CN102719538A - 非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因诊断技术领域的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法；所述基因芯片包括片基以及固定在片基上的探针，所述探针为SEQ IDNO.1～24所示的核苷酸序列；所述基因芯片的使用方法包括如下步骤：制备样品，多重PCR扩增，连接酶检测反应，芯片杂交，芯片扫描，获得结果；同时，本发明还涉及包含所述基因芯片的试剂盒；本发明的诊断芯片操作步骤简单，只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；检测时间短；采用通用芯片技术，片基也可通用于其他芯片，成本低。

Description

非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法

技术领域

本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及使用方法。

背景技术

耳聋是最常见的致残疾病和临床遗传病之一，已报道的新生儿发病率达1～3‰，研究发现，约60%的新生儿耳聋与遗传因素有关，即遗传性耳聋。其中70%左右以常染色体隐性方式遗传。遗传性耳聋由单一基因突变或不同基因的复合突变引起。至今发现的耳聋相关基因已达120余个，具有较高的基因和位点遗传异质性。近年来研究发现GJB2、SLC26A4等基因是最常见的耳聋相关基因，GJB2上的235delC、299delAT、176del16，以及SLC26A4上的IVS7-2A>G、2168A>G等为热点突变位点，病理性携带率和双等位基因突变率均高。针对上述热点突变进行筛查，可以为40%以上的聋病患者明确病因。

遗传性耳聋在临床上多表现为重度的感音神经性聋，缺乏有效的临床治疗办法，因此早期诊断、早期预防是主要的遗传性耳聋防治办法。产前诊断结合基因检测是一种有效的解决遗传性耳聋发病的技术手段。产前诊断技术的原则为尽可能早地做出诊断，以及尽可能采用安全的介入性产前诊断方法，主要包括侵入性和非侵入性两种方式。

侵入性产前诊断以绒毛活检术(chorionic villus sampl ing,CVS)、羊膜腔穿刺术为代表，因其在基因水平上进行诊断，准确率高达99%。传统的产前诊断遗传性耳聋就是运用侵入性产前基因诊断，对胎儿行GJB2、SLA26A4等常见耳聋基因检测。但是由于细胞培养等过程，检测周期长达1～2周，且存在流产、胎儿畸形等风险，目前该技术仅限于高危孕妇的诊断，不利于大范围推广。

非侵入性产前诊断有血清学检测、影像学检测、遗传学检测等。血清学和影像学手段由于是针对表象的检查，存在较高的假阳性和假阴性可能；而新兴的遗传学检测主要是对孕妇外周血中的胎儿遗传物质进行基因诊断，准确性高，与侵入性产前诊断方法相比，仅需孕期抽取适量孕妇外周血即可实现检测，避免了流产、胎儿畸形等风险；检测涉及的PCR技术反应迅速，检测周期仅1～2天；满足产前诊断早期、安全、快速的诊断原则。

目前采用非侵入性手段进行遗传检测的方法主要有：提取母体外周血胎儿有核红细胞进行检测或者富集母体外周血游离胎儿DNA（cell free-fetal DNA，cf-fDNA）进行检测。前者可以获得胎儿全基因组DNA，但由于胎儿细胞数量少，分离、鉴别与富集技术复杂，费用昂贵，限制了临床应用，目前仍在实验研究阶段；后者胎儿DNA含量相对较多，在妊娠早期和晚期分别是母血中胎儿细胞DNA的775倍和970倍，少量母体外周血即可满足诊断需要。此外，由于孕早期即可在外周血中检测到cf-fDNA（最早可在受精卵着床后第18天测得），且分娩后清除迅速，利于孕早期遗传学产前诊断。目前，cf-fDNA已用于RhD血型分析、性别鉴定等临床检测，在染色体病、单基因病诊断方面也有大量探索，效果显著。

因此，基于母体血浆cf-fDNA的无创性产前诊断技术可以在基因水平上实现早期、安全、快速的诊断遗传病。对于遗传性耳聋，该技术可以弥补新生儿听力筛查的局限，即经筛查无法发现的迟发型耳聋；可以解决传统耳聋侵入性产前诊断的局限性，即存在流产、胎儿畸形风险，检测周期长，难以大范围开展等不足；可以筛查人群中携带的隐性突变，做到“未病防病”；为日后胎儿宫内治疗的开展奠定基础。

由于孕妇外周血DNA系胎儿与母体游离DNA的混合物，且胎儿DNA含量仅为3.4～6.2%。母体等位DNA片段可干扰胎儿DNA的检测。因此寻找灵敏度高、特异性好的检测手段成为需要迫切解决的问题。传统的检测手段如限制性酶切片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）、单链构象多态性分析（SingleStranded Conformational Polymorphism,SSCP）、变相高效液相色谱分析（DenaturingHigh Performance Liquid Chromatography，DHPLC）、质谱分析（Mass Spectrometry，MS）等操作复杂、花费高昂、准确性差，且不能高通量、大规模的进行基因多态性分析，难以满足临床应用的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及使用方法。本发明的诊断芯片分型技术操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，时间短，成本低，能用于低丰度遗传性耳聋常见突变的检测，在非侵入性产前诊断领域存在巨大潜力。

本发明的技术方案是通过如下的技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，包括片基以及固定在片基上的探针，所述探针为SEQ ID NO.1～24所示的核苷酸序列。

优选地，所述片基为载玻片、硅片或膜。

优选地，所述片基的材质为高分子材料。

第二方面，本发明涉及前述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：片基酸碱预处理，氨基化处理，异硫氰酸化处理，芯片Zip探针设计，Zip探针点样，氨水封闭，即得。

第三方面，本发明涉及前述基因芯片的使用方法，包括如下步骤：制备样品，多重PCR扩增，连接酶检测反应，芯片杂交，芯片扫描，获得结果。

优选地，所述多重PCR扩增中所用的引物对如下表所示：

第四方面，本发明还涉及一种用于非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的试剂盒，所述试剂盒包括前述的基因芯片。

本发明的基于孕妇外周血cf-fDNA非侵入性产前诊断遗传性耳聋的基因芯片，是以待测孕妇外周血游离DNA（胎儿与母体游离DNA的混合物）为模板，用遗传性耳聋常见突变位点对应的等位基因的引物组进行多重PCR扩增，将得到的多重PCR扩增产物与芯片杂交，根据杂交结果确定胎儿是否携带突变位点的等位基因。

本发明具有如下的有益效果：本发明的诊断芯片操作步骤简单，只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成；采用通用芯片技术，片基也可通用于其他芯片，有效降低了成本，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。

附图说明

图1为对GJB2-235delC位点野生型的检测结果；

图2为对GJB2-235delC位点突变型的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York Cold Spring HarborLaboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的基因芯片采用基于连接酶检测反应（Ligase Detect Reaction,LDR）与通用芯片（Universal Array）技术相结合的分型方法，针对人群中遗传性耳聋的8个热点突变位点，每个位点设计3条探针。其中两条位于突变位点及其上游，其5’端与突变位点配对的碱基分别为野生型和突变型，称为特异性探针；一条位于突变位点下游，与模板序列完全配对，称为common探针，其5’末端携带荧光基团。只有当特异性探针与common探针序列均与模板完全配对，连接酶才会将两条探针连接起来；如果存在错配碱基，连接反应则不能进行。因此，只有与模板基因型相同的特异性探针才能和common探针连接在一起，从而发出荧光信号。芯片片基上固定有Zip探针，特异性探针3’末端具有与Zip探针序列互补的cZip序列，所以当LDR反应后的产物与芯片杂交时，cZip序列就能引导反应产物与Zip探针杂交，在芯片的特定位置可以检测到荧光信号，从而分析模板的基因型。

本发明的基因芯片对于父母双方为遗传性耳聋致病基因座位上不同种突变位点的携带者，可以诊断确定胎儿是否携带该基因座位上父源性突变位点，即可明确父亲是否将携带在染色体上的致病基因传递给子代。对于遗传性耳聋这种常染色体隐性遗传病，父母双方系杂合子突变者，如果检出父源性突变位点，则胎儿有50%的风险罹患该病，应进一步行侵入性产前诊断明确；如果未检出父源性突变位点，则胎儿可排除发病可能，但有50%的可能成为母源性突变的携带者。

在行使传统的产前诊断方法之前使用本发明的基因芯片可以确定胎儿是否为高危遗传性耳聋患儿，具体的说，若芯片结果显示母体样本中没有出现父源的突变等位基因，则胎儿遗传的是父亲正常的等位基因，那么就可以避免对胎儿行侵入性产前诊断；若芯片结果显示母体样本中出现父源的突变等位基因，则胎儿的基因型表现为杂合突变型或纯合突变型，患有遗传性耳聋的风险较高，需要进一步通过传统的侵入性产前诊断方法来确定胎儿是否患病。

本芯片的先进之处还在于，只需一次性抽取孕妇的全血即可在一张芯片上同时检测母亲和胎儿的基因型。具体的说，本发明的一张芯片上设计有两个上样区，抽取的孕妇全血一部分用来抽提母体血液总DNA，一部分用来抽提血浆游离的DNA，一个上样区可以做母亲基因组DNA的基因分型，另一个区可以做cf-fDNA的基因分型。这样一张芯片即可同时检测母亲和胎儿遗传性耳聋各致病位点的基因型，可以根据不同致病位点的基因型情况判断胎儿患病的风险，还可以省却不必要的流程和费用。

实施例1、非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片的制备

本实施例涉及非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，该基因芯片的制备方法包括如下步骤：

将玻片用双蒸水洗净，在碱液中浸泡过夜，取出后用双蒸水清洗3遍，再于体积分数为1%的HCl中浸泡30分钟，清洗后置于玻片缸中待用。将清洁后的玻片经过4-氨丁基三乙氧基硅烷溶液氨基化处理，再经苯异硫氰酸酯溶液进行异硫氰基化处理，用氮气吹干后，放于4℃避光保存；

芯片Zip探针是随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段，将这些寡核苷酸序列利用NCBI网站上的BLAST功能与目的基因组序列进行同源性比较，选择其中同源性程度最低的一组作为Zip探针序列。位点特异性探针长度不等，需保证其Tm值基本保持一致，以确保后续反应的均一性；

将合成好的Zip探针溶解于点样液中，将探针溶液转移到对应的96孔板内，使用GMS417点样仪，运行相应程序将探针点到活化好的片基上，置于37℃，90%湿度的恒温恒湿箱中过夜，使探针与玻片充分交联。固定好的片基在氨水中封闭反应的活性基团，可以储存于4℃以备下步杂交实验用。本领域人员知晓，本实施例用于诊断高危遗传性耳聋的基因芯片配合常规的检测试剂，即会得到可以用于诊断高危遗传性耳聋的试剂盒，进行常规化的使用。

实施例2、利用基因芯片非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋

2.1 样品准备

准备血浆样品，用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen,Basel,Switzerland)抽提血浆中游离的DNA。

2.2 突变检测位点的选择

需要进行检测的8个突变位点及探针核心序列如表1，

表1

突变形式中的“del”表示缺失突变，如35delG表示SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列中第35个碱基G缺失；“>”表示置换突变，如707T>C表示SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列中第707个碱基由T突变为C。以此类推，以上8种突变中前5种所代表的位置是在SEQNO ID.25所示的核苷酸序列中：

第35个碱基是否发生突变，第35个碱基G缺失；

第167个碱基是否发生突变，第167个碱基T缺失；

第176至191个碱基是否发生突变，第176至191这16个碱基缺失；

第235个碱基是否发生突变，第235个碱基C缺失；

第299至300个碱基是否发生突变，第299至300这两个碱基AT缺失；

以上8种突变中第6种和第7种所代表的位置是在SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列中：

第707个碱基是否发生突变，由T→C；第2168个碱基是否发生突变，由A→G；

以上8种突变中第8种所代表的位置是在SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列第99个碱基是否发生突变，由A→G；

所述探针的检测结果如下：

SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列第35个碱基是否发生突变，第35个碱基G缺失；

SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列第167个碱基是否发生突变，第167个碱基T缺失；

SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列第176至191个碱基是否发生突变，第176至191这16个碱基缺失；

SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列第235个碱基是否发生突变，第235个碱基C缺失；

SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列第299至300个碱基是否发生突变，第299至300这两个碱基AT缺失；

SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列第707个碱基是否发生突变，由T→C；

SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列第2168个碱基是否发生突变，由A→G；

SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列第99个碱基是否发生突变，由A→G。

2.3 多重PCR扩增

分别以各样本的游离DNA为模板，进行多重PCR。

为防止某些引物间的相互作用以及扩增片段之间的重叠，多重PCR在两管中进行。

其中，1号管六重PCR反应成分（15μl体系）：20ng基因组DNA，1×QIAGEN MultiplexPCR Master Mix，0.2μM各引物，RNase-free water补足；

2号管一个片段反应成分（15μl体系）：20ng基因组DNA，1×莱枫PCR Master Mix，0.4μM引物，RNase-free water补足。

1号管六重PCR的反应条件为：95℃起始15min，94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min；

2号管一个片段扩增反应条件为：94℃起始5min，94℃变性30s，64℃退火30s，每次循环下降0.5℃，72℃延伸1min，循环14次，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min。

反应完成后在反应混合液中加入1μl蛋白酶K，70℃反应10min，随后94℃20min灭活蛋白酶K；多重PCR反应的引物如表2所示，

表2

2.4 连接反应

蛋白酶K消化后的扩增产物，立刻进行LDR反应。在反应液中依次加入10×Taq ligasebuffer 2μl，探针混合液1μl，各探针浓度均为1μM，Taq DNA ligase 0.25μl，补水至总体积20μl；反应条件为94℃变性30s，65℃退火4min，循环40次。

2.5 杂交

向20μl LDR反应液中加入15μl双蒸水和35μl 2×杂交液，混匀后于95℃加热变性5min，迅速放于冰上冷却，离心待用。

将杂交框粘帖于点样区域，吸取65μl杂交液添加到杂交框中，封闭好置于65℃杂交箱中杂交2至3小时或过夜。

杂交结束后，去掉杂交框，将芯片分别放于0.3×SSC/0.1%SDS和0.06×SSC中各洗脱1min，离心甩干。

2.6 扫描与分析

杂交后的芯片用激光共聚焦微阵列扫描仪进行扫描，得到的图像用软件进行分析。最终获得各个样本位点的荧光信号强度值和背景值，扣除背景值影响后得到该点的AMSI值（absolute median signal intensities）。根据同一位点野生型和突变型探针点的绝对强度比值，确定基因型。芯片扫描结果部分如图1和图2所示，图1为对GJB2-235delC位点野生型的检测结果；图2为对GJB2-235delC位点突变型的检测结果。如图1所示，提示母体样品中不含该位点父源的突变等位基因；如图2所示，提示母体样品中含有父源的突变等位基因，综合所有位点的检测信息即可判断胎儿患遗传性耳聋的风险。

综上所述，本实施例的操作步骤简单，只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，经前期试验该芯片可正确区分各个位点的基因型，多次试验重复性高；时间短，样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成；采用通用芯片技术，片基也可通用于其他芯片，有效降低了成本。

Claims (7)

1.一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，包括片基以及固定在片基上的探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO.1～24所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，其特征是，所述片基为载玻片、硅片或膜。

3.如权利要求1所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，其特征是，所述片基的材质为高分子材料。

4.一种如权利要求1所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：片基酸碱预处理，氨基化处理，异硫氰酸化处理，芯片Zip探针设计，Zip探针点样，氨水封闭，即得。

5.一种如权利要求1所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：制备样品，多重PCR扩增，连接酶检测反应，芯片杂交，芯片扫描，获得结果。

6.如权利要求5所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片的使用方法，其特征是，所述多重PCR扩增中所用的引物对如下表所示：

7.一种用于非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的基因芯片。

Images