CN104133004A - 血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法，所述测定方法包括：血浆样品前处理步骤：在0～4℃下，按体积比为1：5混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱-质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中液相色谱条件包括：色谱柱为Ascentis，RP-Amide，5μm，50×2.1mm；色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45%；质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi；气体流速为9L/min；毛细管电压为4500V；离子源温度为350℃，内标法定量。

Description

血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法

技术领域

本发明属于生物医药检测领域，涉及一种内源性活性化合物2，3-吲哚醌的生物体内血浆样品中的浓度的测定方法。

背景技术

2,3-吲哚醌（2,3-Indolinedione，Isatin，ISA），又名靛红，是近年发现存在于人和动物体内的一种内源性活性因子，具有多种生物活性。

液相色谱与质谱联用技术(LC-MS)，尤其是其中的液相色谱-大气压电离质谱联用技术(LC-API-MS)，是目前分析生物样品中痕量物质的首选。它兼具了液相色谱与质谱两种技术的优点，具有高灵敏度和专一性,，并大大缩短分析时间。

目前，已有报道的2,3-吲哚醌测定方法有ECL、GC-MS、LC-MS以及HPLC等方法，这些方法大多样品前处理复杂，有些需要对生物样品进行多步纯化处理，实验操作过程比较繁琐，而且样品分析时间较长，被用于2,3-吲哚醌的体内药代动力学研究中大批生物样品的分析测试方法还很少，且存在以上问题，因此在处理药代动力学研究中所产生的大量样品就需要开发高通量的快速分析方法，特别是样品前处理简便、检测手段灵敏的快速分析方法。例如中国专利CN102735764A公开一种血浆中利巴韦林含量的测定方法，该方法使用较为简便的血浆预处理方法，并使用LC-MS法检测，灵敏度较高。但是目前关于血浆样品中2,3-吲哚醌浓度的快速简便灵敏的测定方法还鲜有报道。

发明内容

基于2,3-吲哚醌的临床前药代动力学研究中存在的生物样品浓度分析方法中的问题，本发明的目的在于提供一种高通量快速检测血浆中2,3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法。

在此，本发明提供一种血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法，包括：

血浆样品前处理步骤：

在0～4℃下，按体积比为1：5混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品（含2,3-吲哚醌的血浆样品）和内标溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液，其中所述内标溶液为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液；通过液相色谱-质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中

液相色谱条件包括：色谱柱为Ascentis，RP-Amide，5μm，50×2.1mm；色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45%；

质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi；气体流速为9L/min；毛细管电压为4500V；离子源温度为350℃，内标法定量。

本发明通过甲醇蛋白沉淀法处理血浆样品，用液相色谱质谱联用仪器分析血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度。因此，本发明的方法具有前处理简便、检测手段灵敏专一、检测速度快的优点。本发明的方法的准确度、精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2,3-吲哚醌的药代动力学研究中血浆样品的浓度测定需要。

在所述血浆样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液优选为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液。又，所述离心优选为以15000r/min的速度离心5min。

又，在所述检测步骤中，所述液相色谱条件还包括：柱温为40℃；自动进样器温度为6℃；洗针液为异丙醇水溶液，其中，异丙醇与水的体积比为1：1；分析时间为2分钟，流速为400μL/min，进样量为5μL。

在所述检测步骤中，所述质谱条件还包括：用于定量分析的离子对为：2,3-吲哚醌：148→65.1；奎硫平：384.1→253.1。

本发明中，所述血浆样品是哺乳动物的血浆。

在一个示例中，所述血浆样品是动物给予2,3-吲哚醌后采集的新鲜血浆样品。

在又一个示例中，所述血浆样品是动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品存放于-80℃冰箱的储备血浆样品，所述血浆样品前处理步骤还包括在与所述内标物甲醇溶液混合前先将所述储备血浆样品从-80℃冰箱取出，于0～4℃下自然融化后漩涡20～40秒。

本发明中，所述测定方法的最低检测限为10ng/mL。能够满足于低含量2,3-吲哚醌的检测。

本发明中，所述测定方法的相对误差和相对标准偏差均在20%以内，重现性和可靠性较高，具有较高的稳定性。

附图说明

图1是大鼠血浆中选择性样品色谱图，其中图1（a）是空白血浆的2,3-吲哚醌色谱图，图1（b）是空白血浆的奎硫平色谱图，图1（c）是空白血浆加内标的2,3-吲哚醌色谱图，图1（d）是空白血浆加内标的奎硫平色谱图；

图2是大鼠血浆中最低定量下限样品色谱图，其中图2（a）是2,3-吲哚醌色谱图，图2（b）是奎硫平色谱图；

图3是大鼠血浆***残留样品色谱图，其中图3（a）是2,3-吲哚醌色谱图，图3（b）是奎硫平色谱图；

图4是Beagle犬（比格犬）血浆中选择性样品色谱图，其中图4（a）是空白血浆的2,3-吲哚醌色谱图，图4（b）空白血浆的是奎硫平色谱图，图4（c）是空白血浆加内标的2,3-吲哚醌色谱图，图4（d）是空白血浆加内标的奎硫平色谱图；

图5是Beagle犬（比格犬）血浆中最低定量下限样品色谱图，其中图5（a）是2,3-吲哚醌色谱图，图5（b）是奎硫平色谱图；

图6是Beagle犬（比格犬）血浆***残留样品色谱图，其中图6（a）是2,3-吲哚醌色谱图，图6（b）是奎硫平色谱图。

具体实施方式

以下，参照附图，并结合下述实施方式进一步说明本发明。应理解这些实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明。

本发明提供了一种高通量快速检测血浆中2,3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法，涉及：（1）血浆样品的蛋白沉淀前处理方法；（2）血浆样品中2,3-吲哚醌标准曲线的制备；（3）液相色谱分离方法；（4）质谱检测方法；（5）结果的计算。

本发明通过甲醇蛋白沉淀法处理血浆样品，用液相色谱质谱联用仪器分析血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度。本方法的准确度，精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2,3-吲哚醌的药代动力学研究中血浆样品的浓度测定需要。

作为一个示例，本发明的方法可涉及以下方面。

（1）血浆样品的蛋白沉淀前处理：取50μL血浆样品至1.5mL离心管中，加入250μL内标溶液（例如，10ng/mL奎硫平甲醇溶液），涡旋30～90秒后离心（例如15000r/min，离心5分钟4℃）；取上清液100μL至Agilent色谱进样小瓶中。整个前处理过程在4℃（或冰上（约为0～4℃））下进行。血浆样品可以是从哺乳动物（例如大鼠或犬）中取出的新鲜血浆，将其直接置于冰上进行上述前处理，也可以将从哺乳动物中取出的新鲜血浆预先保存在-80℃冰箱中，需要用的时候从-80℃冰箱中取出样品，在4℃（或冰上（约为0～4℃））自然溶化后涡旋30秒后再与内标溶液混合。

（2）标准曲线样品的配制：

a）2,3-吲哚醌储备液（Stock A）的配制：精密称取2,3-吲哚醌标准品1.30mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为260μg/mL的2,3-吲哚醌储备液（Stock A），储存在4℃冰箱中待用；

b）2,3-吲哚醌标准溶液的配制：将2,3-吲哚醌储备液（Stock A）用甲醇稀释到200μg/mL，然后用甲醇逐级稀释，配制成2,3-吲哚醌浓度为100，40，20，10,4，2，0.4μg/mL的标准溶液，如表1，其中表1中的CSS表示标准曲线样品添加溶液（Calibration Standard SpikingSolution），

表1，2,3-吲哚醌标准溶液配制：

c）2,3-吲哚醌标准曲线样品的配制：

将步骤b）所得的2,3-吲哚醌标准溶液各5μL平行加入到195μL空白血浆基质中，制得2,3-吲哚醌浓度为5000，2500，1000，500，250，100，50，10ng/mL的标准曲线样品，如表2，其中STD表示标准曲线样品（Calibration Standard Sample），

表2，2,3-吲哚醌标准曲线样品配制：

（3）质控样品的配制：

a）2,3-吲哚醌储备液（Stock B）的配制：精密称取2,3-吲哚醌标准品1.355mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为271μg/mL的2,3-吲哚醌储备液（Stock B），作为2,3-吲哚醌质控储备液，储存在4℃冰箱中待用；

b）2,3-吲哚醌质控溶液的配制：将320μL2,3-吲哚醌储备液（Stock B）和222μL甲醇混合，得2,3-吲哚醌浓度为160μg/mL的高质控样品添加液（QSS-High）。将高质控样品添加液（QSS-High）用甲醇稀释，配制成2,3-吲哚醌浓度为16和3.2μg/mL的质控溶液，如表3，其中QSS表示质控样品添加溶液（Quality Control Spiking Solution），

表3，质控溶液配制：

c）2,3-吲哚醌质控样品的配制：将步骤b）所得的质控标准溶液各50μL平行加入到1950μL空白血浆基质中，制得2,3-吲哚醌浓度为4000，400和80ng/mL的质控样品，如表4，其中QC表示质控样品（Quality Control Sample）。质控样品按每份200μL分装于1.5mL离心管中，储存于-80℃冰箱，

表4：质控样品配制：

（4）奎硫平储备液（IS Stock A，内标）的配制：精密称取奎硫平标准品2.72mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为543.7μg/mL的奎硫平储备液（IS Stock A，内标），储存在4℃冰箱中待用。

（5）LC/MS/MS检测。

其中，液相色谱分离方法可以是：色谱柱（Ascentis，RP-Amide,5μm，50×2.1mm）；色谱流动相：A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液(55%)，B为甲醇(45%)；柱温40℃；自动进样器温度6℃；洗针液为异丙醇水溶液（1/1，v/v）；分析时间2分钟，流速400μL/min，进样量5μL。

又，质谱检测方法可以是：质谱扫描类型为正离子多反应监测（MRM）；离子源：电喷雾离子源（ESI）；雾化气(NEB)：50psi；气流：9L/min；毛细管电压(IS)：4500V；离子源温度(TEM)：350℃；其他参数如下表5：

表5，质谱检测部分参数：

化合物	Q1(amu)	Q3(amu)	Dwell time(msec)	Fragmentor(v)	CE(v)	Polarity(v)
							吲哚醌	148	65.1	200	100	29	Positive
奎硫平（IS）	384.1	253.1	200	100	21	Positive

（6）检测结果的计算：

a）将上述标准曲线样品通过上述LC/MS/MS检测方法进行检测，并根据检测结果以峰面积为y轴，以药物浓度为x轴制作标准曲线；

b）以经过步骤（1）所述那样的前处理的血浆样品经上述LC/MS/MS检测方法检测所得的值通过所述标准曲线的线性回归方程计算对应的2,3-吲哚醌的浓度，峰面积比和浓度之间的线性关系用由2,3-吲哚醌的回归方程所得的相关系数（r²）来表示。

[方法可靠性验证实验]

本发明的方法可通过以下方式进行可靠性验证实验。

1.最低定量下限样品配制：取2,3-吲哚醌质控储备液（Stock B），用甲醇溶液稀释成0.4μg/mL的标准溶液。取6份大鼠空白血浆或比格犬血浆各195μL，分别加入上述0.4μg/mL标准溶液5μL，配制6份质量浓度为10ng/mL的最低定量限样品，按照上述血浆样品的蛋白沉淀前处理方法进行处理。

2.选择性样品配制：空白基质样品（不加内标）：取6份不同个体的空白大鼠或比格犬血浆各50μL，加入250μL甲醇，涡旋60秒后离心5min（15000r/min），取100μL上清液；

零浓度基质样品（空白加内标）：取1份空白大鼠或比格犬血浆50μL，按照上述血浆样品的蛋白沉淀前处理方法进行处理。

3.***残留空白样品配制：按照空白基质样品（不加内标）配制方法配制空白基质样品，于标准曲线最高点之后分析，考察***残留。

4.基质效应样品和回收率样品配制：对基质效应和回收率的评价，将通过以下配制的样品考察：

质控样品配制：取三个水平的质控样品各6份，按照上述血浆样品的蛋白沉淀前处理方法进行处理后分析；

回收率样品配制：取三份195μL空白大鼠或比格犬血浆，分别用1000μL内标溶液沉淀蛋白，涡旋60秒，分别加入5μL三个水平的质控样品添加液，涡旋60秒后离心5min（15000r/min），取100μL进样分析，每一浓度水平平行处理6份；

基质效应样品配制：取5μL三个水平的质控样品添加液加入995μL甲醇，涡旋60秒，取100μL进样分析，每一浓度水平取6份；

通过质控样品与回收率样品药物峰面积响应的比较评价方法的回收率；通过回收率样品与基质效应峰面积响应的比较评价方法的基质效应。计算公式如下：

5.线性：按照上述生物样品中2,3-吲哚醌定量分析标准曲线的制作方法，在方法学验证第一、二、三天每天配制两份标准曲线样品，按照上述血浆样品的蛋白沉淀前处理方法进行处理，并分别于当天方法学验证的开始和结束时进样分析。当天所有标准曲线样品结果同时拟合成一条标准曲线。

6.准确度和精密度质控样品配制：从冰箱（-80℃）中取出质控池样品，按照上述血浆样品的蛋白沉淀前处理方法进行处理并进样分析。每个浓度水平平行处理6份。

7.稳定性样品配制

冻融稳定性：将配制好的质控样品（QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份），存放于-80℃冰箱中24h后取出，室温下自然融解，当样品完全溶解后再次存放于-80℃冰箱冷冻。如此反复冷冻融解，在第3次融解以后，按照上述血浆样品的蛋白沉淀前处理方法进行处理，进样分析；

处理后样品稳定性：将当天处理后的质控样品（QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份），在自动进样器小瓶板上6℃放置24h后重新进样分析，使用第二天标准曲线定量分析；

样品4℃（冰上）稳定性：将当天配制好的质控样品（QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份），4℃（冰上）放置4h后，按照上述血浆样品的蛋白沉淀前处理方法进行处理，进样分析；

长期稳定性：将储存在-80℃冰箱中的质控样品（QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份），按生物样品前处理方法处理后进样分析。质控样品配制时间与分析测定时间相隔24天；

储备液稳定性：重新称量和配制（相隔24天）待测物2,3-吲哚醌储备液（Stock C）。用甲醇稀释，稀释后2,3-吲哚醌浓度为40ng/mL。

[大鼠和Beagle犬血浆样品中2，3-吲哚醌浓度的测定方法的可靠性验证结果]

1.标准曲线：三天每天配制标准曲线样品，每个浓度水平配制2份。当天所有标准曲线样品同时拟合为一标准曲线，结果标准曲线上的线性点的相对误差（RE）和相对标准偏差（RSD）在20%以内，曲线相关系数r2均在0.995以上，如表6和表7，在以下表格中，以下符号分别表示：n：用于计算统计值数（Number of values used to calculate statistics）；Conc.：浓度（Concentration）；SD：标准偏差（Standard Deviation）；%RE：相对误差（Relative Error）；RSD：相对标准偏差（Relative Standard Deviation）；NA：不适用/不可用（Not Applicable/Not Available）

表6，标准曲线分析结果(大鼠，浓度单位：ng/mL)：

表7，标准曲线分析结果(Beagle犬，浓度单位：ng/mL)：

2.选择性：如图1和图4所示，不同个体空白基质样品的色谱图，在待测物（2,3-吲哚醌）和内标物（奎硫平）的出峰处，没有干扰峰或能影响定量的干扰峰，药物干扰峰<LLOQ相应的20%，内标干扰峰<内标相应的5%。

3.最低定量下限：对6份不同个体的空白血浆配制的最低定量下限（LLOQ为10ng/mL）样品进行分析，结果所用样品的相对误差（RE）和相对标准偏差（RSD）都在20%以内，如表8。在大鼠和Beagle犬血浆中最低定量下限样品色谱图分别如图2和图5所示；

表8，最低定量下限分析结果：

4.精密度与准确度：每天对质控样品（QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份）进行分析结果显示，质控样品的相对误差（RE）和相对标准偏差（RSD）都在20%以内，如表9和表10，

表9，大鼠血浆样品精密度与准确度分析结果：

表10，Beagle犬血浆样品精密度与准确度分析结果：

5.***残留结果：对在最高定量限（ULOQ为5000ng/mL）后分析的空白样品进行分析。空白样品中没有干扰峰或能影响定量的干扰峰，药物干扰峰<LLOQ相应的20%，内标干扰峰<内标相应的5%。在大鼠和Beagle犬血浆中***残留样品色谱图分别如图3和图6所示。

6.基质效应和回收率：基质效应和回收率计算结果如表11和表12，回收率接近100%，有一定的基质效应，

表11，大鼠血浆样品回收率和基质效应分析结果：

表12，Beagle犬血浆样品回收率和基质效应分析结果：

7.稳定性样品分析：结果显示，样品的相对误差（RE）和相对标准偏差（RSD）在20%以内，如表13，说明该样品在规定的储存条件下和时间内是稳定的，

表13，稳定性样品分析结果：

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的参数也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

（试验材料）

药物及试剂：

吲哚醌对照品：上海新生源医药研究有限公司提供，批号为090601；

内标物奎硫平：美迪西普亚（上海）生物医药有限公司提供；

甲醇（Burdick&Jackson，HPLC grade），乙腈（Burdick&Jackson，HPLC grade），甲酸（ACROS ORGANICS，HPLC grade），水为超纯水。

实验仪器：

TGL-16高速台式冷冻离心机由湘仪离心机厂出品。LC***为安捷伦1200系列，质谱***为安捷伦6410B，数据采集及控制***软件为Masshunter（安捷伦科技有限公司）。微型旋涡混合器（XW-80A，上海精科实业有限公司）；微量分析天平（XP26，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司）；微孔过滤超纯水仪。

实施例1

SD大鼠给药2,3-吲哚醌的体内血药浓度测定

1.试验动物：Sprague Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，体重208.6～238.5g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2008-0016；

2.给药方案：称取适量2,3-吲哚醌，根据给药剂量和给药体积配制到所需浓度，灌胃以1.25%西黄耆胶水溶液配制，静脉给药以5%DMSO，40%PEG400，55%生理盐水配制。动物给药前禁食10～14h，自由饮水。大鼠静脉给药：以20mg/kg剂量经尾静脉推注给药（给药容积为2mL/kg）；大鼠灌胃给药：以20，50和100mg/kg的剂量分别灌胃给予2,3-吲哚醌（给药容积为5mL/kg）。给予受试物前（0h）和给予受试物后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8和24h通过颈静脉取血0.20mL，K2EDTA抗凝，血液样本采集后置于冰上，离心分离血浆(离心条件：8000转/min，6min，4℃)。收集的血浆分析前存放于-80℃；

3.血浆样品测定方法：采用上述LC/MS/MS方法测定大鼠给药后不同时间点血浆中2,3-吲哚醌的浓度。

大鼠静脉推注20mg/kg2,3-吲哚醌（n=6）后药物2,3-吲哚醌的药物血浆浓度见表14，大鼠灌胃给予20、50和100mg/kg2,3-吲哚醌后药物的血药浓度见表15-17：

表14，大鼠静脉给药20mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

表15，大鼠灌胃给药20mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

表16，大鼠灌胃给药50mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

表17，大鼠灌胃给药100mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

实施例2

Beagle犬给药2，3-吲哚醌的体内血药浓度测定

1.试验动物：比格犬，雌雄各半，体重7.80～9.60kg，购于北京玛斯生物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2010-0003；

2.给药方案：称取适量吲哚醌，根据给药剂量和给药体积配制到所需浓度，灌胃以1.25%西黄耆胶水溶液配制，静脉给药以5%DMSO，40%PEG400，55%生理盐水配制。动物给药前禁食10～14h，自由饮水。比格犬静脉给药：按15mg/kg的剂量经隐静脉推注给予吲哚醌（给药容积为1.5mL/kg）；比格犬单次灌胃给药：以15，30和60mg/kg的剂量分别灌胃给予吲哚醌（给药容积为2mL/kg）；比格犬七天连续给药：以30mg/kg的剂量分别灌胃给予吲哚醌（给药容积为2mL/kg，一天一次）。给予受试物前（0h）和给予受试物后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8和24h经颈静脉取血1mL，置于含K2EDTA试管中，血液样本采集后置于冰上，离心分离血浆(离心条件：3500rpm转/min，10min，4℃)。收集的血浆分析前存放于-80℃；

3.血浆样品测定方法：采用上述LC/MS/MS方法测定大鼠给药后不同时间点血浆中吲哚醌的浓度。

比格犬静脉推注15mg/kg的吲哚醌后的药物吲哚醌的血药浓度见表18；比格犬空腹以15、30和60mg/kg剂量灌胃给予吲哚醌，药物吲哚醌的血浆浓度见表19-22：

表18，比格犬静脉给药15mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

表19，比格犬口服给药15mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

表20，比格犬口服给药30mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

表21，比格犬口服给药60mg/kg不同时间的血药浓度（ng/mL）：

表22，比格犬连续七天口服给药2，3-吲哚醌（30mg/kg）不同时间的血药浓度（ng/mL）：

Claims (10)

1.一种血浆样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括：血浆样品前处理步骤：

在0～4℃下，按体积比为1：5混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及

通过液相色谱-质谱联用对经前处理的血浆样品进行检测的检测步骤，其中

液相色谱条件包括：色谱柱为Ascentis，RP-Amide，5μm，50×2.1mm；色谱流动相A为5mM甲酸铵/5mM甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与B的体积百分比分别为55%和45%；

质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为50psi；气体流速为9L/min；毛细管电压为4500V；离子源温度为350℃，内标法定量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，在所述血浆样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液为10ng/mL的奎硫平甲醇溶液。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品前处理步骤中，所述离心是以15000r/min的速度离心5min。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，液相色谱条件还包括：柱温为40℃；自动进样器温度为6℃；洗针液为异丙醇水溶液，其中异丙醇与水的体积比为1：1；分析时间为2分钟，流速为400μL/min，进样量为5μL。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：用于定量分析的离子对为：2,3-吲哚醌：148→65.1；奎硫平：384.1→253.1。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品是哺乳动物的血浆。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品是动物给予2,3-吲哚醌后采集的新鲜血浆样品。

8.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述血浆样品是动物给予2,3-吲哚醌后采集的血浆样品存放于-80℃冰箱的储备血浆样品，所述血浆样品前处理步骤还包括在与所述内标物甲醇溶液混合前先将所述储备血浆样品从-80℃冰箱取出，于0～4℃下自然融化后漩涡20～40秒。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的最低检测限为10ng/mL。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的相对误差和相对标准偏差均在20%以内。