CN104130318B - 一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，属于生物技术领域，以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过对发酵液的离心、膜分离、喷雾干燥处理制备抗菌肽成品，采用两个连续离心机离心，再经过分级膜分离，可最大限度去除菌体和杂蛋白，得到活性较高的抗菌肽，利用了抗菌肽的耐热性，通过喷雾干燥技术，使抗菌肽快速干燥，提高了抗菌肽制备效率，且麦芽糊精作为辅料具有溶解性好、稳定性高、不宜吸潮变质、含有丰富微量元素和矿物质等优点，本发明分离纯化抗菌肽活性高，成本低廉，工艺简单，后期处理损耗较低。

Description

一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺

技术领域

本发明涉及一种提取工艺，适用于抗菌肽的生产，尤其适用于利用枯草芽孢杆菌生产抗菌肽，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，属于生物技术领域。

背景技术

抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMP）是指生物体内经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫防御***的一部分。这类蛋白通常具有耐酸性能好、抗菌谱广、水溶性好、安全性高以及作用快速等特点。其作用机理是，抗菌肽通过蛋白凝聚效应，将其末端尾链直接***细菌细胞膜，打孔形成一个通道，使细菌内容物外泄导致细菌死亡。与抗生素相比，抗菌肽具有不杀灭益生菌、提高机体免疫机能、无副作用、无残留、无耐药性、可长期使用等优点。因抗菌肽所具有的特性，可将其广泛应用于多个领域。在医药方面，抗菌肽可平衡和调节炎症应答并激发抗原特异性的适应性免疫反应。在食品防腐方面，抗菌肽作为一种天然防腐剂，毒副作用小，可降解，使用安全，甚至对人体有保健作用。在饲料添加剂方面，抗生素的滥用已极大地影响了我国畜牧业的发展，而抗菌肽恰恰解决了其耐药残留、抗药性、环境污染等问题，是一种环保型高效饲料添加剂。

在以上这些领域，我国与国际上一些发达国家相比技术上和普及方面还有不小的差距，并且由于各方面的原因，我国目前尚未全面禁止饲用抗生素，而多数抗生素饲料添加剂为国外已淘汰或将被禁用的产品，这些问题无疑将影响我国畜产品在国际上的声誉，并造成巨大的经济损失。由于微生物生产抗菌肽有成本低、无毒害、周期短等明显优点，加快抗菌肽的研究已势在必行，但当前研究主要集中在乳酸菌，而乳酸菌产生的抗菌肽存在着耐热性差、抗菌谱窄等缺陷。枯草芽孢杆菌产的抗菌肽抑菌谱广、稳定性高，开始引起国内外研究人员的注意，而对于其发酵产生抗菌肽的工业化生产，尤其是后提取工艺，目前仍然面临成本过高，过程复杂，产物效价损耗过大等问题。

发明内容

本发明所解决的技术问题是针对现有技术的不足，以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过对发酵液的后期处理将其加工成抗菌肽成品，具有操作工艺简单、步骤较少，生产成本较低且产品效价较高的优点。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，其特征在于：所述后提取工艺包括依次进行的放罐、离心、膜分离、调节pH值和喷雾干燥步骤。

采用该技术方案，所述后提取工艺的工艺简单、步骤少，且提取效果好。

一种优化方案，所述膜分离步骤中将离心后的上清液进行分级过滤，过滤温度40℃，陶瓷膜设备的进出口压降为0.1～0.15MPa，平均通量为0.5m3/h，除去菌体和杂蛋白率达到99.97%～99.99%，膜分离后的上清液中抗菌肽的抑菌效价为12689～12813。

采用该技术方案，除去菌体和杂蛋白的效果好，且有效保证抗菌肽的活性。

另一种优化方案，所述分级过滤包括四级过滤；

第一级过滤采用50万分子量陶瓷膜，第二级过滤采用35万分子量陶瓷膜，第三级过滤采用15万分子量陶瓷膜，第四级过滤采用5万分子量陶瓷膜。

采用该技术方案，利用分级过滤，更加有效地去除上清液中的菌体和杂蛋白。

再一种优化方案，所述调节pH值步骤中：收集膜分离后的清液，调整pH值至3.5，静置24h后，滤除上层上清液得到含沉淀物的浓缩液，重复滤除操作直至浓缩液体积为调整pH值前上清液体积的50%。

采用该技术方案，既保证了浓缩液中有效成分的含量，又利于后续工序的进行，为快速高效获得抗菌肽干粉打下良好的基础。

进一步的优化方案，所述浓缩液中加入25%麦芽糊精作为赋型剂搅拌均匀后，按照50L/h的处理量进行喷雾干燥得到抗菌肽干粉。

采用该技术方案，可有效保证抗菌肽的抑菌效价，且便于快速干燥获得抗菌肽干粉。

再进一步的优化方案，所述喷雾干燥的进风温度为120～180℃，出风温度为70～90℃。

采用该技术方案，干燥效果好且不损失抗菌肽的活性。

更进一步的优化方案，所述放罐步骤中发酵液在储料罐中的储存时间为2小时。

采用该技术方案，既保证了抗菌肽的抑菌效价，又在一定程度上增加了成品量，降低了生产成本，并缩短了生产周期。

一种优化方案，所述离心步骤中采用串联的两个连续离心机离心。

采用该技术方案，可有效去除发酵液中的大量沉淀，有利于后续工序的进行。

另一种优化方案，所述调节pH值步骤中调节剂为盐酸、磷酸或柠檬酸。

采用该技术方案，pH值调节效果好且不损失抗菌肽的活性。

再一种优化方案，采用所述后提取工艺提取得到的抗菌肽干粉的抑菌效价与放罐前发酵液中抗菌肽的抑菌效价相比，下降率小于15%。

本发明采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过对发酵液的离心、膜分离、喷雾干燥等处理步骤制备抗菌肽成品，本发明在放罐后经过两个连续离心机离心，再经过膜分离，可最大限度去除菌体和杂蛋白，得到活性较高的抗菌肽。另外，将抗菌肽加工成干粉时，利用了抗菌肽的耐热性，通过喷雾干燥技术，使抗菌肽快速干燥，提高了抗菌肽制备效率，且麦芽糊精作为辅料具有溶解性好、稳定性高、不宜吸潮变质、含有丰富微量元素和矿物质等优点。本发明分离纯化抗菌肽活性高，成本低廉，工艺简单，后期处理损耗较低。

本发明所制的抗菌肽干粉不仅可以抑制***，同时对多种革兰氏阴性细菌及真菌均具有较强的抑制作用，并且酸碱稳定性强、热稳定性较好。

本发明所制的抗菌肽干粉属于天然抗菌剂，无毒副作用，可以用作食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性、安全性高的优点。

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

附图说明

附图1是本发明实施例中后提取工艺的流程示意图；

附图2是本发明实施例中抗菌肽的效价检测。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1，一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，如图1所示，包括如下步骤：

1）放罐

利用压缩空气将发酵罐压力调节至0.05MPa左右，储料罐压力为零，利用发酵罐与储料罐之间的压力差通过不锈钢物料管道将枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵液压到储料罐中，储存2小时进行离心处理。

经试验验证，储存时间过长时，抗菌肽会发生一定的损耗，抑菌效价会大幅下降，而储存时间过短时，将不利于菌体内抗菌肽的进一步代谢释放，进而影响产物效价。发酵液在储料罐中的储存时间为2小时，既保证了抗菌肽的抑菌效价，又在一定程度上增加了成品量，降低了生产成本，并缩短了生产周期，储存时间对发酵液中抗菌肽的抑菌效价的影响如表1所示。

表1储存时间对抗菌肽效价的影响

2）离心

发酵液通过串联的两个连续离心机离心，弃去沉淀，储存上清液。

所述离心机选用“辽阳隆达制药机械有限公司”生产的GQ-105型管式离心机，离心机的转速为12000rpm，离心机的处理量为1m³/h，离心后的上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序，转鼓中的固体杂质刮下后经灭菌等处理后弃掉。

经过连续两次离心处理，可有效去除发酵液中的大量沉淀，有利于后续工序的进行。

3）膜分离

上清液通过5万～50万分子量陶瓷膜进行分级过滤，以除去菌体和杂蛋白，并充分保持抗菌肽的活性。

首先选用50万分子量陶瓷膜进行第一级过滤，大于50万分子量的大分子被截留，小于50万分子量的物质透过陶瓷膜，将经过第一级过滤的清液采用35万分子量陶瓷膜进行第二级过滤，过滤后的清液再采用15万分子量陶瓷膜进行第三级过滤，最后再选用5万分子量陶瓷膜进行第四级过滤。

过滤温度：40℃，操作压力：进口压力为0.2MPa；出口压力0.1MPa，进出口压降为0.1MPa，上清液以0.5m³/h的流速沿着陶瓷膜的表面流过，所述陶瓷膜对上清液进行错流过滤，在压力作用的驱动下，上清液在膜管内流动，小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的液体被陶瓷膜截留，从而使上清液达到分离、纯化的目的。

所用陶瓷膜设备为“安徽普朗膜技术有限公司”生产。

所述膜分离控制参数对除去菌体和杂蛋白效果及抗菌肽抑菌效价的影响如表2所示。

表2膜分离控制参数对除去菌体和杂蛋白效果及抗菌肽抑菌效价的影响

表2中效果指的是除去菌体和杂蛋白的效果，采用正交试验法，经大量试验验证，采用本实施例中的膜分离控制参数，除去菌体和杂蛋白率达到99.98%，且得到的上清液中抗菌肽的抑菌效价达到12765。

4）调节pH值

收集膜分离后的清液，在其中加盐酸将pH值调节至3.5，静置24h后下层出现沉淀，再经过膜分离滤去部分清液得到含沉淀物的浓缩液，重复上述操作直至浓缩液体积为原来的50%。

经试验验证，经过反复静置、膜过滤得到浓缩液体积为原来的50%时，既保证了浓缩液中有效成分的含量，又利于后续工序的进行，为快速高效获得抗菌肽干粉打下良好的基础。

5）喷雾干燥

在浓缩液中加入25%麦芽糊精作为赋型剂搅拌均匀后，按照50L/h的处理量进行喷雾干燥得到抗菌肽干粉，所述喷雾干燥的进风温度为120℃，出风温度为70℃。

所用喷雾干燥机为“无锡市能达干燥设备有限公司”生产。

经试验验证，选用25%的麦芽糊精作为赋形剂，可有效保证抗菌肽的抑菌效价，且便于快速干燥获得抗菌肽干粉。

实施例2，一种枯草芽孢杆菌发酵液的后提取工艺，如图1所示，包括如下步骤：

1）放罐

利用压缩空气将发酵罐压力调节在0.07MPa左右，储料罐压力为零，利用发酵罐与储料罐之间的压力差通过不锈钢物料管道将枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵液压到储料罐中，储存不超过2小时进行离心处理。

经试验验证，储存时间过长时，抗菌肽会发生一定的损耗，抑菌效价会大幅下降，而储存时间过短时，将不利于菌体内抗菌肽的进一步代谢释放，进而影响产物效价。发酵液在储料罐中的储存时间为2小时，既保证了抗菌肽的抑菌效价，又在一定程度上增加了成品量，降低了生产成本，并缩短了生产周期。

2）离心

发酵液通过串联的两个连续离心机离心，弃去沉淀，储存上清液。

所述离心机选用“辽阳隆达制药机械有限公司”生产的GQ-105型管式离心机，离心机的转速为12000rpm，离心机的处理量为1m³/h，离心后的上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序，转鼓中的固体杂质刮下后经灭菌等处理后弃掉。

经过连续两次离心处理，可有效去除发酵液中的大量沉淀，有利于后续工序的进行。

3）膜分离

上清液通过5万～50万分子量陶瓷膜进行分级过滤，以除去菌体和杂蛋白，并充分保持抗菌肽的活性。

首先选用50万分子量陶瓷膜进行第一级过滤，大于50万分子量的大分子被截留，小于50万分子量的物质透过陶瓷膜，将经过第一级过滤的清液采用35万分子量陶瓷膜进行第二级过滤，过滤后的清液再采用15万分子量陶瓷膜进行第三级过滤，最后再选用5万分子量陶瓷膜进行第四级过滤。

过滤温度：40℃，操作压力：进口压力为0.28MPa；出口压力0.15MPa，进出口压降0.13MPa，上清液以0.5m³/h的流速沿着陶瓷膜的表面流过，所述陶瓷膜对上清液进行错流过滤，在压力作用的驱动下，上清液在膜管内流动，小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的液体被陶瓷膜截留，从而使上清液达到分离、纯化的目的。

所用陶瓷膜设备为“安徽普朗膜技术有限公司”生产。

所述膜分离控制参数对除去菌体和杂蛋白效果及抗菌肽抑菌效价的影响如表2所示。

经大量试验验证，由表2可知，采用本实施例中的膜分离控制参数，除去菌体和杂蛋白率达到99.97%，得到的上清液中抗菌肽的抑菌效价达到12689。

4）调节pH值

收集膜分离后的上清液，在其中加磷酸将pH值调节至3.5，静置24h后下层出现沉淀，再经过膜分离滤去部分上清液得到含沉淀物的浓缩液，重复上述操作直至浓缩液体积为原来的50%。

经试验验证，经过反复膜分离得到浓缩液体积为原来的50%时，既保证了浓缩液中有效成分的含量，又利于后续工序的进行，为快速高效获得抗菌肽干粉打下良好的基础。

5）喷雾干燥

在浓缩液中加入25%麦芽糊精作为赋型剂搅拌均匀后，按照50L/h的处理量进行喷雾干燥得到抗菌肽干粉，所述喷雾干燥的进风温度为150℃，出风温度为80℃。

所用喷雾干燥机为“无锡市能达干燥设备有限公司”生产。

经试验验证，选用25%的麦芽糊精作为赋形剂，可有效保证抗菌肽的抑菌效价，且便于快速干燥获得抗菌肽干粉。

实施例3，一种枯草芽孢杆菌发酵液的后提取工艺，如图1所示，包括如下步骤：

1）放罐

利用压缩空气将发酵罐压力调节在0.1MPa左右，储料罐压力为零，利用发酵罐与储料罐之间的压力差通过不锈钢物料管道将枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵液压到储料罐中，储存不超过2小时进行离心处理。

经试验验证，储存时间过长时，抗菌肽会发生一定的损耗，抑菌效价会大幅下降，而储存时间过短时，将不利于菌体内抗菌肽的进一步代谢释放，进而影响产物效价。发酵液在储料罐中的储存时间为2小时，既保证了抗菌肽的抑菌效价，又在一定程度上增加了成品量，降低了生产成本，并缩短了生产周期。

2）离心

发酵液通过串联的两个连续离心机离心，弃去沉淀，储存上清液。

所述离心机选用“辽阳隆达制药机械有限公司”生产的GQ-105型管式离心机，离心机的转速为12000rpm，离心机的处理量为1m³/h，离心后的上清液通过离心机出液管接到中间储罐中进入膜分离处理程序，转鼓中的固体杂质刮下后经灭菌等处理后弃掉。

经过连续两次离心处理，可有效去除发酵液中的大量沉淀，有利于后续工序的进行。

3）膜分离

上清液通过5万～50万分子量陶瓷膜进行分级过滤，以除去菌体和杂蛋白，并充分保持抗菌肽的活性。

首先选用50万分子量陶瓷膜进行第一级过滤，大于50万分子量的大分子被截留，小于50万分子量的物质透过陶瓷膜，将经过第一级过滤的清液采用35万分子量陶瓷膜进行第二级过滤，过滤后的清液再采用15万分子量陶瓷膜进行第三级过滤，最后再选用5万分子量陶瓷膜进行第四级过滤。

过滤温度：40℃，操作压力：进口压力为0.35MPa；出口压力0.2MPa，进出口压降不超过0.15MPa，上清液以0.5m³/h的流速沿着陶瓷膜的表面流过，所述陶瓷膜对上清液进行错流过滤，在压力作用的驱动下，上清液在膜管内流动，小分子物质透过陶瓷膜，含大分子组分的浓缩液被陶瓷膜截留，从而使上清液达到分离、纯化的目的。

所用陶瓷膜设备为“安徽普朗膜技术有限公司”生产。

所述膜分离控制参数对除去菌体和杂蛋白效果及抗菌肽抑菌效价的影响如表2所示。

经大量试验验证，由表2可知，采用本实施例中的膜分离控制参数，除去菌体和杂蛋白率达到99.99%，得到的上清液中抗菌肽的抑菌效价达到12813。

4）调节pH值

收集膜分离后的上清液，在其中加柠檬酸将pH值调节至3.5，静置24h后下层出现沉淀，再经过膜分离滤去部分上清液得到含沉淀物的浓缩液，重复上述操作直至浓缩液体积为原来的50%。

经试验验证，经过反复膜分离得到浓缩液体积为原来的50%时，既保证了浓缩液中有效成分的含量，又利于后续工序的进行，为快速高效获得抗菌肽干粉打下良好的基础。

5）喷雾干燥

在浓缩液中加入25%麦芽糊精作为赋型剂搅拌均匀后，按照50L/h的处理量进行喷雾干燥得到抗菌肽干粉，所述喷雾干燥的进风温度为180℃，出风温度为90℃。

所用喷雾干燥机为“无锡市能达干燥设备有限公司”生产。

经试验验证，选用25%的麦芽糊精作为赋形剂，可有效保证抗菌肽的抑菌效价，且便于快速干燥获得抗菌肽干粉。

药敏试验：将发酵液进行离心，取上清液作为试验组1，取实施例1中得到的干粉在无菌条件下溶于纯化水，作为试验组2，取实施例2中得到的干粉在无菌条件下溶于纯化水，作为试验组3，取实施例3中得到的干粉在无菌条件下溶于纯化水，作为试验组4，在YPD培养基中接种枯草芽孢杆菌进行发酵，所得发酵液进行离心，取上清液作为对照组，所述YPD培养基的有效成分包括：酵母膏、蛋白胨和葡萄糖，所述YPD培养基的制备包括以下步骤：（1）取酵母膏10g和蛋白胨20g溶于900mL纯化水中，121℃灭菌20min；（2）取葡萄糖20g溶于100mL纯化水中，经0.22μm滤器过滤除菌后混入步骤（1）所得的溶液中。

药敏试验检测培养基，其有效成分包括：蛋白胨、酵母膏、氯化钠、葡萄糖和琼脂。

所述药敏试验检测培养基的制备包括以下步骤：取蛋白胨1g、酵母膏0.5g、氯化钠1g、葡萄糖0.5g和琼脂1.5g，蒸馏水定容至100mL，充分溶解，115℃高压灭菌30min。

试验方法：将高压灭菌后的药敏试验检测培养基置于50～55℃的水浴锅保温；

在超净工作台内，取100mL无菌的药敏试验检测培养基，加入100uL检测菌菌液，所述检测菌为大肠杆菌，摇匀，得到含菌检测培养基；

吸取混合均匀的含菌检测培养基10mL，在90mm培养皿底内均匀摊布，放置在超净工作台上使其凝固。

待含菌检测培养基凝固后用灭菌的打孔器打孔，所述打孔器的孔径为2.7mm，在培养皿底部上均匀的打七个上样孔，将上样孔内的含菌检测培养基挑出。

用记号笔在培养皿底部为七个上样孔做好标记，所述上样孔包括一个阴性对照上样孔、一个阳性抗生素对照上样孔和五个待测样品上样孔，所述阴性对照上样孔内放置无菌水，所述阳性抗生素对照上样孔内放置阳性抗生素，所述待测样品上样孔内分别放置试验组1、试验组2、试验组3、试验组4和对照组的待测样品，用微量移液器分别吸取5uL待测样品加入各自对应的上样孔中，并将培养皿置于37℃培养箱中培养16~18h。

培养结果显示按本发明所提供的后提取工艺所得的抗菌肽成品制剂具有较好的抑菌作用。用游标卡尺测定抑菌圈直径，计算抑菌效价。结果如图2所示，可见本发明的3个实施例中的干粉均有较高的抑菌效价，与对照组相比，其效价分别提高了35%、31%和41%，与试验组1相比，效价分别下降了12%、15%、8%，说明抗菌肽经提取后仍具有极高的效价，损耗较少。本发明所提供的后提取工艺中抗菌肽损耗较低，在保证菌体代谢产物仍有极高抑菌效价的基础上，简化了提取过程，缩短了生产时间，降低了发酵成本。

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，其特征在于：所述后提取工艺包括依次进行的放罐、离心、膜分离、调节pH值和喷雾干燥步骤；

所述放罐步骤中：调节发酵罐压力为0.1MPa，储料罐压力为零，发酵液在储料罐中的储存时间为2小时；

所述离心步骤中：离心机的转速为12000rpm，离心机的处理量为1m³/h；所述膜分离步骤中：将离心后的上清液进行分级过滤，分级过滤包括四级过滤，第一级过滤采用50万分子量陶瓷膜，第二级过滤采用35万分子量陶瓷膜，第三级过滤采用15万分子量陶瓷膜，第四级过滤采用5万分子量陶瓷膜；过滤温度：40℃，操作压力：进口压力为0.35MPa；出口压力0.2MPa，上清液以0.5m³/h的流速沿着陶瓷膜的表面流过；

所述调节pH值步骤中：收集膜分离后的清液，调整pH值至3.5，静置24h后，滤除上层上清液得到含沉淀物的浓缩液，重复滤除操作直至浓缩液体积为调整pH值前上清液体积的50%；

所述喷雾干燥步骤中：在浓缩液中加入25%麦芽糊精作为赋型剂搅拌均匀后，按照50L/h的处理量进行喷雾干燥得到抗菌肽干粉，所述喷雾干燥的进风温度为180℃，出风温度为90℃；

所述后提取工艺还包括药敏检测步骤，药敏检测步骤中：药敏试验检测培养基的有效成分包括：取蛋白胨1g、酵母膏0.5g、氯化钠1g、葡萄糖0.5g和琼脂1.5g，蒸馏水定容至100mL，充分溶解，115℃高压灭菌30min；所述抗菌肽干粉的抑菌效价与放罐前发酵液中抗菌肽的抑菌效价相比，下降率为8%。

2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，其特征在于：所述离心步骤中采用串联的两个连续离心机离心。

3.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的后提取工艺，其特征在于：所述调节pH值步骤中调节剂为盐酸、磷酸或柠檬酸。