CN104894088A - 消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶联合消化，该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。

Description

消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。
背景技术
脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，原来是由羊膜包卷着卵黄囊和尿膜的柄状伸长部而形成的。脐带中动静脉是通过尿膜的血管形成，卵黄囊的血管即形成脐肠系膜动脉及脐肠系膜静脉。当卵黄囊及其血管退化，脐动脉和脐静脉就发达起来，在这些间隙中可以看到疏松的胶状的间充质。脐带是母体和胎儿的血液间进行CO2和O2、代谢废物和营养物质交换的地方。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将O2和营养物质从胎盘运送给胎儿，最后由子宫静脉将来自胎儿的代谢废物运走。
而某种激素和抗体等亦通过脐带从母体移交给胎儿，但运行机制尚未清楚。通过体外培养分离和培养脐带上皮细胞，可对脐带上皮细胞的增殖特性，母婴之间的某些激素和抗体的运转及机制等进行研究。同时，分离出人脐带上皮细胞，也可应用于人体烧伤皮肤的恢复应用，具有深远的医学研究意义。
目前，并无人脐带上皮细胞分离的相关技术方案，参考其他组织的上皮细胞分离方案，均采用组织块培养法来分离上皮细胞。
专利申请号为CN201210113304.X的发明报道了一种山羊乳腺上皮细胞的建系方法，山羊乳腺上皮细胞的分离与纯化为：
(一)山羊乳腺上皮细胞的分离
(1)选用已经与妊娠期山羊相分离的***组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和***，留下白色颗粒状腺泡组织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的DPBS溶液洗涤一遍；
(2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成1mm3小块，用移液器吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持1cm2左右；
(3)37℃、5％CO2、饱和湿度下倒扣干涸培养6～12h，期间勿翻动；
(4)上述(3)倒扣干涸培养结束后，添加2mL乳腺上皮细胞培养液，于37℃、5％CO2、饱和湿度下正置培养；
(5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4～6mL，自接种组织块72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8～10mL；以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10％FBS+1％ITS+10ng/mLEGF；
(二)山羊乳腺上皮细胞的纯化
(6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80～90％汇合时，吸取培养基，DPBS洗涤2遍；
(7)加入乳腺上皮细胞消化液于37℃、5％CO2、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细胞消化液的成分包括0.02％EDTA和0.25％Trypsin；
(8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽；
(9)迅速再次加入上述消化液于37℃、5％CO2、饱和湿度下消化；
(10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终止培养液终止消化；传代比例始终保持1∶2；所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/F12+10％FBS；
(11)重复(7)～(11)步骤，直至成纤维细胞去除干净。
专利申请号为CN201410176073.6的发明提供了一种***组织分离和建立原代上皮细胞和/或***的方法，具体步骤包括：
第一步：将小鼠***叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到离心管中，并离心；
第二步：用原代细胞培养液重悬组织并转移到T-25培养瓶中，在37℃培养箱中培养1～2天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，2～3天后，小鼠***上皮和***从组织块周围生长出；
第三步：用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠***组织原代上皮细胞和***：或者，在倒置显微镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将***和组织块刮掉或将上皮细胞和组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠***组织原代上皮细胞或***。
然而，上述现有的组织上皮细胞的获取方法原代培养时间长，获得细胞总数低，细胞纯度低掺杂成纤维细胞。因此，建立一种快速、细胞得率高、细胞纯度高的脐带上皮细胞分离方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该方法采用透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶联合消化，消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种消化酶组合物，包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。
在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶联合消化，该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升。
作为优选，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为(5～30)：(1～10)：(1～10)。
在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为5：1：1。
在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为5：5：10。
在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为10：10：1。
在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为30：1：5。
在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg。
在本发明提供的一些实施例中，胶原酶Ⅷ的规格为125CDU/mg。
在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg。
本发明还提供了该消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用；该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶；作为优选，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为(5～30)：(1～10)：(1～10)；在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为5：1：1；在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为5：5：10；在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为10：10：1；在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为30：1：5。
本发明还提供了一种脐带上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
采用消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获得脐带上皮细胞进行细胞培养；该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。
作为优选，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为(5～30)：(1～10)：(1～10)。
在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为5：1：1。
在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为5：5：10。
在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为10：10：1。
在本发明提供的另一些实施例中，透明质酸酶、胶原酶Ⅷ与胰酶的质量比为30：1：5。
在本发明提供的一些实施例中，透明质酸酶的规格为300U/mg，配制成浓度为0.05％～0.30％。
在本发明提供的一些实施例中，胶原酶Ⅷ的规格为125CDU/mg，配制成浓度为0.01％～0.10％。
在本发明提供的一些实施例中，胰酶的规格为1800U/mg，配制成浓度为0.01％～0.10％。
在本发明提供的一些实施例中，根据脐带表面外层膜的面积，以mL/cm2计，消化酶的加入量为：透明质酸酶的加入量为1mL/cm2，胶原酶Ⅷ的加入量为1mL/cm2，胰酶的加入量为1mL/cm2。
作为优选，细胞培养的培养基为添加EGF的含10％FBS的DMEM/F12培养基。EGF能够促进细胞增殖，缩短培养周期。
作为优选，EGF的质量百分含量为0.01～1％。
在本发明提供的一些实施例中，EGF的质量百分含量为0.1％。
作为优选，细胞培养为在36～38℃、5％CO2条件下培养至融合度80％。
在本发明提供的一些实施例中，细胞培养为在37℃、5％CO2条件下培养至融合度80％。
在本发明提供的一些实施例中，脐带上皮细胞的密度为(1～5)×105/mL。
作为优选，脐带上皮细胞的密度为1×105/mL。
在本发明提供的一些实施例中，脐带上皮细胞的接种量为1mL/cm2。
作为优选，细胞培养的培养基采用明胶包被。脐带上皮细胞的原代培养，采用明胶包被后的细胞培养皿，增加细胞的贴壁率，减少原代培养的时间，增加原代培养获得的细胞总数。
作为优选，消化的温度为36～38℃，消化的时间为0.5～3h。
在本发明提供的一些实施例中，消化的温度为37℃，消化的时间为1h。
在本发明提供的一些实施例中，细胞培养为：取脐带上皮细胞用添加EGF的含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬，调整细胞密度为(1～5)×105/mL，按1mL/cm2的接种量接种至细胞皿，于37℃、5％CO2条件下培养2h；吸取培养上清液转移至明胶包被的细胞培养皿于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞在皿底生长融合度为80％时传代。
作为优选，脐带上皮细胞的密度为1×105/mL。
本发明提供了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法。该消化酶组合物包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。本发明至少具有如下优势之一：
在本发明中，脐带上皮细胞原代分离采用透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶联合消化，该消化酶组合物性质温和，对细胞损伤小，酶解速率高，上皮细胞分离效率大大提升；
本发明在细胞培养基中添加EGF，可促进细胞增殖，缩短培养周期；
本发明采用明胶包被后的细胞培养皿，可增加细胞的贴壁率，减少原代培养的时间，增加原代培养获得的细胞总数。
附图说明
图1示两种方法不同代数上皮细胞的增殖曲线。
具体实施方式
本发明公开了消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的消化酶组合物及其应用、脐带上皮细胞的分离培养方法中所用试剂、仪器均可由市场购得。其中，透明质酸酶的规格为5g/瓶，300U/mg；胶原酶VIII的规格为1g/瓶，125CDU/mg；胰酶的规格为10g/瓶，1800U/mg；中性蛋白酶的规格为2g/瓶，100000U/瓶；胶原酶IV的规格为5g/瓶，625000CDU/瓶。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1人脐带上皮细胞的原代分离与培养
(一)培养皿的明胶包被
称取明胶粉末(Sigma)，用去离子水配成0.1％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，并趁热过滤0.22μm的滤网，放置于4℃备用。
取配制好的0.1％明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0.3mL/cm20.1％明胶溶液，均匀铺满皿底，在37℃细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
(二)人脐带上皮细胞的原代分离
收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗脐带表面血迹，然后用100mL 75％乙醇消毒脐带表面，最后用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)将酒精和血迹清洗干净。
剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入1mL/cm20.25％透明质酸酶+0.05％胶原酶Ⅷ+0.05％胰酶的联合酶液对膜消化(37℃)1h后，拿100μm过滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基重悬，调节细胞密度为1×105/mL，按1mL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养2小时。
2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿(第一部分制得的明胶包被培养皿)放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80％时，即可传代。
(三)人脐带上皮细胞的传代
去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍后，加入0.02mL/cm20.1％胰酶+0.02％EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基重悬，细胞密度为1×105/mL，根据培养皿面积，1mL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
实施例2人脐带上皮细胞的原代分离与培养
(一)培养皿的明胶包被
称取明胶粉末(Sigma)，用去离子水配成0.1％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，并趁热过滤0.22μm的滤网，放置于4℃备用。
取配制好的0.1％明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0.3mL/cm20.1％明胶溶液，均匀铺满皿底，在37℃细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
(二)人脐带上皮细胞的原代分离
收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗脐带表面血迹，然后用100mL 75％乙醇消毒脐带表面，最后用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)将酒精和血迹清洗干净。
剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入1mL/cm20.05％透明质酸酶+0.05％胶原酶Ⅷ+0.1％胰酶的联合酶液对膜消化(36℃)3h后，拿100μm过滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10％FBS+0.01％EGF细胞培养基重悬，调节细胞密度为2×105/mL，按1mL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2小时。
2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿(第一部分制得的明胶包被培养皿)放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80％时，即可传代。
(三)人脐带上皮细胞的传代
去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍后，加入0.02mL/cm20.1％胰酶+0.02％EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基重悬，细胞密度为1-2×105/mL，根据培养皿面积，1mL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
实施例3人脐带上皮细胞的原代分离与培养
(一)培养皿的明胶包被
称取明胶粉末(Sigma)，用去离子水配成0.1％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，并趁热过滤0.22μm的滤网，放置于4℃备用。
取配制好的0.1％明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0.3mL/cm20.1％明胶溶液，均匀铺满皿底，在37℃细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
(二)人脐带上皮细胞的原代分离
收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗脐带表面血迹，然后用100mL 75％乙醇消毒脐带表面，最后用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)将酒精和血迹清洗干净。
剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入1mL/cm20.10％透明质酸酶+0.10％胶原酶Ⅷ+0.01％胰酶对膜消化(38℃)0.5h后，拿100μm过滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10％FBS+1％EGF细胞培养基重悬，调节细胞密度为5×105/mL，按1mL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2小时。
2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿(第一部分制得的明胶包被培养皿)放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80％时，即可传代。
(三)人脐带上皮细胞的传代
去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍后，加入0.02mL/cm20.1％胰酶+0.02％EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基重悬，细胞密度为1-2×105/mL，根据培养皿面积，1mL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
实施例4人脐带上皮细胞的原代分离与培养
(一)培养皿的明胶包被
称取明胶粉末(Sigma)，用去离子水配成0.1％(W/V)溶液，37℃水浴溶解，并趁热过滤0.22μm的滤网，放置于4℃备用。
取配制好的0.1％明胶溶液复温，按照细胞培养皿面积的大小，加入0.3mL/cm20.1％明胶溶液，均匀铺满皿底，在37℃细胞培养箱中放置24h，然后将皿中的全部明胶吸出弃掉，细胞皿明胶包被完成。
(二)人脐带上皮细胞的原代分离
收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗脐带表面血迹，然后用100mL 75％乙醇消毒脐带表面，最后用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)将酒精和血迹清洗干净。
剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入1mL/cm20.3％透明质酸酶+0.01％胶原酶Ⅷ+0.05％胰酶的联合酶液对膜消化(37℃)1h后，拿100μm过滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基重悬，调节细胞密度为1×105/mL，按1mL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养2小时。
2小时后，吸取培养上清液转移至细胞培养皿(第一部分制得的明胶包被培养皿)放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。待细胞在皿底生长融合度为80％时，即可传代。
(三)人脐带上皮细胞的传代
去掉细胞培养基上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍后，加入0.02mL/cm20.1％胰酶+0.02％EDTA消化液消化5min，用8倍于消化液的DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基终止酶解，300g离心5min，DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基重悬，细胞密度为1×105/mL，根据培养皿面积，1mL/cm2接种于没有明胶包被的培养皿。
实施例5脐带上皮细胞分离率计算
选取15根脐带，随机均分成5组，为实验组和对照组，各组区别在于使用不同消化酶，其余实验步骤与实施例1相同。
实验组1：0.25％透明质酸酶+0.05％胶原酶Ⅷ+0.05％胰酶；
实验组2：0.05％透明质酸酶+0.05％胶原酶Ⅷ+0.1％胰酶；
实验组3：0.10％透明质酸酶+0.10％胶原酶Ⅷ+0.01％胰酶；
实验组4：0.3％透明质酸酶+0.01％胶原酶Ⅷ+0.05％胰酶；
对照组1：0.10％中性蛋白酶+0.05％胶原酶IV。
实验具体操作如下：
收集医院孕妇产后弃置后的脐带。在无菌条件下取一根脐带，用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗脐带表面血迹，然后用100mL 75％乙醇消毒脐带表面，最后用100mL无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)将酒精和血迹清洗干净。
剥取脐带表面的最外层膜，将外层膜剪碎，根据外层膜面积，加入消化酶(实验组1：0.25％透明质酸酶+0.05％胶原酶Ⅷ+0.05％胰酶；实验组2：0.05％透明质酸酶+0.05％胶原酶Ⅷ+0.1％胰酶；实验组3：0.10％透明质酸酶+0.10％胶原酶Ⅷ+0.01％胰酶；实验组4：0.3％透明质酸酶+0.01％胶原酶Ⅷ+0.05％胰酶；对照组1：0.10％中性蛋白酶+0.05％胶原酶IV)对膜消化1h后，拿100μm过滤网过滤，滤液300g离心5min，去除上清液，加入DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基重悬，调节细胞密度为1×105/mL，按1mL/cm2密度细胞液接种至细胞皿放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2小时。
2小时后，吸取培养上清液，对上清液进行细胞计数A，转移至细胞培养皿(明胶包被)放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h，去除上清液，用胰酶消化细胞后，加入8倍于消化液的DMEM/F12+10％FBS+0.1％EGF细胞培养基终止消化，对培养液进行细胞计数B，计算出上皮细胞贴壁率，计算公式为：上皮细胞贴壁率＝B/A×100％。
两组上皮细胞分离率测定结果见下表：
表1原代培养上皮细胞贴壁率
从表1可看出实验组1～4比对照组1贴壁率高，且实验组1～4接种时分离出的细胞总数也高于对照组1，平行实验的贴壁率也较一致。证明实验组1～4所用的酶解方法分离效率高，对细胞损伤小。
实施例6不同培养方法的上皮细胞增殖曲线对比
采用CCK-8法检测培养的脐带上皮细胞的增殖活力。选取6根脐带，随机均分为两组，实验组1按照实例1的方法分离和培养上皮细胞，一直传至P10代。实验组2不采用明胶包被的培养皿和培养基中不添加EGF，其余实验方法按照实例1，一直传至P10代。两组分别收集在P1、P5、P10的细胞，接种细胞于96孔板中，2000个/孔。在37℃，5％CO2培养箱中连续培养7d。分别在1d、3d、5d、7d对细胞进行检测。在待检测孔中加入10μL染色剂，37℃，5％CO2培养2h。用酶标仪测450nm处的吸光值，每个样本做6个重复，见图1。
从图1可见，实验组1中的各代次细胞相比于实验组2均有较高的增殖曲线，实验组2代次越高，增殖越趋于缓慢，证明实验组1中的EGF和明胶包被极大促进并保持了细胞增殖的活力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种消化酶组合物，其特征在于，包括透明质酸酶、胶原酶Ⅷ和胰酶。
2.根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述透明质酸酶、所述胶原酶Ⅷ与所述胰酶的质量比为(5～30)：(1～10)：(1～10)。
3.根据权利要求1所述的消化酶组合物，其特征在于，所述透明质酸酶、所述胶原酶Ⅷ与所述胰酶的质量比为5：1：1。
4.如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物在分离脐带上皮细胞中的应用。
5.一种脐带上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用如权利要求1至3中任一项所述消化酶组合物对脐带表面外层膜进行消化，将获得脐带上皮细胞进行细胞培养。
6.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基为添加EGF的含10％FBS的DMEM/F12培养基。
7.根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，所述EGF的质量百分含量为0.01～1％。
8.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养为在36～38℃、5％CO2条件下培养至融合度80％。
9.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述细胞培养的培养基采用明胶包被。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的分离培养方法，其特征在于，所述消化的温度为36～38℃，消化的时间为0.5～3h。
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