CN104120104A

CN104120104A - 一种cd34+细胞的生产方法

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Publication number: CN104120104A
Application number: CN201310302280.7A
Authority: CN
Inventors: 唐立峰
Original assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-07-17
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2033-07-17
Also published as: CN104120104B

Abstract

本发明涉及一种CD34+细胞的生产方法。本发明的方法以脐带来源的间充质干细胞作为起始材料，在CD34抗体存在条件下经传代培养，间充质干细胞被诱导成为CD34+细胞。采用本发明的方法，能够以相对简便的方式生产大量CD34+细胞，用于治疗肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的下肢动脉病变。

Description

一种CD34+细胞的生产方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域；更具体而言，涉及一种以脐带源间充质干细胞为起始材料生产CD34+细胞的方法。

背景技术

外周动脉病变（peripheral arterial disease，PAD），尤其是下肢动脉病变往往由动脉硬化闭塞症和血栓闭塞性脉管炎导致的肢体动脉狭窄闭塞和糖尿病所引起。PAD主要体现为严重的肢体缺血，尤其是下肢缺血。

目前，临床上对于远端流出道通畅者，常以介入支架和外科手术治疗。PAD患者常表现为两种情况：

（1）管腔狭窄早期：主要表现为以行走时出现疼痛为特征的间歇性跛行；

（2）随着狭窄的加重，可出现静息痛，甚至丧失行走能力和伴随组织坏死与溃疡发生为特点的危重肢体缺血（critical limb ischaemia,CLI）。

CLI的预后极差，5年生存率仅为50%或更低。CLI的治疗不仅仅是缓解症状、改善受累肢体的功能和防止截肢，还要防止全身动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的进展，以预防心脑血管事件发生。目前主要的治疗手段为：控制高血糖、高血压、血脂异常；去除危险因素，如吸烟；强制性运动锻炼；抗血小板药物和扩血管药物；以及循环重建手术，如外科手术（如旁路移植术或动脉内膜切除术）、血管内介入技术（如支架置入或球囊扩张术）。

经过上述治疗后，约40%的CLI患者仍不能改善预后。对于这部分患者来说，截肢目前被认为是挽救生命所做出的最后治疗选择。但截肢后的总死亡率大约为25%-50%；截肢术围手术期的死亡率为5%-20%；二次截肢率大约为30%。到目前为止，CLI的治疗选择仍然有限，大约40%的患者不符合进行循环重建的指征，或进行循环重建不能得到有益的反应。对于这些“没有其它治疗选择”的患者，药物治疗对延缓病情进展和预防截肢的作用十分有限。

因此，探索缺血肢体血液循环重建的新治疗策略对于减少患者截肢和提高患者生活质量具有非常重要的临床意义。这促使研究者将研究重点转向寻求具有分化潜能的干细胞移植治疗PAD，研究者们希望在病变局部能够使干细胞被诱导为血管上皮细胞来修复损坏的血管。

基础研究发现，能分化为血管内皮细胞的干细胞类型有血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPCs）、骨髓源性单核细胞（bonemarrow mononuclear cell,BMMNC）和外周血单核细胞（peripheral bloodmononuclear cell,PBMNC）。但这些干细胞受组织来源的限制，提取和扩增的数量有限。致使这种疗法目前尚处于临床前研究阶段。

实验证明，人CD34+细胞（CD34是成熟血管的标志物）可以缓解CLI的症状、改善受累肢体的功能和防止截肢。但由于其在脐带沃尔通氏胶（Wharton's jelly）中含量仅为5%-10%左右，因此，如何高效地生产该细胞就成为其能否获得广泛应用的重要前提。

截至目前，对脐带血中CD34+细胞的分离通常采取Ficoll分离法、羟乙基淀粉分离法和明胶自然沉降分离法，并在随后用免疫磁珠吸附法（MACS）进一步纯化所获得的CD34+细胞以获得符合要求的CD34+细胞。上述方法直接从人脐带血中分离并纯化原代CD34+细胞，鉴于人脐带血的供应量有限，利用上述方法所能获取的CD34+细胞的数量也极其有限。

因此，本领域仍然需要一种能够以相对简便的方法从人脐带生产大量CD34+细胞的方法。

发明内容

本发明的一方面，提供一种CD34+细胞的生产方法，其包括步骤：

（a）提供脐带来源的间充质干细胞；

（b）对间充质干细胞进行原代培养；

（c）对间充质干细胞进行传代培养；

（d）在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；

（e）获得CD34+细胞。

本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式来提供脐带来源的间充质干细胞。例如，在一些实施方式中，将脐带组织进行酶解之后得到脐带来源的间充质干细胞。

本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式和任何适合的培养基对间充质干细胞进行原代培养。在一些实施方式中，采用贴壁的培养方式对间充质干细胞进行原代培养。在一些实施方式中，在补充有胎牛血清的RPMI1640培养液中对间充质干细胞进行原代培养。经原代培养的间充质干细胞称为P1代。在本发明的上下文中，原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行的首次培养。

在一些实施方式中，可以采用本领域任何适合方式和任何适合的培养基对间充质干细胞进行传代培养。在一些实施方式中，采用贴壁的培养方式对间充质干细胞进行传代培养。在一些实施方式中，在补充有人血浆的RPMI1640培养液中对间充质干细胞进行传代培养。

在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导。在一个优选的实施方式中，从第5次传代培养起，向传代培养基中加入诱导剂将间充质干细胞诱导成CD34+细胞。

在一些实施方式中，诱导剂为CD34抗体。CD34抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。CD34抗体可以是鼠源、兔源、猪源、牛源、羊源、马源、狗源的；优选鼠源、兔源、马源；最优选鼠源或兔源。在一个优选的实施方式中，CD34抗体是鼠单克隆抗体。

在一些实施方式中，CD34抗体在传代培养基中的终浓度为0.01μmol/L至1μmol/L；优选0.1μmol/L至1μmol/L；最优选0.1μmol/L。

与不含CD34抗体的培养条件下，间充质干细胞表达非成熟血管标志物CD105，不表达成熟血管内皮细胞标记物CD34；而在CD34抗体存在条件下，间充质干细胞被诱导表达CD34，成为CD34阳性（+）细胞。

在一些实施方式中，自加入诱导剂后，对间充质干细胞传代培养2至15次；优选5至7次；最优选5次。

根据本发明的另一方面，提供一种细胞制品，其包括根据本发明的方法所生产的CD34+细胞和可药用载体。

本发明的细胞制品可以根据本领域常规方法胃肠外施用。目前临床应用中细胞制品的施用途径包括但不限于局部注射移植、循环注射移植。根据本发明的细胞制品可以制备成任何适合施用的形式。例如制备成适合通过微量泵将含有CD34+细胞的细胞制品泵入目标区域的形式；或者制备成适合通过穿刺针将将含有CD34+细胞的细胞制品注入目标区域的形式。根据移植方式、治疗目的的不同，本领域技术人员可以确定自行选择适当的可药用载体。在一些实施方式中，可药用载体是生理盐水。

根据本发明的另一方面，提供含有根据本发明方法所生产的CD34+细胞的细胞制品在缓解或改善血管病变的药物中的用途。

所述血管病变为肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的外周动脉病变（peripheral arterial disease，PAD）；优选肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的下肢动脉病变。

附图说明

图1A.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），无CD34抗体孵育hUC-MSCs，7天的CD105蛋白表达。

图1B.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），0.01μmol/L CD34抗体孵育hUC-MSCs7天的CD105蛋白表达。

图1C.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），0.1μmol/L CD34抗体孵育hUC-MSCs7天的CD105和CD34蛋白表达。

图1D.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），1μmol/L CD34抗体孵育hUC-MSCs7天的CD105和CD34蛋白表达。

图1E.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），无CD34抗体孵育hUC-MSCs14天的CD105蛋白表达。

图1F.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），0.01μmol/L CD34抗体孵育hUC-MSCs14天的CD105和CD34蛋白表达。

图1G.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），0.1μmol/L CD34抗体孵育hUC-MSCs14天的CD105和CD34蛋白表达。

图1H.免疫组化结果（CD34蛋白：红色荧光；CD105蛋白：绿色荧光），1μmol/L CD34抗体孵育hUC-MSCs14天的CD105和CD34蛋白表达。（图2A至图2H中标尺为50.0μm）。

图2.免疫组化结果：CD105和CD34蛋白共表达的细胞数占总细胞数的百分比。

图3.人脐带源间充质干细胞（hUC-MSCs）经传代培养所得的P5代细胞（CD105蛋白：绿色荧光）。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料

人脐带：吉林省四平市中心医院妇产科的孕妇签署知情同意书之后，自愿提供；

RPMI1640培养液购自GENMED，GMS12049.2A；

人AB血浆购自北京红十字血液中心；

注射用重组人白细胞介素-2，国药准字S10970016；

LG-DMEM培养液购自Gibco；

完全培养液购自Gibco；

CD34抗体为鼠抗人CD34单克隆抗体，购自cell signal；

兔抗人CD105抗体购自Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA。

实施例1、人脐带样本的预处理

在无菌条件下，取正常足月生产的近胎儿段脐带；

用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS充分洗涤，去除残余血渍；

将脐带等分为0.5cm的脐带段，仔细剔除动静脉后，取50mL离心管盛装脐带段，1段/离心管；

在离心管中，将脐带段剪成大小约为1mm×1mm×1mm的碎片，剪碎过程中滴加LG-DMEM培养液保持组织湿润；

用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS（pH7.2）洗涤2次后备用。

实施例2、酶解

将实施例1中获得的脐带碎片，用混合酶液（0.1%Ⅰ型胶原酶、0.1%胰酶、0.1%透明质酸酶、0.1%DNA酶、0.02%EDTA；%表示质量浓度百分比），在37℃下消化2h；

消化后，以离心力400g，温度4±2℃，离心15分钟；

弃去混合酶液，获得脐带来源的单个细胞。

实施例3、细胞的原代培养

将实施例2处理所得的细胞，按1×10⁶细胞/ml的密度，接种到T-25培养瓶中，在20ml补充有10%（v/v）胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO₂（v/v）、95%湿度的培养箱中孵育培养3天；

3天后第1次换液，去除未贴壁的细胞；

以后每48h更换培养液。

实施例4、细胞的传代培养

倒置显微镜下观察细胞的形态，待细胞长满至培养瓶底的80%左右，弃去培养液；

PBS（pH7.2）漂洗1次后，加0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；

轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含10%（v/v）人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；

收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；

用含10%（v/v）人AB血浆的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、5%（v/v）CO₂、95%湿度的培养箱中孵育培养；

每2天更换培养液1次；

待细胞增殖并覆盖瓶底80%左右时，用同样方法传代，传代4次后，获得P5代细胞。

实施例5、诱导条件下的传代培养

倒置显微镜下观察P5代细胞的形态，待长满至培养瓶底的80%左右，弃去培养液；

收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；

用含10%（v/v）人AB血浆和0.1μmol/L CD34抗体的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、5%（v/v）CO₂、95%湿度的培养箱中孵育培养；

每2天更换培养液1次；

待细胞增殖并覆盖瓶底80%左右时，用同样方法传代，最多可以传代15次。

实施例6、CD34+细胞的收集

待传代培养的细胞增殖并覆盖瓶底80%左右时，弃去培养液；

轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后终止消化；

吹打后所得细胞以1000g离心10min，弃上清；

收集细胞。

实施例7、脐带源间充质干细胞向CD34+细胞分化的细胞增殖活性分析（MTT法）

1.检测步骤：

将实施例4培养的P5代细胞用0.25%的胰酶消化，300×g离心10分钟；

PBS（pH7.2）清洗2次，弃上清；

用完全培养液调整细胞浓度，接种于96孔板，每孔90μL，使细胞数为每孔1×10⁵个；

设空白组、对照组、用药组（其中用药组分别加入0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L CD34抗体；对照组不加CD34抗体；空白组不加CD34抗体只加培养液）；

每组复种12孔，在37℃、5%（v/v）的CO₂培养箱中培养96h；

每孔加20μL MTT溶液，4h后每孔加100μL10%SDS，18h后用酶标仪测定570nm处吸光度值（A值）。

细胞增殖率=（各实验组A值-对照组A值）/对照组A值×100%。

2.结果：

与对照组相比，hUC-MSCs与CD34抗体孵育（0.1μmol/L或1μmol/L）96h后，分别增殖了52.3%和28.1%。

表1.CD34抗体对hUC-MSCs96小时增殖的影响

实施例8、脐带源间充质干细胞向CD34+细胞分化过程中CD34和CD105的表达检查（免疫荧光染色检查）

1.分组：

按照实施例1至6的方法，将hUC-MSCs与CD34抗体进行孵育。区别仅在于：CD34抗体浓度分别为0.01μmol/L、0.1μmol/L和1μmol/L；且从第5次传代起，CD34抗体加入到传代培养基中；分别继续再传代2次（约7天）和5次（约14天）。

无CD34抗体的hUC-MSCs孵育组作为对照组。

2.检测方法：

分别在加入CD34抗体后第7天和14天收集贴壁细胞（即P7代细胞和P10代细胞），用4%冷多聚甲醛固定15分钟；

0.1%的Triton X100-PBS洗10分钟后，细胞用3%牛血清白蛋白封闭30分钟；

各组用CD34抗体（1:200）和兔抗人CD105抗体（1:200）孵育，4°C过夜；

抗体去除后，细胞用PBS（pH7.2）洗三次；

然后，FITC标记的二抗（多克隆山羊抗兔IgG抗体1:100；Abcam）和TRITC标记的二抗（多克隆山羊抗小鼠IgG抗体1:100；Abcam）37℃孵育1小时；

细胞用PBS（pH7.2）洗三次；

细胞核用DAPI染色（4’，6-diamidino-2-phenylindole）；

Leica DM5000B荧光显微镜下观察细胞染色情况。

3.结果：

（1）在不含CD34抗体的孵育组中，hUC-MSC在第7天和第14天仅呈现CD105阳性，CD34阴性（图1A和图1E）。

对于0.01μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时hUC-MSC仅呈现CD105阳性，未见CD34阳性（图1B）；在14天时，呈现CD105和CD34双阳性（图1F）。

对于0.1μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时就已经有效诱导CD34阳性（图1C）；在14天时，呈现CD105和CD34双阳性，且细胞形态及成份趋于均一（图1G）。

对于1μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时就已经有效诱导CD34阳性（图1D）；在14天时，呈现CD105和CD34双阳性（图1H）；但是在14天时，细胞数量明显少于本组第7天时以及0.1μmol/L孵育组第14天时的细胞数量（数据未显示）。

图1A-图1H的结果表明，CD34抗体可以促进hUC-MSC向CD34+细胞的转化。然而在高浓度组（如1μmol/L的CD34抗体），细胞增殖率早期提高较快，随着培养的进展呈现减缓。因此，对于较长时间的培养，0.1μmol/L浓度最为适宜。

（2）发明人进一步考察了CD105+细胞以及CD34+细胞在细胞群中所占的比例。从图2的结果可见：

对于0.01μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时hUC-MSC仅呈现CD105+，CD34为阴性，双阳性细胞百分比为0%；在14天时，双阳性比例提高到60%。

对于0.1μmol/L CD34抗体孵育组，从第7至14天，双阳性比例从57%提高至76%。

对于1μmol/L CD34抗体孵育组，从第7至14天，双阳性比例变化不大，在40-44%范围附近。

这一结果表明，CD34抗体可以促进hUC-MSC向CD34+细胞转化。不同浓度的CD34抗体对转化细胞的增殖率影响不同，其中以0.1μmol/L浓度为最佳诱导浓度。并且，随着时间的增加，CD34+细胞所占比例也增加，这为大量生产CD34+细胞提供了可能。

（3）产量：

发明人对实施例6所收集的CD34+细胞进行了免疫荧光染色检查。发现在加入0.1μmol/L CD34抗体之前，P5代细胞不表达可检测到的CD34（图3）；而在0.1μmol/L CD34抗体存在条件下传代5次后，hUC-MSC被诱导为CD34+细胞；至多可以传代15次（即P20代细胞），阳性率高达90-95.5%；从形态上观察，CD34+细胞的形态及成份均一。本发明的方法不仅操作简便，且使得能够大量生产CD34+细胞，为满足临床需求提供了可能。

实施例9、含有CD34+细胞的细胞制品的制备

在无菌条件下，将实施例6生产的CD34+细胞加入到0.9%生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域。

实际施用给患者的CD34+细胞的量可以根据多种相关因素（包括疾病的严重程度、施用途径、患者的体重、年龄和性别等）由临床操作者自行确定。根据治疗目的，细胞制品中还可以添加细胞因子和/或药物。

本发明方法生产的CD34+细胞单独使用、或者配合传统治疗方案（如控制高血糖、高血压、血脂异常；去除危险因素如吸烟；强制性的运动锻炼；施用抗血小板药物和扩血管药物；循环重建手术）联合使用，从而促进局部微循环形成，以提高、巩固治疗效果。

Claims

1.一种CD34+细胞的生产方法，其包括步骤：

a）提供脐带来源的间充质干细胞；

b）对间充质干细胞进行原代培养；

c）对间充质干细胞进行传代培养；

d）在传代培养过程中，向传代培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；

e）获得CD34+细胞。

2.根据权利要求1所述的CD34+细胞的生产方法，其中所述的诱导剂为CD34抗体。

3.根据权利要求1所述的CD34+细胞的生产方法，其中所述传代培养基是含人血浆的RPMI1640培养液。

4.根据权利要求2所述的CD34+细胞的生产方法，其中所述CD34抗体在传代培养基中的终浓度为0.01μmol/L至1μmol/L；优选0.1μmol/L至1μmol/L；最优选0.1μmol/L；所述CD34抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；所述CD34抗体是鼠源、兔源、猪源、牛源、羊源、马源或狗源的；优选鼠源、兔源或马源；最优选鼠源或兔源。

5.根据权利要求1所述的CD34+细胞的生产方法，自加入诱导剂后，对间充质干细胞传代培养2至15次；优选5至7次；最优选5次。

6.根据权利要求1所述的CD34+细胞的生产方法，在所述步骤d）中，从第5次传代培养起，向培养基中加入CD34抗体。

7.一种细胞制品，其包括：

根据权利要求1所述方法生产的CD34+细胞；和

可药用载体。

8.根据权利要求7所述的细胞制品在制备缓解或改善血管病变的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述血管病变为肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的外周动脉病变。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述外周动脉病变为下肢动脉病变。