CN106661626A - 用于单核细胞增多性李斯特菌检测的序列和它们的用法 - Google Patents

用于单核细胞增多性李斯特菌检测的序列和它们的用法 Download PDF

Info

Publication number
CN106661626A
CN106661626A CN201580039030.6A CN201580039030A CN106661626A CN 106661626 A CN106661626 A CN 106661626A CN 201580039030 A CN201580039030 A CN 201580039030A CN 106661626 A CN106661626 A CN 106661626A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
probe
primer
nucleic acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580039030.6A
Other languages
English (en)
Inventor
S.L.布鲁梅曼
S.瓦基
M.A.詹森
D.R.德马科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qualicon Diagnostics Ltd
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of CN106661626A publication Critical patent/CN106661626A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及基于核酸序列的存在的检测和表征单核细胞增多性李斯特菌血清型的快速、准确的方法，具体地，涉及基于PCR的检测方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和试剂以及试剂盒。该方法优选地用于检测食物和环境样品中的单核细胞增多性李斯特菌。本发明还涉及用于实施本发明的方法的复制组合物和试剂盒。

Description

用于单核细胞增多性李斯特菌检测的序列和它们的用法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2014年7月18日提交的美国临时申请序列号62/026,135的优先权，所述文献全文以引用方式并入。
技术领域
本技术领域涉及基于核酸序列的存在的检测单核细胞增多性李斯特菌血清型的方法，优选基于PCR的检测方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和试剂以及试剂盒。
背景技术
单核细胞增多性李斯特菌是与即食型食品(例如奶酪和熟肉制品)以及加工食品(例如热狗)相关的食源性疾病爆发的致病原。单核细胞增多性李斯特菌也是通常不与单核细胞增多性李斯特菌污染相关的甜瓜及其它食品有关的食源性疾病爆发的原因。李斯特菌病对于老年人和儿童可以极为致命，其死亡率高达40％。孕妇也易受所产生感染的影响，从而导致流产、死产或胎儿疾病。单核细胞增多性李斯特菌及其它李斯特氏菌属菌种是在有利于其持久生存的各种场所中常见的环境细菌。各种食品生产设施可提供能允许李斯特氏菌属菌种(包括单核细胞增多性李斯特菌)复制以及配料原料或食品制成品的可能污染的有利环境。李斯特氏菌属的许多菌种能够在冷藏温度下存活并且继续生长且数量增加。在相同的环境中可存在多个李斯特氏菌属的菌种。用于检测食品或食品制备环境中李斯特氏菌属菌种的典型微生物学方法在筛选测定开始后可需要至多五天。在等待筛选测定结果时，产品的生产者或销售商必须以相当可观的费用储存食品。在对李斯特氏菌属的存在的后续测试呈阳性的环境中制备的食物可能需要在装运之前就测定单核细胞增多性李斯特菌的存在或所报废库存的亏损。
因此，需要一种短时间出结果，准确度高，以及非常容易使用的检测单核细胞增多性李斯特菌的检定。
发明内容
一个方面是用于检测样品中单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含合适的引物对，该合适的引物对用于扩增单核细胞增多性李斯特菌的编码肌醇单酮异构酶的基因(例如，loll)的至少一部分，(b)使用步骤(a)的反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及(c)检测步骤(b)的扩增，从而扩增的阳性检出表明了样品中单核细胞增多性李斯特菌的存在。
另一个方面是一种引物，该引物包括基于BLASTN比对方法与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9和10所示的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。
另一个方面是一种引物，该引物包括基于BLASTN比对方法与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9和10所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
另一个方面是Scorpion探针，该Scorpion探针包括基于BLASTN比对方法与如
SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。
另一个方面是Scorpion探针，该Scorpion探针包括基于BLASTN比对方法与如SEQID NO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
另一个方面是单核细胞增多性李斯特菌检测序列，该检测序列包括基于BLASTN比对方法与如SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列。
另一个方面是单核细胞增多性李斯特菌属检测序列，该检测序列包括基于BLASTN比对方法与如SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
另一个方面是用于进行PCR的复制组合物，其包含：(a)选自下列的一组引物对：SEQ ID NO 2、7和11；SEQ ID NO 2和7；SEQ ID NO 2和11；SEQ ID NO 3、5和11；SEQ ID NO3和5；SEQ ID NO 3和11；SEQ ID NO 4、5和11；SEQ ID NO 4和5；SEQ ID NO 4和11；SEQ IDNO 5、6和11；SEQ ID NO 5和6；SEQ ID NO 6和11；SEQ ID NO 5、8和11；SEQ ID NO 5和8；SEQ ID NO 8和11；SEQ ID NO 5、8和12；SEQ ID NO 5和12；SEQ ID NO 5、6和13；SEQ ID NO5和13；SEQ ID NO 9、10和14；SEQ ID NO 9和10；SEQ ID NO 10和14；SEQ ID NO 5、8和15；SEQ ID NO 5和15；SEQ ID NO 5、8和16；以及SEQ ID NO 5和16(以下第052段的表1中所列的任意引物-探针-引物、引物-探针、或引物-引物配对)，和(b)至少一种DNA聚合酶。至少一种DNA聚合酶可为热稳定性DNA聚合酶。
另一个方面是用于检测样品中单核细胞增多性李斯特菌(包括所有血清型)的试剂盒，该试剂盒包含前述复制组合物，其中试剂盒包含选自SEQ ID NO：2和7；SEQ ID NO：3和5；SEQ ID NO：4和5；SEQ ID NO：5和6；SEQ ID NO：5和8；和SEQ ID NO：9和10中的一种或多种引物对以及Scorpion探针SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16(如表1所示)。
参见下文的详述，其它优点对本领域的技术人员而言将变得显而易见。
序列说明
序列符合37 C.F.R.§§1.821-1.825(“对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1是单核细胞增多性李斯特菌的靶基因序列(推定的loll肌醇单酮异构酶基因)。以下为SEQ ID NO：1的序列表
ATGACAAATGCAAATGGCAATCTAAAAAAATGCCCCATCACGATTAGCTCTTACACACTAGGAACGGAGGTATCTTTTCCTAAACGAGTGAAAGTCGCTGCGGAAAATGGTTTTGACGGAATTGGCTTGCGTGCAGAAAATTATGTAGATGCACTAGCTGCCGGATTAACCGATGAAGACATGTTGCGGATTTTAGACGAGCATAACATGAAAGTAACAGAAGTGGAGTACATAACCCAGTGGGGAACTGCCGAAGATCGTACAGCAGAACAACAAAAGAAAGAGCAAACAACTTTCCACATGGCGCGATTATTTGGCGTCAAACATATTAATTGTGGTTTGCTTGAAAAAATCCCTGAGGAACAAATCATTGTCGCGCTTGGTGAATTATGTGACCGCGCAGAAGAATTAATTATTGGTTTAGAATTTATGCCATATAGCGGTGTAGCAGACTTACAAGCAGCTTGGCGAGTAGCAGAAGCATGCGGACGAGATAACGCGCAACTTATTTGTGACACATGGCACTGGGCTAGAGCAAATCAAACAGCTGAATCTATCAAAAATGTTCCCGCTGATCGGATTGTTTCTATCCAACTATGCGATGTCCACGAAACACCTTACAAAGAACTTCGTGAAGAATCACTTCATGATCGTTTAGCTCCTGGAGAAGGATACGGAGATACGGTCGGTTTTGCAAAAATTTTAAAAGAGCATGGTGTAAATCCACGTGTGATGGGAGTTGAAGTTATTTCAGACTCTATGGTAGCAACTGGTTTAGAGTATGCCGCTCTTAAAGTATACAATGCCACGAAAAAAGTATTAGACGAAGCATGGCCAGAGATTTCTCCACGCTAA
SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9和10是用于检测单核细胞增多性李斯特菌血清型的引物序列。
SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16是用于检测单核细胞增多性李斯特菌血清型的Scorpion探针。在一个实施方案中，探针用荧光染料进行5′端标记。在一些实施方案中，SEQID NO：11、12、13、14、15和16的3’末端由以上所列引物中的一者(例如SEQ ID NO：5)、合适的接头部分(例如由6个聚乙二醇单元组成的间隔区)和淬灭剂染料构成。
优选实施方案详述
本发明申请人特别地将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开中。此外，当量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应被理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值中的任何一对所构成的所有范围，而不管这些范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点以及在该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时所列举的具体数值。
定义
在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。
如本文所用，术语“约”或“大约”表示在给定值或范围的20％内，优选地在10％内，还更优选地在5％内。
术语“包括”意在包括由术语“基本由......组成”和“由......组成”所涵盖的实施方案。类似地，术语“基本由......组成”包含旨在包括术语“由......组成”所涵盖的实施方案。
术语“单核细胞增多性李斯特菌IoII基因”或“IoII”是指编码肌醇单酮异构酶蛋白的家族成员的单核细胞增多性李斯特菌血清型的基因组的区域。出于参考，肌醇单酮异构酶的基因序列(IoII)用作本文的实施例，但可类似地考虑肌醇单酮异构酶蛋白家族中的其它基因。登记为GenBank：HG421741.1(范围为2326424至2327278)的核苷酸序列是各个菌种的单核细胞增多性李斯特菌肌醇单酮异构酶蛋白的高度保守的基因序列的示例。
“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。
术语“分离的”指如下物质，例如核酸分子和/或蛋白质，该物质基本上不含或者去除了在天然存在的环境中通常伴随该物质或与该物质反应的组分。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获取分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
术语“核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。多核苷酸还可由在一个核苷酸序列的3’端经由接头例如3碳或6碳(分别为丙二醇或己二醇)部分，或者3个或6个聚乙二醇亚基(分别为三甘醇或六甘醇)的连接臂连接至另一个核苷酸序列的5’端的核苷酸序列组成。本领域中已知的任何合适的接头或间隔区将用于本专利申请。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一条或多条链构成。
术语“扩增产物”指在引物引导的扩增反应期间产生的核酸片段。引物引导的扩增的典型方法包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，或链置换扩增反应(SDA)。如果选择PCR方法，则复制组合物可包含用于核酸复制的组分，例如：核苷三磷酸、两种(或更多种)具有合适序列的引物、热稳定性聚合酶、缓冲剂、溶质和蛋白质。这些试剂及其用于扩增核酸的详细描述的过程提供于美国专利4,683,202和4,683,195中，这些专利均以引用方式并入本文。如果选择LCR方法，则核酸复制组合物可包含例如：热稳定性连接酶(例如，水生栖热菌(Thermus aquaticus)连接酶)，两组邻近的寡核苷酸(其中每组的一个成员与每个所述靶链互补)，Tris-HCl缓冲液，KCl，EDTA，NAD，二硫苏糖醇，以及鲑精DNA。参见，例如，Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：1074-78(1985)。
术语“引物”指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，当被置于其中通过聚合酶催化互补链合成的条件下时，它能够作为沿互补链进行核酸合成或复制的起始点。引物还能包含可检测的标记，例如5’末端标记。
术语“探针”是指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，其与所关注的多核苷酸互补(但不一定完全互补)并且通过与所关注的多核苷酸的至少一条链杂交形成双链结构。探针或引物-探针复合物还可包含可检测的标记。
探针与引物复合或者以其它方式与引物连接，例如其中探针经由其3’末端通过接头连接至引物的5’末端，所述接头可为核苷酸或非核苷酸接头并且其可为不可扩增的接头(阻断剂)，例如3碳或6碳(分别为丙二醇或己二醇)部分，或者3个或6个聚乙二醇亚基(分别为三甘醇或六甘醇)的连接臂。在这种情况下，这将称为“引物-探针复合物”。此类引物-探针复合物的一个示例可见于美国专利6,326,145(全文以引用方式并入本文)，其在很多情况下被称为“Scorpion探针”或“Scorpion引物”。
如本文所用，术语“标记”和“可检测的标记”是指能够检测包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶的辅助因子、酶抑制子、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、半导体纳米晶体、配体(例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或半抗原)等的分子。可检测的标记还可包括报告基因和淬灭剂与探针的组合。
术语“报告基因”是指物质或其一部分，其能够表现出可检测的信号，其信号能被淬灭剂抑制。所述报告基因的可检测的信号为例如在可检测范围内的荧光。术语“淬灭剂”是指物质或其一部分，其能够抑制(suppressing)、降低、抑制(inhibiting)等由所述报告基因产生的可检测的信号。
如本文所用，术语“淬灭”和“荧光能量传递”是指如下过程，即，当报告基因和淬灭剂密切接近时，并且所述报告基因被能量源激发，所述激发态的能量的主要部分非辐射性地转移至所述淬灭剂，其中它非辐射性地耗散或者以不同于所述报告基因的发射波长发射。
优选地，所述报告基因可选自用适宜的连接基团修饰的荧光有机染料，以连接至所述寡核苷酸，诸如连接至末端3′碳或末端5′碳。所述淬灭剂也可选自有机染料，取决于本发明的实施方案，所述有机染料可以为荧光的，也可以不是荧光的。一般来讲，如果所述淬灭剂是荧光的或只是通过非辐射衰减从所述报告基因释放被转移的能量，所述淬灭剂的吸收带会至少基本上覆盖所述报告基因的荧光射线带以优化淬灭。非荧光淬灭剂或暗淬灭剂通常通过从被激发的报告基因吸收能量起作用，但不放射性地释放所述能量。
对于特定探针的适宜的报告基因-淬灭剂对的选择可根据已知技术进行。在例如Berlman的Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，第二版，Academic Press，New York，1971中列出并描述了可选择的来自示例性报告基因-淬灭剂对的荧光和暗淬灭剂以及它们相关的光学性能，其内容以引用的方式并入本文。在例如Haugland的Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，MolecularProbes of Eugene，Oreg.，1992中可找到经由常见的反应性基团(能添加至本发明的寡核苷酸)用于共价连接的经修饰报告基因和淬灭剂的示例，其内容以引用方式并入本文。
优选的报告基因-淬灭剂对可选自呫吨类染料，包括荧光素和罗丹明染料。这些化合物的多个适宜形式可商购获得，所述化合物的苯基上具有取代基，其可被用作结合位点或作为连接至寡核苷酸的结合官能团。另一个用作报告基因的优选的荧光化合物基团是萘胺，其在α-或β-位点具有氨基。包含在此类萘胺化合物中的有1-二甲基氨萘基-5磺酸、1-苯胺基-8-萘磺酸和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸。其它染料包括3-苯基-7-香豆素异氰酸酯；吖啶，例如9-异硫氰酸酯吖啶；N-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并二唑；二苯乙烯；芘等。
最优选地，所述报告基因和淬灭剂选自荧光素和罗丹明染料。连接至寡核苷酸的这些染料和适当的连接方法为本领域所熟知。
淬灭剂的适宜的示例可选自6-羧基-四甲基-罗丹明、4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABYL)、四甲基罗丹明(TAMRA)、BHQ-0TM、BHQ-1TM、BHQ-2TM、以及BHQ-3TM，其中每个购自LGC Biosearch Technologies，Inc.of Novato，Calif.，QSY-7TM、QSY-9TM、QSY-21TM和QSY-35TM，其中每个购自Molecular Probes，Inc.等。
报告基因的适宜的示例可选自染料诸如SYBR绿、5-羧基荧光素(5-FAMTM购自Applied Biosystems of Foster City，Calif.)、6-羧基荧光素(6-FAM)，四氯-6-羧基荧光素(TET)、2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、6-羧基-2′，4，7，7′-四氯荧光素(6-TETTM购自Applied Biosystems)、羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(6-JOETM购自Applied Biosystems)、VICTM染料产品(购自Molecular Probes，Inc.)、NEDTM染料产品(购自Applied Biosystems)、Cal染料产品(例如Cal金540、橙560、红590、红610、红635，购自LGC BiosearchTechnologies)、Quasar染料产品(例如Quasar 570、670、705，购自LGC BiosearchTechnologies)等。
包含报告基因和淬灭剂的探针的一个示例是处于单分子或双分子构象的Scorpion探针。在单分子Scorpion中，所述引物-探针复合物的探针部分侧翼为自身互补区，当所述探针从其靶DNA解绑时所述自身互补区使得所述探针形成茎-环结构。另外，在单分子Scorpion中，报告基因通常连接在或靠近所述自身互补区中的一个，诸如在所述Scorpion探针的5′末端处，而淬灭剂连接在或靠近另一个所述自身互补区，诸如在互补序列的3′端并邻近非扩增接头，使得当所述探针处于其茎-环构象时所述淬灭剂足够靠近所述报告基因以导致淬灭。在双分子Scorpion中，通常不采用自身互补侧翼区，而是采用分离的“阻断寡核苷酸”结合所述Scorpion探针。当所述探针从其靶DNA解绑时，这个阻断寡核苷酸能杂交至所述Scorpion探针的探针区。另外，在双分子Scorpion中，所述报告基因通常连接到所述Scorpion探针的探针区，诸如所述Scorpion探针的5’末端，而所述淬灭剂连接至所述阻断寡核苷酸，诸如所述阻断寡核苷酸的3′末端，使得当所述探针从其靶DNA解绑并且相反杂交至所述阻断寡核苷酸时，所述淬灭剂足够接近所述报告基因以导致淬灭。
包含报告基因和淬灭剂的探针的另一个示例是在5′-核酸外切酶测定(诸如实时聚合酶链反应技术)中使用的探针。在此上下文中，所述寡核苷酸探针邻近其5′端将具有足够数量的磷酸二酯键使得所用的5′至3′核酸酶活性能高效地降解所述绑定探针以分离所述报告基因和淬灭剂。包含报告基因和淬灭剂的探针的另一个示例是Molecular Beacon型探针，其包含探针区，侧翼具有自身互补区，所述自身互补区使得所述探针从所述探针的靶序列解绑时形成茎-环结构。此类探针通常具有连接至或靠近一侧末端的报告基因和连接或靠近另一侧末端的淬灭剂，使得当所述探针处于其解绑状态并且从而形成茎-环结构时，所述淬灭剂足够接近所述报告基因以导致淬灭。
术语“复制抑制部分”是指任何连接至寡核苷酸的3′末端羟基的原子、分子或化学基团，其将阻止核酸链复制的链延伸的引发。示例包括但不限于：3′-脱氧核苷酸(例如，虫草素)，双脱氧核苷酸，磷酸酯，配体(例如，生物素和二硝基苯酚)，报告基因分子(例如，荧光素和罗丹明)，碳链(例如，丙醇)，错配的核苷酸或多核苷酸，或肽核酸单位。术语“非参与”是指对于核酸分子的扩增反应缺乏探针或引物的参与。具体地非参与探针或引物是将不作为底物或被DNA或RNA聚合酶延伸的探针或引物。“非参与探针”本质上不能通过聚合酶延伸链。它可以有或没有复制抑制部分。
当所述核酸分子的单链形式能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其它核酸分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中进行例示。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。对于同源核酸初步筛选，低严格性杂交条件对应于Tm为55℃，可使用例如5×δSSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，并且无甲酰胺；或者30％甲酰胺，5×δSSC，0.5％SDS。中度严格性杂交条件对应于更高的Tm，例如，40％甲酰胺，和5×δ或6×δSSC。杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的公式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，并且寡核苷酸的长度确定其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个优选的实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。更优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约11个核苷酸，至少约12个核苷酸，至少约13个核苷酸，至少约14个核苷酸，至少约15个核苷酸，至少约16个核苷酸，至少约17个核苷酸，至少约18个核苷酸，至少约19个核苷酸，至少约20个核苷酸，至少约21个核苷酸，至少约22个核苷酸，至少约23个核苷酸，至少约24个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约26个核苷酸，至少约27个核苷酸，至少约28个核苷酸，至少约29个核苷酸，或者最优选地，至少30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于例如Sambrook等人(同上)；和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)。
基因组检测区域
申请人通过利用基于推定的IolI基因的鉴定而发展的单核细胞增多性李斯特菌菌种检测法的方法，已经解决了上述问题。在一些实施方案中，测定结合了用于检测单核细胞增多性李斯特菌血清型(以及在一些实施方案中的内部阳性对照(例如sSV40))的未标记引物和Scorpion探针。在一些实施方案中，测定还包含用于荧光信号归一化并抵消阱间(well-to-well)信号变化的参比荧光。
在104cfu/mL或更低的含单核细胞增多性李斯特菌血清型的液体培养物下，本发明公开的检测测定法具有分析灵敏性。对53个单核细胞增多性李斯特菌的菌株的包容性测试示出，全部均在得比相当的细胞密度下检出(表4)。对61个密切相关的非单核细胞增多性李斯特菌菌种的菌株的专有性研究(表5)显示出，没有一个受试样品与单核细胞增多性李斯特菌检测测定法发生交叉反应。使用食品营养强化剂(food enrichment)样品的测试显示出优异的敏感性和特异性，以及对PCR抑制剂的稳健性。
本公开因此涉及通过检测推定的loll基因序列来检测和鉴定单核细胞增多性李斯特菌。本发明检测方法可用于检测任意类型的样品，例如用于食品测试、环境测试、或者人或动物的诊断性测试的合适样品中的单核细胞增多性李斯特菌菌种。在用于检测这些区域的合适方法的示例包括于本文的情况下，应当理解本发明并不限于所述方法。相反，任何合适的方法可用于检测这些DNA区域并随后检测样品中的单核细胞增多性李斯特菌。
寡核苷酸
Scorpion构造
Scorpion引物是荧光引物/探针寡核苷酸杂交体，其设计使它们仅在扩增期间结合到PCR产物中时发光。这些引物包含两个不同的结构：1)靶特异性PCR引物和2)靶特异性DNA探针序列
靶特异性引物
靶特异性PCR引物通过阻断部分例如3碳或6碳(分别为丙二醇或己二醇)部分，或者3个或6个聚乙二醇亚基的连接臂共价连接至DNA探针序列的3’端。该部分防止聚合酶延伸进入探针元件中。在典型的PCR反应中，引物序列在核苷酸的存在下通过DNA聚合酶的作用退火于互补靶DNA序列，从引物的3’端开始模板DNA合成反应。
DNA探针序列
Scorpion探针的DNA探针序列与从结合到Scorpion探针中的靶特异性引物的3’端进行聚合酶延伸所合成的靶基因序列互补。
荧光淬灭机制
荧光淬灭可通过双分子或单分子机制来实现。在双分子Scorpion形式中，淬灭剂寡核苷酸也与DNA探针序列互补。荧光团分子共价连接至DNA探针序列的5′端，而淬灭剂部分例如BHQ(黑洞淬灭剂，Black Hole Quencher)染料则共价连接至淬灭剂寡核苷酸的3’端。在单分子机制中，探针序列被两个互补序列夹在中间。荧光团分子共价连接至DNA探针序列的5′端，并且淬灭剂位于互补序列的3’端并且邻近于3碳或6碳(分别为丙二醇或己二醇)部分或者3个或6个聚乙二醇亚基的连接臂。当探针未与聚合酶延伸所合成的靶基因序列杂交时，这些互补序列将彼此杂交。这使荧光团和淬灭剂紧靠并导致荧光团淬灭。
本发明的寡核苷酸如SEQ ID NO：2-16所示。
本发明的寡核苷酸可用作PCR扩增的引物。优选的引物对及其对应的靶标和探针示出于表1中。
表1
5′引物 探针 3′引物
SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：11
SEQID NO：3 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：10 SEQID NO：9
SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：14
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：5
表2
在上表2中，以下Scorpion探针序列在序列表中作为全序列示出而无修饰。SEQ IDNO：11(单分子Lmono-357 UM09)在序列表中作为全序列示出而无修饰，该scorpion探针在SEQ ID NO：11中的核苷酸编号1之前具有5’荧光团即Cal Fluor红610，并且在SEQ ID NO：11的核苷酸编号46之后具有内部BHQ2淬灭剂和SP-18间隔区，之后为剩余的27个核苷酸。类似地，SEQ ID NO：12(单分子Lmono-RC737 UM10)在序列表中作为全序列示出而无修饰，该scorpion探针在SEQ ID NO：12的核苷酸编号1之前具有5’荧光团即Cal Fluor红610，并且在SEQ ID NO：12的核苷酸编号50之后具有内部BHQ2淬灭剂和SP-18间隔区，之后为剩余的27个核苷酸。类似地，SEQ ID NO：13(单分子Lmono-471 UM11)在序列表中作为全序列示出而无修饰，该scorpion探针在SEQ ID NO：13的核苷酸编号1之前具有5’荧光团即Cal Fluor红610，并且在SEQ ID NO：13的核苷酸编号46之后具有内部BHQ2淬灭剂和SP-18间隔区，之后为剩余的27个核苷酸。类似地，SEQ ID NO：14(单分子Lmono-821 UM12)在序列表中作为全序列示出而无修饰，该scorpion探针在SEQ ID NO：14的核苷酸编号1之前具有5’荧光团即Cal Fluor红610，并且在SEQ ID NO：14的核苷酸编号42之后具有内部BHQ2淬灭剂和SP-18间隔区，之后为剩余的27个核苷酸。类似地，SEQ ID NO：15(单分子Lmono-RC737 UM13)在序列表中作为全序列示出而无修饰，该scorpion探针在SEQ ID NO：15的核苷酸编号1之前具有5’荧光团即Cal Fluor红610，并且在SEQ ID NO：15的核苷酸编号48之后具有内部BHQ2淬灭剂和SP-18间隔区，之后为剩余的27个核苷酸。类似地，SEQ ID NO：16(单分子Lmono-RC737 UM14)在序列表中作为全序列示出而无修饰，该scorpion探针在SEQ ID NO：16的核苷酸编号1之前具有5’荧光团即Cal Fluor红610，并且在SEQ ID NO：16的核苷酸编号48之后具有内部BHQ2淬灭剂和SP-18间隔区，之后为剩余的27个核苷酸。
这些寡核苷酸引物对于其它核酸扩增方法也是可用的，例如连接酶链反应(LCR)(EP 0 320 308；Carrino等人，J.Microbiol.Methods 23：3-20(1995))；基于核酸序列的扩增(NASBA)(Carrino等人，1995，同上)；以及自动维持序列复制(3SR)和“Q-β复制酶扩增”(Pfeffer等人，Vet.Res.Commun.19：375-407(1995))。
本发明的寡核苷酸引物还可包含可检测的标记，例如5’末端标记。
此外，本发明的寡核苷酸也可用作杂交探针。很多情况下采用使用DNA探针的杂交来检测食物、临床的和环境样品中的病原体，并且一般来讲所述方法学对本领域技术人员是已知的。普遍认为探针杂交的敏感性和特异性的程度低于通过之前描述的扩增技术实现的敏感性和特异性。本发明的核酸探针还可具有可检测的标记，例如报告基因-淬灭剂组合用于Scorpion探针测定或者用于5′-核酸外切酶检测测定法，例如测定法。
在本发明的一个实施方案中，核酸探针的3′末端核苷酸可能不能通过核酸聚合酶延伸。DNA聚合酶可为热稳定性DNA聚合酶。此类阻断可例如通过使复制抑制部分如报告基因或淬灭剂经由连接部分连接至核酸探针的末端3′碳，或者通过使3′-末端核苷酸为双脱氧核苷酸来实现。在本发明的另一个实施方案中，使用至少一种DNA聚合酶。另选地，可通过将一个或多个经修饰核苷酸间键结合到寡核苷酸的3′端上，使得核酸探针的3′端不受聚合酶的3′到5′延伸活性影响。最低限度地，3′末端核苷酸间键必须被修饰，然而，其它核苷酸间键可能被修饰。防止从核酸探针的3′端延伸并且/或者在PCR过程中阻断DNA聚合酶的3′到5′核酸外切酶活性的核苷间的修饰可包括硫代磷酸键、甲基膦酸酯键、硼烷磷酸酯键、以及其它类似的聚合酶抗性核苷酸间键。用于阻断探针3′延伸的另选方法是用丝裂霉素C或其它类似的抗肿瘤抗生素在探针3′端形成加合物，例如在Basu等人，Biochemistry 32：4708-18(1993)中有所描述。因此，使核酸探针的3′端受到保护而免于裂解的精确机制并非必须的，只要淬灭剂不从核酸探针裂解下来即可。
核酸探针序列还可任选地与本发明的引物序列对一起用于基于扩增的检测技术，例如3′-核酸外切酶测定法。优选的引物/探针和引物/引物组合选自：SEQ ID NO 2、7和11；SEQ ID NO 2和7；SEQ ID NO 2和11；SEQ ID NO 3、5和11；SEQ ID NO 3和5；SEQ ID NO 3和11；SEQ ID NO 4、5和11；SEQ ID NO 4和5；SEQ ID NO 4和11；SEQ ID NO 5、6和11；SEQ IDNO 5和6；SEQ ID NO 6和11；SEQ ID NO 5、8和11；SEQ ID NO 5和8；SEQ ID NO 8和11；SEQID NO 5、8和12；SEQ ID NO 5和12；SEQ ID NO 5、6和13；SEQ ID NO 5和13；SEQ ID NO 9、10和14；SEQ ID NO 9和10；SEQ ID NO 10和14；SEQ ID NO 5、8和15；SEQ ID NO 5和15；SEQID NO 5、8和16；以及SEQ ID NO 5和16(以上第052段的表1中所列的任何引物-探针-引物、引物-探针、或引物-引物配对)。
本发明的SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16包含引物区和探针区两者，因此可在合适的测定例如Scorpion探针测定中用作引物-探针复合物。本发明的该种引物-探针复合物包含不可扩增的接头，其将所述探针区的3’末端连接到所述引物区的5’末端。这个不可扩增的接头阻止互补链延伸进入所述引物-探针复合物的探针区中。此类不可扩增的接头的示例包括六乙烯乙二醇(HEG)和优选的3个或6个聚乙二醇亚基的连接臂。本发明的引物-探针复合物也可包含自身互补区，当所述探针从其靶DNA解绑时其使得所述引物-探针复合物形成茎-环结构，这可用于例如使所述报告基因和淬灭剂彼此足够接近，以导致所述报告基因信号被淬灭。优选地，SEQ NO：11、12、13、14、15和16的5′端标记有CAL Fluor红610报告基因和处于或邻近非扩增接头处的BHQ-2标记。其它报告基因部分和对应的淬灭剂能够被取代。
测定方法
单核细胞增多性李斯特菌存在的检测能以任何适宜的方式实现。优选的方法是引物导向的扩增方法和核酸杂交方法。这些方法可用于检测样品中的单核细胞增多性李斯特菌分离物，所述样品是复合的基质或是经纯化的培养物，例如，来源于疑似被污染的动物、环境或食物来源。
本发明的优选的实施方案包括(1)在非选择性或选择性培养基中培养复合物样品混合物以复苏靶细菌，(2)释放靶细菌总DNA，以及(3)加入本发明的引物对并任选地加入包含可检测标记的核酸探针，使所述总DNA按扩增方案实施。
引物导向的扩增测定方法
本领域已知有多种引物导向的核酸扩增方法可用于本发明中，包括热循环方法(例如，聚合酶链反应(PCR)，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，和LCR)，以及等温方法和链置换扩增反应(SDA)。优选的方法是聚合酶链反应(PCR)。
样品制备：
根据本发明的所述寡核苷酸和方法可直接用于任何适宜的临床或环境样品，无需任何样品制备。为了获得更高的灵敏度，并且在时间不是限制性因素的情况下，预处理所述样品并且进行预扩增富集是优选的。
检测食品源性细菌病原体的最低行业标准为，可靠地检测25克的食品基质中一个病原体细胞的存在的方法，如AndrewS等人，1984，“Food Sample and Preparation ofSample Homogenate”，Bacteriological Analytical Manual，第8版的第1章，Revision A，U.S.Food and Drug Administration中所述。为了满足这个严格的标准，已开发出富集方法和培养基以增强所述靶病原体细胞的生长，以通过生物化学，免疫学或核酸杂交方法方便其检测。典型的富集步骤使用了培养基，其将增强所述靶细菌的生长和健康并且也会抑制存在的任何背景或非靶微生物的生长。
已开发出用于多种细菌病原体的选择性培养基，本领域技术人员了解选择适于待富集的特定生物体例如单核细胞增多性李斯特菌的培养基。非选择性和选择性培养基的综述性讨论和配方描述于在线FDA细菌分析手册(Bacteriological Analytical Manual)(http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratorvMethods/ucm071363.htm)和硬拷贝，(1998)，由Association of Analytical Chemists公布和发行(Suite 400，2200Wilson Blvd，Arlington，VA 22201-3301)。
在选择性生长后，取出所述复合混合物的样品用于进一步分析。这个取样步骤可以通过本领域的技术人员熟知的多种方式完成。在一个优选的实施方案中，取出5μl所述富集培养物，然后添加至200μl的包含蛋白酶和/或变溶菌素的裂解溶液中。加热所述裂解溶液至55℃，30分钟，随后在95℃蛋白酶失活10分钟，并冷却至4℃，如System User’sGuide，DuPont Nutrition and Health，Wilmington，DE中所述。
聚合酶链反应(PCR)测定方法：
用于检测样品中的单核细胞增多性李斯特菌存在的优选方法包括：
(a)使用选自下列的引物对和引物探针对进行PCR扩增以产生PCR扩增结果：SEQID NO 2、7和11；SEQ ID NO 2和7；SEQ ID NO 2和11；SEQ ID NO 3、5和11；SEQ ID NO 3和5；SEQ ID NO 3和11；SEQ ID NO 4、5和11；SEQ ID NO 4和5；SEQ ID NO 4和11；SEQ ID NO5、6和11；SEQ ID NO 5和6；SEQ ID NO 6和11；SEQ ID NO 5、8和11；SEQ ID NO 5和8；SEQID NO 8和11；SEQ ID NO 5、8和12；SEQ ID NO 5和12；SEQ ID NO 5、6和13；SEQ ID NO 5和13；SEQ ID NO 9、10和14；SEQ ID NO 9和10；SEQ ID NO 10和14；SEQ ID NO 5、8和15；SEQID NO 5和15；SEQ ID NO 5、8和16；以及SEQ ID NO 5和16(以上第052段的表1中所列的任何引物-探针-引物、引物-探针、或引物-引物配对)；以及(b)检测扩增，从而扩增的阳性检出表明了样品中单核细胞增多性李斯特菌的存在。
在另一个优选的实施方案中，在进行PCR扩增之前，可进行制备所述样品的步骤。所述制备步骤可包括下列步骤中的至少一个：(1)细菌富集，(2)从所述样品分离细菌细胞，(3)细胞裂解，以及(4)总DNA提取。
扩增条件：
技术人员会理解，使用根据本发明的寡核苷酸，任何一般来讲可接受的PCR条件可用于成功检测单核细胞增多性李斯特菌，并且根据待测样品和其它实验室条件，对PCR条件进行常规优化可能是必要的，以达到最佳的灵敏度和特异性。最佳地，他们实现了来自所有预期的特异性靶菌种的PCR扩增结果而未得到其它非靶菌种的PCR结果。
检测/检验/分析：
引物引导的扩增产物可用各种方法进行分析。匀质检测是指用于检测扩增产物的优选的方法，其中不需要分离(诸如通过凝胶电泳)来自模板或引物的扩增产物。通常通过在扩增过程中或紧接扩增测量所述反应混合物的荧光水平来完成匀质检测。此外，在本发明中能使用异质检测方法，其涉及在检测过程中或之前分离扩增产物。
可使用匀质检测以实施“实时”引物导向的核酸扩增和检测，使用本发明的引物对(例如，“实时”PCR和“实时”RT-PCR)。在美国专利6,171,785、5,994,056、6,326,145、5,804,375、5,538,848、5,487,972和5,210,015中示出了优选的“实时”方法，其中每个全文以引用方式并入本文。
尤其优选的“实时”检测方法是在美国专利6,326,145中示出的所述Scorpion探针测定法，其全文以引用方式并入本文。在所述Scorpion探针测定法中，使用Scorpion探针(单分子或双分子)作为引物-探针复合物进行PCR扩增，所述Scorpion探针具有一个适当的报告基因-淬灭剂对，使得在所述引物伸长之前淬灭所述报告基因的可检测的信号。伸长后，所述淬灭效应被消除，并且存在的信号数量被定量。随着扩增产物数量增加，将会观察到可检测的信号的等同增加，从而使得将存在的扩增产物的数量确定为测得的可检测信号数量的函数。当在Scorpion探针测定法中使用多于一种Scorpion探针时，每种探针可具有连接的不同的可检测的标记(例如，报告基因-淬灭剂对)，从而允许独立于其它探针地检测每种探针。
另一个优选的“实时”检测方法是所述5’-核酸外切酶检测方法，如美国专利5,804,375，5,538,848，5,487,972和5,210,015中示出的，其中的每个全文以引用方式并入本文。在所述5’-核酸外切酶检测中，在PCR过程中使用经修饰的探针，所述探针结合在扩增引物对的两个成员中间或之间。所述经修饰的探针具有报告基因和淬灭剂，并且被设计为在PCR过程中生成可检测的信号以表明其已经与所述靶核酸序列杂交。只要所述报告基因和所述淬灭剂两者都在所述探针之上，所述淬灭剂则使所述报告基因停止发射可检测的信号。然而，在扩增过程中随着聚合酶延伸所述引物，所述聚合酶固有的5′至3′核酸酶活性降解了所述探针，将所述报告基因和所述淬灭剂分离，并且使得可检测的信号能够被发射。一般来讲，在扩增循环过程中生成的可检测的信号的数量与每个循环中生成的产物数量成比例。
已经熟知淬灭的效率是所述报告基因和所述淬灭剂的接近度的强函数，即，随着两个分子逐渐靠近，所述淬灭效率增加。由于淬灭强烈依赖于所述报告基因和所述淬灭剂的物理接近，所述报告基因和所述淬灭剂优选地连接至所述探针，彼此在几个核苷酸内，通常彼此在30个核苷酸内，更优选地在从约6至16个核苷酸的分离内。通常，通过将报告基因-淬灭剂对的一个成员连接至所述探针的5′端，并且将另一个成员连接至约6至16个核苷酸之外来实现这种分离。
同样，当在5’-核酸外切酶检测测定法中使用多于一种探针时，每种探针可具有连接的不同的可检测的标记(例如，报告基因-淬灭剂对)，从而允许独立于其它探针地检测每种探针。
另一种优选的匀质检测方法涉及使用DNA解链曲线分析，具体地采用***硬件和试剂片剂(得自DuPont Nutrition and Health)。***的细节在美国专利6,312,930和PCT公开WO 97/11197和WO 00/66777中给出，其中每个全文以引用方式并入本文。
通过在每次扩增循环过程中在所选时间点监测靶扩增产物(“靶扩增子”)的荧光，解链曲线分析检测和量化双链核酸分子(“dsDNA”或“靶标”)。
如技术人员所熟知的，当温度高于dsDNA解链温度时，dsDNA的两条链分开或解链。dsDNA分子的解链为如下过程：在给定的溶液条件下，解链开始于一个温度(在下文中命名为Tms)，并且完成于另一个温度(在下文中命名为Tme)。类似的术语Tm表示解链完成50％时的温度。
典型的PCR循环涉及：靶dsDNA解链的变性阶段；引物退火阶段，其中温度对于引物结合到现在的单链靶标是最佳的；和链延长阶段(在温度Te下)，其中温度对于DNA聚合酶起作用是最佳的。
根据本发明，Tms应当高于Te，并且Tme应当低于(通常远远低于)使DNA聚合酶加热灭活的温度。解链特征受给定dsDNA分子固有性质的影响，例如脱氧核苷酸组成和dsDNA的长度。
嵌入染料将结合至双链DNA。染料/dsDNA复合物将在暴露于适当的光激发波长时发荧光，这取决于染料，并且荧光强度可与dsDNA的浓度成比例。利用DNA嵌入染料检测和定量dsDNA的方法在本领域中是已知的。许多染料是已知的并且用于这些目的的本领域。本发明方法也利用了此类关系。
此类嵌入染料的示例包括但不限于SYBR溴化乙锭、碘化丙锭、{喹啉，1-1′-[1，3-丙二基双[(二甲基亚氨基)-3，1-丙二基]]双[4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]]-，四碘化物}，和{喹啉，4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噁唑亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵)-丙基]-，二碘化物}。本发明最优选的是非不对称氰化物染料，例如SYBR由Molecular Probes，Inc.制造(Eugene，OR)。
解链曲线分析通过在温度增大时监测荧光的变化来实现。当温度达到对靶扩增子特异性的TMS时，dsDNA开始变性。当dsDNA变性时，嵌入染料从DNA解离并且荧光减小。荧光对数变化除以温度变化的负数相对于温度绘图的数学分析产生了称为解链曲线的图形化峰。
应当理解，本发明可利用这些技术的组合进行操作，例如通过使Scorpion探针定向于一个靶区域并使探针定向于第二靶区域。应当理解本发明并不限于上述技术。相反，本领域的技术人员认识到还可使用本领域已知的用于检测扩增的其它技术。例如，诸如基于PCR的定量序列检测(QSD)的技术可使用核酸探针进行，当该核酸探针在溶液中以单链状态存在时被构造成使得报告基因和淬灭剂靠近到足以显著淬灭报告基因的发射。然而，在完整的报告基因-淬灭剂核酸探针与扩增的靶核酸序列杂交时，报告基因和淬灭剂变得彼此足够远离。因此，淬灭基本上消除，从而导致检测到的荧光发射增大。
除了匀质检测方法，本领域已知的多种其它异质检测方法可用于本发明中，包括标准非变性凝胶电泳(例如，丙烯酰胺或琼脂糖)，变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳。标准非变性凝胶电泳是一种简单和快速的PCR检测方法，但可能不适于所有应用。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是检测小DNA片段(200-700bp)的变性行为的差异的分离方法。分离原理基于片段长度和核苷酸序列两者。在长度相同的片段中，可检测到小至一个碱基对的差异。这与DNA片段仅仅按尺寸分离的非变性凝胶电泳相反。非变性凝胶电泳的此种局限性是由于DNA分子之间的电荷密度差异接近中性并且在其分离中几乎不起作用的结果。随着DNA片段尺寸的增大，其通过凝胶的速度减小。
DGGE主要基于其变性特征和序列用来分离相同尺寸的DNA片段。使用DGGE，当施加热或化学变性剂时，DNA分子的两条链分开或解链。DNA双链体的变性受两个因素影响：1)互补碱基对之间形成的氢键(因为GC富集区在比AT富集区更高的变性条件下解链)；和2)同一链的相邻碱基之间的引力，或“堆积”。因此，DNA分子可具有若干解链结构域，其各个特征变性条件中的每一者由其核苷酸序列确定。DGGE利用的事实在于，除特异性变性结构域内的仅一个核苷酸外，具有相同长度和DNA序列的其它方面相同的DNA分子将在不同温度或Tm下变性。因此，当双链(ds)DNA片段通过递增的化学变性剂梯度电泳时，其开始变性并发生构象和迁移率变化两者。dsDNA片段将比变性的单链(ss)DNA片段更快地移动，因为分子单链部分的支链结构在凝胶基质内缠结在一起。随着变性环境增大，在DNA链的特定低变性结构域发生解离的变性剂浓度下，dsDNA片段将完全解离并且分子通过凝胶的迁移率降低。在实施过程中，电泳在恒定温度(约60℃)下进行并且化学变性剂以导致100％DNA分子变性的浓度使用(即，40％甲酰胺和7M脲)。该种可变的变性梯度用梯度仪创建，由此使得各个DGGE凝胶的组成逐渐由0％变性剂变为至多100％变性剂。当然，还可注入包含范围减小的变性剂(例如，35％至60％)的梯度以增大DNA的分离。
DGGE中所用的原理也可应用于使用温度梯度而非化学变性剂梯度的第二方法。该方法称为温度梯度凝胶电泳(TGGE)。该方法利用温度梯度诱导dsDNA的构象变为ssDNA，以分离尺寸相等而序列不同的片段。如在DGGE中，具有不同核苷酸序列的DNA片段将在凝胶的不同位置被固定。引物设计的变型可用来有利地增大用于表征和鉴定PCR产物的DGGE的实用性。这些使用引物设计变型的方法和原理描述于PCR Technology Principles andApplications，Henry A.Erlich编辑，M.Stockton Press，NY，第71至88页(1988)。
仪器：
当使用匀质检测时，优选地使用激光荧光计测量荧光水平，例如***Q7装置(DuPont Nutrition and Health，Wilmington，DE)。然而，本发明包括了用于测量样品中荧光水平的类似检测***。
试剂和试剂盒：
可使用任何形式的任何适宜的核酸复制组合物(“复制组合物”)。用于PCR扩增的典型的复制组合物可包含，例如，dATP、dCTP、dGTP、和dTTP、靶特异性引物和至少一种合适的聚合酶。
如果所述复制组合物是液体形式的，可使用在本领域中已知的适宜的缓冲剂(Sambrook，J.等人，同上)。
作为另外一种选择，如果所述复制组合物被包含在片剂形式中，则典型的片剂化试剂可包括诸如稳定剂和结合剂。在美国专利4,762,857和4,678,812中示出了优选的片剂化技术，其中每个全文以引用方式并入本文。
本发明优选的复制组合物包含：(a)选自以下的一组引物对或引物-探针对：SEQID NO 2、7和11；SEQ ID NO 2和7；SEQ ID NO 2和11；SEQ ID NO 3、5和11；SEQ ID NO 3和5；SEQ ID NO 3和11；SEQ ID NO 4、5和11；SEQ ID NO 4和5；SEQ ID NO 4和11；SEQ ID NO5、6和11；SEQ ID NO 5和6；SEQ ID NO 6和11；SEQ ID NO 5、8和11；SEQ ID NO 5和8；SEQID NO 8和11；SEQ ID NO 5、8和12；SEQ ID NO 5和12；SEQ ID NO 5、6和13；SEQ ID NO 5和13；SEQ ID NO 9、10和14；SEQ ID NO 9和10；SEQ ID NO 10和14；SEQ ID NO 5、8和15；SEQID NO 5和15；SEQ ID NO 5、8和16；以及SEQ ID NO 5和16(以下第052段的表1中所列的任何引物-探针-引物、引物-探针、或引物-引物配对)，和(b)热稳定性DNA聚合酶。
本发明更优选的复制组合物包含：(a)选自表1的引物对和任意对应的探针，其中所用的各个核酸探针或引物-探针复合物包含可检测的标记；和(b)热稳定性DNA聚合酶。优选地，可检测的标记包含能够发射可检测的信号的报告基因以及当报告基因和淬灭剂彼此足够紧靠时能够显著淬灭报告基因并防止可检测的标记发射的淬灭剂。
本发明的优选的试剂盒包含上述复制组合物的任一种。本发明的优选的片剂包含上述复制组合物的任一种。更优选地，本发明的试剂盒包含前述优选的片剂。
在一些情况下，在反应中可包括内部阳性对照。内部阳性对照可包括对照模板核酸(例如，DNA或RNA)、对照引物、以及对照核酸探针。之前已经描述被包含在PCR反应内的内部阳性对照的优点(美国专利6,312,930和PCT申请wO 97/11197，其中的每个全文以引用方式并入本文)，并且包括：(i)对照可用单一引物扩增；(ii)对照扩增产物的量与样品中所含的任何靶DNA或RNA无关；(iii)对照DNA可用其它扩增试剂压片以在手动和自动测试过程两者中均易于使用且有高度重复性；(iv)对照可用于匀质检测，即无需从反应物中分离产物DNA；并且(v)内部对照具有与反应中其它可能的扩增产物不同的解链曲线图和/或与定向于靶标的核酸探针上的可检测标记不同的对照核酸上的可检测标记。
对照DNA将具有适当的大小和碱基组合物以允许在引物引导的扩增反应中扩增。可从单核细胞增多性李斯特菌的基因组或从另一来源获得所述对照模板DNA序列，但必须在相同条件下可重复地扩增以允许所述靶标扩增产物响扩增。
优选的对照序列包括例如存在于SV40的那些。当使用时，SV40优选的浓度范围为101至107个拷贝/PCR反应。
SEQ ID NO：17
AATAGCAGACACTCTATGCCTGTGTGGAGTAAGAAAAAACAGTATGTTATGATTATAACTGTTATGCCTACTTATAAAGGTTACAGAATATTTTTCCATAATTTTCTTGTATAGCAGTGCAGCTTTTTCCTTTGTGGTGTAAATA
所述对照反应可用于验证所述扩增反应。所述对照DNA的扩增发生在与被测试的所述样品相同的反应管中，因此当样品为靶标阴性、即没有生成靶标扩增产物时，表明是成功的扩增反应。为了获得所述扩增反应的显著验证，在每个扩增反应中必须包括适宜数量的所述对照DNA模板的复制。
在一些情况下，包括附加的阴性对照复制组合物可能是有用的。所述阴性对照复制组合物将包含与所述复制组合物相同的试剂，但没有聚合酶。当所述方法使用荧光检测方法时，此类对照的主要作用是监测匀质形式的伪背景荧光。
可根据是否设计用于扩增靶标DNA或对照DNA来修饰复制组合物。将扩增所述靶标DNA的复制组合物(测试复制组合物)可包含(i)聚合酶(一般来讲是热稳定性的)，(ii)能杂交至所述靶标DNA的引物对，和(iii)用于扩增反应进行的必需的缓冲剂。将扩增对照DNA的复制组合物(阳性对照，或阳性复制组合物)可包含(i)聚合酶(一般来讲是热稳定性的)，(ii)对照DNA；(iii)至少一种能杂交至对照DNA的引物；和(iv)用于扩增反应进行的必需的缓冲剂。此外，用于靶DNA或对照DNA扩增的所述复制组合物可包含核酸探针，优选地其具有可检测的标记。
核酸杂交方法
除引物引导的扩增测定法之外，还可在本发明中使用核酸杂交测定法以检测单核细胞增多性李斯特菌。核酸杂交试验的基本组分包括探针、疑似含有单核细胞增多性李斯特菌的样品及特定的杂交方法。通常探针长度可从少至五个碱基变化到单核细胞增多性李斯特菌诊断序列的全长并且将依赖于待进行的特定测试。需要探针分子的仅一部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基没有与正确的互补碱基配对。
特别可用于核酸杂交方法的探针为SEQ ID NO：2-16中的任一者或由其衍生的序列。
样品可能或者可能不包含单核细胞增多性李斯特菌。样品可采用多种形式，然而其通常从疑似被污染的动物、环境或食物源提取。DNA可被直接检测到，但是最优选地，在可能发生探针和靶分子的任何杂交之前，样品核酸必须可用于接触探针。因此，生物体的DNA优选地不含细胞并且在可能发生杂交之前被置于适当的条件下。溶液中杂交的方法需要纯化DNA，从而能够获得样品DNA与探针的杂交。这就意味着，使用溶液中的方法检测样品中的靶序列需要样品的核酸必须先被纯化以除去蛋白质、脂质、及其它细胞组分，然后使其在杂交条件下与探针接触。用于纯化样品核酸的方法在本领域中是常见和熟知的(Sambrook等人，同上)。
在一个优选的实施方案中，杂交测定可直接在细胞裂解液上进行而无需提取核酸。这除去了来自于样品处理过程的若干步骤并且加快了测定。为了在粗制细胞裂解液上进行此类测定，通常将离液剂添加到如上所述制备的细胞裂解液中。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外离液剂允许短的寡核苷酸探针在室温下灵敏且严格的杂交至DNA(Van Ness&Chen，Nucleic Acids Res.19：5143-51(1991))。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。通常，离液剂的最终浓度将为约3M。如果需要，技术人员可将甲酰胺加到杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。
另选地，技术人员可在探针杂交之前纯化样品核酸。多种方法对本领域的技术人员是已知的(例如，苯酚-氯仿提取，IsoQuick提取(MicroProbe Corp.，Bothell，WA)，以及其它)。杂交前纯化特别用于标准滤膜杂交测定。此外，通过结合体外RNA扩增方法例如自动维持序列扩增(参见例如Fahy等人，In PCR Methods and Applications，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1991)，第25-33页)或者逆转录酶PCR(Kawasaki，In PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，M.A.Innis等人编辑，(1990)，第21-27页)，纯化有利于使测量增大测定灵敏性。
在DNA释放后，其可通过任何各种方法检测到。然而，最有用的实施方案具有至少一些特征：速度、方便性、灵敏性和特异性。
杂交方法是本领域所熟知的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在适当浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交均可发生。混合物中的探针或靶标的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。常见的杂交溶液使用约30-50％v/v的甲酰胺，约0.15至1M的氯化钠，约0.05至0.1M的缓冲液如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围介于约6-9之间)，约0.05至0.2％的洗涤剂如十二烷基硫酸钠，或0.5-20mM EDTA，FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500千道尔顿)，聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)，以及血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其它添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的方法形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与DNA序列的一部分互补。
夹心测定可包括于测定试剂盒中。该试剂盒将包含用于收集疑似被污染的样品的第一组分以及用于分配和裂解样品的缓冲剂。第二组分将包括以干燥形式或液体形式存在的介质，所述介质用于杂交靶多核苷酸和探针多核苷酸以及通过洗涤移除非期望的和非双链形式的核酸。第三组分包括固体支持体(量杆)，其上固定(或其缀合)与本文所公开的一种或多种序列互补的未标记的核酸探针。第四组分将包含与相同DNA链的第二及不同区域互补的经标记的探针，第三组分的固定化的未标记核酸探针与该DNA链杂交。
在一个优选的实施方案中，本文所公开的多核苷酸序列或其衍生物可以以匀质或异质测定形式用作3′阻断的检测探针。例如，由这些序列产生的探针可以是3′阻断的或非参与性的并且将不通过(或参与)核酸扩增反应而延长。另外，探针结合了可充当反应性配体的标记，该标记用作用于固定探针/分析物杂交体的连接点或者用作报告基因以产生可检测的标记。因此，在过量的3′阻断的检测探针存在下，通过标准引物引导的扩增方案扩增从疑似被单核细胞增多性李斯特菌污染的样品分离的基因组或cDNA，以产生扩增产物。因为探针是3′阻断的，所以其不参与或妨碍靶标的扩增。在最终的扩增循环之后，检测探针对扩增DNA的相关部分退火，然后通过反应性配体使经退火的复合物捕获于支持体上。
在一些情况下，希望结合配体标记的dNTP，复制组合物中的标记探针有利于PCR反应产物固定于支持体上，然后通过经标记的探针试剂检测经固定的产物。例如，可将生物素、地高辛、或毛地黄(digoxin)标记的dNTP添加至PCR反应组合物。接着，可将结合于PCR产物中的生物素、地高辛、或毛地黄分别固定到链霉抗生物素蛋白、抗毛地黄或抗地高辛抗体支持体上。经固定的PCR产物然后可由存在的探针标记检测。
实施例：
本发明将在以下的实施例中进一步阐述。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。
用于实施例的一般性方法和材料
适于细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域所熟知的。适用于如下实施例的技术可见于如下文献：Manual of Methods for General Bacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology，Washington，DC.(1994)或Thomas D.Brock的Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第二版，(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.或Bacteriological Analytical Manual.第6版，Association of Official AnalyticalChemists，Arlington，VA(1984)。
引物和探针(SEQ ID NO：2-16)通过LGC Biosearch Technologies，Inc.，2199S.McDowell Blvd.，Petaluma，CA 94954 USA制备。
所有PCR反应均用标准Q7***(DuPont Nutrition and Health，Wilmington，DE)进行。
缩写的含义如下：“h”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“ml”是指毫升，“ul”是指微升，“cfu”是指菌落形成单位数，“M”是指摩尔，“μM”是指微摩尔，“nM”是指纳摩尔，“L.mono”是指单核细胞增多性李斯特菌，“Ct”是指循环阈值，“IPC”是指内部阳性对照，“IoII”是指肌醇单酮异构酶蛋白基因。
实施例1
单核细胞增多性李斯特菌引物和Scorpion的开发
评估一组九种引物和六种单分子scorpions，参见表1。当以80nM至640nM范围内的引物浓度测试时，通过凝胶分析的PCR产物显示出单核细胞增多性李斯特菌特异性靶标的扩增。当扩增作为靶标的低水平单核细胞增多性李斯特菌基因组DNA时，将PCR反应条件最优化以使Ct最小化，同时维持更低的整体总引物浓度以使引物二聚体形成最小化。
用较低的引物(SEQ ID NO：2-10)浓度滴定探针(SEQ ID NO：11-16)的浓度来评估扩增，从而确定对信号振幅和基线荧光强度的影响并且阐明这是否将在较低的DNA靶水平下对Ct值具有任何影响。Scorpion探针(SEQ ID NO：11-16)浓度从5nM滴定到40nM。基于滴定结果，根据基线荧光、荧光信号振幅和Ct值，15nM的SEQ ID NO：11-16示出最佳的PCR和Scorpion性能。
实施例2
包容性测定
使不同血清型以及最初从各种来源分离的(得自DuPont Nutrition&Health内部培养物收集，命名为“DD”)单核细胞增多性李斯特菌菌株共53个菌株在35℃下于脑心浸液培养基(BHI)中生长过夜。使细胞稀释至约105CFU/ml并用标准BAX裂解方案进行裂解，并且通过实时单核细胞增多性李斯特菌检测测定法进行测试。全部示出为阳性信号(表3)。将代表一组单核细胞增多性李斯特菌血清型(表2中所列的#2、3、4、5、10、14、22、29、33、35和39以及DD651和DD1423)的13种分离物的子组连续稀释至约102cfu/mL并且由实时PCR测定进行测试。在103cfu/mL和更高下，所有菌株测试呈阳性。
表3
实施例3
专有性测定
将六十一种非单核细胞增多性李斯特菌菌株的分离物(包括其它李斯特氏菌属菌种)在30℃或37℃下于BHI中生长过夜。各个菌株在BHI液体培养基中稀释至1∶10，并且采用标准BAX裂解方案制备细胞裂解液，通过实时单核细胞增多性李斯特菌PCR测定进行测试。所有菌株测试均呈阴性。(表4)。
表4
实施例4
另外用不同食品基质的掺加李斯特氏菌属的富集物评估测定的敏感性和特异性。简而言之，在225mL具有抗生素补充剂的24LEB(李斯特氏菌属富集液体培养基，ListeriaEnrichment Broth)中富集25g不含李斯特氏菌属的食品基质部分。连续稀释所列单核细胞增多性李斯特菌分离物的新生长的BHI培养物并加入相应的食品营养强化剂中以实现1×108、1×107、1×106、1×105、1×104和1×103cfu/ml的浓度。使用标准裂解方案制备加入富集物的裂解物，并且以冻干的片剂形式进行测定。就各个单核细胞增多性李斯特菌富集裂解物而言，该测定示出约104cfu/mL的灵敏性。未发现背景微生物区系的交叉反应，因为所有空白食品营养强化剂裂解物由测定测试为阴性。

Claims (18)

1.一种用于检测样品中单核细胞增多性李斯特菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含合适的引物对，所述合适的引物对用于扩增推定的肌醇单酮异构酶蛋白(IoII)基因的至少一部分；
(b)使用所述步骤(a)的反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及
(c)检测所述步骤(b)的扩增，从而扩增的阳性检出表明所述样品中所述单核细胞增多性李斯特菌的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括用于扩增SEQ ID NO：1的合适的引物对。
3.根据权利要求2所述的方法，其中用于扩增所述SEQ ID NO：1的核酸区域的所述引物对选自：
(A)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8、以及SEQ ID NO：9和SEQIDNO：10。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述反应混合物还包含用于各个待检测核酸区域的至少一种核酸探针。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种核酸探针选自SEQ ID NO：11、12、13、14、15和16。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一种核酸探针中的每一者包含可检测的标记。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括食物样品或环境样品。
8.一种引物，其包含基于BLASTN比对方法与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或10中所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的引物，其中所述引物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9或10中所示的多核苷酸序列。
10.一种单核细胞增多性李斯特菌血清型检测序列，其包括基于所述BLASTN比对方法与SEQ ID NO：1中所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的单核细胞增多性李斯特菌血清型检测序列，其包括SEQ IDNO：1中所示的多核苷酸序列。
12.一种分离的多核苷酸，其包含基于所述BLASTN比对方法与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中所示的多核苷酸序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16中所示的多核苷酸序列。
14.一种用于进行PCR的复制组合物，其包含：
(a)选自下列的一组引物对：
(i)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7；
(ii)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5；
(iii)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
(iv)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；
(v)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8；以及
(vi)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
15.根据权利要求14所述的复制组合物，其中至少一种DNA聚合酶为至少一种热稳定性DNA聚合酶。
16.一种用于检测样品中单核细胞增多性李斯特菌血清型的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求14所述的复制组合物，其中所述试剂盒包含(i)所述(a)(i)-a(vi)的引物对和所述SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、或SEQIDNO：16的探针，或者(ii)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11、SEQID NO：4和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11、SEQID NO：5和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：15、或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：16的探针-引物对。
17.根据权利要求16所述的用于检测样品中单核细胞增多性李斯特菌血清型的试剂盒，其中所述试剂盒还包含至少一种DNA聚合酶。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述至少一种DNA聚合酶为至少一种热稳定性DNA聚合酶。
CN201580039030.6A 2014-07-18 2015-07-16 用于单核细胞增多性李斯特菌检测的序列和它们的用法 Pending CN106661626A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462026135P 2014-07-18 2014-07-18
US62/026135 2014-07-18
PCT/US2015/040753 WO2016011255A1 (en) 2014-07-18 2015-07-16 Sequences and their use for detection of listeria monocytogenes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106661626A true CN106661626A (zh) 2017-05-10

Family

ID=53762378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580039030.6A Pending CN106661626A (zh) 2014-07-18 2015-07-16 用于单核细胞增多性李斯特菌检测的序列和它们的用法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP3169802B8 (zh)
JP (1) JP2017521083A (zh)
CN (1) CN106661626A (zh)
AU (1) AU2015289612B2 (zh)
WO (1) WO2016011255A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725474B (zh) * 2020-12-30 2022-05-20 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 含有特异性分子靶标的单核细胞增生李斯特菌标准菌株及其检测和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998020160A1 (en) * 1996-11-08 1998-05-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company GENETIC MARKERS AND METHODS FOR THE DETECTION OF LISTERIA MONOCYTOGENES AND $i(LISTERIA SPP)
WO2000066777A2 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Qualicon, Inc. Assay based on the analysis of dna melting curves
WO2004092406A1 (en) * 2003-04-18 2004-10-28 Warnex Research Inc. Polynucleotides for the detection of listeria monocytogenes
CN103703147A (zh) * 2011-07-25 2014-04-02 纳幕尔杜邦公司 扩增核酸以产生保守的和随机的产物的荧光标记的片段的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998020160A1 (en) * 1996-11-08 1998-05-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company GENETIC MARKERS AND METHODS FOR THE DETECTION OF LISTERIA MONOCYTOGENES AND $i(LISTERIA SPP)
WO2000066777A2 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Qualicon, Inc. Assay based on the analysis of dna melting curves
WO2004092406A1 (en) * 2003-04-18 2004-10-28 Warnex Research Inc. Polynucleotides for the detection of listeria monocytogenes
CN103703147A (zh) * 2011-07-25 2014-04-02 纳幕尔杜邦公司 扩增核酸以产生保守的和随机的产物的荧光标记的片段的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3169802B8 (en) 2019-07-03
AU2015289612B2 (en) 2021-03-25
EP3169802A1 (en) 2017-05-24
JP2017521083A (ja) 2017-08-03
WO2016011255A1 (en) 2016-01-21
AU2015289612A1 (en) 2017-01-19
EP3169802B1 (en) 2019-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2013500008A (ja) 大腸菌ｏ１５７：ｈ７の検出及びキャラクタリゼーションのための配列並びにそれらの使用
US11479826B2 (en) Nucleic acids and methods for the detection of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
CN103890192A (zh) 用于stec细菌的检测和鉴定的序列以及它们的使用
US20220205020A1 (en) Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis
US9816145B2 (en) Compositions for detection of Clostridium difficile
CN106661626A (zh) 用于单核细胞增多性李斯特菌检测的序列和它们的用法
US9234248B2 (en) Simultaneous quantitative multiple primer detection of Clostridium difficile
WO2020205491A1 (en) Sequences and their use for detection and characterization of genus cronobacter
US20160201116A1 (en) Sequences and their use for detection of salmonella enteritidis and/or salmonella typhimurium
JP4766878B2 (ja) ハイブリダイゼーションアッセイを使用する真正細菌群の検出、同定および識別
EP2959012B1 (en) Sequences and their use for detection and characterization of e. coli o157:h7
WO2020051301A1 (en) Sequences and their use for detection and characterization of escherichia coli serotype o157:h7
JP2017213003A (ja) サルモネラ属の検出のための配列およびその使用
CN116848268A (zh) 用于检测与细菌性和念珠菌***病相关的细菌和真菌的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170818

Address after: California, USA

Applicant after: QUALICON diagnostics Ltd

Address before: Delaware, USA

Applicant before: E. I. du Pont de Nemours and Co.

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170510