CN104195061B - 一种枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.6088。本发明枯草芽孢杆菌HS5B5对牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉具有很强的抑制作用，能够有效的预防和治疗牡丹褐斑病。本发明枯草芽孢杆菌HS5B5对生态环境无害，不会引起病原的抗药性。本发明枯草芽孢杆菌HS5B5的培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
牡丹虫害较少，但病害发生种类多且危害严重。病害是牡丹在其生长发育和越冬过程中，受到病原微生物的浸染或不良环境条件的影响，使其从生理机制到形态结构发生一系列病变。已鉴定出来的20余种牡丹病害中，大多数是真菌性病害，如褐斑病、灰霉病、锈病、白绢病和紫纹羽病等。它们引起叶局部坏死或整叶枯死，危害牡丹的叶、枝条和根茎部，使牡丹提前落叶，影响生机。牡丹褐斑病是最为严重的病害之一，此病主要危害叶片，也可侵染茎和花，多在开花前后发生，一直延续到枯叶期。病原真菌为牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae），属半知菌亚门，丝孢菌纲，丛梗孢目，枝孢菌属。病原以菌丝体或分生孢子在枯叶或土壤里越冬，借助风雨传播夏初开始发生，秋季、危害严重，高温高湿、光照不足、通风不良、连作等均有利于病害发生。
牡丹褐斑病的防治目前主要依赖化学药物的使用，这不仅对人体健康和生态环境安全有害，而且易引起病原抗药性。生物防治是利用生物或其产物控制农林病虫发生危害的防治方法，由于其具有对人畜安全，对环境无污染，不易产生抗药性，高效广谱，能够促进作物生长等特点，日益受到人们的重视，然而生物防治在牡丹病害防御上的研究和应用还很少。为了加快我国牡丹产业的快速发展，研制对人体健康和生态环境安全无害、不易引起病原抗药性、高效广谱的生物防治剂迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够抑制牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉的枯草芽孢杆菌。
本发明所采取的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5，该菌株于2012年5月9日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 6088。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落呈白色，杆状，表面干燥有皱褶，鞭毛中生，菌落直径0.8-2.3μm，革兰氏染色阳性。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5菌株的16S rDNA序列如SEQ IDNO：1所示。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5菌株通过对峙培养法筛选获得。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5菌株对牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉的拮抗抑菌作用。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5菌株制剂在防治牡丹褐斑病中的应用。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5菌株对菊花黄萎病、苹果白粉病、油茶叶枯病菌、月季黑斑病中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5对牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉具有很强的抑制作用，能够有效的预防和治疗牡丹褐斑病。
2、本发明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5对生态环境无害，不会引起病原的抗药性。
3、本发明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5的培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5的抑菌圈；
图2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5的菌落特征。
具体实施方式
本发明筛选分离了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 6088。该菌株对牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉具有很强的抑制作用，可用于制备防治牡丹褐斑病的生物制剂。
一、菌株的筛选分离方法
1、样品中芽孢杆菌的分离
（1）在洛阳国际牡丹园牡丹栽培区，采集牡丹根部表层土壤，在不同地点采集100个样本，装袋带回实验室风干。风干后的各样品经研磨后，从每个样品中称取10g分别加入到装有90mL无菌水和5颗玻璃珠的三角瓶中，充分摇动20～30min，使得样品与无菌水混合均匀，制得样品悬液。
（2）将制得的样品悬液置于温度为80℃的水浴中加热10min，以杀死不产芽孢的细菌和其他微生物，然后在无菌条件下吸取1mL的样品悬液加入到装有9mL无菌水的试管中，振荡混匀，制得10-2样品稀释液。
按上述方法依次制得10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液，分别吸取10-5、10-6、10-7浓度梯度的各样品稀释液0.1mL涂布相应的牛肉膏蛋白胨平板上，30℃倒置培养48h。根据菌落特征挑取形态等性状差异比较明显的菌落，反复平板划线纯化，编号后保存备用。
2、牡丹褐斑病拮抗菌的筛选
拮抗芽孢杆菌的筛选采用牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae）为靶标，方法采用对峙培养筛选法。
用于筛选的牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae）购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏号为ACCC 36063。
将牡丹枝孢霉接种于PDA平板中央，28℃培养8d后，接入初筛得到的芽孢杆菌菌株，28℃恒温培养3d后观察抑菌情况，测量抑菌圈直径，每组实验重复3次。根据抑菌直径的大小选取抑菌效果较为明显的菌株，转移至牛肉膏蛋白胨斜面培养基保存备用。
3、细菌鉴定方法
（1）形态特征观察
形态特征观察包括对菌落形态的观察和细菌个体形态的观察两方面，主要采用《常见细菌***鉴定手册》中的实验方法进行。
①菌落形态的观察
将菌种于平板上划线培养24h，对其菌落形态、菌落质地、菌落的颜色、菌落边缘、光学特性及是否分泌可溶性色素等进行观察记录。
②个体形态的观察
革兰氏染色：采用菌龄为10～14h的菌种。涂片后先用结晶紫初染，再用碘液媒染，经95%乙醇脱色后再用番红复染，水洗，吸干。镜检菌体为紫色的是革兰氏阳性菌，菌体为红色的是革兰氏阴性菌。
芽孢染色：涂片后，先用孔雀绿染15min，经水冲洗，风干后用番红复染2min，水洗，吸干。镜检为芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。
菌体大小的测量：用显微测微尺对革兰氏染色涂片进行菌体大小的测量，每个菌株测量10个以上菌体的宽度和长度，平均值即为菌体一般大小。
（2）生理生化鉴定
生理生化鉴定按照《常见细菌***鉴定手册》及《芽抱杆菌属》中的方法，对各菌株进行包括接触酶反应、好氧性试验、甲基红反应、V.P反应试验、硝酸盐还原试验、糖醇发酵试验、吲哚产生试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、酪素水解试验、硫化氢产生试验及耐盐性试验等生理生化特征的鉴定。
（3）16S rDNA序列分析
用细菌基因组提取试剂盒进行细菌基因组DNA提取，作为PCR反应的模板。引物用16S rDNA全长扩增通用引物。PCR扩增反应体系30μL：PCR预混料15μL、模板DNA 1μL、引物各0.5μL、双蒸水13μL。PCR反应条件：95℃ 3min；95℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸10min。用PCR胶回收试剂盒回收PCR产物，经1.5%的凝胶电泳检测后，与克隆载体pGM-T在T4连接酶作用下于16℃过夜连接，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。引物及阳性克隆菌测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。利用Blast将菌株的16S rDNA的序列与GenBank数据库中已知的序列进行比较，分析其同源性。
二、筛选分离结果
1、样品中芽孢杆菌的分离纯化
从样品中，经稀释分离、纯化共获得79株细菌，分别编号、保存，用于拮抗菌的筛选。用显微镜初步镜检观察发现其中有68株为芽孢杆菌，占获得细菌总数的86.1%，这说明试验中采用的在稀释分离前，将样品悬液先在80℃水浴中加热10min的处理方法，能够有效杀死样品中的微生物细胞，从而最大限度的获得芽孢杆菌，适于芽孢杆菌的分离。
2、牡丹褐斑病病原菌拮抗菌的筛选
以牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae）作为靶标，采用对峙培养法，以抑菌效果即抑菌圈大小为标准，进行拮抗芽孢杆菌的筛选。结果表明，从样品中分离得到的68株芽孢杆菌中，对牡丹褐斑病有抑制作用的有11株，约占总数的16.2%，其中抑菌圈直径在6mm以上的有1株，抑菌圈直径为6.18mm，见图1，命名为HS5B5，进行微生物菌株鉴定。
3、个体及菌落形态观察结果
可以看出，菌株HS5B5的菌体形态为杆状，革兰氏染色阳性，中生芽孢，周生鞭毛，同时从菌落所显示的不规则、干燥、不透明等特征可以初步推断菌株HS5B5可能属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
表1菌株HS5B5的形态特征
4、生理生化特征鉴定结果
HS5B5为严格好氧菌，甲基红反应和V.P反应均为阳性，均具有过氧化氢酶、硝酸盐还原酶、淀粉水解酶和酪素水解酶，能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，均能发酵葡萄糖、甘露醇产酸，均能在10%NaCl、7%NaCl、5%NaCl、2%NaCl盐浓度条件下生长，均能在45℃条件下生长而不能在65℃条件下生长，其生理生化特征都与枯草芽孢杆菌标准菌株相同。根据菌株HS5B5的形态特征和生理生化特征，并参照《常见细菌***鉴定手册》及《芽抱杆菌属》，可以确定拮抗菌株HS5B5属于枯草芽孢杆菌属（Bacillus）。
表2 菌株HS5B5生理生化特征
注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。
16S rDNA测序结果
以细菌基因组为模板，经过PCR扩增后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测出现大约1500bp荧光条带。通过阳性克隆菌质粒的目标区域测序，16S rDNA片段大小为1470bp，16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。序列分析结果显示与已知菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis L520（FJ906822.1）等菌株的亲缘关系最为接近，同源性达到93%。结合菌株个体形态、菌落形态以及生理生化鉴定的结果，可以确定菌株HS5B5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
三、菌株HS5B5对牡丹褐斑病的抑制作用
2013年5月20日，选取洛阳国际牡丹园牡丹栽培区的200株牡丹作为试验对象，将牡丹均分为A、B两组，且对A、B两组中的牡丹苗接种等量的牡丹枝孢霉，之后A组使用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5菌液，每隔两周喷洒一次；B组每隔两周喷洒一次水。
2013年7月20日检查结果：A组仅有4株牡丹有褐斑病生成，B组有92株牡丹有褐斑病生成。
结果表明：本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5能够有效的抑制牡丹褐斑病的生成，抑制率达91.67%。
四、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5对多种病原菌的拮抗作用
采用对峙培养法，用直径为6mm的打孔器分别在培养好的菊花黄萎病、苹果白粉病、油茶叶枯病菌、月季黑斑病的菌落边缘取菌块，将菌块接种到PDA平板中央，然后把枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5接种到距离平板中央距离相等的位置，做3次重复，之后置于温度为28℃的恒温箱中培养，计算病原菌生长抑制率。结果如表3。
表3 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5对多种病原菌的抑制作用
结果表明：本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5能够有效的抑制菊花黄萎病、苹果白粉病、油茶叶枯病菌、月季黑斑病。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1470
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
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Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS5B5，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 6088。
2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌在抑制牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉中的应用。
3.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌在制备用于防治牡丹褐斑病制剂中的应用。
4.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌在抑制菊花黄萎病、苹果白粉病、油茶叶枯病菌、月季黑斑病中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |