ID NO:10的核酸的引物的第五引物组;
包括含有SEQ ID NO:11的核酸的引物和含有SEQ ID NO:12的核酸的引物的第六引物组;
包括含有SEQ ID NO:13的核酸的引物和含有SEQ ID NO:14的核酸的引物的第七引物组;
包括含有SEQ ID NO:15的核酸的引物和含有SEQ ID NO:16的核酸的引物的第八引物组;
包括含有SEQ ID NO:17的核酸的引物和含有SEQ ID NO:18的核酸的引物的第九引物组;
包括含有SEQ ID NO:19的核酸的引物和含有SEQ ID NO:20的核酸的引物的第十引物组;
包括含有SEQ ID NO:21的核酸的引物和含有SEQ ID NO:22的核酸的引物的第十一引物组;
包括含有SEQ ID NO:23的核酸的引物和含有SEQ ID NO:24的核酸的引物的第十二引物组;
包括含有SEQ ID NO:25的核酸的引物和含有SEQ ID NO:26的核酸的引物的第十三引物组;
包括含有SEQ ID NO:27的核酸的引物和含有SEQ ID NO:28的核酸的引物的第十四引物组;
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