CN102108412A - 用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，它检测PDS基因的五个突变位点：IVS7-2A＞G、A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G＞A和T416P。分别对应下述SNP位点：rs111033313位点、rs121908362位点、rs80338848位点、rs80338849和rs28939086位点。利用本试剂盒，通过检测一组大前庭水管综合症性耳聋PDS基因突变位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，可清晰的判断受检人群是否携带“大前庭水管综合症性耳聋易感基因”，将大前庭水管综合症性耳聋易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

Description

用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，通过检测PDS基因热点突变的单核苷酸多态性位点(SNP)，来预测个体对大前庭水管综合症性耳聋的易感性。

背景技术

耳聋是一种严重影响生活质量和交流的常见疾病。它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素或基因与环境两者共同作用而致。新生儿耳聋的发病率为1-3/1000，一般认为，遗传性耳聋占儿童期耳聋的50％，其具有较高的遗传异质性。GJB2基因和PDS(SLC26A4)基因是非综合征性常染色体隐性遗传性耳聋中最常见的两个致病基因。1978年，Valvassori和Clemis在对3700例颞骨连续分层扫描中发现有50例前庭水管扩大，将其命名为大前庭水管，又将临床上伴感音神经性听力损失等症状者称为“大前庭水管综合症”(Larged Vestibular Aqueduct Syndrome，LVAS)。此病出生时可能听力正常，或伴有轻度至中重度的听力损失，患儿早期多有较好的语言能力，听力逐渐下降，听力下降的诱发因素多为头部外伤、颅内压升高、感冒等，因堕床、儿童玩耍或体育活动中的轻度碰撞可以造成明显的听力下降，因此对于该病的早期发现、早期诊断、早期干预成为预防或推迟其发病的有效措施。

近年来国内外多项研究表明大前庭水管综合症与PDS基因突变有密切的关系。PDS(SLC26A4)(Solute carrier family)基因含21个外显子，开放阅读框架2343bp，编码780个氨基酸的蛋白质Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸组成，属于离子转运体家族，研究表明其功能主要与碘/氯离子转运有关。PDS基因突变造成耳聋的遗传模式绝大部分属于常染色体隐性遗传方式。

随着对SLC26A4基因认识的逐渐深入，发现该基因突变极具异质性：突变位点遍布于整个基因序列；突变形式多样，包括错义突变、无义突变、移码突变、剪接位点突变等等。不同种族的耳聋人群中PDS基因热点突变不同。在欧洲，T416P和L236P是LVAS患者最常见的两种突变类型；在东亚，IVS7-2A＞G和A2168G(H723R)是韩国人中突变频率较高的类型，H723R和L676Q是日本人和蒙古人中突变频率较高的类型。

现有技术检测大前庭水管综合症性耳聋易感人群，采用直接测序法，虽准确率高，但其成本高、操作复杂且不能实现批量检测，因此现有方法均无法满足大规模基因筛选的要求。

因此目前需要一种简便易行的技术来满足对大前庭水管综合症性耳聋PDS基因热点突变进行广泛筛查和快速诊断的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过检测一组大前庭水管综合症性耳聋PDS基因突变位点，利用特异性引物和探针，通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，综合检测和分析受检人群是否携带“大前庭水管综合症性耳聋易感基因”，将大前庭水管综合症性耳聋易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感的检测试剂盒，它检测PDS基因的五个突变位点：IVS7-2A＞G、A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G＞A和T416P。。

分别对应下述SNP位点：rs111033313位点、rs121908362位点、rs80338848位点、rs80338849和rs28939086位点。

所述的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感的基因组合，用于针对所述位点设计特异性的引物对和探针。

所述的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感的基因组合设计的特异性引物，所述的特异性引物对的序列如下，用于进行多重PCR扩增，能同时扩增出上述5个位点的基因片段：

针对rs111033313位点：AATCCCAGTCCCTATTCCTA(SEQ ID NO：1)

CATTGTAATTTTTTTCCAGGTT(SEQ ID NO：2)

针对rs121908362位点：GTTCTTTGACGACAACATTAGAA(SEQ ID NO：3)

GAACCTTGACCCTCTTGAGA(SEQ ID NO：4)

针对rs80338848位点：GGTACTTGGCAGATCCTTTG(SEQ ID NO：5)

AATAGAGAGAACTCCATTGTAGTTT(SEQ ID NO：6)

针对rs80338849位点：TAATTGCTACTGCCATTTCATA(SEQ ID NO：7)

TTGAAGGAGTATCAGTGAAATGA(SEQ ID NO：8)

针对rs28939086位点：CTTCCTCTGTTGCCATTCCT(SEQ ID NO：9)

AATTCATTGCCTTTGGGATC。(SEQ ID NO：10)

所述的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感的基因组合设计的特异性探针，其特征在于，所述的特异性探针序列如下，能同时对5个位点进行检测分型：

针对rs111033313位点：

ACGCACGTCCACGGTGATTTTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC(SEQ ID NO：11)

针对rs121908362位点：

GGATGGCGTTCCGTCCTATTAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC(SEQ ID NO：12)

针对rs80338848位点：

CGTGCCGCTCGTGATAGAATGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC(SEQ ID NO：13)

针对rs80338849位点：

AGCGATCTGCGAGACCGTATGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG(SEQ ID NO：14)

针对rs28939086位点：

GCGGTAGGTTCCCGACATATGTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG(SEQ ID NO：15)

所述的引物或探针，用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术特异性检出大前庭水管综合症性耳聋易感基因。

本试剂盒的组分和含量包括：

250ul 10×PCR反应缓冲液，

20ul 10mM dNTP混合液，

450ul 25mM MgCl2溶液，

45ul(5U/ul)Taq DNA聚合酶，

50ul特异性引物(10条)混合液(10uM each)，

15ul特异性延伸探针(5条)混合液(10uM)，

90ul ExoI(10U/ul)，

450ul SAP(1U/ul)，

140ul 10×SAP反应缓冲液，

1700ul Extension Dilution Buffer，

90ul 10×Extension Mix，

10ul DNA polymerase，

3500ul Hybridization Solution，

200ul Hybridization Additive，

2500ul 20×Wash Buffer 1，

800ul 64×Wash Buffer 2，

一个384孔12重微阵列芯片

去离子水20ml，

本试剂盒供380人份检测应用，试剂盒保存温度为-20℃。

本发明的有益效果是：(1)分型结果准确性高达99％以上，重复性好，没有假阳性影响；(2)同时检测多个SNP位点，检测成本低；(3)通量高，可一次对384个样本进行检测；(4)操作简便；(5)灵敏度高，每次检测的DNA用量仅2ng。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验放大，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

1DNA的提取：

取受检者外周静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充***解白细胞，离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)，65℃孵育10分钟，异丙醇沉淀、75％乙醇洗涤两次，晾干后溶于适量TB溶液中。

2PCR扩增

取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板中，进行多重PCR扩增：

反应总体积5ul，其中10M mol/L dNTPs 0.0375ul，10×PCR Buffer0.5ul，25mmol/L MgCl₂1ul，模板DNA 30ng，5重引物混合液10uM/L each0.025ul，Amplitaq Gold(5U/ul)0.1ul，补足水到5ul。置于PCR仪上反应：预变性94℃1min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，40个循环；Hold 4℃。

扩增引物混合液包括下列引物：

1F  AATCCCAGTCCCTATTCCTA(SEQ ID NO：1)

1R  CATTGTAATTTTTTTCCAGGTT(SEQ ID NO：2)

2F  GTTCTTTGACGACAACATTAGAA(SEQ ID NO：3)

2R  GAACCTTGACCCTCTTGAGA(SEQ ID NO：4)

3F  GGTACTTGGCAGATCCTTTG(SEQ ID NO：5)

3R  AATAGAGAGAACTCCATTGTAGTTT(SEQ ID NO：6)

4F  TAATTGCTACTGCCATTTCATA(SEQ ID NO：7)

4R  TTGAAGGAGTATCAGTGAAATGA(SEQ ID NO：8)

5F  CTTCCTCTGTTGCCATTCCT(SEQ ID NO：9)

5R  AATTCATTGCCTTTGGGATC(SEQ ID NO：10)

3纯化

在PCR扩增产物中加入0.2ul ExoI，1ul SAP，0.3ul 10×SAP反应缓冲液和1.5ul去离子水。将96孔板放入PCR仪中进行纯化，纯化程序：37℃30min，96℃10min，Hold 4℃。

4引物延伸反应

纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物：extension Dilution Buffer3.76ul，延伸探针混合液(1010uM/L each)0.03ul，20×Extension Mix 0.2ul，DNA聚合酶0.02ul，去离子水3ul。将装有延伸反应混合物的96孔板再次放入PCR仪中进行延伸反应，反应程序：Hold 96℃3min；94℃20sec，40℃11sec，46个循环；Hold 4℃。

延伸探针混合液包含下列探针：

1P  ACGCACGTCCACGGTGATTTTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTC(SEQ ID NO：11)

2P  GGATGGCGTTCCGTCCTATTAAGGACACATTCTTTTTGACGGTCC(SEQ ID NO：12)

3P  CGTGCCGCTCGTGATAGAATGCCTTCCAAGTGCTGGTCTCACAGC(SEQ ID NO：13)

4P  AGCGATCTGCGAGACCGTATGCATTGTTAAATCCATCCCAAGGGG(SEQ ID NO：14)

5P  GCGGTAGGTTCCCGACATATGTTCCTACCTGTGTCTTTCCTCCAG(SEQ ID NO：15)

以上延伸探针5’端具有与微阵列芯片地址引物对应的地址序列。

5延伸反应结束后，加入杂交液可与微阵列芯片进行杂交反应。

孵育温度42℃，孵育时间2小时。

6激光扫描检测荧光信号

同时检测上述5个基因突变位点对预测、比较个体的大前庭水管综合症性耳聋易感性具有重要意义。本发明将与大前庭水管综合症性耳聋易感、发生密切相关的PDS基因热点突变进行组合，通过大量的筛选数据表明所述5个多态性位点：IVS7-2A＞G、A2168G(H723R)、L236P、IVS8+1G＞A和T416P，如出现突变，则患大前庭水管综合症性耳聋的概率最高高；没有位点发生突变患大前庭水管综合症性耳聋的概率较小。

本发明采用单核苷酸延伸技术和微阵列芯片技术相结合的方法，针对上述5个位点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增携带SNP位点的5个基因片段，根据SNP位点上游5’端23-25bp的序列设计寡核苷酸探针，此探针与序列杂交后3’末端位于snp5’端上游1bp处。检测时聚合酶根据SNP携带的碱基在探针末端结合上一个携带荧光的ddNTP，根据结合的ddNTP不同，其所携带的荧光颜色也不相同，在探针的5’端根据与微阵列芯片结合位置的不同设计有不同的20bp的Tag地址序列，与微阵列芯片上对应的序列互补，延伸后的探针与微阵列芯片上对应区域上的序列杂交，不同的探针结合在芯片的不同区域，通过检测对应位置的荧光，达到同时进行多个SNP分型的目的。

疾病的发生是一个十分复杂的过程，受到多个蛋白和基因的共同影响，其中任何一个酶的改变都会影响疾病的易感性。传统的基因检测疾病的方法受到方法的限制，往往只能对一到两个基因的多态性进行分析，只能覆盖一部份患病风险人群，对于由于其他基因上的多态性造成的疾病患病风险不能及时的预警，检测的准确性因此会大幅降低，受检者不能全面的了解自身疾病的易感情况。

本发明针对一种疾病不同的患病途径检测多个相关的基因和其多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能给受检者提出具有针对性和有效地健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。

由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成本，可以对不同患病途径的多个基因同时进行检测，本发明针对大前庭水管综合症性耳聋PDS基因寻找挑选了5个多态性位点，能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险，能够给受检者提出具有针对性的健康建议，及时有效的避免其疾病的发生。本发明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术，利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型准确率超过99％，同时检测上述5个基因突变位点对检测、比较个体的大前庭水管综合症性耳聋易感性具有重要意义

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (6)

1.一种用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，其特征在于，包括：同时检测PDS基因的IVS7-2A＞G的rs 111033313位点、A2168G的rs121908362位点、L236P的rs80338848位点、IVS8+1G＞A的rs80338849位点和T416P的rs28939086位点的特异性引物及对应的延伸探针，Taq酶，dNTP混合液，MgCl₂溶液，10×PCR反应缓冲液，ExoI，SAP，10×SAP反应缓冲液，Extension Dilution Buffer，10×Extension Mix，DNA polymerase，Hybridization Solution，Hybridization Additive，20×Wash Buffer 1，64×Wash Buffer 2，去离子水，微阵列芯片。

2.根据权利要求1所述的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是针对PDS基因的IVS7-2A＞G的rs111033313位点、A2168G的rs121908362位点、L236P的rs80338848位点、IVS8+1G＞A的rs80338849位点和T416P的rs28939086位点而设计，能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段的引物对。

3.根据权利要求1所述的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，其特征在于：所述的特异性延伸探针是针对PDS基因的IVS7-2A＞G的rs111033313位点、A2168G的rs121908362的位点、L236P的rs80338848位点、IVS8+1G＞A的rs80338849位点和T416P的rs28939086位点而设计，能通过单核苷酸延伸和微阵列技术检测出这五个SNPs位点基因型的探针。

4.根据权利要求1所述的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1，2所示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID NO：3，4所示核苷酸序列的引物对、具有SEQID NO：5，6所示核苷酸序列的引物对、具有SEQ ID NO：7，8所示核苷酸序列的引物对以及具有SEQ ID NO：9，10所示核苷酸序列的引物对。

5.根据权利要求1所示的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，其特征在于：所含的特异性延伸探针选自具有SEQ ID NO：11、12、13、14和15所示的延伸探针。

6.根据权利要求1所述的用于检测大前庭水管综合症性耳聋易感性的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包含250ul 10×PCR反应缓冲液，20ul 10mM dNTP混合液，450ul 25mM MgCl₂溶液，45ul 5U/ul的Taq DNA聚合酶，50ul每条10uM的10条特异性引物混合液，15ul每条10uM的5条特异性延伸探针混合液，90ul 10U/ul ExoI，450ul 1U/ul SAP，140ul 10×SAP反应缓冲液，1700ul Extension Dilution Buffer，90ul 10×Extension Mix，10ul DNA polymerase，3500ul Hybridization Solution，200ulHybridization Additive，2500ul 20×Wash Buffer 1，800ul 64×WashBuffer 2，去离子水20ml，一个供380人份检测应用的384孔12重微阵列芯片，试剂盒保存温度为-20℃。